화장품독성시험동물대체시험법가이드라인 (Ⅷ) 독성평가연구부특수독성과

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도경 부
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2 지침서 ᆞ 안내서제 ᆞ 개정점검표 명칭화장품독성시험동물대체시험법가이드라인 (Ⅷ) ( 민원인안내서 ) 아래에해당하는사항에체크하여주시기바랍니다. 이미등록된지침서ㆍ안내서중동일ㆍ유사한내용의 지침서ㆍ안내서가있습니까? 예 아니오 등록대상 여부 상기질문에 예 라고답하신경우기존의지침서ㆍ안내서의개정을우선적 으로고려하시기바랍니다. 그럼에도불구하고동지침서ㆍ안내서의제정이 필요한경우그사유를아래에기재해주시기바랍니다. ( 사유 : ) 법령 ( 법ㆍ시행령ㆍ시행규칙 ) 또는 행정규칙 ( 고시ㆍ훈령ㆍ예규 ) 의내용을단순편집또는 나열한것입니까? 단순한사실을대외적으로알리는공고의내용입니까? 1 년이내한시적적용또는일회성지시ㆍ명령에해당하는내용입니까? 외국규정을번역하거나설명하는내용입니까? 신규직원교육을위해법령또는행정규칙을알기쉽게정리한자료입니까? 예 아니오 예 아니오 예 아니오 예 아니오 예 아니오 상기사항중어느하나라도 예 에해당되는경우에지침서ㆍ안내서등록대상이아닙니다. 지침서ㆍ안내서제ㆍ개정절차를적용하실필요는없습니다. 지침서ㆍ안내서 구분 내부적으로행정사무의통일을기하기위하여반복적으로행정사무의세부기준이나절차를제시하는것입니까? ( 공무원용 ) 대내외적으로법령또는고시ㆍ훈령ㆍ예규등을알기쉽게풀어서설명하거나특정한사안에대하여식품의약품안전처의입장을기술하는것입니까? ( 민원인용 ) 예 ( 지침서 ) 아니오 예 ( 안내서 ) 아니오 기타확인 사항 상위법령을일탈하여새로운규제를신설ㆍ강화하거나민원인을구속하는내용이있습니까? 예 아니오 상기질문에 예 라고답하신경우상위법령일탈내용을삭제하시고지침서ㆍ 안내서제ㆍ개정절차를진행하시기바랍니다. 상기사항에대하여확인하였음 년 5 월 31 일 담당자확인 ( 부서장 ) 고경육 이종권

3 이안내서는화장품독성시험동물대체시험법가이드라인 (Ⅷ) 에대하여 알기쉽게설명하거나식품의약품안전처의입장을기술한것입니다. 본안내서는대외적으로법적효력을가지는것이아니므로본문의기술방식 ( 하여야한다 등 ) 에도불구하고민원인여러분께서반드시준수하셔야하는사항이아님을알려드립니다. 또한, 본안내서는 2016 년 5월 17일현재의과학적ㆍ기술적사실및유효한법규를토대로작성되었으므로이후최신개정법규내용및구체적인사실관계등에따라달리적용될수있음을알려드립니다. 민원인안내서 란대내외적으로법령또는고시ㆍ훈령ㆍ예규등을알기쉽게풀어서설명하거나특정한사안에대하여식품의약품안전처의입장을기술하는것 ( 식품의약품안전처지침서등의관리에관한규정제 2 조 ) 본안내서에대한의견이나문의사항이있을경우식품의약품안전평가원독성평가연구부특수독성과에문의하시기바랍니다. 전화번호 : 팩스번호 :

4 제 개정이력

5 목 차 I. 개요 1 II. 유의사항 2 III. 시험의원칙 4 IV. 시험절차 5 V. 자료와보고 9 VI. 결과보고서 12 VII. 용어정의 15 VIII. 참고문헌 18 부록 1. 시험법숙련을위한시험물질 21 부록 2. 분석순서의예 23

6 I. 개요 1. UN GHS(United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals) 의정의에따르면피부감작물질은피부에접촉하여알레르기반응을일으키는물질을말한다 (1). 본가이드라인은 UN GHS 기준에따라피부감작물질과비감작물질을구별하는데사용되는 in chemico 시험법 ( 펩타이드반응성시험법, Direct Peptide Reactivity Assay, DPRA) 을설명한다 (1). 2. 피부감작에관여하는주요생물학적현상들이알려져있다. 피부감작과관련된화학적 / 생물학적기전들에대한기존지식들은독성발현경로 (Adverse Outcome Pathway, AOP) 의형식으로요약하여설명될수있다 (2). 독성발현경로는피부감작의시작단계에서중간단계를거쳐유해효과, 즉사람에서는접촉성피부염, 설치류에서는접촉성과민반응을일으키는과정으로이루어진다. 피부감작독성발현경로에있어서의분자수준의시작단계는피부단백질의친핵성중심에친전자성물질이공유결합하는것이다. 3. 피부감작성의평가는일반적으로실험동물을이용한다. 기니픽을이용한전통적인방식인 Magnusson Kligman Guinea Pig Maximization Test(GMPT) 와 Buehler Test OECD TG 406 (3) 방법은피부감작의유도기와유발기모두감안한시험법이다. 설치류를이용한시험법인 Local Lymph Node Assay(LLNA, OECD TG 429 (4) ) 및 LLNA의비방사성변형법인 LLNA: DA(OECD TG 442A (5) ) 와 LLNA: BrdU-ELISA(OECD TG 442B (6) ) 방법들은모두유도기의반응만을반영한시험법이다. 이방법들은동물복지차원에서기니픽시험법보다이점이있고, 유도기의피부감작능을객관적으로측정할수있기때문에피부감작성시험법으로인정되었다. 4. 최근에는화합물질의피부감작유해성평가에있어서메커니즘에근거한 in chemico와 in vitro 시험법이과학적으로타당하다고여겨지고있다. 그러나현재사용가능한각각의비동물시험법들이독성발현경로메커니즘을제한적으로충족시키기때문에, 현재사용되고있는동물을이용한시험법을완전히대체하기위해서는비동물시험법들 (in silico, in chemico, in vitro) 을조합하는통합독성평가 (Integrated Approach to Testing and Assessment, IATA) 가필요하다 (2)(7)

7 5. DPRA는피부감작독성발현경로에서분자적초기현상, 즉단백질의반응성을평가하는것으로, 이는시스테인또는리신을함유한합성펩타이드모델에대한시험물질의반응성을정량화한다 (8). 합성펩타이드내시스테인과리신소실율은피부감작성과비감작성을구별하기위한 4가지등급의반응성으로분류하는데사용된다 (9). 6. DPRA 는화합물의유해성분류와표시의목적으로피부감작성과비감작성을 구별하기위하여통합독성평가의일부로서사용된다 (10). 또한다른정보와조합할 목적으로 DPRA 데이터를이용한다 (11)(12)(13)(14). 7. 본가이드라인에서사용된용어의정의는 VII 항에기술되어있다. II. 유의사항 1. 단백질반응성과피부감작성의잠재력에대한상관관계는잘알려져있다 (15)(16)(17). 그럼에도불구하고단백질결합은피부감작독성발현경로의분자적초기단계로서단지하나의주요한단계 (key event) 에지나지않기때문에시험또는비시험방법으로생성된단백질반응성에대한정보만으로는어떤화합물이피부감작성이없다고결론을내리기어렵다. 그러므로본가이드라인으로부터얻어진데이터는다른보완적인정보들 ( 예를들어, 피부감작독성발현경로의다른주요한단계들을대변할수있는 in vitro 시험법들과유사한화학물질과의교차해석을포함한비시험법으로부터유래된정보들 ) 과조합하여통합독성평가와같은통합적인맥락에서다뤄져야한다. 2. 본가이드라인에서설명한시험방법은다른보완적인정보들과조합하여통합독성평가접근방식으로피부감작성 (UN GHS Category 1) 과비감작성을구별하는데사용할수있다. 2개의분류기준으로운영하는국가의경우, 본가이드라인만으로피부감작성을 UN GHS (1) Category 1A와 1B로분류할수없으며, 또한안전성평가를위한예측에사용될수없다. 그러나규제에따라 DPRA 양성결과를근거로화학물질을 UN GHS Category 1로분류할수있다. 3. DPRA 는액체크로마토그래프법 (High-performance liquid chromatography, HPLC) 을 운용하는실험실에서시행할수있다. 이시험법은실험실내재현성이 85%, 실험실 간재현성이 80% 로알려져있다 (10). 이시험법의검증연구 (18) 와보고된연구 - 2 -

8 결과 (19) 에의하면, LLNA 결과를기준하였을때, 비감작으로부터감작 (UN GHS Category 1) 을구별해내는정확도가 80%(N=157) 이며, 80% 의민감도 (88/109) 와 77% 의특이도 (37/48) 를갖는다. DPRA는피부감작능이낮거나중간수준을나타내는화학물질인경우 (UN GHS Category 1B) 피부감작능을강하게나타내는화학물질 (UN GHS Category 1A) 에비해피부감작능이실제보다낮게측정될수있다 (18)(19). 그러나여기에서제시된독립적시험법 (Stand-alone) 으로서 DPRA의정확도값은단순한지표일뿐이다. 왜냐하면이시험법은통합독성평가의맥락에서다른시험법의결과와조합을고려해야하며, 위 II-2 항에제시된항목과도일치되어야하기때문이다. 또한피부감작평가를위해비동물시험법을활용할때, LLNA 시험법뿐만아니라다른동물시험법도인간의상황을완벽하게반영하지못함을염두에두어야한다. 보고된연구결과에따르면 DPRA는다양한유기작용기, 반응메카니즘, 피부감작능 (in vivo 연구에서결정된바와같이 ) 및이화학적성질을가진시험물질들에적용할수있다 (8)(9)(10)(19). 이것은 DPRA가피부감작유해성을판정하는데유용하게이용될수있다는것을의미한다. 4. 본가이드라인에서 시험물질 은시험대상을나타내며이용어는화합물 (substances) 또는혼합물 (mixtures) 에있어서 DPRA의적용에사용할수없다. 또한금속화합물은공유결합이아닌다른메커니즘으로단백질들과반응하는것으로알려져있기때문에본시험법을적용할수없다. 시험물질은적당한용매에녹여최종농도가 100 mm이되어야한다 (IV-3 항참조 ). 그러나이농도에서녹지않는시험물질인경우녹을수있는낮은농도에서시험할수있다. 이경우, 양성결과는피부감작으로시험물질을식별하는데이용할수있지만음성결과로부터반응성이없다는결론을내릴수없다. 조성이알려진혼합물에대한 DPRA의사용도제한적이다 (18)(19). 그럼에도불구하고 DPRA는다성분물질과구성이알려진혼합물의시험에기술적으로적용할수있는것으로여겨진다 (IV-3 항참조 ). 이시험법이규제목적을위해혼합물의피부감작능을평가하는경우, 이시험법이그목적에적합한지, 적합한경우에는시험법에대한적절한이유는무엇인지를고려해야한다. 이러한고려사항은이미혼합물을시험하는규제요건이있을때는필요하지않다. 현재의예측모델은시험물질과펩타이드간의몰비율이필요하기때문에조성이알려져있지않은혼합물과조성이알려져있지않거나다양한조성을가진화합물, 복잡한반응산물및생물학적물질 (UVCB) 에는사용할수없다. 이와같은물질들은중량을기반으로하는새로운예측모델을만들어야 - 3 -

9 한다. 기타특정한범주의화합물에대하여본가이드라인을적용할수없다는 사례가있는경우특정화합물에이시험법을사용하지말아야한다. 5. 본가이드라인은 in chemico 방법으로, 대사시스템을전체적으로총망라하는것은아니다. 피부감작성을나타내기위하여효소에의한활성단계를거쳐야하는화학물질 (pro-haptens) 들은이시험법으로측정할수없다. 비생물학적변형을거쳐피부감작성을나타내는화학물질 (pre-haptens) 은일부의경우에이시험법으로정확하게측정할수있다고보고된다 (18). 위에서언급한바와같이이시험법에서얻어진음성결과는설명되었던시험법의한계와통합독성평가의맥락에서다른시험법의정보와연관되어해석되어야한다. 펩타이드에공유결합을하지않지만펩타이드의산화를촉진하는 ( 예, 시스테인이합체화 ) 시험물질인경우펩타이드소실이실제보다과대평가될수있고, 그결과시험물질은위양성으로예측되거나높은반응성을나타내는그룹으로분류될가능성이있다 (V-3 항참조 ). 6. 위에서설명한바와같이, DPRA는피부감작성과비감작성을구분하는데사용될수있다. 또한통합독성평가와같은통합적접근법에사용되어질때피부감작능 (sensitising potency) (11) 을평가하는데기여하게될것이다. 그러나 DPRA 결과가어떻게피부감작능을평가하는데관련되는지를파악하기위해서는더많은연구 ( 특히, 인체데이터에바탕을둔연구 ) 가요구된다. III. 시험법의원칙 1. DPRA는 25 ± 2.5 에서시험물질을 24 시간반응시킨다음시스테인또는리신함유펩타이드농도를정량하는 in chemico 방법이다. 이합성펩타이드들은검출을돕기위해페닐알라닌을함유한다. 펩타이드농도는 HPLC에서구배용출 (gradient elution) 로 220 nm에서흡광도를측정하여결정된다. 시스테인또는리신펩타이드의소실율이산출되고, 예측모델에사용된다 (V-3 항, 표 1 참조 ). 이예측모델에서시험물질은감작성인지혹은비감작성인지구별하기위한 4개의반응성분류중하나에해당하게된다. 2. 본가이드라인에서설명한방법을일상적으로사용하기전에실험실은부록 1 에 수록된 10 개의숙련도시험물질을이용하여기술적숙련도를입증하여야한다

10 IV. 시험절차 1. 본가이드라인은 DPRA DB-ALM 프로토콜 n 154 (20) 에바탕을두고있다. 다음은 DPRA의주요구성과방법들에대하여설명이다. 만약적용하고자하는 HPLC 분석방법이 DB-ALM 프로토콜에설명하고있는검증된아세토니트릴분석방법과다르다면그방법이동등하다는것을증명하여야한다.( 예, 부록 1의시험물질을이용한숙련도검사 ). 2. 시스테인 - 또는리신 - 함유펩타이드의제조 순도가 85% 이상 ( 되도록 90-95% 의범위 ) 의시스테인 (Ac-RFAACAA-COOH) 또는리신 (Ac-RFAAKAA-COOH) 함유합성펩타이드의용액은시험물질과반응시키기직전조제한다. 시스테인펩타이드의최종농도는 ph 7.5의인산완충액에서 mm이며리신펩타이드의최종농도는 ph 10.2의암모늄아세테이트완충액에서 mm이어야한다. 한번의아세토니트릴분석시간은 30시간이내가되도록조정한다. 본가이드라인의아세토니트릴분석으로최대 26개의분석시료 ( 이것은시험물질, 양성대조군, 시험에사용된각각의용매수에근거한용매대조군이며, 각각 3회반복씩감안한것임 ) 가한번의분석배치에서처리될수있다. 동일한아세토니트릴분석배치에사용하는모든샘플시료는동일한시스테인또는리신펩타이드용액을사용하여야한다. 이용액을사용하기전, 각펩타이드배치의용해도가적절하다는것을증명하여야한다. 3. 시험물질의제조 분석하기전 DPRA DB-ALM 프로토콜 (20) 에따라서적절한용매에시험물질의용해도를측정해야한다. 그리고적절한용매는시험물질을완전히녹여야한다. DPRA에있어서시험물질을과량의시스테인또는리신펩타이드와반응시키기때문에맑은용액형성여부를육안으로관찰하는것은시험물질 ( 다성분으로이루어진화합물또는혼합물을시험하는경우에있어서모든구성성분들 ) 이용해되었는지를확인하는충분한방법이다. 이시험법에있어서는아세토니트릴 (acetonitrile), 물, 물과아세토니트릴이 1:1 비율로섞인용액, 이소프로판올 (isopropanol), 아세톤 (acetone), 아세톤과아세토니트릴이 1:1 비율로섞인용액들이적당한용매로사용된다

11 참고대조군 C( 적당한용매에용해된펩타이드만으로구성된시료들 ; 부록 2 참조 ) 로확인하였을때펩타이드의안정성에영향을주지않는다면다른용매도사용가능하다. 만일시험물질이이들용매중어느것에서도녹지않는다면마지막선택으로시험물질을디메칠설폭사이드 (DMSO) 300 μl에녹인다음아세토니트릴 2700 μl을넣어희석하는방법이있다. 여기에도녹지않으면 DMSO 1500 μl에녹인다음아세토니트릴 1500 μl을넣어희석한다. 시험물질을유리바이알 (vial) 에서미리무게를재고시험직전에적당한용매에녹여 100 mm 용액을만든다. 혼합물이나조성이알려지고다성분으로이루어진화합물인경우, 그물질의순도는그구성성분들 ( 물제외 ) 비율의합으로결정되어야하며, 그분자량은혼합물 ( 물제외 ) 인경우구성성분각각의분자량및비율을고려하여결정되어야한다. 계산된순도및분자량은 100 mm 용액을준비하기위해필요한시험물질의무게를계산하는데사용된다. 주요구성성분의분자량을결정할수없는중합체는단량체의분자량 ( 또는중합체를이루는다양한단량체들의분자량 ) 으로 100 mm 용액을준비할수한다. 그러나조성이알려진중합체, 다성분으로이루어진화합물, 혼합물을시험하는경우, 원화학물질 (neat chemical) 의평가를고려해야한다. 액체인경우, 용매에희석과정없이시스테인또는리신펩타이드와각각 1:10 또는 1:50으로혼합하여반응시킨원화학물질이평가되어야한다. 고체인경우시험물질은 100 mm 용액을만들때사용하는같은용매에최대로녹일수있는농도만큼녹인다. 이용액을더이상의희석과정없이시스테인또는리신펩타이드와각각 1:10 또는 1:50으로혼합하여반응시킨다. 100 mm 용액과원화학물질의결과값이같다면, 시험하여얻어진결과에대해확신할수있다. 4. 양성대조군, 참고대조군, 동시용출 (Co-elution) 대조군의제조 아세토니트릴에 100 mm 농도로녹인 cinnamic aldehyde(cas ; 95% 식용기준의순도 ) 를양성대조군으로한다. 만일허용기준을충족하는데이터가있다면되도록중간범위의소실값을갖는다른적당한양성대조군을이용할수있다. 추가적으로참고대조군들 ( 적당한용매에펩타이드만녹인시료 ) 을 HPLC 분석에포함시켜야한다. 이러한참고대조군들은 HPLC 시스템의적합성을증명하기위한참고대조군 A, 시간경과에따른안정성을증명하기 - 6 -

12 위한참고대조군 B, 시험물질을녹인용매가펩타이드소실율에영향을주지않는다는것을증명하기위한참고대조군 C가있으며 ( 부록 2 참조 ), 각물질에대한적절한참고대조군들은그물질에대한펩타이드소실율을계산하기위하여이용된다 (V-1 항참조 ). 또한시험물질의머무름시간 (retention time) 이시스테인이나리신펩타이드의머무름시간이같은지를확인하기위하여각시험물질로만구성된동시용출대조군을 HPLC 분석에포함해야한다. 5. 시험물질과시스테인또는리신펩타이드용액의반응 유리재질의자동시료주입바이알에서시험물질과시스테인또는리신펩타이드용액을각각 1:10 또는 1:50의비율로반응시킨다. 시험물질의낮은수용성때문에시험물질을펩타이드용액에첨가하고나서즉시침전물이관찰되는경우, 펩타이드와반응할수있는시험물질이용액중얼마만큼남아있는지알수없다. 이경우, 양성결과는이용할수있으나음성결과는불확실하기때문에조심스럽게해석해야한다 (100 mm 농도에서녹지않는화합물에대한 II-4 항의설명참조 ). 반응용액은 25 ± 2.5 의암실에서 24 ± 2시간동안반응시킨후 HPLC로분석한다. 시험물질은두펩타이드에대하여각각 3회반복하여분석한다. 검체는 HPLC로분석하기전에육안으로검사하여야한다. 만약침전물이나상의분리가발견되면그침전물들을가라앉히기위해원심분리한다. 과량의침전물은액체크로마토그래피의관이나칼럼을막을수있기때문에검체를낮은속도 (100~400 x g) 로원심분리하여침전물을바이알의바닥으로침전시킨다. 반응후에침전물이나상의분리가일어나면펩타이드소실이과소평가될수있고, 음성결과의경우에도반응이없다는결론은내릴수없다. 6. HPLC 표준검량곡선작성 시스테인과리신펩타이드모두에대한표준검량곡선을작성하여야한다. 펩타이드표준액은 20% 또는 25% 의아세토니트릴 : 완충액을사용하여준비한다. 완충액은시스테인펩타이드인경우인산완충액 (ph 7.5) 을, 리신펩타이드인경우는암모늄아세테이트완충액 (ph 10.2) 을사용한다. 펩타이드원액 (0.667mM) 을순차적으로희석하여 mm 범위의 6개표준액을제조한다. 희석완충액의맹검액 (blank) 도표준검량곡선에포함시켜야하며, 적절한표준검량곡선의 r 2 값은 0.99를초과하여야한다

13 7. HPLC 준비와분석 HPLC 분석을수행하기전 HPLC 시스템의적합성을증명하여야한다. 펩타이드소실은 UV 검출기 ( 광다이오드배열검출기또는 220 nm에서고정파장흡광도검출기 ) 를장착한 HPLC로분석하여정량화할수있다. 적당한칼럼을 HPLC 시스템에장착한다. 검증프로토콜에있어서 HPLC 분석은 Zorbax SB-C-18 (2.1 mm x 100 mm x 3.5 μm) 칼럼을사용하였다. 이역상 HPLC 칼럼을포함한전체시스템은샘플을분석하기전에 30 에서 50% 의이동상 A (0.1% (v/v) trifluoroacetic acid in water) 와 50% 의이동상 B (0.085% (v/v) trifluoroacetic acid in acetonitrile) 로최소 2시간동안흘려주어평형을이루도록한다. HPLC 분석은 0.35 ml/ 분의유속으로 10분동안아세토니트릴을 10% 에서 25% 까지직선구배로증가시키고, 이후아세토니트릴농도를 90% 까지급속하게증가시켜다른물질들을제거한다. 동일한부피의표준물질, 검체, 대조군을주입한다. 칼럼은주입사이에 7분동안초기조건에서재평형시킨다. 만약다른종류의역상 HPLC 칼럼을사용하는경우, 주입량 ( 사용된시스템에따라달라질수있으나, 일반적으로 3-10 μl 범위임 ) 을포함한조작조건을적절히조정하여시스테인또는리신펩타이드가적절하게용리되어그피크면적이계산될수있도록한다. 무엇보다도중요한것은, 만약다른 HPLC 분석조건을이용한다면위에서설명한검증된 HPLC 분석조건과동등하다는것을증명하여야한다 ( 예, 부록 1의숙련도시험 ). 흡광도는 220 nm에서측정하며, 만약광다이오드배열검출기를이용한다면 258 nm에서의흡광도를측정한다. 어떤아세토니트릴제품은펩타이드안정성을떨어뜨릴수있기때문에주의해야하며새로운배치의아세토니트릴을사용할때펩타이드의안정성에대해평가하여야한다. 220 nm과 258 nm에서피크면적비는동시용출을확인하는지표로사용될수있다. 각시료의피크면적비가대조군시료피크면적비의평균제곱값 (mean 2 ) 의 90%~ 100% 범위에있다면동시에용출되지않았다는좋은증거이다. 시스테인펩타이드의산화를촉진하는시험물질이있을수있다. 이합체시스테인펩타이드의피크는육안으로확인할수있다. 만약이합체화가일어나면펩타이드소실율이과대평가되어위양성으로판정되거나더높은반응성등급으로판정받는결과를초래할수있다는점을 ( 위양성판정및 / 또는더높은반응성등급으로분류될수있기때문에 ) 주의해야한다 (V-3 항참조 )

14 시스테인과리신펩타이드의 HPLC 분석은동시에수행하거나 ( 만약, 두대의 HPLC 시스템을갖추고있다면 ) 각각다른날에수행할수있다. 만약분석을다른날에한다면모든시험물질용액은시험당일분석을위해새롭게조제하여야한다. 분석시간은첫시료의주입시간이시험물질과펩타이드용액을혼합한후, 22-26시간에시작될수있도록조정해야하며, HPLC 분석시간은 30시간이내에마칠수있도록조정해야한다. 검증연구와본가이드라인에서사용한 HPLC 분석조건은한대의 HPLC를이용하는경우한번에 26개샘플까지처리할수있다 (IV-2 항참조 ). HPLC 분석순서의예는부록 2에수록하였다. V. 자료와보고 1. 데이터판정 시스테인또는리신펩타이드의농도는각검체를 220 nm의파장에서광도계로측정하여적당한피크의면적 ( 곡선하면적, area under the curve: AUC) 을측정한후, 표준액으로부터얻어진표준검량곡선에대입하여계산할수있다. 펩타이드소실율은각검체에서피크면적을구하고이것을참고대조군 C 의 평균피크면적으로나눈값으로결정한다 ( 부록 2 참조 ). 구하는식은다음과 같다. 펩티드소실백분율 검체의펩티드피크면적 참고대조군 의펩티드피크면적평균 2. 허용기준 HPLC 분석의유효성을얻기위해서다음의기준을충족시켜야한다 : a) 표준검량곡선에서 r 2 > 0.99이어야한다, b) 양성대조군 cinnamic aldehyde의 3회반복펩타이드평균소실율은시스테인펩타이드인경우 % 범위의값, 리신펩타이드인경우는 % 범위의값을나태내야하며, - 9 -

15 양성대조군반복시료들의최대표준편차가시스테인소실율에서는 14.9% 이하, 리신소실율에서는 11.6% 이하로나타나야한다. c) 참고대조군 A의펩타이드농도평균이 0.50 ± 0.05 mm이어야하고, 9개의참고대조군 B와 C의펩타이드피크의변동계수 (coefficient of variation: CV) 는 15.0% 이하이어야한다. 만약이기준중하나라도충족시키지못하면 HPLC 분석은다시실시하여야한다. 시험물질의결과가유효성이있기위해서는다음의기준을충족시켜야한다 : a) 시험물질반복시료들의최대표준편차는시스테인소실율에서는 14.9% 이하, 리신소실율에서는 11.6% 이하이어야하며, b) 적당한용매에서 3 개의참고대조군 C의펩타이드농도평균은 0.50 ± 0.05 mm이어야한다. 만약이기준들을충족시키지못하면데이터는기각하고그시험물질에대한 HPLC 분석을다시수행하여야한다. 3. 예측모델 각각의시험물질에대하여시스테인소실과리신소실의평균값을구한다. 평균소실값을계산했을때, 음수이면 0 으로간주한다. 표 1에서제시된시스테인 1:10/ 리신 1:50 예측모델을사용함에있어서, 기준점 6.38% 의평균펩타이드소실에대한역치는통합독성평가맥락에서피부감작물질과비감작물질을구별하기위해사용된다. ( 즉, 시험물질의반응등급을결정하기위한예측모델은통합독성평가맥락에서감작능을평가하는데유용하다.) 표 1: 시스테인 1:10/ 리신 1:50 예측모델 1 시스테인과리신소실 % 평균 반응성등급 DPRA 예측 2 0% 소실 % 평균 6.38% 무반응성또는최소반응성 음성 6.38% < 소실 % 평균 22.62% 저반응성 22.62% < 소실 % 평균 42.47% 중반응성 양성 42.47% < 소실 % 평균 100% 고반응성 어떤시험물질 ( 단일화합물, 단일또는여러가지성분들로구성된다성분

16 화합물, 또는혼합물 ) 이 220 nm에서상당한흡광도를나타내고펩타이드와동일한머무름시간을보일수있다 ( 동시용출 ). 이러한동시용출은시험물질과펩타이드의용출시간을분리하기위하여 HPLC 분석조건을약간조정함으로써해소할수있다. 만약동시용출을해소하기위하여다른 HPLC 분석조건을사용한다면검증된분석조건과동등하다는것을증명하여야한다 ( 예, 부록 1의숙련도시험 ). 만약동시용출이일어나면펩타이드피크의면적을구할수없고펩타이드소실율도계산할수없다. 시스테인과리신펩타이드에서모두동시용출되는경우분석결과는 미결 로보고한다. 리신펩타이드에서만동시용출이일어나면표 2에서와같이시스테인 1:10 예측모델을이용할수있다. 표 2: 시스테인 1:10 예측모델 1 시스테인소실 % 반응성등급 DPRA 예측 2 0% 시스테인소실 % 13.89% 무반응성또는 최소반응성 음성 13.89% < 시스테인소실 % 23.09% 저반응성 23.09% < 시스테인소실 % 98.24% 중반응성 양성 98.24% < 시스테인소실 % 100% 고반응성 시험물질과두개의펩타이드중하나가겹치는현상이불완전한경우도있을 수있다. 이경우펩타이드소실율은시스테인 1:10, 리신 1:50 예측모델을 이용하여추정될수있지만, 시험물질의반응성등급은정확히분류할수없다. 시험결과가명백하다면시스테인과리신펩타이드에대한한번의 HPLC 분석으로충분하다. 그러나결과가양성과음성을구분하는기준점에가까이있을때에는 ( 즉, 경계결과 ) 추가적인시험이필요하다. 만약시스테인 1:10/ 리신 1:50 예측모델에서소실율평균이 3-10% 범위이거나시스테인 1:10 예측모델에서시스테인소실율이 9-17% 범위에있다면 2차시험을고려해야한다. 또한, 두번의시험에서서로불일치한결과가나오면 3차시험을고려해야한다

17 VI. 결과보고서 결과보고서는다음의정보를포함하여야한다. 시험물질 l 단일성분화합물 - IUPAC 또는 CAS 명칭, CAS 번호, SMILES 또는 InChI 코드, 구조식및 / 또는다른식별요인등과같은화학적특징 - 물리적성상, 용해도, 분자량, 기타물리화학적성질 - 순도, 불순물의종류 - 시험전처리방법 ( 예, 가온, 분쇄 ) - 시험농도 - 보관조건과안정성 l 다성분화합물, UVCB, 혼합물 - 특징 : 성분들의화학적특징, 순도, 함량, 물리화학적성질 - 물리적성상, 용해도, 기타물리화학적성질 - 분자량, 또는겉보기분자량 ( 조성이알려지거나다른관련정보들이알려진혼합물 / 중합체의경우 ) - 시험전처리방법 ( 예, 가온, 분쇄 ) - 시험농도 - 보관조건과안정성 대조군 l 양성대조군 - IUPAC 또는 CAS 명칭, CAS 번호, SMILES 또는 InChI 코드, 구조식 - 물리적성상, 용해도, 분자량, 기타물리화학적성질 - 순도, 불순물의종류 - 시험전처리방법 ( 예, 가온, 분쇄 ) - 시험농도 - 보관조건과안정성 - 가능하다면, 판정기준의적합성을설명할만한양성대조군결과에대한참고문헌

18 l 용매 / 부형제 - 사용된용매 / 부형제및그성분들의비율 - IUPAC 또는 CAS 명칭, CAS 번호등과같은화학적특징 - 순도, 불순물의종류 - 가이드라인에서제시되지않은용매 / 부형제를사용하였을경우이들의물리적성상, 분자량, 기타물리화학적성질 - 보관조건과안정성 - 용매선택의근거 ( 각각의시험물질에대한용매선정의근거 ) - 아세토니트릴의경우, 펩타이드안정성에미치는영향에대한시험결과 펩타이드, 양성대조군, 시험물질의제조 - 펩타이드용액의특징 ( 공급자, 로트, 펩타이드의정확한무게, stock 용액에첨가된양 ) - 양성대조군의용액의특징 ( 양성대조군물질의정확한무게, 시험용액에첨가된양 ) - 시험물질용액의특징 ( 시험물질의정확한무게, 시험용액에첨가된양 ) HPLC 기기및분석조건 - HPLC 기기및칼럼, 가드칼럼, 검출기및자동시료주입기의종류 - HPLC 분석과관련한지표 : 칼럼온도, 주입량, 유속, 구배 시스템적합성 - 표준물질과참고대조군 A 시료의 220 nm에서펩타이드피크면적 - 직선표준검량곡선을그림으로제시하고 r 2 표시 - 각각의참고대조군 A의펩타이드농도 - 3 개의참고대조군 A 시료의펩타이드농도 ( 의 ) 평균 (mm), 표준편차, 변동계수 - 참고대조군 A와 C의펩타이드농도 분석순서 l 참고대조군 - 참고대조군 B와 C의 220 nm에서펩타이드피크면적 - 아세토니트릴에녹인 9 개의참고대조군 B와 C의펩타이드피크면적평균, 표준편차, 변동계수 ( 분석기간동안안정성확인을위한참고대조군 ) - 각각의사용한용매에대해서는 3 개의참고대조군 C의 220 nm에서

19 펩타이드피크면적평균 ( 펩타이드소실율계산목적 ) - 사용한용매별 3 개의적당한참고대조군 C의펩타이드농도 (mm) - 사용한용매별 3 개의적당한참고대조군 C의펩타이드농도 (mm) 평균, 표준편차, 변동계수 l 양성대조군 - 각양성대조군시료의 220 nm에서펩타이드피크면적 - 각양성대조군시료의펩타이드소실율 - 3 개의양성대조군시료의펩타이드소실율평균, 표준편차, 변동계수 l 각각의시험물질 - 반응후반응액에서침전물의형성여부. 침전물의재용해또는원심분리여부 - 동시용출여부 - 기타특이사항의설명 - 각시험물질의 220 nm에서펩타이드피크면적 - 각시험물질의펩타이드소실율 - 3개의시험물질의펩타이드소실율평균, 표준편차, 변동계수 - 시스테인과리신소실율의평균 - 사용된예측모델과 DPRA 예측 숙련도시험 - 해당되는경우, 실험실에서시험법의숙련도시험과정 ( 예, 숙련도를위한 시험물질을이용 ) 또는시험법의재현성확보과정제시 고찰 - DPRA 시험결과의고찰 - 다른관련있는정보가있다면 ( 기타관련정보가있는경우,) 통합독성평가의맥락에서본시험법결과의고찰 결론

20 VII. 용어정의 1. 정확도 (Accuracy) : 시험결과와참고치의일치정도. 시험수행에대한평가 척도이고상관성 (relevance) 의한측면이다. 정확하게맞춘시험결과의비율을 의미하는 일치성 (concordance)" 과 " 정확도 (Accuracy)" 는같은의미로쓰임 (21) 2. 독성발현경로 (AOP, Adverse Outcome Pathway) : 분자수준의시작단계를 거쳐서 in vivo 유해반응까지표적화합물또는유사한화합물그룹으로부터 일어나는일련의사건 (2) 3. 표준검량곡선 (Calibration curve, standard curve) : 알려진물질의분석 농도와시험반응값과의관계 4. 변동계수 (Coefficient of variation) : 동일반복시료로부터얻은데이터의 변동성을나타내며표준편차를평균으로나눈값. 100 을곱하여백분율로 나타냄 5. 유해성 (Hazard) : 물질이생명체, 생태계또는특정인구집단에노출될때, 유해영향을야기할가능성이있는물질또는상황 (situation) 의본질적특성 6. 통합독성평가 (IATA, Integrated Approach to Testing and Assessment) : 화학물질또는화학그룹의유해성동정 ( 잠재력 ), 유해성특성 ( 효력 ) 및 / 또는안전성평가 ( 잠재력 / 효력, 노출 ) 를위하여사용되는구조적접근방법. 유해성잠재력및 / 또는위험성및 / 또는심화추적필요성에관한규제결정을위하여모든관련데이터를전략적으로통합하고경중을가림으로써최소한의시험만수행하도록함 7. 분자적초기현상 (Molecular Initiating Event) : 독성발현경로의시작단계로서 분자수준에서화학물질에의해유도되는생물계의변화 8. 혼합물 (Mixture) : 서로반응하지않는두가지이상의화학물질로구성된 혼합물질또는용액 (1) 9. 단일성분화합물 (Mono-constituent substance) : 정량적인구성에의해 정의되어지며, 하나의주요성분이적어도 80% (w/w) 이상인물질

21 10. 다성분화합물 (Multi-constituent substance) : 두가지이상의주요성분의양이 10% (w/w) 및 < 80% (w/w) 인물질. 다성분물질은생산과정의산물이다. 혼합물과다성분물질의차이는혼합물은두가지이상의물질을화학반응없이섞어서얻고, 다성분물질은화학반응의산물임 11. 양성대조군 (Positive control) : 시험계의모든구성요소를포함하고양성반응을유도한다고알려진물질을처리한군. 시간에따른양성대조군반응의변동성을평가할수있다는확신을갖기위하여양성반응의범위가초과해서는안됨 12. 참고대조군 (Reference control) : 한시험계의모든구성요소를포함하면서아무런처리를하지않는시험물질. 시험물질을처리하기위해사용된용매또는부형제및동일한용매또는부형제로녹인시험물질로처리한시료의기본반응 (baseline response) 을정하기위해사용된다른대조군샘플. 음성대조군과함께시험될때, 참고대조군는용매또는부형제가시험계와상호작용하는지보여줌 13. 상관성 (Relevance) : 시험과관심효과의관련성및시험이특정목적에의미있고유용한지에대한설명. 상관성은시험이얼마나관심생물학적효과를정확하게측정하고예측하는지나타내며, 상관성은시험법의정확도 ( 일치성 ) 를 내포함 (21) 14. 신뢰도 (Reliability) : 동일한시험방법에따라반복시행하였을때동일 실험실과다른실험실에서시험결과를재현할수있는정도. 신뢰도는실험실 내, 실험실간재현성 (reproducibility) 으로평가됨 (21). 15. 재현성 (Reproducibility) : 동일한방법으로동일한물질을시험하였을때 나온결과의일치 ( 신뢰도참조 ) (21) 16. 민감도 (Sensitivity) : 시험법으로모든양성 / 활성물질이정확하게분류되는 비율. 민감도는시험법의범주결정에대한정확도의척도이며시험법의 상관성을평가하는중요한고려사항임 (21) 17. 특이도 (Specificity) : 시험법으로모든음성 / 비활성물질이정확하게분류되는

22 비율. 특이도는시험법의범주결정에대한정확도의척도이며시험법의 상관성을평가하는중요한고려사항임 (21) 18. 화합물 (Substance) : 생산과정을통해얻어지거나또는자연상태로얻어진화학원소들 (elements) 과이들로이루어진구성물질 (compound). 생산품의안정성을유지시키는데필요한첨가제와생산과정에서유래하는불순물을포함한다. 그러나해당물질의안정성이나조성의변화에영향을주지않고분리될수있는용매는제외함 (1) 19. 시스템적합성 (System suitability) : 분석배치를운전하기전에표준물질을 분석하여기기성능 ( 예, 민감도 ) 을판정 (22) 20. 시험물질 (Test chemical) : 시험할때무엇을사용하였는지언급할때 사용됨 21. UN GHS (United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals) : 물리적, 보건적, 환경적유해성의수준및표준화된유형에따른화학물질 ( 물질또는복합화합물 ) 의분류체계로, pictogram, 표시방법, 유해사항, 사전주의사항, 안전정보지등의소통방식을통해화학물질의유해정보를전달하여, 사람 ( 고용주, 근로자, 운송자, 소비자, 응급처치자등 ) 과환경을보호하고자제시된체계 (1) 22. UVCB (Substances of unknown or variable composition, complex reaction products or biological materials) : 조성이알려져있지않거나 다양한조성으로이루어진화합물, 복잡한반응산물, 또는생물학적물질 23. 검증된시험법 (Validated test method) : 특정한목적에대한상관성과 신뢰도를충족시키고과학적으로입증된원리에근거한시험법. 절대적으로 완벽하게검증된시험법은없지만특정한목적과관련됨 (21)

23 VIII. 참고문헌 1. United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Fifth revised edition, UN New York and Geneva, Available at: 2. OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. Series on Testing and Assessment No. 168, OECD, Paris. 3. OECD (1992). Skin Sensitisation. OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 406, Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. Available at: 4. OECD (2010), The Local Lymph Node Assay. OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 429, Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. Available at : 5. OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay: DA. OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 442A, Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. Available at: 6. OECD (2010), Skin Sensitisation: BrdU-ELISA: DA. OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 442B, Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. Available at: 7. Adler et al. (2011). Alternative (non-animal) methods for cosmetics testing: current status and future prospects Archives of Toxicology 85:

24 8. Gerberick et al. (2004). Development of a peptide reactivity assay for screening contact allergens. Toxicological Sciences 81: Gerberick et al. (2007). Quantification of chemical peptide reactivity for screening contact allergens: A classification tree model approach. Toxicological Sciences 97: EC EURL-ECVAM (2013). Recommendation on the Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) for skin sensitisation testing. Available at: ons/eurl-ecvam-recommendation-on-the-direct-peptide-reactivity-assay dpra. 11. Jaworska et al. (2013). Bayesian integrated testing strategy to assess skin sensitization potency: from theory to practice Journal of Applied Toxicology, published online, 14 May 2013, DOI: /jat Bauch et al. (2012). Putting the parts together: combining in vitro methods to test for skin sensitizing potential. Regulatory Toxicology and Pharmacology 63: Nukada et al. (2013). Data integration of non-animal tests for the development of a test battery to predict the skin sensitizing potential and potency of chemicals. Toxicology In Vitro 27: Ball et al (2011). Evaluating the sensitization potential of surfactants: integrating data from the local lymph node assay, guinea pig maximization test, and in vitro methods in a weight-of evidence approach. Regulatory Toxicology and Pharmacology 60: Landsteiner and Jacobs (1936). Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds. Journal of Experimental Medicine 64: Dupuis and Benezra (1982). Allergic contact dermatitis to simple

25 chemicals: a molecular approach. New York & Basel: Marcel Dekker Inc. 17. Lepoittevin et al. (1998). Allergic contact dermatitis: the molecular basis. Springer, Berlin. 18. EC EURL ECVAM (2012). Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) Validation Study Report 74pp. Accessible at : eurl-ecvam-recommendation-on-the-direct-peptide-reactivity-assay-dpra 19. Natsch et al. (2013). A dataset on 145 chemicals tested in alternative assays for skin sensitization undergoing prevalidation. Journal of Applied Toxicology, published online, 9 April 2013, DOI: /jat DB-ALM (INVITTOX) Protocol 154: Direct Peptide Reactivity assay (DPRA) for skin sensitisation testing 17pp. Accessible at: OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. OECD Series on Testing and Assessment, No. 34. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris, France. 22. FDA (Food and Drug Administration (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation 22pp. Accessible at: guidance/ucm pdf ECETOC (2003). Contact sensitization: Classification according to potency. European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals (Technical Report No. 87)

26 부록 1. 시험법숙련을위한시험물질 In Chemico 피부감작시험법 : 펩타이드반응성시험법 (Direct Peptide Reactivity Assay, DPRA) 본시험법가이드라인에따라 DPRA를시작하기에앞서표 1의 10개물질에대하여 DPRA 예측을정확하게판정하는지또한시스테인과리신소실율이 10개의숙련도시험물질중 8개의물질에서표1에제시된참고범위안에들어오는지파악하여숙련도를입증하여야한다. 이러한숙련도물질들은피부감작유해성의전체범위를나타낼수있도록선정된것이다. 또한상업적으로구입가능한것, 고품질의 in vivo 참고데이터와 DPRA로얻은 in vitro 데이터가있는것, EURL ECVAM 검증연구에서이시험법의성공적인수행을설명하기위해참여실험실에서사용되었던것등이선정시고려한것이다

27 표 1: DPRA 시험법숙련을위한시험물질 숙련도물질 CASRN 성상 In vivo 예측력 1 DPRA 예측력 2 시스테인펩타이드소실율범위 (%) 리신펩타이드소실율범위 (%) 2,4-Dinitrochlorobenzene 고체 Oxazolone 고체 Formaldehyde 액체 Benzylideneacetone 고체 Farnesal 액체 2,3-Butanedione 액체 고도강감작 (extreme) 고도강감작 (extreme) 강감작 (strong) 중감작 (moderate) 약감작 (weak) 약감작 (weak) 양성 양성 양성 양성 양성 양성 Butanol 액체비감작음성 Methylcoumarin 고체비감작음성 Lactic Acid 액체비감작음성 Methoxyacetophenone 고체비감작음성

28 부록 2. 분석순서의예 검량표준액과참고대조군동시용출대조군참고대조군들첫번째반복시험두번째반복시험세번째반복시험참고대조군들 표준액 1 표준액 2 표준액 3 표준액 4 표준액 5 표준액 6 희석에사용된완충액참고대조군 A, 1 회참고대조군 A, 2 회참고대조군 A, 3 회 시험물질 1 에대한동시용출대조군 시험물질 2 에대한동시용출대조군 참고대조군 B, 1 회 참고대조군 B, 2 회 참고대조군 B, 3 회 참고대조군 C, 1 회 Cinnamic aldehyde, 1 회시험물질 1, 1 회시험물질 2, 1 회 참고대조군 C, 2 회 Cinnamic aldehyde, 2 회시험물질 1, 2 회시험물질 2, 2 회 참고대조군 C, 3 회 Cinnamic aldehyde, 3 회시험물질 1, 3 회시험물질 2, 3 회 참고대조군 B, 4 회참고대조군 B, 5 회참고대조군 B, 6 회

29 발행일 발행처 2016 월 5 월 식품의약품안전처식품의약품안전평가원바이오생약심사부화장품심사과 편집위원이윤제, 이정표, 김정근, 김도정, 김선희, 권경진, 이주연, 조미란, 박소영 ( 화장품심사과 ) 손수정, 김태성, 김주환, 고경육, 이정선, 안일영 ( 특수독성과 )

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화장품독성시험동물대체시험법가이드라인 (I) 독성평가연구부특수독성과 화장품독성시험동물대체시험법가이드라인 (I) 2007. 11. 독성평가연구부특수독성과 지침서 ᆞ 안내서제 ᆞ 개정점검표 명칭화장품독성시험동물대체시험법가이드라인 (I) ( 민원인안내서 ) 아래에해당하는사항에체크하여주시기바랍니다. 이미등록된지침서ㆍ안내서중동일ㆍ유사한내용의 지침서ㆍ안내서가있습니까? 예 아니오 등록대상 여부 상기질문에 예 라고답하신경우기존의지침서ㆍ안내서의개정을우선적