대한임상병리사회지 : 제 24 권 1 호 1992 Dry Slide Technology 및벌리루번측정에서의새로운개념 학교건강관리소 이명자 Key words : Dry-slide, CM slide, PM slide, conjugated bilirubin. Unconjug

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1 대한임상병리사회지 : 제 24 권 1 호 1992 Dry Slide Technology 및벌리루번측정에서의새로운개념 학교건강관리소 이명자 Key words : Dry-slide, CM slide, PM slide, conjugated bilirubin. Unconjugated bilirubin. 1 Kodak Ektachem Analyzer 의 Dry-slide Technology 1. 건식슬라이드 (dry-slide) 방법 건식슬라이드화학방식은시약에대신하는슬 라이드를사용하여정량분석을하는것이며슬라 이드는우표만한크기이지만습식화학에서수행하 는모든복잡한기능을한다. 건식슬라이드를두가지부분으로나누어설명 할수있는데한분야는광학분야이고하나는임 상화학분야로나눌수있다. 건식슬라이드기법은습식화학방법을그대로 옮겨놓은독특한방법으로서, 습식화학 (wet chemistry) 에서시약을회석하거나혼합하는불편을멀 어주고반응용기가필요없고특히 carryover 가 없다. 시약슬라이드는투명한포리에스터필름위에 여러층으로반응에필요한모든시약이도포, 건 조되어있어각층에각각의특별한화학적, 물리 적기능을갖고분석을행하는독특한방법이다. 슬라이드의종류는 colorimetric 과 potentiometric 두가지로구별되며, colorimetric slide 로는빛의반 사로농도와활성도를측정하는데, 그예로는 glucose, uric acid, albumin, calcium 동을측정하고 potentiometric slide 로는 electolyte 농도를측정한 다. 즉 Na, K, CI, CO 2 이다. 2. Slide 구조와기능 1) Colorimetric slide Colorimetric slide 는맨위층에서부터 spreading layer, reagent layer, indicater layer, support layer 로 이루어져있다 ( 그림 1 ). Sample Spreading Layer Registration Layer Indicator Layer Support Layer Fig. 1. A cross-sectional view of the 확산충 (spreading layer) 확산층은슬라이드의맨위층에자리하고있으 며스폰지와같은성질을나타내는데그구조가 모세관망상으로되어있어처음검체가슬라이드 위에고루잘퍼지게하여오차를없애게한다. 또 한지질, 단백, 헤모글로빈같은고분자물질이내 려가지않게막아주는역할을하여간섭물질을제 거하고선택적인홉수기능을한다. 또한반사효과 의배경역할을하는데그작용을하는것은 BaS04 또는 Ti0 2 시약충 (reagent layer) 이층은확산충아래에있으며생화학반응이 일어나는데필요한시약이도포되어있다. 이들시 약은효소, 완충제, 촉매제동을포함한다. 때로는몇몇반응이일어나야할때하나씩또 는차례로일어나도록필요에따라만들어져있으 며이것은여러개의시약충으로이루어져있다. 예 : Glucose 검사용슬라이드의시약층 ( 그림 2) - 42-

2 [b l 빼 e Spreading Layer Glucose Oxidase Peroxidase Reagent Layer Chromogens Indicator and Support Layers Buffer at ph 5.0 Fig.2. Ektachem clinical chemistry silde(glu) 또한여기에는경우에따라 scavenger layer 라고 하는특수층이있어서생화학반응에서의방해물 질을제거한다. 즉종래의 uric acid 검사에서방해 가되어오던 ascorbic acid 를제거하여검사상의오 차를없애준다. 즉, scavenger layer 에서검체에있 는 ascorbic acid 와결합히 - 여 ascorbateo-xidase 로 되어시약층에서 ascorbic acid 를제거히 - 발색충 (indica tor lay er) 여기에는발색만응을일으키는발색제나색소 Reflectence spectrometry ( 그림 3) 색의농도를측정하는데있어서습식생화학적 검사법에서는시약과반응이일어나는것을 cuvette 을투사한빛이통과한것을읽지만건식생 화학적검사법에서는빛을투사하면확산층 (spreading layer) 에서반사한것을 photodetector 에서 읽는다. 그러므로헤모글로빈이나벌리루빈같은방 해물질이습식생화학적검사법에서는혼합된상 태로윈어지지만건식생화학적검사법에서는확 산층 (spreading layer) 에서걸러진상태에서원게 되므로그들로인한오차가없다 ( 그림 4). 가들어있는데이런발색제는분석시약농도에 /17/ Light Path 비레해있으며이층에서시약층과색소가결합하 Support layer Fig. 3. Light is directed through support ]ayer t 이층은슬라이드의맨아래층에있으며투명한 measure the colored complex, proportional 플라스틱으로되어있다. 이층의효과는발색된 to analyte concentration. Layer Transmission Reflectance Analyte with interferents Fig.4. Principle of the refectence spectrometry - 43-

3 2) PM(potentiometric) slide K 를검사하는데쓰이는슬라이드를예를들어그 PM 슬라이드는두개의흘이있는 paper bridge 구조를본다 ( 그림 5). 로되어있으며, 한흘에는혈청 ( 겸체 ) 을넣고하그림 5 에서 ion-selective membrane 은 internal 나는 electrolyte 의표준액을넣게되어있다. ref erance layer 로침투하는검체와 referance 로부 Ectachem 에서는 direct ISE(ion-selective elec- 터 K 이온과결합하는 valinomycin 을함유한다. 검 trode) method를쓰며이방법은 phygiological reg- 제와 referance에서 K 이온의활성비를 3 개의층을 ulation 상태에있는희석되지않은혈청으로검사 통하여측정한다. 두쌍의침투되는지점에서서로 하므로 displase water 로인해발생되는영향을받다른전극에의해전위차로 voltage 를측정한다. 지않기때문에다른 ISE 방법에서발생되는 con- ERF 에는 known concentration ion 이있다. tamination drift 를제거하도록개발되었다. 다음은 Patient s Serum Reference Fluid Membrane Membrane (Valinomycin) (Valinomycin) Internal Internal Reference Reference Layer Layer - AgCl I J AgCI Ag I I Ag - Fig. 5. Principle of the PM slide technology 3. 장비의구조및원리 Main unit, control unit, printer 의 3 부분으로되어 았다. Main unit 는컴퓨터시스템과슬라이드를저 장, 공급하는모률로되어있다. Control unit 는키 보드와 display unit 로되어있으며, 오퍼레이터와 장비의교신역할을한다. 프린터는 2 대를연결시 킬수있어서검사실과그외다른곳에도설치하 여동시에프린트시킬수있다 ( 그림 6). 1) Modules 총 3,000 개의슬라이드를저장할수있으며, 슬 라이드는 supply 1, supply n 로두곳에각각넣 게되어있고, 각각 30 개의캐드리지를넣게되어 있다. Supply 1 : 습도가 25-45% 로유지되도록되어 있으며, TP. URIC. ALB.TRIG. CHOL. AMYL. Cl. K. Na. TBIL. LIPA. Mg. 의슬라이드를저장한다. Supply n : 습도가 20% 로유지되도록되어있 다. GLU. NH3. CREA. AST. ALKP. ALT. LDH. CK. GGT. THEO. CKMB. 의슬라이드를저장한다. 2) Rate incubator 24 개의슬라이드를 37 0 C 에서 5 분 30 초동안 Incubation 한다. Supply n 로부터슬라이드가오면 sample metering station 으로부터검체를받고 incubaton 한다. Incubation 이끝날때까지 54 회읽 는다. 54 회읽는것은효소의활성도를측정하는 것이며컴퓨터는효소의활성도를측정하여 kinetic curve 의 slope 를만들고계산치가프린터로간 다. 즉한슬라이드에서발색변화속도에따른반 사도를측정하여효소활성도를측정하는것이다

4 3) Colorimetric test CM incubator 에서 27 개의슬라이드를 37 0 C 로 IDcubate 시킨다. Supply 1 또는 R 에서 CM slide block 으로슬라 이드를보내면 sample metering station 에서 10 마이 크론썩검제를분주하며 precondition station 에서 4) PM slide tech * Two point colorimetric test : Incubator cycle 에 서정해진두개의시간사이에서 reflectance 익변화에의해서효소를측정하는것이다., AMYL. LIPA. CREA(single slide). THEO. CM incubater로가서약 5 분간 incubation 한다읍 Supply 1 에서슬라이드가 sample metering sta- CM read station 에옮겨져 light reflectance로측정 tion 으로가면검체가 10 마이크론씩분주되고동시 된다. 에 ERF 가 10 마이크론씩분주된다. *End pont : ALB. NH 3 CHOL. GLU. HDLC. Mg. 슬라 - 이드가 precondition 에오면즉시 PM incu- P. TP. TRIG. BUN. UA. 를측정한다 bator로가서 25 0 C 에서 3분간 incubate하며, 총슬 * Dual-wavelength : 각두종류의다른파장으 리-이드는 17 개가들어간다. 로한개의슬리 - 이드를읽는다. TBIL BuBc 그다음 read station 에가서 electrometer 에의해 * Blank corrected: Creatinine(two slide meth- 검체와표준액사이의전위차가 reading 된다. od), ammonia 는두개의슬라이드를읽는다. Fig. 6. Kodak Ektachem analyzer unit. 4. Calibration 의이론 n. 혈청빌리루빈측정에있어서의 Transmission method 에서는빛을투사하면정색 새로운개념 반응을일으킨물질의일부는통과한다. 이때 cu- 1. 일반적개념 vette 을통과한빛을원는다. 그러나 dry slide 에서 는빛을입사하면발색된색조에의해일부는흡근간 70 여년동안검사실에서는, 직접빌리루빈 수되고나머지는반사되는데이렇게반사된빛을 이란용어는 glucronic acid와결합한 bilirubin을의 측정지점에서측정한다. Calibration은농도가각기 미하고간접빌리루빈은 unconjugated bilirubin을 다른세가지표준액을특정한파장에서측정하여의미하는것으로불리어져왔다. 이미기계에입력된각표준값과표준액을기계에 1913 년 Van den Bergh 는혈청에서빌리루빈을 서읽은값을구하여자동으로 slope 와 intercept 를측정하는것을착안해냈으며그후직접빌리루빈 계산하여보정해준다. 과간접빌리루빈을측정하는것이개발되었다. Calibration diskette 을새로넣을때는 ERF 의 Direct-reacting bilirubin 은 1-2 개의 glucronic Gemeration No. 를확인해야한다 acid 분자가 ester 화된빌리루빈분자로이루어진 % 월

것으로생각해왔다. 이러한형태는수용성이며신 장에서여괴되고즉시 diazotïzed sulfanilic acid 와 반응한다. Unconjugated 로분석되는간접빌리루 빈은일차적으로알부민과결합되어있고디 - 만 methanol 과같은 mordant 아래서 diazotized sulfanilic acid 와반응한다.

5 것으로생각해왔다. 이러한형태는수용성이며신 장에서여괴되고즉시 diazotïzed sulfanilic acid 와 반응한다. Unconjugated 로분석되는간접빌리루 빈은일차적으로알부민과결합되어있고디 - 만 methanol 과같은 mordant 아래서 diazotized sulfanilic acid 와반응한다. 이런원리는 Malloy-Evelyn method 에서또는 caffeine 과 sodium benzoate 를이용하는 Jendrassik -Groff( 이상 J.G 로표기 ) 원리에서이용되었다. 간접 직접빌리루빈이란용어는검사실이나임 상의학에서오랫동안통용되어왔 며 hyperbiliru - binemia 진단에흔히이용되어왔다. 그러나이제는직접빌리루빈이란용어가잘못 정의된것이라는게알려졌다. 더구나소변에서빌 리루빈이안나오거나적게검출되면서혈청에 conjugate bilirubin(bc) 이증가되는것이특정인케이 스에서는항상 Bc 가출현하리라는일반적인경향 과는일치되지않은것이다. 그러므로 direct bilirubin 은 mono 와 diglucuronidated form 외에다른종류가있기때문에그개 념은바뀌어져야한다 i1i rubin 의분류 Kuenzle 과 Lauff 는 LC (liquid choromatography) 를이용하여네종류의 bilirubin(bil) 분류를병적 혈청에서논증하였다. 그하나는 a-form 으로간접또는 unconjugated bilirubin(bu) 이라흔히불려지는것으로서이는 비수용성이며알부민과결합되어 lipophilic form 을 구성하며신장에서여과되지않는다. 두번째종류는 β 또는 monoconjugated bililubin glucuronide 이고셰번째는 y 또는 diglucuronide 이 며나중두형태는수용성 로서직접반응을일 으키며혈청에서이들직접빌리루빈이증가될때, 소변에서도증가된다. 마지막한종류는델타빌리루빈 (δ BIL) 으로서 가장최근에알려진것으로서알부민분획에붙어 있는빌리루빈으로구성된다. 텔타빌리루빈은전 반적으로직접반응을일으키나알부민과배위결 합 (covalently bound) 되어서 glomeruli 에의하여여 과되지않는다. 또한, 이는알부민과빌리루빈이강하게결합되었다고 biliprotein 이라고도한다. 몇몇빌리루빈측정용액체시약에는 indirect bilirubin 은 a-bil 과거의같고 β, ô, y 형태의빌리루 빈의합이직접빌리루빈 (DBIL) 과거의같다. 그 러나, 대부분의액체시약방법에서는 DBIL 이 y, ß 그리고 δ BIL 보다낮다. 3. 델타빌리루빈 (ô 81 니 델타빌리루빈은빌리루빈과알부민의복합체이 다. 이것은정상인의혈청에서는검출되지않으나 Bc 가증가되면어떤경우에도발견된다. Mc Donagh 는동물실험에서 bile-duct ligation 이 Bu, Bc, 델타빌리루빈의빠른축적을이룬다는것 을증명하였다. 실제로댈타빌리루빈은사람혈청 이나 Sprague-Dawley 쥐의혈청과함께 bilirubin diglucr onide 를 37 0 C 에서 incubate 하므로써형성될 수있다. Mc Donagh 팀은 biliprotein 의형성이알부민괴 Bc 의 nonenzymatic 반응을포함한다고결론지었 다. Gautan 동도 3TC, ph 7.4 에서쥐의혈청에서 델타빌리루빈을형성할수있었다. 길버트증후군을가진사람에대한그들의연구 는 Bc 가델타빌리루빈의 precursor 이고 Bu 는아 니라는것이다. 즉 Bu 는델타빌리루빈으로바뀌기전에 glucuronidated 되어야한다는것을확인했다. 텔타빌리루빈의반감기는 일또는알부 민과같은것으로알려져있다. 텔타빌리루빈은 glucuronidated bilirubin 보다쥐에서 serum halflife 가더길다. Mc Donagh 연구에서쥐에서의담관폐색은신 체밖으로 fistula 를통한담즙배설을수반하며담 관폐색을제거한후 2 시간안에 glucuronide bilirubin 의빠른감소를보였으며 7 시간안에완전히 소실되었다. 담즙배설후 7-12 시간후에혈청의 LC 분석 에서 9 마리쥐중에서 6 마리에서 predominent bilirubin fraction 은델타빌리루빈이었다. 텔타빌리루빈의반감기는 Weiss 둥에의해서 일또는알부민과같다고추정되었다. 분명히텔타빌리루빈은알부민으로부터분리되 지않고또한알부민과독립적으로소실되지않는다. 4. 표준화의경향 최근거의모든임상검사실에서실시하고있는 임의의수치는표준액, 시약의촉매또는다른인 자에달려있다. 다음그림은 John A. Lott 팀이신선한환자혈청 으로 Bc 를 aca 와 Astra 방법으로측정하여비교한 것이다 ( 그림 7)

6 b A i } }그 :ijid되 다 j다i언φ벼 며O O m 띠 J b X Fig.7. Y= R=0.998 U -짜- x= Conjugated bilirubin aca Comparision of conjugated bilirubin 25 ctry 에의해측정된다. Dye 는 nm 에서 plateau 를이룬다. 적당한 computer algorithms 을 이용해서 nm 에서반사를측정하여빌리 루빈의양을알아낸다. 이방법은적어도 210 mg/ dl 까지는근사치를측정할수있다. 혈청을슬라이 드에직접떨구어서각층으로이루어진시약과 슬라이드에서반응을하게한다 ( 그립 8). Sample Regresion plot 는그림 7 에서와같이두방법에 서우수한관계를보여주는데 aca 와 Astra 의값 의차이는 Astra 의결과에대히 - 여 aca 의결과가 지속적으로평균 0.7 mg/dl 가높게니 - 왔다. 이와같이 Bc 의표준액이없을때는그검사결과 를정확하디 - 고말할수없다. Bc 의결과가정확하지못하면총빌리루빈의결 과가믿을만해도간접빌리루빈은부정확할것이 다. 그이유는간접빌리루빈은총빌리루빈의차 로계산하기때문이다. Ou 동은 DBIL 이어떤방 법에서는임상적으로중요할수있는간접빌리루 빈분류를과대평가한나머지특히 neonates 에서 너무낮게나온다는것을증명하였다. 간접빌리루빈은광선치료또는교환수혈시비정상적으로증 가한다. 5. Dry film 방법에서의빌리루빈분류 Kodak 은모든빌리루빈분리를위한순차적인 과정을 dry film 기술로개발했다. Film slide 법에서 빌리루빈을알부민으로부터분리하기위하여 dyphylline Triton X-I00 을채택했다. 모든빌리루빈의종류는 diazonium salt 4-(N-carboxymethyl sulfamyl)-benzenediazonium hexafluorosphate 와반응하여 azo dye 를생성하며이것은 520nm 에서 absorbance 피크를나타낸다. 착색료 copoly(styrene-/n-vinylbenzyl-n-n-dimethylbenzylammonium chloride / divinuylbenzene) 에 의하여반사파장이최고에달하게하고 diazobilrubin 의발색을증대시킨다. 발색된색조는투명한필름을통하여 ref1ectom- Fig.8. Principle of dry film slide method for total bilirubin Dappen 동은슬라이드방법에서의총빌리루빈 값과 J. G. 방법과의값이아주정확하게일치한다 고했다 ( 여기서사용한표준으로는 pool serum 으로 된 Bu 를사용했으며 referance method 는 J. G. 방 법을썼다 ). 6. Unconjugated and glucuronidated bilirubin 그림 9 는 a, β, r bilirubin(bu and glucuronidated form) 을측정하는데사용하는 BuBc 슬라이드 를나타낸것이다. 발색제와반응한후 mono- 와 diglucuronidated bilirubin (Bc) 가 nm 에서반사를보이는 반면 Bu 는 nm 에서최고의반사값을보 인다. Mordant-enhanced bilirubin pigment 를사용 하여분광계를직접 \} 용하였을때발색제의흔재하에 Bu가 endogenous bilirubin 의약두배의반 사를갖는다. [TBIL] - 47-

7 6 Sample Ti02 Gelatin Reagent Layer1 Mordant / Buffer t-s-u-pp-ort-lay;;--1 Estar / J + [Bu] [Be] Ditaurobilirubin %~.g. -T- 71]9.1 1 t:jl absorbance-~ ~-E til -&-}-ti--e 465 nm oj] J.1, -T- Jti ~11-E ~ ~ {}~ lila nmoj] ~ ti-. Ditaurobilirubin.g_ o}-t -AJ ~~ l:ij-~e.... bilirubin-glucuronideill Eq value~- Al -AJ?sll -T0-1 oj: ~c}-. {f-:;;}~ E.... ditaurobilirubin.g_ % 4i'-.9.1 diconjugated forml!}-e q.s.al ~ ~ol] ftllill ~:;~:1] -&-1-oJl J.1 ditaurobilirubin.g_ glucuronidated bilirubin.i!} %J.l-?>1-q. opj <(!if~ t:l]-.2} ~oj ~ ~ ~ el.!f-lfl.g_ l;jj 7]].9.1 fj=-~~ %fl-.. T--"J 10-1 ~q. ~ unconjugated, mono-, diglucuronidated, ::z. el :J1.. 8-bilirubin o 1 q. t:~ EJ- ~ el _!f.lfl.g_ ~- - ~ l!} ~ ~ ~ :JI.. DBIL j~ ttl ~%?>1-nl l!}~ el.!f-~ ~.;g:-~~1-9.1 ~ ~ 4i'-oJ1 ~4i'-~r:t. %- ~ el.!f- ~.g_ ~~ }- Q} l:ij"~ ojl J.1 ~ 1E ~ }- j 0-1 ~Al~ Bc.9.] ~78l!} lf:~ l-71- o}-~.i!j-q}~e.... Fig. 9. Principle of BuBc slide film Conjugated form. ~~ftll.9.1 ~A]lt>l-oJl-"-1 ~~ol ~~ 1Ul q-ajtsl 460 nmojla-1 Bu Be.!f. ~ 1i2} o}e_oj}.a-1 ~.78~:;::. ~c}-. BuBc 1i2}o].=.i=- t:~e} ~el.!f-~o] ~78 1Al ~ -Ec}-. ~ Y=i>l-~ t:~ EJ- ~ el.!f-~.g. 3.7]71-3.7] n:ji ~ oj} ~{!-~oj}-"-1 ~t!:l~-"-1 lfr%~77}-a} op:~}a} *i>t 7] n:ji~o] c}-. t:~ Et ~ el.!f- ~.g. ~ ~ el.!f- ~ l!} BuBc~ ~78 ~ n:ji :::::z. ~1-oJl.9.1 'Bl1 -"1 ~78 ~ c}-. ~' TBIL=a+.B+r+o BIL BuBc=a+,B+o BIL 8 BIL =TBIL-BuBc BuBc.9.] 1E~~78.g. ditaurobilirubin~ -"1-%~c}-. ~:Jl.~ ~el&t:l--e ~%~~ ~-2-oJl.9-]~~q. :::::z. 2:l t+ '-ll..-&:- dry-film 7] ~.g. ::z. -"3 {f- t:l] ~. ~~ TBILill 78 ~~ ~-AJ ~ 7}-*t>l-711 ~q. ::z..c-1.!::... 0 BIL.9.] 'i:i -"J~ %%-"a~ ~ 7}-i>l--E ~OJ o] ftl] 7}-*t>l-J!l 1 ~ q. Cholestatic disoder. - - Ei ~ ~ 1-E ~ ~1- ojl 711 J.1 %- ~ ellf-~.g_ {J-±i>tAJ ~ ~ E} ~ el _!f-~9-l ~rg: l:l] (~ -ill..)i=-.;g:-7}-~q. 1}Zft>l-J!l o}~ ~~1-oJlA-1 TBIL.?:- ~±t>}i=-ti] l:l] i>}o:] t:~ EJ- ~ ellf-~.9.) ~ -ill..7} _;g:-7}i>}aj ~..~ o'j}~i=- ~Aj *i>}c}-. t:~ej- ~ ellf-lil.9.1 ~ 1(!-.af %%-"J~ ~~ -o-j ~ 0?>}71.!fl&l-"-1~ c-] \t.g. ~.AJ:&] ~-T-7} ~JLii}~Al tfr l!}~ el.!f-lil ~ "F ~~1-oJl 711-E o'j].;.~ ~ 78?>}'=:-til *JL~ :S:.T-7} ~ ~o]q. Introduction to Dry-slide Technology and New Concepts in Serum Bilirubin Measurment Lee, M. J. School Health Center ABSTRACT of Kodak's expertise : photographic layering technology, and the science of laboratory chemicals. Dry Dry-slide technology is a combination of 2 areas placed traditional wet chemistry methods. It has e- ( 1) Introcuction to dry-slide technology -slide technology is a unique process which has re- -48-

liminated the need to prepare and handle wet reagents. In dry-~::, >cchnology, multilayered reagents are applieu cj a clear polyester supportbase cut to the size of a postage stamp.

8 liminated the need to prepare and handle wet reagents. In dry-~::, >cchnology, multilayered reagents are applieu cj a clear polyester supportbase cut to the size of a postage stamp. When serum, urine, or CSF come into contact with these dry chemical layers, the reaction occurs. The chemical reactions thus incorporated into the slides are similar to those used in traditional wet chemistries. There are two basic types of slides used by the Kodak Ektachem 700 analyzer. Colorimetric ( CM) slides measure analyte concentration or activity by light reflectance. The intensity of light reflectance is preportional to the color density formed. Potentiometric(PM) slides measure electrolyte concentration by the potential difference between the sample and referenced electrodes. The top layer of a colorimetric slide is the spreading layer. A drop of undiluted sample is metered onto this layer of the slide. The term metered indicates that a precisely measured amount of sample is placed onto work, which allows the liquid in the specimen to penetrate through to the other layers. Its porous capillary network assures uniform distribution of the sample volume over the slide area. The structure of the spreading layer traps large molecules such as lipids, proteins, and hemoglobins. This eliminates interference from these substances and creates a type of protein-free filtrate. The reagent layer contains the reagents necessary for the chemical reactions to occur. These reagents include enzymes, buffer, and catalysts. Often several different reactions must occur, making it necessary to separate and control each reaction sequence. This is made possible by constructing the slide with serveral reagent layers. The indicator layer of the colorimetric slide contains a dye or similar indicator to produce a colored complex formed is the slide by the analyzer. This method eliminates potential errors caused by initial sample dilution. The spreading layer is a porous capillary net- in proportion to the analyte concentration. The support layer is the bottom layer of the slide. It is made of a clear plastic, onto which all other layers are applied. The purpose of the support layer is to allow light to pass through, so that the colored complex can be measured. (2) New concepts in serum bilirubin mesurement. For nearly 70 years, laboratorians have used the terms 'direct bilirubin' to mean bilirubin conjugated to glucuronic acid and 'indirect bilirubin' to mean unconjugated bilirubin. Van den Bergh described the measurement of bilirubin in serum in 1913 the 'direct' and 'indirect' tests were described shortly there after. Direct-reacting bilirubin has always been thought to consist solely of bilirubin molecules esterfied to one or two molecules of glucuronic acid. These forms are water soluble, are cleared by the kidneys, and react at once with diazotized sulfanilic acid. Indirect bilirubin is the unconjugated analyte ; is bound primarily to albumin, and reacts with diazotized sulfanilic acid only in the presence of ac- celerators such as methanol, which is used in the Malloy-Evelyn method, or a mixture of caffeined and sodium benzoate, as employed in the Jendrassik -Grof procedure. The terms direct and indirect bilirubin are now deeply embedded in the practice of laboratory and clinical medicine and have served reasonably well in the differential diagnosis of hyperbilirubinemias. However, it is now known that 'direct' bilirubin is an ill-defined quantity. Furthermore, cases of an increased serum concentration of conjugated bilirubin with little or no bilirubin in the urine have been descrbed-a finding that contradicts the prevalent notion that conjugated bilirubin should always appear in the urine when it is present in abnormal a mounts in the serum. Accordingly, the concept of direct bilirubin must change, since there are species other than the mono and diglucuronidated forms. REFERENCES 1. Van den Bergh. A. A. H. and Snapper, J.: Die Fearbstoffe des Blusterums, Deutsch. Arch. Klin. Med. llo : , Van den Bergh. A. A. H. and Mueller P.: -49-

9 Ueber eine direkte und eine indirekte Diazoreaktion auf Bilirubin. Biochem. Z. 77 : , Meites, S. : Bilirubin, direct-reacting and total, modified Malloy-Evelyn Method. In Selected Methods for the Small Clinical Chemistry Laboratory. Meites, S. and Faulkner, W. (eds) Washington, D. C.: American Association for Clinical Chemistry, pp.ll9-124, Koch, T. R. and Doumas, B. T.: Bilirubin, total and conjugated, modified Jendrassik-Grof method. In selected methods for the Small Clinical Chemistry Laboratory. Meites, S. Faulkner, W.(eds.) Washington, D. C.: Amercin Association for Clinical chemistry, pp.ll3-118, Kuenzld, C. C., et. al :Separation and quantitative estimation of four bilirubin fractions from serum and three bilirubin fractions from bile, J. Lab. Clin. Med. 67 : , Lauff, J. J., et al. : Isolation and preliminary characterization of a fraction of bilirubin in serum that is firmly bound to protein. Clin. Chern. 28: , Wu, T. W.: The Ektachem clinical chemistry slide for simultaneous determination of unconjugated and sugar-conjugated bilirubin. Clin Chern. 30: , Du Pont TBIL and CBIL Methodology, Du Pont Clinical Systems, Wilmington, DE Me Donagh, A. F., Palma, L. A., Lauff, J. J. and Wu, T. W.: Origin of mammalian biliprotein and rearrangement of bilirubin glucuronides in vivo in the rat. J. Clin. Invest. 74: , Ou, C. N., et al. : Unconjugated hyperbilirubinemia is overestimated in neonates with cholestasis. Am. J. Clin. Pathol. 84 : , Alpers. J., et al. : Interlaboratory comparison of direct bilirubin methods. Clin. Chern. 31 : 989 (Abstract), Kodak TBIL and BuBc Methodology, Document MP2-39. Eastman Kodak Co., Rochester, NY Dappen G. M., et al: A diazobased dry film for determination of total bilirubin in serum. Clin. Chern. 29 : 37-41, Chan K. W., et al.: Inacurate values for direct bilirubin with some commonly used direct bilirubin procedures. Clin. Chern. 31 : , Dry-slide technology. Eastman Kodak. 16. Kodak Ektachem 700 Analyzer Operater's Manuual for in vitro diagnostic use MP2-51 : Eastman Kodak Co. Rochester, NY

제 3 강 Bilirubin 측정법 (page928) 혈청내빌리루빈은 van den Berg 및 snapper에의해처음으로증명 alcohol이첨가된 Ehrlich's diazo reagent와반응하는 bilirubin을발견. bilirubin이촉진제첨가없이도디아조시약과

제 3 강 Bilirubin 측정법 (page928) 혈청내빌리루빈은 van den Berg 및 snapper에의해처음으로증명 alcohol이첨가된 Ehrlich's diazo reagent와반응하는 bilirubin을발견. bilirubin이촉진제첨가없이도디아조시약과 Bilirubin 측정법 (page928) 혈청내빌리루빈은 van den Berg 및 snapper에의해처음으로증명 alcohol이첨가된 Ehrlich's diazo reagent와반응하는 bilirubin을발견. bilirubin이촉진제첨가없이도디아조시약과반응하면직접빌리루빈이라고하고메탄올과카페인같은반응촉진제를사용하는것을간접빌리루빈이라한다. 촉진제를사용하여측정된빌리루빈이총빌리루빈이되고총빌리루빈농도에서촉진제를사용하지않고측정된직접빌리루빈농도를뺀것이간접빌리루빈의농도이다.