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1 건강기능식품공전 시험법 해설서

2 건강기능식품 시험법 해설서 목차 Ⅲ.1 일반원칙 1 Ⅲ.2 일반시험법 3 Ⅲ.2.1 붕해시험법 3 Ⅲ.2.2 내용량 시험법 12 Ⅲ.2.3 입도시험법 14 Ⅲ.2.4 산도시험법 15 Ⅲ 산도 15 Ⅲ 유기산 산도 17 Ⅲ.2.5 유해물질 시험법 19 Ⅲ 시안화합물 19 Ⅲ 카페인 21 Ⅲ 디에틸렌글리콜 25 Ⅲ 시트리닌 33 Ⅲ 초산에틸 41 Ⅲ.3 개별 성분별 시험법 45 Ⅲ.3.1 비타민 45 Ⅲ 비타민 A Ⅲ 비타민 D Ⅲ 베타카로틴 Ⅲ 비타민 E Ⅲ 비타민 K Ⅲ 비타민 B 1 Ⅲ 비타민 B 2 Ⅲ 나이아신 Ⅲ 판토텐산 Ⅲ 비타민 B 6 Ⅲ 엽산 Ⅲ 비타민 B 12 Ⅲ 비오틴 Ⅲ 비타민 C Ⅲ.3.2 무기질 182 Ⅲ 구리, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 셀렌, 크롬 182 Ⅲ 칼슘 188 Ⅲ 요오드 193 Ⅲ 철 198 Ⅲ 아연 203 Ⅲ 칼륨 206 Ⅲ.3.3 아미노산 및 단백질류 209 Ⅲ 조단백질 209

3 Ⅲ 아미노산 213 Ⅲ.3.4 당 및 탄수화물류 219 Ⅲ 글루코사민 219 Ⅲ N-아세틸글루코사민 228 Ⅲ 베타글루칸 232 Ⅲ 식이섬유 236 Ⅲ 총 다당체 246 Ⅲ 콘드로이친황산 249 Ⅲ 키토산(총글루코사민으로서) 261 Ⅲ 키토올리고당 265 Ⅲ 프락토올리고당 267 Ⅲ.3.5 지방산 및 지질류 274 Ⅲ 지방산 274 Ⅲ 인지질(아세톤불용물로서) 283 Ⅲ 인지질 중 포스파티딜콜린의 함량 286 Ⅲ 콜레스테롤 298 Ⅲ 구연산 303 Ⅲ 스쿠알렌 307 Ⅲ 식물스테롤 311 Ⅲ 유리식물스테롤 317 Ⅲ 알콕시글리세롤 322 Ⅲ 바틸알콜 확인 327 Ⅲ 옥타코사놀 330 Ⅲ 히드록시-2-데센산(10-HDA) 334 Ⅲ 총(-)-Hydroxycitric acid 338 Ⅲ 루테인 342 Ⅲ 아스타잔틴 346 Ⅲ.3.6 페놀류 352 Ⅲ 카테킨 352 Ⅲ 안트라퀴논계화합물(무수바바로인으로서) 357 Ⅲ 총 플라보노이드 360 Ⅲ 파라(ρ)-쿠마르산(Coumaric acid), 계피산(Cinamic acid) 확인 364 Ⅲ 다이드제인 및 제니스테인 확인 369 Ⅲ 총 모나콜린 K 373 Ⅲ 코엔자임Q Ⅲ 대두이소플라본 381

4 Ⅲ.3.7 터핀류 391 Ⅲ 진세노사이드 Rb1과 Rg1 391 Ⅲ 총 엽록소 399 Ⅲ 총 페오포르바이드 405 Ⅲ.3.8 발효미생물류 412 Ⅲ 유산간균 및 구균 412 Ⅲ 비피더스균(Bifidobacterium) 418 Ⅲ 자실체 또는 균사체의 함량 및 확인 423 Ⅲ 효모수 438 Ⅲ.3.9 효소활성 441 Ⅲ α-아밀라아제 441 Ⅲ 프로테아제 444

5 건강기능식품 시험법 해설서 범례 본 시험법 해설서는 아래 제시된 건강기능식품 공전 Ⅲ.1 일반원칙에 기재된 시료채취 방법과 용어의 정의 및 단위에 따라 기술되었다. Ⅲ.1 일반원칙 1. 시료채취 방법 1) 시료는 채취된 검체에서 시험에 직접 사용되는 물질을 말한다. 2) 시료채취는 시험의 대표성을 가질 수 있도록 균질하여 해당 시험항목에서 기재된 필요한 량을 정확히 채취한다. 3) 시험에 사용된 시료는 규격항목에 따라 채취 방법을 달리한다. (1) 미생물 (가) 캡슐은 외피를 포함하여 시험의 시료로 사용한다. (2) (1)항을 제외한 규격항목 (가) 캡슐은 외피는 제거하고 내용량을 취하여 균질화 시킨 후 시험의 시료 로 사용한다. (나) 과립, 정제 및 환은 분쇄하여 균질화 시킨 후 시험의 시료로 사용한다. (다) 분말 및 액상은 균질화 시킨 후 시험의 시료로 사용한다. 2. 용어의 정의 및 단위 1) 이 공전에서 계량의 단위는 다음의 기호를 사용한다. (1) 길이 : m, cm, mm, μm, nm (2) 용량 : L, ml, μl (3) 질량 : kg, g, mg, μg, ng, pg (4) 넓이 : cm 2, m 2, mm 2 (5) 열량 : kcal, kj (6) 온도 : 2) 원자량은 최신 국제원자량표에 의하고, 분자량은 국제원자량표에 의하여 계 산한다. 3) 질량백분율을 표시할 때에는 %의 기호를 쓰며, 용액 100 ml중의 물질함량(g)을 표시할 때에는 w/v%로, 용액 100 ml중의 물질함량(mL)을 표시할 때에는 v/v%의 기호를 쓴다. 질량백만분율을 표시할 때에는 mg/kg을 사용하며, mg/l도 사용할 수 있다. 4) 표준온도는 20, 상온은 15~25, 실온은 1~35, 미온은 30~40 로 한다. 1

6 5) 찬 곳(냉소) 이라 함은 따로 규정이 없는 한 0~15 의 장소를 말한다. 6) 시험은 따로 규정이 없는 한 상온에서 실시하고 조작 후 30초 이내에 관찰한 다. 다만, 온도의 영향이 있는 것에 대하여는 표준온도에서 행한다. 7) 시험에 쓰는 물은 따로 규정이 없는 한 증류수 또는 정제수로 한다. 8) 액성을 산성, 알카리성 또는 중성으로 표시한 것은 따로 규정이 없는 한 ph미 터기 또는 리트머스지를 써서 시험한다. 액성을 상세히 나타낼 때에는 ph값 을 쓴다. 또한, 강산성은 ph 약 3.0이하, 약산성은 ph 약 3.0~5.0, 미산성은 ph 약 5.0~6.5, 중성은 ph 약 6.5~7.5, 미알카리성은 ph 약 7.5~9.0, 약알카 리성은 ph 약 9.0~11.0, 강알카리성은 ph 약 11.0이상을 말한다. 9) 혼액을 (1 : 1), (4 : 2 : 1) 등으로 나타낸 것은 액체시약의 혼합 용량비 또 는 고체시약의 혼합 무게비를 말한다. 또한, 용액의 농도 (1 5), (1 10), (1 100) 등으로 나타낸 것은 고체 시약 1 g 또는 액체시약 1 ml를 용매에 녹여 전량을 각각 5 ml, 10 ml, 100 ml 등으로 하는 것을 뜻한다. 10) 무게를 정밀히 단다 라 함은 달아야 할 최소단위를 고려하여 0.1 mg, 0.01 mg 또는 mg까지 다는 것을 말한다. 또 무게를 정확히 단다 라 함은 규정된 수치의 무게를 그 자리수 까지 다는 것을 말한다. 11) 검체를 취하는 양에 약 이라고 한 것은 따로 규정이 없는 한 기재량의 90~ 110%의 범위 내에서 취하는 것을 말한다. 12) 건조 혹은 강열할 때 항량 이라고 기재한 것은 다시 계속하여 1시간 더 건조 혹은 강열할 때에 전후의 칭량차가 전회 측정한 무게의 0.1%이하임을 말한 다. 다만, 칭량차가 화학천칭을 썼을 때 0.5 mg이하, 마이크로 화학천칭을 썼 을 때 0.01 mg 이하인 경우에는 항량으로 본다. 13) 데시케이터의 건조제는 따로 규정이 없는 한 실리카겔로 한다. 14) 감압은 따로 규정이 없는 한 15 mmhg이하로 한다. 15) 시약, 시액, 표준용액을 보존하는 유리용기는 용해도 및 알카리도가 매우 낮 고 납 및 비소를 될 수 있는 대로 함유하지 아니하는 것을 사용한다. 16) 용매는 특별한 규격이 없는 한 HPLC용 을 사용한다. 17) 따로 규정이 없는 한 시약, 표준품은 최순품을 사용한다. 18) 따로 규정이 없는 한 표준용액을 이용하여 검량선을 작성할 경우 3가지 이상 의 농도로 검량선을 작성하여야 하고 시험용액 중 분석하고자 하는 농도가 검 량선 내에 포함될 수 있도록 표준용액 농도를 조절하여 사용한다. 19) 따로 규정이 없는 한 시험용액 시험 시 반드시 공시험을 함께 한다. 20) 영양정보에 표시된 열량, 탄수화물, 단백질, 지방 및 나트륨의 시험법은 식품 공전 제10. 일반시험법에 따른다. 21) 이 공전에 별도로 규정이 없는 시험법에 대해서는 식품공전 시험법을 따른다. 2

7 Ⅲ.2 일반시험법 Ⅲ.2.1 붕해시험법 1) 1. 시험방법의 원리 2) 붕해(disintegration)란 내복용의 성형제제가 소화관액 등의 액중에서 붕해되어 적 어도 그 구성입자까지 분산하는 현상 을 말하며 붕해과정이 활성부분의 완전한 용 해를 의미하는 것은 아니다. 그러나 고형제제의 붕해는 영양성분 등의 흡수나 효과 에 밀접한 관계가 있기 때문에 중요하다. 본 시험법은 시료가 물이나 시험액상에서 반복된 상하 움직임에 의하여 시료가 녹는 시간을 측정하는 방법으로, 내용고형제품 의 시험액에 대한 붕해성 또는 저항성을 시험하는 방법이다. 따로 규정이 없는 한 정 제제품, 적당한 제피제로 제피를 한 정제제품, 환제품, 캡슐제품, 과립제품, 장용성 제품은 각각 다음의 시험에 적합하여야 한다. 2. 안전 주의사항 시액 제조시 사용되는 염산(Hydrochloric acid)은 자극적인 냄새를 가지고 있고 피 부 화상, 점막 화상, 호흡 자극, 눈 자극 등의 건강 위험성이 있다. 물리적 위험으로 는 용기가 열에 노출되면 파열되거나 폭발할 수도 있고 물과 접촉 시 반응할 수 있 다. 또한 흡입 시 자극이 심한 경우도 있을 수 있으며 두통, 폐 울혈과 폐 이상이 생길 수 있다. 또한 피부에 접촉 시 자극 및 동상과 눈 접촉 시에는 실명 및 동상 마지막으로 섭취 시에는 화상, 구역, 구토 및 설사를 유발시킬 수 있으므로 환기가 잘되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의 를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 분석장비 이 시험에 쓰는 장치는 다음과 같으며 시험기, 안지름 약 110 mm이고 높이 약 155 mm인 비커, 적당한 가열기 및 전동기로 되어 있으며, 따로 조작법에 따라 보조판 또는 보조통을 쓴다. 3

8 3.1.1 시험기 그림 1-1 그림 1-2 그림 1-3 A : 플라스틱판 B : 체 눈의 간격 2.0 mm, 선재의 지름 6.0 mm의 내산성 망 C : 내산성 금속판 D : 유리관 J 및 M : 플라스틱통 E : 나사 K : 체 눈의 간격 0.42 mm F : 지주 및 나사 선재의 지름 0.29 mm의 내산성 망 G : 매다는 축 L : 내산성 철사 손잡이 H : 온도계 삽입구 시험기는 그림 1-1과 같이 지름 90 mm, 두께 6 mm의 상하 2장의 플라스틱 판 A가 있고 여기에 각각 지름 24 mm의 구멍이 같은 간격으로 6개 뚫어 져 있다. 아래의 플라스틱판의 아랫면에는 체 눈의 간격 2.0 mm, 선재( 線 材 )의 지름 0.6 mm의 내산성 망 B를 달고 위의 플라스틱판의 윗면과 아 래의 플라스틱판 망의 아랫면에는 각각의 구멍에 해당하는 부분에 지름 22~23 mm의 구멍을 6개 뚫은 지름 90 mm, 두께 1 mm의 내산성 금속판 C를 단다. 상하의 플라스틱판의 구멍에 안지름 21.5±0.5 mm, 바깥지름 23.5 mm, 길이 77.5±2.5 mm의 유리관 D 6개를 끼우고 지주( 支 柱 ) 3개를 써서 내산성 금속판 위에 나사로 유리관을 고정한다. 중심에 매단 축( 軸 ) G는 길이 80 mm로 하고 그 위 끝은 전동기를 써서 부드럽게 상하운동을 할 수 있도록 한 수축( 受 軸 )에 단다. 다만, 시험기는 유리관 및 망에 관한 규정 을 제외하고는 그 구조를 다소 변경할 수도 있다 보조판 3) 보조판은 그림 1-2에 표시한 것과 같이 높이 9.50±0.15 mm, 지름 20.70±0.15 mm의 투명하고 매끄러운 플라스틱제의 원주로 비중은 1.18~1.20이다. 이 4

9 윗면에서 아랫면까지에 지름 2 mm의 구멍이 5개가 뚫어져 있으며 그 1개 는 중심을 통하고 다른 4개는 중심에서 6 mm의 거리에 같은 간격으로 위 치하고 있다. 보조판의 측면에는 V자형으로 자른 것이 4개 같은 간격으로 있고 각각 자른 부분의 폭은 윗면이 9.5 mm, 아랫면이 1.6 mm, 깊이는 윗 면 2.55 mm, 아랫면 1.6 mm이다 보조통 4) 보조통은 그림 1-3에 표시한 것과 같이 안지름 12 mm, 바깥지름 17 mm, 길이 20 mm의 플라스틱통 M의 양단 바깥쪽의 나사를 풀고 안지름 12 mm, 바깥지름 17 mm, 길이 2.5 mm의 플라스틱통 J의 안쪽나사를 풀고 체 눈 간격 0.42 mm, 선재의 지름 0.29 mm의 내산성의 망을 놓고 먼저의 원통의 양단에 밀착시킨 것이다. 보조통의 상하 망의 간격은 20±1 mm로 하고 바깥쪽 중앙부에 지름 1 mm의 내산성 철사를 써서 높이 80 mm 의 손잡이를 단다. 3.3 분석장비의 준비 시험기를 수축에 달고 비커 속에 넣어 1분간 29~32회 왕복, 진폭 53~57 mm 로 부드럽게 상하운동을 하도록 조절한다. 시험기가 최대로 내려갔을 때 아래의 망 면이 비커의 바닥으로부터 25 mm가 되도록 하고 비커에 넣는 시험액의 양 은 시험기가 최하로 내려갔을 때 시험기의 윗면의 액의 표면에 일치하도록 한다. 시험하는 동안 액의 온도는 37±2 로 유지한다. 과립제품 이외는 시료 6개를 취하여 시험기의 유리관에 1개씩 넣고 시험기를 미리 온도 및 액량을 조절한 비커중의 시험액에 담그고, 일정시간 상하운동을 한 다음 시험기를 가만히 시험액에서 꺼내고 유리관 내의 시료상태를 관찰한 다. 보조판을 쓰도록 지정되어 있을 경우에는 시험기의 유리관에 시료를 넣고 다음에 보조판 윗면을 위로 하여 1개씩 가만히 넣은 다음 앞에서와 같은 조 작을 한다. 다만, 판정이 곤란할 때에는 보조판을 쓰지 않을 수 있다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 일반시약 염화나트륨(Sodium chloride) 염산(Hydrochloric acid) 증류수(Distilled water) 제1인산칼륨(Monopotassium phosphate) 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 4.2 시액의 조제 제1액 : 염화나트륨 2.0 g에 염산 7.0 ml 및 물을 넣어 녹여 1 L로 한다. 이 액은 무색투명하고 그 ph는 약 1.2 5) 이다 제2액 : 0.2 mol/l 인산이수소칼륨시액 250 ml에 0.2 mol/l 수산화나트 5

10 륨시액 118 ml 및 물을 넣어 1 L로 한다. 이 액은 무색투명하고 그 ph 는 약 6.8 6) 이다. 5. 시험과정 5.1 조작 방법 과립제품 이외에는 시료 6개를 취하여 시험기의 유리관에 1개씩 넣는다 시험기를 미리 온도 및 액량을 조절한 비커 중의 시험액에 담그고, 일정시간 상하운동을 한다 시험기를 가만히 시험액에서 꺼내고 유리관 내의 시료상태를 관찰한다. 5.2 시험 방법 및 결과 판정 정제제품 7) 물을 시험액으로 하고 보조판을 넣어 30분간 상하운동을 시킨 다음 관찰 할 때 시료의 잔류물이 유리관 내에 없거나 있더라도 해면상( 海 綿 狀, 잔구 멍이 송송 배게 뚫리어 해면처럼 된 모양)의 물질이든가 또는 연질(부드러 운 성질)의 물질 또는 니상( 泥 狀, 진흙과 같은 반죽상태)의 물질이 약간 있 을 때에는 적합한 것으로 한다 8). 시료 6개 중 시료가 원형상태로 머무르는 것이 1개 또는 파편상태로 있 는 것이 1개가 있을 때에는 새로 시료 6개를 가지고 위의 시험을 되풀이 하여 시료의 잔류물이 유리관 내에 없거나 있더라도 해면상의 물질이든가 또는 연질의 물질 또는 니상의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다 적당한 제피제로 제피를 한 정제제품 물을 시험액으로 하고 보조판을 넣어 60분간 상하운동을 시킨 다음 관찰 할 때 시료의 잔류물이 유리관 내에 없든가 있더라도 피막이든가 또는 연 질의 물질 또는 해면상의 물질 또는 니상의 물질이 약간 있을 때에는 적 합한 것으로 한다. 시료 6개 중 원형상태로 머무르는 것이 1개 또는 피막이 용해, 구멍 또는 벗겨져 있더라도 내용물의 방출이 인정되지 않는 것 1개가 남았을 때에는 시료 6개를 다시 취하여 이 시험을 반복하여 시료의 잔류물이 유리관 내에 없든가 있더라도 피막이든가 또는 연질의 물질 또는 해면상의 물질 또는 니상의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다 환제품 정제제품의 시험법에 따른다. 다만, 시험은 제1액에서 60분간 하고 시료의 잔류물이 유리관 내에 남아 있을 때에는 계속하여 제2액에서 60분간 시험 한다 캡슐제품 물을 시험액으로 쓰고 보조판을 넣어 20분간 상하운동을 시킨 다음 관찰 6

11 할 때 시료의 잔류물이 유리관 내에 없거나 있더라도 피막이든가 또는 연 질의 물질 또는 니상의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다. 시료 6개 중 원형상태로 머무르는 것이 1개 또는 피막이 용해, 구멍 또는 벗겨져 있더라도 내용물의 방출이 되지 않은 것이 1개 남았을 때에는 새로 시료 6개를 가지고 이 시험을 되풀이하여 시료의 잔류물이 유리관 내에 없든가 있더라도 피막이거나 또는 연질의 물질 또는 니상의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다 과립제품 과립제품을 35호(500 μm) 체로 쳐서 35호 체 위에 잔류한 시료 0.1 g씩을 각각 보조통 6개에 넣고 보조통을 시험기 유리관 속에 각각 1개씩 넣어 아 래쪽에 고정시키고 따로 규정이 없는 한 시험액으로 물을 써서 30분간 상하운동을 시킨 다음, 보조통을 꺼내어 관찰할 때 시료의 잔류물이 보조 통 내에 없든가 있더라도 원형상태로 머무르는 것이 보조통 1개에만 있을 때 또는 피막이거나 또는 연질의 물질 또는 니상의 물질이 약간 있을 때 에는 적합한 것으로 한다. 다만, 제피를 한 과립에 대하여는 시험액으로 물 을 써서 60분간 상하운동을 시킨다 장용성제품 과립제품 또는 과립상의 형으로 충전한 캡슐제품 다음의 1 제1액에 의한 시험 및 2 제2액에 의한 시험의 두 시험을 한다. 1 제1액에 의한 시험 과립제품 또는 캡슐제품 속에서 빼낸 내용물을 35호(500 μm) 체로 쳐서 35호 체 위의 잔류물 0.10 g씩을 각각 보조통 6개에 넣고 보 조통을 시험기의 유리관에 1개씩 넣어 밑에 고정하고 제1액을 시험 액으로 하여 60분간 상하운동을 시킨 다음 관찰할 때 시험기의 망목 으로부터 떨어지는 입자가 15알갱이 이내일 때에는 적합한 것으로 한다. 2 제2액에 의한 시험 따로 제1액에 의한 시험과 동일한 방법에 따라 시료 0.1 g씩을 각각 보조통 6개에 넣고 보조통을 시험기의 유리관에 1개씩 넣어 아래에 고정하고 제2액을 시험액으로 하여 30분간 상하운동을 한 다음 관 찰할 때 시료의 잔류물이 보조통 내에 없거나 있더라도 원형대로 있는 것이 보조통 1개에만 있을 때 또는 있더라도 피막이거나 또는 연질의 물질 또는 니상의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다 과립제품 또는 과립상의 형으로 충전한 캡슐제 이외의 장용성 제품 다음의 1 제1액에 의한 시험 및 2 제2액에 의한 시험의 두 시험을 한 7

12 다. 1 제1액에 의한 시험 시험액으로 제1액을 써서 120분간 상하운동을 한 다음 관찰할 때 시료 6개 중 붕해, 장용성 피막의 구멍 또는 벗겨져 있거나 또는 파손 등으로 내용물이 방출되는 것이 1개 이하일 때에는 제1액에 의한 시험에 적합 한 것으로 하고 2개일 때에는 새로 시료 6개를 가지고 이 시험을 되풀 이한다. 이 때 6개 모두가 앞에서 말한 이상이 없을 때에는 적합한 것 으로 한다. 2 제2액에 의한 시험 따로 시료 6개를 취하여 제2액을 시험액으로 하고 보조판을 넣어 60분 간 상하운동을 시킨 다음 관찰할 때 시료의 잔류물이 유리관 내에 없든 가 있더라도 피막이거나 해면상의 물질이든가 또는 연질의 물질 또는 니상의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다. 6. 참고문헌 6.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 시험 주의사항 1) 붕해시험법으로서 약전에 처음 수재한 것은 스위스 약전(Pharmacoeia Helvetica Ⅴ, 1934년)이지만 JP에서는 이미 그 제4개정(1920년)에서 정제 (Pastilli)의 시험법에 정제는 이것을 37 의 수중에서 때때로 흔들어 방치할 때 30분 이내에 전부 붕해하여야 한다. 로 기재하고 있다. 여기에는 진동의 세 기, 회수, 붕해의 판정은 없어 시험자의 주관이 들어가기 쉬운 것이었다. 그 후 객관적 판정이 가능하도록 한 점, 재현성이 양호한 점, in vivo와 어느 정도 상 관성이 있다는 점 등을 조건으로 새로운 장치가 차차 개발되어 왔다. 현재의 붕해시험법의 원형이 되었던 장치는 Gershberg가 고안한 것으로 약간 개량된 다음 1950년 공정서로서는 처음으로 USP ⅩⅣ에 채용되었다. 미국에서 붕해시 험이 채용된 것은 이것이 처음인 것으로 당시의 시판제제에 붕해시간을 맞추 었기 때문에 다른 나라 약전과는 달리 의약품 각조에서 하나 하나 붕해시간을 규정하게 된 것이다. 현재의 USP 23에서도 이와 같은 체제가 계속되고 있다. 2) 붕해 시험법에서 제제는 장치 중에서의 마찰이나 교반으로 신속하게 붕해되지 만 생체 내에서는 이러한 물리적인 조건이 없기 때문에 붕해시험법의 결과를 직접적으로 소화관 흡수, 생체이용률 등과 관련하여 해석하는 것은 피해야 한 다. 그러나 붕해시험에 적합한 제제가 양호한 생체이용률을 나타낸다는 보증은 없다할지라도 붕해시험의 규정에 적합하지 않은 제제는 생체이용률에도 문제 를 일으킬 가능성이 매우 높다는 사실은 중요하다. 또 붕해시간 편차가 큰 제 8

13 제는 효과가 불안정하여 제품으로서의 신뢰성을 상실하게 된다. 그래서 내용 고형제제는 일정한 시간 내에 거의 균일하게 붕해하여야 하며, 이것을 in vitro 의 조건에서 시험하는 방법이 붕해 시험법이다. 다만, 직경 20.0 mm이상 크기 의 제제, 지효성의 제제 및 용출시험 2) 을 적용하는 제제는 이 시험법을 적용하 지 않는다. 3) 보조판 : 정제, 환제, 캅셀제, 제피정제, 장용성제제의 제2액에 의한 시험에 사 용한다. 비중 1.18 ~ 1.20의 플라스틱제 디스크로 검체의 부상을 억제할 목적으 로 사용한다. 약간의 압( 壓 )을 줌과 동시에 교반효과를 보이며 사용하지 않을 때에 비해 붕해시간이 약 1/2로 단축된다. 또 피막 등 연질부유물을 유리관 밖 으로 내보내기 때문에 붕해의 판정이 용이하게 된다. 4) 보조통 : 통부의 상하면은 금속제의 망으로 구성된다. 통내에 과립제 또는 장 용성캅셀중의 과립을 넣어 손잡이의 탄성으로 시험기의 유리관 중에 고정하여 사용한다. 5) 위와 장의 ph를 고려하여 만든 조건으로 대략적인 범위이지만, 실제 실험에서 는 붕해여부를 결정짓는 중요한 조건이 될 수 있으므로 제시된 ph를 맞춰서 실험하기 바란다. 9

14 6) 제제종류에 따른 시험조작과 적합조건 제형 시험액 보조판 시험시 적합조건 * 간 정제 물 + 30분 1)6개중 모두 붕해하면 적합 캅셀제 물 + 20분 제피정제 제1액 + 60분 환제 과립제 제피한 (비장용성) 과립제 장용성제제(과립 제 및 캅셀제중 에 충전된 과립 제가 아닌것) 장용성의 과립 제 및 캅셀제중 에 충전한 장용 성과립제 제1액 (제2액) 물 제1액 + - (보조통 ) - (보조통 ) 60분 (60분) 30분 60분 제1액 - 120분 2)1개만이 불완전할 때 재시험에서 6개 모두 붕해하면 적합 1)6개중 모두 붕해하면 적합 2)제1액중에서 붕해가 불완전 할 때에는 계속 제2액으로 시험. 붕해 유무를 본다. 붕해갯수의 규정은 정제와 같다. 붕해가 불완전한 보조통1개 이하면 적합 붕해,피막의 개구 박리 파손에 의한 내용물의 방출이 1개이하면 적합, 2개이면 재시험에서 6개 모 두 이상이 없을 때 적합 제2액** + 60분 규정시간내에 붕해 제1액 제2액 - (보조통 ) - (보조통 ) 60분 30분 시험기의 망목으로부터 떨어지는 입자는 약15알갱이 이내면 적합 붕해가 불완전한 보조통 1개 이하 면 적합 10

15 7) 붕해의 판정 규정시간까지 조작하고 시험기를 액에서 꺼내었을 때 관내에 잔류물이 없으면 적합이며 다음의 상태가 관찰되는 경우도 검체는 붕해한 것으로 판정한다. 다음 표 참조 제형 붕해했을때의 유리관 또는 보조통내의 상태 정제 잔류물이 유리관내에 없거나 있더라도 해면상의 물 질이던가 또는 연질의 물질이 약간 있을 때 환제 제1액 또는 제2액중에서 시험 후 유리관내에 잔류물 이 없을 때 캅셀제, 제피정제 잔류물이 유리관내에 없거나 있더라도 피막일 때 또 는 연질의 물질이 약간 있을 때 과립제, 장용성의 과립 원형상태로 머무르는 잔류물이 보조통 6개중 1개 이 제 및 캅셀제중에 충전 하이든가 각통내의 잔류물이 피막이든가 소량의 연 된 장용성과립제 질성 또는 죽상의 물질일 때 장용성 중 과립제 및 유리관내에 잔류물이 없거나 해면상물질 이든지 연 캅셀제중에 충전한 과 질의 물질이 약간 있을 때 립제가 아닌 제제 11

16 Ⅲ.2.2 내용량 시험법 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 시료의 내용량을 측정하고 표시량과 비교하여 허용된 오차범위 내의 결과 값을 나타내는 지를 판정하는 방법이다. 2. 제품 형태별 시험방법 및 계산방법 2.1 용량표시제품 시료의 내용물을 메스실린더에 완전히 옮겨 측정한다. 다만, 점성 등이 있어 내용물을 완전히 옮기기 어려운 시료에 대해서는 내용물이 들어 있는 용기에 물을 넣어 용기를 가득 채웠을 때의 양을 측정한다 용기의 내용물을 제거하여 물 또는 적당한 용매로 용기의 내부를 깨끗이 씻 어 말린 후 물을 넣어 용기를 가득 채웠을 때의 양을 측정하여 전후의 용량 차로 계산한다(시료 3개를 가지고 시험하여 평균값을 내용량으로 한다). 2.2 중량표시제품 내용물이 들어있는 용기 외면을 깨끗이 닦고 무게를 정밀히 측정한다 내용물을 완전히 제거하고 물 또는 용매 등으로 용기의 내부를 깨끗이 씻 어 말린 후 용기의 무게를 달아 전후의 무게차로 계산한다(시료 3개를 가지고 시험하여 평균값 내용량으로 한다). 다만, 내용량에 포함된 흡습제 등 비가식 대 상은 제외한다. 2.3 소포장제품 내용물이 소포장으로 20개 이하일 경우에는 전체를, 20개 이상일 경우에는 20개를 무작위로 취해 위와 같이 실험하여 평균값을 구한 후 전체 개수를 곱 하여 총량으로 계산한다. 2.4 캡슐제품 경질캡슐제품 표시된 시료의 전체 개수를 확인한 후, 캡슐 20개를 취하여 무게를 측정한다 캡슐을 열고 내용물을 작은 붓 등을 사용하여 제거하고 빈 캡슐의 무게를 측정한다 전후의 무게차를 20으로 나눈 평균값을 캡슐 당 무게로 하여 캡슐별로 무게와 총 개수에 대하여 각각 판정한다 연질캡슐제품 12

17 표시된 시료의 전체 개수를 확인한 후, 캡슐 20개를 취하여 무게를 측정하고, 캡슐을 절개하여 그 내용물을 에테르 등의 휘발성 용매로 씻는 다 1) 여과지 등으로 빈 캡슐로부터 용매를 가볍게 제거하고 실온으로 30분 이상 방치하여 캡슐에 묻어 있는 용매를 제거한다.(이 때 캡슐이 흡습 또 는 건조되는 것을 피한다) 빈 캡슐의 무게를 측정한 후, 전후의 무게차를 20으로 나눈 평균값을 캡슐 당 무게로 하여 캡슐별의 무게와 총 개수에 대하여 각각 판정한다 2). 2.5 정제제품 표시된 시료의 전체 개수를 확인한 후 20정을 취하여 무게를 측정하고, 20 으로 나눈 평균값을 정 당 무게로 하여 정별로 무게와 총 개수에 대하여 각 각 판정한다 3. 참고문헌 3.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 시험 주의사항 1) 캅셀을 절개한 후 화장지를 이용하여 내용물을 잘 닦아내고 에테르 등의 휘발 성 용매로 씻으면 캅셀의 내용물을 더 깨끗이 제거할 수 있다. 2) 분류에 따라 내용량을 측정한 후 표시된 양과 실제량과의 부족량의 허용오차 (범위)를 기준으로 판정한다. 13

18 Ⅲ.2.3 입도시험법 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 KS 규격의 체 를 통과하는 시료의 양을 측정하여 과립제형 제품의 성형 상태를 판정하는 방법이다. 2. 시험방법 및 결과 판정 2.1 과립제품 호(1680 μm), 14호(1410 μm) 및 45호(350 μm) 체를 써서 시험한다. 다만 이 시험법에 쓰는 체 틀의 안지름은 75 mm로 한다 시료 20 g을 정확하게 달아 앞에서 지정한 체 및 수기( 受 器 )를 겹쳐놓은 용 기의 상단 체에 넣고 뚜껑을 덮은 다음 3분간 수평으로 흔들어 주면서 때 때로 가볍게 두드려준 다음 각 체 및 수기 내 잔류물의 질량을 단다 호(1680 μm) 체를 전량 통과하고 14호(1410 μm) 체에 남는 것은 전체량의 5%이하이고 또 45호 (350 μm) 체를 통과하는 것은 전체량의 15%이하일 때 적 합하다. 14

19 Ⅲ.2.4 산도시험법 Ⅲ 산도 1. 시험방법의 원리 식품을 회화하였을 때 식품을 구성하고 있는 무기성분 가운데 Ma, Mg, Zn, Ca, K, Fe, Cu, Mn, Co등 양이온을 이루는 것을 알칼리 생성원소라 하고 P, O, S, Cl, Br, I등의 음이온을 이루는 것을 산 생성원소라 한다. 따라서 K+, Ca2+, Na+, Mg2+ 등 물과 결합해서 알칼리성을 나타내는 이온이, Cl-, P-, S- 등 산성을 나타 내는 것에 비해서 많은 식품이 알칼리성 식품이다. 본 시험법은 산의 총량측정을 이용한 분석법으로 ph 지시약(페놀프탈레 인)을 사용하여 알칼리 표준용액으로 적정함으로써 산의 함량을 구한다. 증류수로 용해 ph 지시약 첨가 표준용액으로 적정 2. 안전 주의 사항 시험 중 수산화나트륨(Sodium hydroxide)은 삼키면 유해하며 호흡기도, 피부, 눈, 점막에 화상을 입힐 수 있고 물과 접촉 시 반응 할 수 보안경으로 눈 보호, 실험복 착용 및 안전장갑 등의 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 삼각플라스크(250 ml) 3.2 분석장비 ph 측정기 3.3 분석장비의 준비 ph 측정 전에 충분히 안정화 시키고, 기기보정을 해둔다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 시액의 조제 N 수산화나트륨 용액(Sodium hydroxide) 1 N 수산화나트륨 용액을 취하여 증류수로 10배 용량으로 희석 1) 하여 사 용하거나 수산화나트륨 4.5 g을 취하여 일정량의 증류수에 녹이고 1000 ml 부피플라스크에 옮겨 담은 후 증류수를 표선까지 채운 다음 표정하여 사용 15

20 한다 페놀프탈레인 시액(Phenolphthalein) 페놀프탈레인 1 g을 에탄올 100 ml에 녹인다. 5. 시험과정 5.1 시험용액의 조제 시료 0.5 g에 끓여서 식힌 증류수 50 ml를 가하여 페놀프탈레인 시액 0.5 ml를 가한다 N 수산화나트륨용액으로 30초간 붉은색이 지속될 때까지 적정한다. 단, 시험용액이 착색되어 있는 경우는 ph 측정기를 이용하여 ph 8.3까 지 적정한다. 6. 분석 및 계산 6.1 계산 산도(1 N NaOH ml/100g) = S S : 0.1 N 수산화나트륨용액의 소비량(mL) f : 0.1 N 수산화나트륨용액의 역가 f 10 시료채취량( g) 7. 참고문헌 7.1. AOAC Official Methods : Total Monomeric Anthocyanin Pigment Content of Fruit Juices, Beverages, Natural Colorants, and Wines ph Differential Method, Association of Official Analytical Chemists. Inc, ( ), 시험 주의사항 1) 표준용액을 제조 시 부피플라스크를 이용하여 목적하는 농도가 되도록 단계별 로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 16

21 Ⅲ 유기산 산도 Ⅲ 유기산 산도(젖산으로서) 1. 시험방법의 원리 유기산은 산성을 나타내는 유기 화합물로써 가장 대표적인 유기산은 카르복실산으 로 -COOH의 작용기를 갖고 있으며 젖산, 아세트산, 포름산, 시트르산, 옥살산, 요산 등이 있고, 동식물의 조직 중에 존재하고 특히, 과실, 야채, 발효성 식품에 많이 함 유되어 있다. 식초에는 초산이, 김치와 요구르트에는 젖산이, 레몬과 오렌지 등 과 일에는 사과산과 구연산이 신맛을 낸다. 화합물로써 지방으로부터 핵산에 이르기까 지 여러 가지 화합체가 있지만 모두가 영양과 생화학적으로 중요하다. 본 시험법은 산의 총량측정에 의한 분석법으로 ph 지시약(페놀프탈레인)을 사용하여 알칼리 규정액으로 적정함으로써 유기산 함량을 구한다. 증류수로 용해 ph 지시약 첨가 표준용액으로 적정 2. 안전 주의 사항 시험 중 수산화나트륨(Sodium hydroxide)은 삼키면 유해하며 호흡기도, 피부, 눈, 점막에 화상을 입힐 수 있고 물과 접촉 시 반응 할 수 보안경으로 눈 보호, 실험복 착용 및 안전장갑 등의 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 삼각플라스크(250 ml) 3.2 분석장비 ph 측정기 3.3 분석장비의 준비 ph 측정 전에 충분히 안정화 시키고, 기기보정을 해둔다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 시액의 조제 N 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 1 N 수산화나트륨 용액을 취하여 증류수로 10배 용량으로 희석 1) 하여 사 용하거나 수산화나트륨 4.5 g을 취하여 일정량의 증류수에 녹이고 1000 ml 17

22 부피플라스크에 옮겨 담은 후 증류수를 표선까지 채운 다음 표정하여 사용 한다 페놀프탈레인 시액(Phenolphthalein) 페놀프탈레인 1 g을 에탄올 100 ml에 녹인다. 5. 시험과정 5.1 시험용액의 조제 시료 10 g에 끓여서 식힌 증류수 100 ml를 가하여 페놀프탈레인 시액 0.5 ml를 가한다 N 수산화나트륨용액으로 30초간 붉은색이 지속될 때까지 적정한다. 단, 시험용액이 착색되어 있는 경우는 ph 측정기를 이용하여 ph 8.3까 지 적정한다. 6. 계산 6.1 계산 유기산 산도(젖산으로서, %) = S S : 0.1 N 수산화나트륨용액의 소비량(mL) f : 0.1 N 수산화나트륨용액의 역가 f 시료채취량(g) 참고문헌 7.1. MARIE-VINCENTE ALBERTINI, ELODIE CARCOUET, OLIVIER PAILLY, CLAUDE GAMBOTTI, FRANCu OIS LURO, LILIANE BERTI : Changes in Organic Acids and Sugars during Early Stages of Development of Acidic and Acidless Citrus Fruit, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, , 시험 주의사항 1) 표준용액을 제조 시 부피플라스크를 이용하여 목적하는 농도가 되도록 단계별 로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 18

23 Ⅲ.2.5 유해물질 시험법 Ⅲ 시안화합물 1. 시험방법의 원리 시안화수소(HCN, 청산)의 금속염을 시안화물이라 하고, 대표적인 것이 시안화 칼리(KCN), 시안화나트륨(NaCN) 등이다. HCN은 자연계에서는 매화나무속(체리, 아몬드)과 같은 어떤 종식물의 종자 속에 글리고시도아미다린으로 존재한다. HCN은 백금촉매에 의한 암모니아와 메탄의 반응, 포름아미드의 촉매에 의한 분 해, 시안화합물과 산의 반응 등에서 생산되고 옛날에는 살서ㆍ살충제로서 훈증작 업, 전기도금작업, 화학물질의 합성, 특히 아릴로니트릴. 아세트시안히드린의 제 조에 관계하는 작업 등, 산업현장에서의 시안화물에 노출 되는 경우가 많았지만, 최근에는 도금공장의 페액중 시안으로 인한 물 오염, 유기합성재ㆍ신건축재 등의 화재연소에 의한 시안가스의 발생, 자동차의 배기가스, 쓰레기 소각장의 연기중 의 시안가스 등, 환경오염에 의한 노출이 문제가 되고 있다. 시료를 수기에 밀전하고 시료로부터 휘발되는 시안화합물에 의한 피크린산지의 색변화를 관찰하여 시안화합물을 정성분석 한다. 완충액 혼합 피크린산지로 밀전 혼합 / 진탕 / 방치 피크린산지 색변화 2. 안전 주의 사항 피크린산 지를 만들 때 사용하는 피크린산은 삼키면 유해하며, 호흡기도를 자극 하고, 피부와 눈에 자극을 일으키며 알레르기 반응이 일어날 수 있다. 또한 충격이 나 마찰 또는 열에 노출되면 폭발할 수도 있으므로 밀페된 용기에서 서늘하고 건조 한 장소에 보관하도록 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 삼각플라스크(200 ml) 코르크 마개 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 일반시약 19

24 4.1.1 탄산나트륨(Sodium carbonate) 구연산(Citric acid) 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 피크린산(Picric acid) 주석산(Tartaric acid) 4.2 시액의 조제 구연산 완충액 구연산 g, 수산화나트륨 64.4 g을 증류수에 용해시켜 1 L로 하고 ph 5.9로 조절한다 피크린산 지 여지를 포화 피크린산 용액에 담그고 실온에서 건조한 후 7 40 mm의 크 기로 잘라서 사용 시 10% 탄산나트륨용액에 담근다. 5. 시험과정 5.1 시험용액의 조제 시료 20 g을 200 ml 삼각플라스크에 취한다 구연산 완충액 50 ml를 5.1.1에 가한다 삼각플라스크를 피크린산지를 매달은 코르크 마개로 밀전한다 ~35 에서 때때로 흔들어 혼합시키면서 3시간 방치한다 이후 주석산 2 g을 가한다 코르크마개를 신속히 밀전하고 때때로 흔들어 혼합하면서 50~60 에서 1 시간 방치 1) 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 결과 분석 피크린산지의 색변화를 관찰 (공시험 : 노란연두, 시료 : 갈색) 7. 참고문헌 7.1. 권훈정, 심순미, 조혜전, 한영아 : 식품 중 천연유래 시안화합물 규격관리, 식 품의약품안전청연구보고서, 10, , 고용노동부, 한국산업안전보건공단 : 물질안전보건자료, 1-8, 시험 주의사항 1) 모든 가열 반응은 반응시키는 수욕조나 가열기를 목적하는 온도로 미리 맞추 어 두어 목적온도에서의 시간을 정확히 유지토록 한다. 20

25 Ⅲ 카페인 1. 시험방법의 원리 카페인은 융점 238. 견사상의 가벼운 백색결정, 승화는 178 로부터 시작된 다. 열수에 잘 녹고 쓴맛(역치 M)을 나타낸다. 유사 화합물에는 theobromine, theopurine이 있다. 커피나 차 같은 일부 식물의 열매, 잎, 씨앗 등에 함유된 알칼로이드(alkaloid) 의 일종으로, 커피, 차, 소프트드링크, 강장음료, 약품 등의 다양한 형태로 인체 에 흡수되며, 중추신경계에 작용하여 정신을 각성시키고 피로를 줄이는 등의 효 과가 있으며 장기간 다량을 복용할 경우 카페인 중독을 야기할 수 있다. 본 시험법은 카페인이 메탄올에 잘 용해되는 성질을 이용하여 초음파 처리를 통하 여 시료 중 카페인을 충분히 추출하여 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기 를 통해 분석하는 방법으로 카페인의 최대 흡수파장인 280 nm에서 정량분석을 한다. 메탄올 추출 초음파진탕 filtration 액체크로마토그래피 자외부흡광광도검출 2. 안전 주의 사항 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴(Acetonitrile)은 흡입이나 섭취시 구 토, 구역질, 혈압변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의식불명 등의 증상이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 부피플라스크(100 ml) 여과용 멤브레인 필터 액체크로마토그래프용 유리병 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 칼럼오븐 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 21

26 3.3 분석장비의 준비 이동상인 아세토니트릴과 0.1%인산용액을 이용하여 분당 1.0 ml로 충분한 시 간동안 흘려 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 카페인(Caffeine, 1,3,7-trimethyl-1H-purine-2,6(3H,7H)-dione, 1,3,7-trimethylxanthine, trimethylxanthine, theine, methyltheobromine) 분자식 : C 8 H 10 N 4 O 2, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 메탄올(Methanol) 아세토니트릴(Acetonitrile) 초산(Acetic acid) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 표준물질을 메탄올에 녹여 1,000 μg/ml 되도록 표준원액을 만든다 표준원액을 적당량 희석 1) 하여 표준용액으로 한다. 5.2 시험용액의 조제 시료(카페인으로서 20~80 mg) 적당량을 취하여 100 ml 부피플라스크에 넣은 후 메탄올을 가하여 초음파 추출을 한다 위의 시험액을 메탄올로 표선까지 채운 다음, 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다. 22

27 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항목 주입량 검출기 파장 조건 20 μl 280 nm 칼럼 온도 40 이동상 유속 A : 0.1%초산용액, B : 100%아세토니트릴 1.0 ml/분 표 2. 이동상 조건(예) 시간(분) A용액(%) B용액(%) 표준물질 크로마토그램 23

28 6.3 계산 카페인함량(mg/kg) = S V 시료채취량( g) S : 시험용액 중 카페인의 농도(μg/mL) V : 시험용액의 전량(mL) 7. 참고문헌 7.1. 김희연, 이영자, 홍기형, 이철원, 하상철 : HPLC를 이용한 카페인으 분석법 개 발 및 시판 식품중 함유량 조사, 한국식품과학회지, 31(6), , Karen W, Andrews, Amy Schweitzer, Cuiwei Zhao, Joanne M. Holden, Janet M. Roseland, Mary Brandt, Johanna T. Dwyer, Mary Frances Picciano, Leila G. Saldanha, Kenneth D. Fisher, Elizabeth Yetley, Joseph M. Betz, Larry Douglass : The caffeine contents of dietary supplements commonly purchased in the US: analysis of 53 products with caffeine-containing ingredients, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 389(1), , 시험 주의사항 1) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 24

29 Ⅲ 디에틸렌글리콜 Ⅲ 디에틸렌글리콜(제1법) 1. 시험방법의 원리 디에틸렌글리콜(Diethylene glycol, DEG)은 점조성이 있는 투명한 액체이며 알코올 의 일종으로 에탄올과 글리세린의 중간적 성질을 갖는다. 무취이며 약간의 단맛이 있고, 단맛이 식욕을 돋구기 때문에 포도주에 사용한 때도 있었다. 체내에 들어가 2 분자의 에틸렌글리콜이 되고, 이것이 다시 산화되어 옥살산을 생성하기 때문에, 신 장에 옥살산칼슘이 축적되는 경로로 만성독성을 나타낸다. 본 시험법은 시료를 메탄올로 추출한 후 알루미나칼럼을 통해 부분 정제하고 가스 크로마토그래프를 이용하여 분석하는 방법으로 표준물질과의 면적비를 이용하여 정성 정량한다. 메탄올 추출 감압농축 알루미나칼럼 가스크로마토그래피 2. 안전 주의 사항 표준용액 조제 시 사용되는 디에틸렌글리콜은 호흡기를 통한 흡입 시 구역, 두통, 졸음, 현기증, 조정(기능) 손실이 유발될 수 있으며, 섭취 시 저체온 또는 발열과, 혈 압변화, 구역, 구토, 설사, 위통, 흉통, 호흡곤란, 불규칙 심장박동, 신장이상 등이 올 수 있으므로 취급에 주의를 기울여야 한다. 시료 추출 시 사용되는 메탄올의 경우 포름알데하이드 제조나 부동액으로 사용되 는 독성을 갖는 무색의 가연성 알코올로서, 생체 내에서알코올탈수소효소에 의해 포름알데하이드나 포름산이 되기 때문에 독성이 강하다. 30mL 이하를 섭취하더라 도 사망에 이르며, 만성독성으로는 실명을 초래하는 것으로 알려져 있으므로 환기 가 잘되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 감압농축기 알루미나칼럼 환저플라스크(100 ml) 부피플라스크(100 ml) 3.2 분석장비 가스크로마토그래프 25

30 3.2.2 불꽃이온화검출기(Flame Ionization Detector) 칼럼오븐 % dimethylpolysiloxane 칼럼, 길이 50 m, 안지름 0.32 mm, 필름두께 0.17 μm) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 분석시작 전에 주입부 및 검출기 온도, 유량, 칼럼온도를 분석조건에 맞게 조 작하고, 가스크로마토그래프를 충분히 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 디에틸렌글리콜(Diethylene glycol, (2-hydroxyethoxy)ethan-2-ol) 분자식 : C 4 H 10 O 3, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 메탄올(Methanol) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 디에틸렌글리콜 100 mg을 100 ml 부피플라스크에 넣는다 메탄올을 표선까지 채운다 위의 용액 5 ml을 취하여 1) 다시 100 ml부피플라스크에 넣는다 메탄올을 표선까지 채운 다음, 필요 농도로 희석 2) 하여 사용한다. 5.2 시험용액의 조제 분말 또는 페이스트상의 시료는 1 g을 취하여 메탄올 10 ml를 가하여 녹 인다. 단, 액상시료는 5 ml를 취하여 40 에서 감압 농축하여 수분을 제거 한 후 잔사에 메탄올 10 ml를 가하여 녹인다 위의 용액을 활성화된 알루미나칼럼에 가한다 메탄올 30 ml로 용출한다 용출액을 40 에서 약 1 ml로 감압 농축시킨다 메탄올을 가하여 5 ml로 한 후 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 가스크로마토그래프 조건 26

31 항목 조건 주입부 온도 140 오븐 온도 40 칼럼 온도 40 (3분) 15 /분 300 (20분) 검출기 온도 250 캐리어 가스 및 유량 split flow 헬륨, 45 kpa 300 ml/min. 6.2 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 디에틸렌글리콜 함량(μg/g) = C (a/s) C : 시험용액 중의 디에틸렌글리콜 농도(μg/mL) a : 최종희석액(mL) S : 시료 채취량(g) 7. 참고문헌 7.1. Peter Korytar, Hans-Gerd Janssen, Eva Matisova, Udo A.Th. Brinkman : Practical fast gas chromatography: methods, instrumentation and applications, Trends in Analytical Chemistry, 21, ,

32 8. 시험 주의사항 1) 정밀하게 용액을 취하기 위해서는 반드시 해당 용량의 홀 피펫을 사용하여야 한다. 2) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조 시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 28

33 Ⅲ 디에틸렌글리콜(제2법) 1. 시험방법의 원리 디에틸렌글리콜(Diethylene glycol, DEG)은 점조성이 있는 투명한 액체이며 알코올 의 일종으로 에탄올과 글리세린의 중간적 성질을 갖는다. 무취이며 약간의 단맛이 있고, 단맛이 식욕을 돋구기 때문에 포도주에 사용한 때도 있었다. 체내에 들어가 2 분자의 에틸렌글리콜이 되고, 이것이 다시 산화되어 옥살산을 생성하기 때문에, 신 장에 옥살산칼슘이 축적되는 경로로 만성독성을 나타낸다. 본 시험법은 메탄올로부터 시료를 추출하여 알루미나칼럼을 통해 부분 정제하여 가스크로마토그래프/질량검출기를 통해 분석하는 방법으로 표준물질과의 이온질량 비교로 정성 정량한다. 질량검출기 메탄올 추출 감압농축 알루미나칼럼 가스크로마토그래피 2. 안전 주의 사항 표준용액 조제 시 사용되는 디에틸렌글리콜은 호흡기를 통한 흡입 시 구역, 두통, 졸음, 현기증, 조정(기능) 손실이 유발될 수 있으며, 섭취 시 저체온 또는 발열과, 혈 압변화, 구역, 구토, 설사, 위통, 흉통, 호흡곤란, 불규칙 심장박동, 신장이상 등이 올 수 있으므로 취급에 주의를 기울여야 한다. 시료 추출 시 사용되는 메탄올의 경우 포름알데하이드 제조나 부동액으로 사용되 는 독성을 갖는 무색의 가연성 알코올로서, 생체 내에서알코올탈수소효소에 의해 포름알데하이드나 포름산이 되기 때문에 독성이 강하다. 30mL 이하를 섭취하더라 도 사망에 이르며, 만성독성으로는 실명을 초래하는 것으로 알려져 있으므로 환기 가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 감압농축기 알루미나칼럼 환저플라스크(100 ml) 부피플라스크(100 ml) 3.2 분석장비 가스크로마토그래프 29

34 3.2.2 질량검출기(Mass Selective Detector) 칼럼오븐 % dimethylpolysiloxane 칼럼(길이 50 m, 안지름 0.32 mm, 필름두께 0.17 μm) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 분석시작 전에 주입부 온도, 유량 및 칼럼 온도를 분석조건에 맞게 조작하고, 가스크로마토그래프/질량검출기를 충분히 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 디에틸렌글리콜(Diethylene glycol, (2-hydroxyethoxy)ethan-2-ol) 분자식 : C 4 H 10 O 3, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 메탄올(Methanol) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 디에틸렌글리콜 100 mg을 100 ml 부피플라스크에 넣는다 메탄올을 표선까지 채운다 위의 용액 5 ml를 취하여 1) 다시 100 ml부피플라스크에 넣는다 메탄올을 표선까지 채운 다음, 필요 농도로 희석 2) 하여 사용한다. 5.2 시험용액의 조제 분말 또는 페이스트상의 시료는 1 g을 취하여 메탄올 10 ml을 가하여 녹 인다. 단, 액상시료는 5 ml을 40 에서 감압농축시켜 수분을 제거한 후 잔사에 메탄올 10 ml을 가하여 녹인다 위의 용액을 활성화된 알루미나칼럼에 가한다 메탄올 30 ml로 용출한다 용출액을 40 에서 약 1 ml로 감압 농축시킨다 메탄올을 가하여 5 ml로 한 후 시험용액으로 한다. 30

35 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 가스크로마토그래프-질량검출기(GC/MS) 조건 항목 조건 주입부 온도 280 칼럼 온도 280 주입량 1 μl 이온질량 m/z 45, m/z 75 캐리어 가스 헬륨 0.75 kg/cm 2 Split ratio 30 : 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 디에틸렌글리콜 함량(μg/g) = C (a / S) C : 시험용액 중의 디에틸렌글리콜 농도(μg/mL) a : 최종희석액(mL) S : 시료 채취량(g) 7. 참고문헌 7.1. Xiaoping Xing, Xue Shi, Haitao Zhang, Weiyu Wang, Jiannong Ye : Determination of diethylene glycol in toothpaste by capillary electrophoresis with electrochemical detection, Microchimica Acta, 167, ,

36 8. 시험 주의사항 1) 정밀하게 용액을 취하기 위해서는 반드시 해당 용량의 홀 피펫을 사용하여야 한다. 2) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 32

37 Ⅲ 시트리닌 Ⅲ 시트리닌(제1법) 1. 시험방법의 원리 시트리닌은 Penicillium cit-rinum이 생산하는 황색 색소이다. 처음에는 항생물질로 서 분리한 것이지만, 지금은 신장 독성을 야기하는 곰팡이 독의하나로 분류된다. 마 우스의 LD50은 35mg/kg(s.c.)이며, 강력한 신장장애를 일으키는 특이적 독성이 있다. 또한 신장독성이 있는 N-(3,5-dichlophenyl) succimide에서 래트를 전 처리한 후 시 트리닌을 투여하여 신장암의 발생을 확인했다. 종종 사료, 식품의 일부에서 검출된 다. 그 외에 P. viridicatum 등이 citrinin을 생산한다. Citrinin은 ochratoxin A와 더 불어, 대표적인 신장 장해를 발생시키는 물질이다. 신장에 있어서의 물의 재흡수능 을 저하시키는 것에 의해 뇨량을 증가시켜 급성 또는 만성의 네플로시스를 일으킨 다. 또한 신장암의 진행을 축진하는 작용을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 본 시험법은 에탄올을 이용하여 시료 중 시트리닌을 충분히 추출하여 액체크로마 토그래프를 통해 분석하는 방법으로 형광검출기를 이용하여 정성 및 정량분석을 한 다. 에탄올 추출 초음파처리 원심분리 감압농축 filtration 액체크로마토그래피 형광검출기 2. 안전 주의 사항 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴(Acetonitrile)은 흡입이나 섭취 시 구토, 구역, 혈압변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의 식불명 등의 증상이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비 를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 부피플라스크(100 ml) 여과용 멤브레인 필터 액체크로마토그래프용 유리병 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 33

38 3.2.2 형광검출기(Fluorescence Detector, FLD) 칼럼오븐 옥타데실실릴화한한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상인 0.1% 삼불화초산용액 : 아세토니트릴(60 : 40)을 이용하여 용매를 분 당 1.0 ml로 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 시트리닌(Citrinin) 분자식 : C 13 H 14 O 5, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 에탄올(Ethanol) 메탄올(Methanol) 아세토니트릴(Acetonitrile) 삼불화초산(Trifluoroacetic acid) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 표준물질을 10 mg을 정밀하게 달아 100 ml부피플라스크에 넣는다 메탄올을 표선까지 채운다 이를 메탄올로 희석 1) 하여 표준용액으로 한다. 5.2 시험용액의 조제 시료 2.5 g을 정밀하게 달아 원심관에 넣고 에탄올 20 ml를 첨가한다 분간 초음파 처리한다 추출액을 원심분리(3,000 g, 10분)한 뒤 상등액을 취한다 이를 감압농축 한다 메탄올 1 ml에 녹여 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한다. 34

39 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건 항목 조 건 주입량 검출기 파장 10 μl 여기파장 : 335 nm, 측정파장 : 502 nm 칼럼 온도 40 이동상 0.1% 삼불화초산용액 : 100% 아세토니트릴 (60 : 40) 유속 1.0 ml/분 6.2 표준물질 크로마토그램 6.3. 계산 시트리닌 함량(mg/kg) = C (a b) / S C : 시험용액 중 시트리닌의 농도(μg/mL) a : 시험용액의 전량(mL) b : 희석배수(적용될 경우) S : 시료 채취량(g) 7. 참고문헌 7.1. S. Schmidt, A. Brockmeyer, K. Knor, G. Thielert : Bestimmung von Citrinin in Getreide, Mycotoxin Research, 19(2), , 2003.s 35

40 8. 시험 주의사항 1) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 36

41 Ⅲ 시트리닌(제2법) 1. 시험방법의 원리 시트리닌은 Penicillium cit-rinum이 생산하는 황색 색소이다. 처음에는 항생물질로 서 분리한 것이지만, 지금은 신장 독성을 야기하는 곰팡이 독의하나로 분류된다. 마 우스의 LD50은 35mg/kg(s.c.)이며, 강력한 신장장애를 일으키는 특이적 독성이 있다. 또한 신장독성이 있는 N-(3,5-dichlophenyl) succimide에서 래트를 전 처리한 후 시 트리닌을 투여하여 신장암의 발생을 확인했다. 종종 사료, 식품의 일부에서 검출된 다. 그 외에 P. viridicatum 등이 citrinin을 생산한다. Citrinin은 ochratoxin A와 더 불어, 대표적인 신장 장해를 발생시키는 물질이다. 신장에 있어서의 물의 재흡수능 을 저하시키는 것에 의해 뇨량을 증가시켜 급성 또는 만성의 네플로시스를 일으킨 다. 또한 신장암의 진행을 축진하는 작용을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 본 시험법은 시료로부터 시트리닌을 추출한 후, 액체크로마토그래프/질량검출기/ 질량검출기 이용하여 정성 분석하는 방법이다. 에탄올 추출 초음파처리 원심분리 감압농축 filtration 액체크로마토그래피 형광검출기 2. 안전 주의 사항 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴(Acetonitrile)은 흡입이나 섭취 시 구토, 구역, 혈압변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의 식불명 등의 증상이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비 를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 부피플라스크(100 ml) 여과용 멤브레인 필터 액체크로마토그래프용 유리병 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 질량검출기(Mass Selective Detector) 칼럼오븐 37

42 3.2.4 옥타데실실릴화한한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상을 충분히 흘려 액체크로마토그래프와 질량검출기를 안정화시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 시트리닌(Citrinin) 분자식 : C 13 H 14 O 5, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 에탄올(Ethanol) 메탄올(Methanol) 아세토니트릴(Acetonitrile) 삼불화초산(Trifluoroacetic acid) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 표준품을 10 mg을 정밀하게 달아 100 ml 부피플라스크에 넣는다 메탄올을 넣어 표선까지 채운다(100 μg/ml) 이를 메탄올로 희석 1) 하여 표준용액으로 한다(0.01 μg/ml). 5.2 시험용액의 조제 검체 2.5 g을 정밀하게 달아 원심관에 넣고 에탄올 20 ml를 첨가한다 분간 초음파 처리한다 추출액을 원심분리(3,000 g, 10min)한 뒤 상등액을 취한다 이를 감압농축한다 메탄올 1 ml에 녹여 0.45 μm 멤브레인필터로 여과한다. 38

43 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기 조건 항목 조건 주입량 5 μl 칼럼온도 40 이동상 A : 0.1% 개미산, B : 0.1% 개미산이 포함된 아세토니트릴 유속 0.3 ml/분 이온화 ESI, Positive 분석모드 MRM Capillary voltage 4.0 kv Corn voltage 25 V Source temperature 120 Desolvation temperature 350 Monitor ions(m/z) 251(precursor), 233(product) 표 2. 이동상 조건 시간 A용액(%) B용액(%) 표준물질 크로마토그램 39

44 7. 참고문헌 7.1. Martien C. Spanjer, Peter Rensen, Jos Scholten : LC-MS/MS multimethod for mycotoxins after single extraction and validation data for peanut, pistachio, wheat, maize, cornflake, raisin and fig, Food Additives and Contaminants, 25(4), , 시험 주의사항 1) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 40

45 Ⅲ 초산에틸 1. 시험방법의 원리 초산에틸은 식물에서 널리 발견되는 에스테르로 묽은 농도일때는 파인애플과 비슷 한 과일향과 좋은 맛을 내기때문에 식품 첨가제로 사용되어지며, 향료나 흥분제 따 위로 쓴다. 이 화합물은 용재로 우수할 뿐만 아니라, 인체에도 해가 적어 매니큐어 를 만들 때 쓰이거나, 매니큐어 제거제로도 사용된다. 초산에틸은 아세트알데히드의 아세트산이 알루미늄 에톡사이드 촉매하에서 에틸알코올 및 부탄올 등의 알코올류 와 반응하여 에스테르와 물을 형성하게 된다. 본 시험법은 초산에틸이 휘발성인 것을 이용하여 건강기능식품 중 휘발성물질을 헤드스페이스 포집법으로 추출하여 GC 칼럼을 통하여 추출된 용매를 분리하는 방법 이다. 분리된 성분은 가스크로마토그래프 불꽃이온화 검출기를 이용하여 정량한다. 헤드스페이스 포집/추출 가스크로마토그래피 불꽃이온화검출기 2. 안전 주의 사항 톨루엔(Tolune)은 섭취 시 기도에 치명적일 수 있으며 호흡기계에 자극을 일으키 고 장기간 또는 반복노출 시 장기에 손상을 일으킨다. 또한 태아 혹은 생식능력에 손상을 일으킬 수도 있으므로 환기장치를 설치하고 보안경으로 눈 보호, 실험복 착 용 및 안전장갑 등의 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 GC용 유리병 (2 ml) 헤드스페이스샘플러용 스크류캡 유리병 (25 ml) 부피플라스크 (100 ml, 50 ml) 막자사발 가스타이트시린지 100, 50 μl 3.2 분석장비 가스크로마토그래프/불꽃이온화검출기 혹은 질량분석기 헤드스페이스샘플러 (HeadSpaceSampler) Wax 칼럼 (0.25 mm i.d. 30m 0.25 μm film thickness), FFAP 칼럼 (0.25 mm i.d. 30m 0.25 μm film thickness) 혹은 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 가스크로마토그래프는 가스를 0.5 ml/min.으로 충분한 시간동안 흘려, 검출기 41

46 및 칼럼을 안정화시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 초산에틸 Ethyl acetate (EA) 분자식 : CH 3 COOC 2 H 5, 분자량 : 88.11, CAS No. : O O 4.2 일반시약 톨루엔(Toluene, HPLC grade) 증류수(Distilled water, HPLC grade) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 초산에틸 1.00 ml을 취하여 100 ml 부피플라스크에 넣는다 부피플라스크에 톨루엔을 넣어 표선까지 채운 다음, 표준원액 1) 으로 사용 한다 의 표준원액을 톨루엔으로 적절히 희석 2) 하여 1250, 2500, 5000 ppm 표준용액으로 사용한다 상기용액은 휘발성이 있으므로 휘발성을 최소화한 바이알에 넣는다. 5.2 검량선 작성용액의 조제 균질화 한 공시험용(초산에틸이 검출되지 않는)시료 5 g을 정밀히 취한다 위의 시료를 25 ml 헤드스페이스샘플러용 유리병에 넣는다 여기에 가스타이트 시린지를 이용하여 표준원액 1250, 2500, 5000 ppm인 표준용액 100 μl를 각각 넣은 후 다음의 시험조작에서 검량선 작성용액 으로 사용한다. 이 용액은 각각 1, 2, 5 ppm의 농도가 된다. 5.3 시험용액의 조제 균질화 한 시료 5 g을 정밀히 취한다 위의 시료를 25 ml 헤드스페이스샘플러용 유리병에 넣은 후 시험용액으 로 사용한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 다음 표 1의 조건으로 사용하되 적용되는 기기나 칼럼에 따라 수정이 필요할 수 있다. 42

47 표 1. 가스크로마토그래프/헤드스페이스샘플러 조건(예) 구분 항목 조건 가스크로마토 그래프 고정상 칼럼온도 캐리어가스 및 유량 FFAP 칼럼(0.25 mm i.d. 30 m 0.25 μm) 초기조건 : 40 에서 5분 정체 승온 1단계 1) : 3 /분으로 50 후 5분 정체 승온 2단계 2) : 50 /분으로 150 후 3분 정체 질소 또는 헬륨, 0.5 ml/분 분할비율 40 : 1 주입량 100 μl 헤드스페이스 샘플러 주입기 온도 120 가열 온도 및 방법 80, 흔들면서 가열 가열 시간 10분 검출기 온도 250 분석시간 분석시간 20분 6.2. 결과 분석 표준물질 크로마토그램 결과 해석 표준물질 크로마토그램 및 스펙트럼 위의 조건으로 얻어진 크로마토그램 상의 피이크는 어느 측정조건에서도 43

48 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다 정성시험 위의 조건으로 얻어진 크로마토그램 상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다 정량시험 검량선 작성 혼합액을 가스크로마토그래프에 주입함으로서 용매들의 검출 기 반응을 측정하여 각 성분에 대한 면적을 구하고 검량선을 작성하여 시료 중 초산에틸의 잔류량을 구한다. 6.3 계산 초산에틸 (μg/g) = A x (B/C) x D A : 시험용액 중 초산에칠 농도(μg/mL) B : 시험용액 전량(mL) C : 시료 채취량(g) D : 표준품 순도(%) 7. 참고문헌 7.1. Nishith Vora and Prodromos Daoutidis : Analys,is and Nonlinear Control of an Ethyl Acetate Reactive Distillation Column, Proceedings of the Americaln Control Conference, , SB PURANIK, VARUN R PAWAR, N LALITHA, PN SANJAY PAI AND GK RAO : RESIDUAL SOLVENT ANALYSIS IN HYDROCHLORIDE SALTS OF ACTIVE PHARMACEUTICAL INGREDIENTS, Pak Journal Pharmacy Science. Vol.22, No.4, , 시험 주의사항 1) 다음과 같이 정밀하게 용액을 취하기 위해서는 반드시 해당 용량의 홀 피펫을 사용하여야 한다. (1.00mL/100mL 10,000ppm) 2) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 44

49 Ⅲ.3 개별 성분별 시험법 Ⅲ.3.1 비타민 Ⅲ 비타민 A Ⅲ 비타민 A(제1법) 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 시료 중에 존재하는 비타민A를 비누화시킨 후 벤젠으로 추출하여 감 압 건조시키고 잔류물을 클로로포름으로 희석을 시킨 것으로 삼염화안티몬(Antimony trichloride)과 정색반응 1) 을 시켜 청색으로 변색된 정도에 따라 대조액과 비교하여 분광 광도계를 통하여 파장 620 nm에서 흡광도를 측정하는 방법이다. 비누화 진탕 및 감압건조 분광광도계 2. 안전 주의 사항 시험 중 수산화나트륨(Sodium hydroxide)은 삼키면 유해하며 호흡기도, 피부, 눈, 점막에 화상을 입힐 수 있고 물과 접촉 시 반응 할 수 보안경으로 눈 보호, 실험복 착용 및 안전장갑 등의 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 클로로포름은 신경을 마비시키는 작용을 하므로 마취제로서 사용되지만 과량복용 이나 주사 시 심장을 멈춰 죽음에 이르게 하며, 장기간 복용이나 노출은 간, 폐, 신 장에 해를 주므로 환기가 잘되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여 야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 증류플라스크 분액깔대기 질소가스 감압농축기 3.2 분석장비 분광광도계 3.3 분석장비의 준비 45

50 두 개의 셀에 클로로포름 0.6 ml과 정색용액 3 ml을 가하여 분광광도계의 영점을 맞춘다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 Retinyl Palmitate(all trans Retinol palmitate; Vitamin A palmitate) 분자식 : C 36 H 60 O 2, 분자량 : , CAS No. : Retinyl Acetate(Retinol acetate; Vitamin A acetate) 분자식 : C 22 H 32 O 2, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 에테르(Ether) 벤젠(Benzene) 에탄올(Ethanol) 빙초산(Glacial acetic acid) 클로로포름(Chloroform) 무수초산(Acetic anhydride) 삼염화안티몬(Antimony trichloride) 황산(Sulfuric acid) 증류수(Distilled water) 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 산화크롬(Chromium oxide) 무수황산나트륨(Sodium sulfate anhydride) 수산화칼륨(Potassium hydroxide) 아연(Zinc) 피로갈롤(pyrogallol) 5. 시험과정 5.1 시약 제조 무알데히드에탄올 에탄올 1 L에 50% 수산화칼륨용액 5 ml 및 아연분말 5 g을 가해 약 2시간 46

51 환류냉각기를 달아 가온한 후 증류한다. 단, 처음 및 마지막 증류액 각각 10%를 버린다 초산 빙초산 1 L에 대해서 산화크롬 10 g을 가해 2회 증류한다. 116 이상의 증류액을 취한다 클로로포름 클로로포름 1 L를 황산 20~30 ml씩으로 황산층이 착색되지 않을 때까지 수 회 씻는다. 수세하여 황산을 제거하고, 15~20% 수산화나트륨용액 20~ 30 ml로 2~3회 씻은 후 수세한다. 여기에 탄산칼륨을 가하여 혼합한 후 냉암소에 약 12시간 이상 방치하고 탈수 2) 시켜 증류한다. 정제한 클로로포 름은 갈색병에 넣어 냉동에 보존한다. 보존 중 흡습하지 않도록 주의한다. 이 클로로포름은 적어도 1주간은 사용이 가능하다 정색용액 3) 삼염화안티몬 20 g을 상기의 클로로포름 100 ml에 녹여 하룻밤 방치한 후 무수초산 2 ml를 가해 콜크마개나 폴리에틸렌마개를 하여 차광하여 상온으로 보존한다. 이 용액은 흡습성이 강하고 변질이 쉬우므로 조제 후 1주간 내에 사용한다 표준비타민 A 비타민 A유[1 g 중 비타민 A 10,000국제단위(IU) 함유]를 사용한다. 5.2 표준용액 제조 표준비타민 A를 약 100~150단위로 정밀히 측정한다 측정한 표준비타민 A를 증류플라스크에 취한다 피로갈롤100 mg, 하이드로퀴논 100 mg을 가한다 최소한 3 ml 또는 동량의 50% 수산화칼륨용액 및 그 8배량의 무알데히 드에탄올을 가한다 비등 수욕 상에서 플라스크를 흔들어주면서 30분간 비누화한다 비누화한 후 냉각시키고 벤젠 100 ml을 가한다 초간 격렬히 흔든다. 침전이 있으면 그것이 침전될 때까지 방치한다 위의 용액 250~300 ml 분액깔대기에 옮긴다. 이 때 침전물이 발생한 경 우 침전물을 씻어 옮길 필요는 없다 분액깔때기에 1 N 수산화칼륨액 100 ml을 가하여 15초간 흔들어준 후 방치 한다 혼탁된 물층은 버리고 벤젠층에 0.5 N 수산화칼륨액 40 ml을 가하여 격 렬히 진탕한다 벤젠층을 증류수 40 ml로 최소한 4회 가하여 15초간 격렬하게 진탕 혼 합하여 수세를 반복한다. 이 때 수세액에 페놀프탈레인시액으로 알칼리 의 반응이 나타내지 않을 때까지 수세한다. 47

52 분액깔대기를 정치하여 벤젠층과 물층을 완전히 분리한다 벤젠층에 산화방지제로서 소량의 디부틸히드록시톨루엔을 가한다 위의 용액의 벤젠층 50 ml을 100 ml 증류플라스크에 정확히 취한다 수욕 상에서 짧은 시간 내에 감압 농축시킨다 불활성 가스로 증류플라스크 내부를 건조시킨다 잔류물에 직접 클로로포름으로 녹여서 1 ml 중 비타민A가 2, 4, 6, 10 μ g을 함유하는 용액을 조제한다. 5.3 시험용액 제조 시료 약 100~150 unit에 상당하는 양 4) 을 취한다 표준용액 제조 방법 [5.2.2] ~ [5.2.16]까지의 방법과 동일하다 상기 방법 결과 나온 잔류물에 클로로포름을 가하여 10~20 unit/ml이 되게 희석한다. 5.4 시험조작 시험용액 0.3 ml과 클로로포름 0.3 ml을 정확히 셀에 취한다 정색용액 3 ml 5) 을 가한다 대조셀에 클로로포름 0.6 ml을 정확히 취한 후 정색용액 3 ml을 가한다 파장 620 nm에서 흡광도를 측정 6) 한다 표준용액도 [5.4.1] ~ [5.4.4] 방법대로 하여 검량선을 작성한다. 6. 분석 및 계산 비타민 A 함량(μg/100g) = A B (100/C) 2 A : 시험용액 중 비타민 A 농도(μg/mL) B : 시험용액의 전량(mL) C : 시료 채취량(g) 7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 시험 주의사항 1) 비색법 중에서는 감도가 높은 방법이지만, 수분의 존재로는 반응액이 혼탁해져 정량이 방해되기 때문에, 수분제거에 충분한 주의를 요한다. 2) 탈수시간은 20시간을 넘지 않도록 한다. 탈수의 확인은 1~2개의 청색 실리카 겔을 넣어 곧바로 방치해서 변색하지 않는 것을 확인한다. 3) 특이한 냄새를 갖는 액체로, 공기 중 수분과 반응해서 HCl을 발생하고, 염화안 티모닐(SbOCl)을 생성한다. 취급은 주의해서 빨리 행하고, 유리기구나 광도계 cell에 묻은 SbOCl은 희염산으로 세척해서 제거 하든가, 구연산 또는 주석산, 48

53 또는 주석산칼륨나트륨용액으로 씻어 제거한다. 4) 시료는 통상 10 g 이하이지만, 5 g 이하가 바람직하다. 5) SbCl 3 시액의 사용량은 반응액조 크기에 따라 3~10 ml을 사용한다. 이 경우 피험액의 사용액량도 0.3~1.0 ml을 사용하고 있다. 또, 피험액과 표준용액은 동일조건에서 반응시킨다. 6) 반응액의 발색최대흡광도는, 통상 SbCl 3 시액을 가한후부터 4 5초후라고 되어 있다. 그러나, 발색시액 혼화 후 5초에서 흡광도를 읽는다는 것은 매우 곤란하 다. 최대흡광도에 도달한 후 20초 정도까지는 흡광도의 감소가 완만하므로 실 제 위의 시간범위 내에 일정 시간을 정해 (예를들면 15초후) 흡광도를 읽는다. 49

54 Ⅲ 비타민 A(제2법) 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 비타민 A가 자외선하에서 강한 형광을 발하는 특성을 이용하여, 시 료 중 비타민 A를 에탄올과 피로갈롤에탄올용액을 이용하여 비누화시키고 석유에 테르를 이용하여 추출 후 갑압건조시켜 이소프로판올로 녹인 것을 옥타데실실릴화한 칼럼을 통하여 비타민 A를 분리하는 방법으로 형광검출기로 정량한다. 비누화 추출 및 감압농축 HPLC FLD 2. 안전 주의 사항 석유 에테르(petroleum ether)는 호흡기도 자극, 피부 자극, 눈 자극, 중추 신경 계 통 억제의 건강 위험성이 있고 물리적 위험으로는 가연성이 매우 높은 액체 또는 증기이므로 증발 연소를 야기할 수도 있고 물질의 흐름 또는 혼합에 의하여 정전기 가 발생할 수도 있어 환기가 잘 되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안 전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 용매용 일회용 실린지 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터 액체크로마토그래프용 유리병 증류플라스크(100 ml) 분액깔대기 감압농축기 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 형광검출기(Fluorescence Detector, FLD) 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상은 에탄올과 물을 95 : 5의 비율로 혼합하여 분당 1 ml씩 흘려 기기와 칼럼을 안정화 시킨다. 50

55 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 Retinyl Acetate(Retinol acetate; Vitamin A acetate) 분자식 : C 22 H 32 O 2, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 에탄올(Ethanol) 증류수(Distilled water) 수산화칼륨(Potassium hydroxide) 석유에테르(Petroleum ether) 무수황산나트륨(Sodium sulfate anhydride) 이소프로판올(Isopropanol) 피로갈롤(Pyrogallol) 5. 시험과정 5.1 시약 제조 무알데히드에탄올 에탄올 1 L에 50% 수산화칼륨용액 5 ml 및 아연분말 5 g을 가해 약 2시간 환류 후 증류한다. 단, 처음 및 마지막 증류액 각각 10%는 버린다 무수황산나트륨 무수황산나트륨을 2시간 이상 120 에서 가열한 후 데시케이터 방냉한 후 보관한다. 5.2 표준용액 제조 비타민 A 아세테이트 결정을 비누화 시켜 비타민 A 알코올로 하여 국제 단위(IU) 또는 μg단위로 환산한다 이소프로판올로 희석하여 각각 1 ml 중 5, 25, 50 IU가 함유되도록 한다. 사용 시 마다 제조한다. 5.3 시험용액 제조 비타민 A 약 20~30 IU(6~9 μg) 1) 에 상당하는 시료를 정밀히 취하여 증류 플라스크에 넣는다 에탄올 30 ml, 피로갈롤에탄올용액(1 10) 1 ml, 90% 수산화칼륨용액 3 ml을 넣고 수욕 중에 30분간 비누화 시킨다 신속히 냉각하여 물 30 ml을 가하여 200 ml 분액깔대기에 옮긴다 증류플라스크를 물 10 ml로 씻어 분액깔대기에 합친다 증류플라스크를 석유에테르 30 ml로 씻은 후 분액깔대기에 합한다. 51

56 5.3.6 물층은 석유에테르 30 ml씩 2회 추출한다 위의 용액을 물 10 ml 1회, 이어 50 ml씩으로 씻는다. 이 때 수세액에 페놀프탈레인시액으로 알칼리의 반응이 나타내지 않을 때까지 수세한다 분액깔대기에서 물층을 충분히 분리한 석유에테르층을 취하여 무수황산나 트륨으로 탈수하여 증류플라스크에 옮긴다 황산나트륨을 석유에테르 10 ml씩으로 2회 씻은 후 [5.3.8]의 증류플라스 크에 가한다 석유에테르층을 40~50 에서 감압 농축한다 위의 잔류물을 이소프로판올으로 녹여 1.0 ml 2) 로 한 것을 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항 목 조 건 주입량 20 μl 칼럼온도 35 이동상 에탄올 : 물 (95 : 5) 검출기 파장 유량 여기파장 340 nm, 측정파장 460 nm 0.5 ml/분 6.2 표준물질 크로마토그램 52

57 6.3 계산 비타민 A 함량(IU * /g) = A x ((B x C)/D) A : 시험용액 중 비타민 A의 농도(IU/mL) B : 시험용액의 전량(mL) C : 시험용액의 희석배수 D : 시료 채취량(g) * : 비타민 A의 단위환산 : 1 μg = 3.33 IU 7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 시험 주의사항 1) 유지류는 그대로 시료로 하지만, 그 외는 chloroform methanol 혼합액 등으 로 지질을 추출해서 시료로 한다. 2) 비타민 A 함량이 적은 시료에서는 불검화물 추출잔류물을 녹일 때 isopropanol의 량(VmL)을 0.5mL 0.2mL과 같이 적게하면 좋다. 53

58 Ⅲ 베타카로틴 1. 시험방법의 원리 베타카로틴은 알파카로틴의 이성체로 천연 카로티노이드의 한 종류이며 9개의 isoprene units으로 구성되어 있다. 비타민 A의 전구체인 베타카로틴은 장과 간 에서 레티놀로 전환되며, 이는 다시 비타민 A의 형태로 전환되어 비타민 A의 활성을 가진다. 비타민 A는 정상적인 시각 기능을 유지하는데 중요한 역할을 한 다. 또한 베타카로틴은 항산화제로써 신체 보호의 기능을 한다. 베타카로틴은 당근과 시금치와 같은 녹황색 채소와 해조류에 많이 함유되어 있 다. 현재 베타카로틴 제품은 조류추출카로틴함유제품, 녹엽식물추출카로틴함유제 품, 당근추출카로틴함유제품으로, 합성베타카로틴을 원료로 사용하여서는 아니 되고, 각각 수중에서 증식하는 식용조류, 식용녹엽식물, 당근으로부터 베타카로 틴을 추출하여 식용에 적합하도록 제조 가공한 것을 말한다. 본 시험법은 검화과정을 거쳐 시료로부터 베타카로틴을 추출한 후 고속액체크로 마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대흡수파장 인 450 nm에서 검출하여 정량한다. 베타카로틴 추출 검화 / 냉각 감압 건조 고속액체크로마토그래피 자외부흡광광도검출기 2. 안전 주의 사항 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴(Acetonitrile)은 흡입이나 섭취 시 구 토, 구역, 혈압변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의식불명 등의 증 상이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 또 다른 이동상인. 메탄올의 경우 포름알데하이드 제조나 부동액으로 사용되는 독성을 갖는 무색의 가연성 알코올로서, 생체 내에서 알코올탈수소효소에 의해 포 름알데하이드나 포름산이 되기 때문에 독성이 강하다. 30mL 이하를 섭취하더라도 사망에 이르며, 만성독성으로는 실명을 초래하는 것으로 알려져 있으므로 환기가 잘되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 환류냉각기 54

59 3.1.2 수욕조 갈색분액깔대기(250 ml) 냉각관 여과용 멤브레인 필터 감압건조기 액체크로마토그래프용 유리병 용매용 일회용 실린지 갈색플라스크(100 ml 또는 250 ml) 부피플라스크(200 ml) 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 칼럼오븐 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상인 아세토니트릴 : 메탄올(85 : 15)과 디클로로메탄을 사용하여 용매를 분 당 1.0 ml를 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 베타 카로틴(β-carotene) 분자식 : C 40 H 56, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 메탄올(Methanol) 아세토니트릴(Acetonitrile) 이소프로판올(2-propanol) 디클로로메탄(Dichloromethane) 에탄올(Ethanol) 피로갈롤(Pyrogallol) 수산화칼륨(Potassium hydroxide) 석유에테르(Petroleum ether) 55

60 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 베타카로틴을 10 mg을 정밀히 취하여 200 ml 부피플라스크에 넣는다 이소프로판올을 이용하여 완전히 녹인다(50 μg/ml) 이소프로판올로 적당히 희석한다(예. 25, 12.5, 6.25 μg/ml) μm 멤브레인필터로 여과하여 표준용액으로 한다. 5.2 시험용액의 조제 베타카로틴이 5~10 μg 함유되도록 시료를 취한다 에탄올 30 ml, 10% 피로갈롤에탄올용액 1 ml를 가하여 잘 섞은 후 수산 화칼륨용액(9 10) 3 ml를 가한다 환류냉각기를 부착하여 비등수욕 중에서 30분간 비누화 1) 시킨다. 단, 검체가 유지를 함유하지 않는 경우 비누화과정을 생략할 수 있다 이를 신속히 냉각하여 실온으로 한 후 분액깔대기로 옮긴다 냉각관 수기를 증류수 30 ml로 씻어낸 후, 씻은 액은 분액깔대기에 합하여 잘 혼합한다 방치하여 층 분리를 완전히 시킨 후 물층은 별도의 갈색분액깔대기에 옮 긴다 물층은 석유에테르 30 ml로 추출 2) 한다(2회 반복) 모든 석유에테르 추출액을 합하여 증류수 10 ml 1회, 이어 50 ml(페놀프 탈레인시액으로 정색되지 않을 때까지) 씻는다 물층을 완전히 분리한 후, 석유에테르층을 취하여 무수황산나트륨을 가해 탈 수하고 석유에테르층을 갈색플라스크에 옮긴다 이어 위에서 사용한 황산나트륨을 석유에틸에테르 10 ml씩으로 2회 씻고, 씻은 액을 [5.2.9]의 갈색 플라스크에 더한다 석유에테르 추출액을 모두 합하여 40~50 에서 감압 건조한다 잔류물을 이소프로판올로 녹여 1 ml로 한 것을 시험용액으로 한다. 56

61 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 액체크로마토그래프 조건 항목 조건 주입량 20 μl 검출기 파장 450 nm 칼럼 온도 40 이동상 A용매 : 아세토니트릴 : 메탄올 (85 : 15), B 용매 : 디클로로메탄 용매 조건 A용매(70%), B용매(30%) 유속 1.0 ml/분 6.2 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 베타카로틴(mg/g) = C (a b)/s 1/1,000 C : 시험용액 중의 베타카로틴 농도(μg/mL) a : 시험용액의 양(mL) b : 희석배수(적용될 경우) S : 시료 채취량(g) 1/1,000 : 단위 환산 계수 57

62 7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, Dinesh Talwar, Tom KK Ha, Josephine Cooney, Christine Brownlee, Denis St JO 'Reilly : A routine method for the simultaneous measurement of retinol, a-tocopherol and five carotenoids in human plasma by reverse phase HPLC, Clinica Chimica Acta, 270, , 시험 주의사항 1) 검화시 목적하는 온도가 되었을 때부터 정확히 시간을 지켜야 한다. 2) 석유에테르 추출 시 에멀전이 되어 분리가 안 되는 경우를 방지하기 위하여 초기에는 약하게 흔들어서 에테르 증기를 완전히 뺀 다음 격렬하 게 흔들어서 추출한다. 58

63 Ⅲ 비타민 D 1. 시험방법의 원리 비타민 D는 측쇄구조가 다른 D2(ergocalciferol)형 과 D3(cholecalciferol)형이 있고, 사람을 포함한 포유류에 있어서 양자는 동일하게 대사활성화 되어 같은 생리효력을 나타낸다.(이하 D2 와 D3를 총칭하는 의미로 D를 사용한다.) 비타민 D는 간장에서 24-hydroxy vitamin D로 대체된 후, 신장에서 활성형 1,25-hydroxy vitamin D로 된 다. 활성형 비타민 D는 구루병, 골연화증, 골다공증 등의 골질환의 치료에 유효할 뿐만 아니라, 골수성 백혈병 세포를 정당한 marcrophage로 분화유도하거나, 건선치 료에 유효하다는 것이 밝혀져 주목을 받고 있다. WHO에서 결정 D3의 μg이 1 IU(국제단위)라고 정하고 있다. 본 시험법은 시료 중 비타민 D를 에탄올과 피로 갈롤에탄올용액을 이용하여 비누화시키고 벤젠용액을 이용하여 추출 후 갑압건조 시켜 아세토니트릴 : 메탄올(1 : 1)용액으로 녹인 것을 옥타데실실릴화한 칼럼에서 비 타민 D를 분리 농축시킨 후 실리카겔 칼럼을 이용하여 비타민 D를 분리하는 방법 으로 자외부흡광광도검출기를 이용하여 최대흡수파장인 254 nm에서 분리하여 정 량한다. 진탕 혼합 감압 농축 HPLC 자외부흡광광도검출기 2. 안전 주의 사항 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴은 흡입이나 섭취시 구토, 구역질, 혈압 변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의식불명 등의 증상이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 헥산은 상기도를 약간 자극하고 중추신경계를 억제한다. 만성폭로하면 말초신경장 해를 초래한다. 2,000ppm 농도에 10분 폭로될 때에는 아무런 작용이 없으나 5,000ppm에서는 현기증이 생긴다. 구역, 두통, 눈과 목의 자극증상이 1,400~1,500ppm 농도에서 생기며 탈지작용이 있 으므로 오래 동안 폭로되면 피부를 자극하게 된다. 피부에 닿으면 바로 물로 씻어 내고 사용할 때에는 충분히 환기를 해야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 용매용 일회용 실린지 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터 59

64 3.1.3 액체크로마토그래프용 유리병 증류플라스크(100 ml) 분액깔대기 감압농축기 여과지(FH Type, pore size 0.5 μm) 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 7.5 mm, 길이300 mm, 충진재 Octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 순상형 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 Silica gel) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이 시험법에 사용되는 이동상은 2가지가 있다. 하나는 아세토니트릴과 메탄올을 1 : 1비율로 혼합한 용매인데 이것은 비타민 D를 칼럼안에 농축시키기 위해 비타민 D와 섞이지 않는 용매, 즉 분취용 이동상으로 쓰인다. 다른 또 하나의 용매는 0.4% 이소프로판올 헥산용액이다. 이것은 칼럼 안에 농축되어있는 비 타민 D와 섞이는 용매, 즉 분석용 이동상으로 쓰인다. 처음에는 일단 칼럼에 농축을 비타민 D를 농축시켜야 하기 때문에 분취용 이동상인 아세토니트릴과 메탄올을 1 : 1비율로 섞은 용매를 분당 2.0 ml씩 흐르게 하여 기기와 칼럼 을 안정화시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 Ergocalciferol(Calciferol; Ercalciol; Ergocalciferol; Ergosterol irradiated; Irradiated ergosterol; Vitamin D 2 ) 분자식 : C 28 H 44 O, 분자량 : , CAS No. : Cholecalciferol((+)-Vitamin D 3 ; 7-Dehydrocholesterol activated; Calciol; Activated 7-dehydrocholesterol; Cholecalciferol) 60

65 분자식 : C 27 H 44 O, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 에탄올(Ethanol) 벤젠(Benzene) 아세토니트릴(Acetonitrile) 헥산(n-Hexane) 메탄올(Methanol) 피로갈롤(Pyrogallol) 5. 시험과정 5.1 시약 제조 무알데히드에탄올 에탄올 1 L에 50% 수산화칼륨용액 5 ml 및 아연분말 5 g을 가해 약 2시간 환류 후 증류한다. 단, 처음 및 마지막 증류액 각각 10%는 버린다. 5.2 표준용액 제조 비타민 D 2 또는 D 3 를 무알데히드에탄올에 녹인 후 적절하게 희석하여 표준용액으로 사용한다. 5.3 시험용액 제조 시료가 고체인 경우 초고속마쇄기로 잘게 마쇄한다 비타민 D 2 IU(0.05 μg) 이상 함유한 시료를 증류플라스크에 정밀히 취 한다 피로갈롤 : 에탄올(1 10)용액 40 ml을 가하여 약하게 진탕 혼합한다 % 수산화칼륨 10 ml을 가하고 1) 환류냉각기에 부착하여 수욕중에서 30 분간 가열 비누화 2) 한다 냉각 후 벤젠 100 ml을 가하여 15초간 강하게 진탕 혼합한다. 침전이 생 기면 이것이 가라앉을 때까지 방치한다 ml 분액깔대기에 옮기고 1 N 수산화칼륨 100 ml을 가하여 15초간 강하게 진탕 혼합한다 방치하여 층분리를 한후 혼탁한 물층은 버린다 벤젠층에 0.5 N 수산화칼륨 40 ml을 넣어 진탕 혼합한다. 61

66 5.3.9 벤젠층에 적어도 4회 매회 15초씩 물 40 ml로 세척한다. 세척액이 페놀프 탈레인시액으로 알칼리반응을 나타내지 않을 때까지 세척한다 분액깔대기를 수 분간 방치하여 물 한방울까지 분리하여 물층을 제거한다 벤젠용액 80 ml을 농축플라스크에 취하여 40 이하에서 용매를 감압농축 한다 잔류물에 벤젠 5 ml을 가하여 녹이고 이 액 4.5 ml을 환저플라스크에 취하여 감압농축한다 잔류물에 아세토니트릴 : 메탄올(1 : 1)용액 500 μl를 정확하게 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다. 5.4 정량시험 단계 분취용 고속액체크로마토그래피 시험용액 200 μl를 정확히 취해 제1단계 고속액체크로마토그래피에 주입 하여 분획포집기로 비타민D 획분을 분취한다(비타민D 표준용액의 크로마 토그램으로 비타민D가 검출기에 도달하는 시간을 측정하여 피크가 검출기 에 도달하는 전후 30초 동안 분액을 받을 수 있도록 예비실험으로 분석조 건을 준비한다) 제2단계(분석용) 고속액체크로마토그래피 제1단계에서 얻은 비타민D 획분의 용매를 감압농축하여 잔류물에 0.4 % 이소프로판올 헥산 200 μl를 정확히 가하여 녹인다. 이 용액 100 μl를 정확히 취하여 제2단계 고속액체크로마토그래피에 주입하여 얻어진 크로 마토그램에 나타난 비타민D의 피크의 높이 또는 면적을 측정한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 제 1단계(분취용) 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항목 조건 칼럼온도 35 이동상 아세토니트릴 : 메탄올 = (1 : 1) 검출기 파장 유량 254 nm 2.0 ml/분 62

67 표 2. 제 2단계(분석용) 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항목 조건 칼럼온도 35 이동상 검출기 파장 유량 0.4% 이소프로판올 헥산용액 254 nm 1.6 ml/분 6.2 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 계산식 비타민 D(IU/100g) = P sa P st S a 시료 채취량(g) 100 S P st P sa a : 비타민 D 표준용액의 농도(IU/mL) : 비타민 D 표준용액의 피크의 높이 또는 면적 : 시료에 대한 피크의 높이 또는 면적 : 시험용액의 전량(mL) 63

68 7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 시험 주의사항 1) 지질함량에 따라 적당히 증감한다. 대개 지질 1g이 수산화칼륨 1g 상당한다. 2) 비타민 D 는 가열 검화시 일부분 가역적으로 열 이성화되어 previtamin D로 전환하는 것으로 알려져 있다. 이러한 열 이성화 반응은 습도에만 의존하는 가 역반응으로, 습도가 일정하면 거의 대부분 일정한 비율로 진행한다. 따라서 본 법에서는 비타민 D표준용액에 대해서도 시료와 동일한 조건하에서 가열 검화 한다. 이것에 따라 시료, 표준품 모두 같은 비율로 previtamin D로 이성화하기 때문에, 피크높이를 비교하는 것만으로 previtamin D로 이성화된 부분이 상쇄 된다. 64

69 Ⅲ 비타민 E Ⅲ 비타민 E(제1법) 1. 시험방법의 원리 비타민 E는 tocopherol이라고도 불리우는 지용성비타민이다. 토코페롤에는 크로만 핵에 붙어 메틸기의 수와 위치의 차이에 따라 α,β,γ,δ 4종류가 있고, 각각 식물섬유 등에 존재하고 있다. 천연에 존재하는 비타민 E 작용물질에는 토코페롤과는 측쇄구 조가 다른 tocotrienol이 있고, 이것도 또 α,β,γ,δ이성체가 존재하고 있다. 천연에 존 재하는 토코페롤은 d형이지만, 합성품은 dl형으로, dl-α-tocopherol이 가장 일반적으 로 사용되고 있고, 식품첨가물의 산화방지제로서도 사용이 허용되고 있다. 비타민 E 는 생체 내에서 산화방지작용을 나타낸다. 특히 생체막의 인지질에 함유된 불포화 지방산 부분의 산화를 방지하여 생체막을 안정화하고, 이를 통해 노화방지에 공헌 하고 있는 것으로 주목을 받고 있다. 사람에서는 명백한 결핍증은 없지만, 용혈, 빈 혈, 리포스틴 형 색소침착, 크레아틴뇨증 등이 비타민 E 결핍에 의해 기인하는 것으 로 알려져 있다. 비타민 E의 국제단위(IU)는, dl-α-tocopheryl acetate, d-α-tocopheryl acetate, dl-α -tocopherol, d-α-tocopherol 각 1 mg이 각각, 1, 1.36, 1.1, 1.49 IU로 정해져 있다. 본 시험법은 비타민 E를 염화제이철과 반응시켜 생성된 Fe 2+ 에 α,α -dipyridyl을 반응시 키면 착염이 형성되면서 나타내는 홍색을 비색정량하는 원리를 이용하여 시료 중 비타민 E를 에탄올과 피로갈롤에탄올용액을 이용하여 비누화시키고 석유에테르용액 을 이용하여 추출 후 갑압건조시켜 에탄올로 녹인 후 염화 제이철에탄올용액과 디 피리딜에탄올용액으로 정색반응을 시킨 후 대조액을 에탄올로 하여 분광광도계를 이용하여 파장 520 nm에서 흡광도를 측정한다. 비누화 추출 및 감압농축 분광광도계 2. 안전 주의 사항 석유 에테르(petroleum ether)는 호흡기도 자극, 피부 자극, 눈 자극, 중추 신경 계 통 억제의 건강 위험성이 있고 물리적 위험으로는 가연성이 매우 높은 액체 또는 증기이므로 증발 연소를 야기할 수도 있고 물질의 흐름 또는 혼합에 의하여 정전기 65

70 가 발생할 수도 있어 환기가 잘 되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안 전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 증류플라스크(100 ml) 분액깔대기(Sperate funnel) 감압농축기(Vacuum evaporator) 3.2 분석장비 분광광도계 3.3 분석장비의 준비 분광광도계의 0점을 맞추기 위해 에탄올을 두개의 셀에 담아 0점을 맞춘다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 α-tocopherol((±)-α-tocopherol; DL-all-rac-α-Tocopherol; Vitamin E) 분자식 : C 29 H 50 O 2, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 에탄올(Ethanol) 피로갈롤(Pyrogallol) 증류수(Distilled water) 수산화칼륨(Potassium hydroxide) 석유에테르(Petroleum ether) 무수황산나트륨(Sodium sulfate anhydride) 5. 시험과정 5.1 시약 제조 정색용액 : 0.5%, α, α'-디피리딜에탄올용액 1) 염화제이철에탄올용액 염화제이철 0.2 g을 에탄올 2) 에 녹여 100 ml로 한다 석유에테르 석유에테르에 1/10량의 황산을 가하고 황산층이 착색되지 않을 때까지 세 척하고 1회 수세한 다음, 순차로 10% NaOH 용액 및 물로 수세한다. 세정 66

71 한 석유에테르층에 무수황산나트륨을 가하여 탈수한 다음 증류하여 30~ 60 에서 유분을 취한다. 5.2 표준용액 제조 α-토코페롤 약 20 mg을 정밀히 측정한다 ml 부피플라스크에 취하고 에탄올을 가하여 표선까지 맞춘다. 5.3 시험용액 제조 토코페롤 약 0.5~1 mg에 상당하는 시료를 정밀히 취하여 증류플라스크에 넣는다 에탄올 30 ml, 피로갈롤에탄올용액(1 10) 1 ml, 90% 수산화칼륨용액 3 ml을 넣고 수욕 중에 30분간 비누화 3) 시킨다 신속히 냉각하여 물 30 ml을 가하여 200 ml 분액깔대기에 옮긴다 증류플라스크를 물 10 ml로 씻어 분액깔대기에 합친다 증류플라스크를 석유에테르 30 ml로 씻은 후 분액깔대기에 합한다 물층은 석유에테르 30 ml씩 2회 추출한다 위의 용액을 물 10 ml 1회, 이어 50 ml씩으로 씻는다. 페놀프탈레인시액 으로 정색이 되지 않을 때까지 씻는다 분액깔대기에서 물층을 충분히 분리한 석유에테르층을 취하여 무수황산나 트륨으로 탈수하여 증류플라스크에 옮긴다 황산나트륨을 석유에테르 10 ml씩으로 2회 씻은 후 [4.3.8]의 증류플라스 크에 가한다 석유에테르층을 60 에서 감압 농축한다 위의 잔류물을 에탄올 5 ml 녹여 25 ml부피 플라스크에 옮긴다. (2회반복) 위의 부피플라스크에 에탄올을 넣어 표선까지 맞춘다. 4) 5.4 시험조작 시험용액 5 ml과 α-토코페롤용액 1 ml을 25 ml 부피플라스크에 취한다 각각에 염화제이철에탄올용액 1 ml과 0.5% α, α -디피리딜에탄올용액 1 ml을 취한다 에탄올을 가하여 표선까지 맞춘다 대조액은 시험용액과 표준용액 대신에 에탄올 1 ml을 취하여 위 방법으 로 조작한 것으로 한다. 6. 계산 6.1 총토코페롤 함량(mg/100g) = A x (B / C) (25 / 5) (1/D) A : 시험용액 중 베타카로틴의 농도(mg/mL) B : 시험용액의 흡광도 C : 표준용액의 흡광도 D : 시료 채취량(g) 67

72 7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 시험 주의사항 1) 비타민 E 이외에도 Fe 3+ 을 Fe 2+ 으로 환원하는 물질이 존재하면, 정량을 방해하 기 때문에 비타민 E 특이성이라는 점에서는 미약하다. 그러나 조작이 쉽고, 정 량감도도 비교적 높은 것으로 알려져 있다. 2) 에탄올은 정제해서 물이나 알데히드를 완전히 제거할 필요가 있다. 알데히드가 존재하면 FeCl 3 를 가했을 때 갈색으로 된다. 이 경우는 비타민 A 정량에 이용 되었던 에탄올 정제법에 따른다. 3) 토코페롤은 알칼리 존재 시 공기와 접촉하면 쉽게 산화되기 때문에, 검화 할 경우 산화방지제로 피로갈롤을 첨가하고 있다. 4) 빛에 의해 산화가 촉진되기 때문에, 가능한 빛을 피해 조작하도록 한다. 68

73 Ⅲ 비타민 E(제2법) 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 일반 식품인 경우 시료 중 비타민 E를 에탄올과 피로갈롤에탄올용액 을 이용하여 비누화시키고 석유에테르용액을 이용하여 추출 후 갑압건조시켜 헥산을 가하여 녹여 형광검출기를 이용하는 방법과 유지식품의 경우 비누화조작을 생략하고 헥산으로 추출한 후 형광검출기를 이용하여 여기파장 298 nm, 측정파장 325 nm에서 검출하고 정량한다. 추출 감압농축 HPLC FLD 2. 안전 주의 사항 표준용액의 조제 시 사용되는 헥산은 상기도를 약간 자극하고 중추신경계를 억제 한다. 만성폭로하면 말초신경장해를 초래한다. 2,000ppm 농도에 10분 폭로될 때에 는 아무런 작용이 없으나 5,000ppm 에서는 현기증이 생긴다. 구역, 두통, 눈과 목의 자극증상이 1,400~1,500ppm 농도에서 생기며 탈지작용이 있으므로 오래 동안 폭로 되면 피부를 자극하게 된다. 피부에 닿으면 바로 물로 씻어내고 사용할 때에는 충 분히 환기를 해야 한다. 석유 에테르(petroleum ether)는 호흡기도 자극, 피부 자극, 눈 자극, 중추 신경 계 통 억제의 건강 위험성이 있고 물리적 위험으로는 가연성이 매우 높은 액체 또는 증기이므로 증발 연소를 야기할 수도 있고 물질의 흐름 또는 혼합에 의하여 정전기 가 발생할 수도 있어 환기가 잘 되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안 전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 용매용 일회용 실린지 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터 액체크로마토그래프용 유리병 증류플라스크(100 ml) 분액깔대기(Seperate funnel) 감압농축기 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 형광검출기(Fluorescence Detector, FLD) 69

74 3.2.3 칼럼오븐 순상형 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 Silica gel) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상으로서 핵산과 이소프로판올을 98 : 2로 혼합하여 분당 0.5 ml씩 흘려줌 으로서 칼럼과 기기를 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 α-tocopherol((±)-α-tocopherol; DL-all-rac-α-Tocopherol; Vitamin E) 분자식 : C 29 H 50 O 2, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 에탄올(Ethanol) 피로갈롤(pyrogallol) 증류수(Distilled water) 수산화칼륨(Potassium hydroxide) 석유에테르(Petroleum ether) 무수황산나트륨(Sodium sulfate anhydride) 헥산(n-Hexane) 5. 시험과정 5.1 시약 제조 에탄올 에탄올 1 L에 50% 수산화나트륨용액 5 ml 및 아연분말 5 g을 가해 약 2 시간 환류 후 증류한다 무수황산나트륨 무수황산나트륨을 120 에서 2시간 이상 가열시킨 후 데시케이터(실리카겔) 에서 방냉하고 밀전하여 보존한다. 5.2 표준용액 제조 토코페롤동족체 표준용액 토코페롤 동족체(α-, β-, γ-, δ-토코페롤)을 각각 100 mg씩 정밀히 취해 100 ml 부피플라스크에 넣는다 헥산을 넣어 표선까지 맞춘다. 70

75 각각 5 ml씩 취하여 25 ml 부피플라스크에 넣는다 헥산을 넣어 표선까지 맞춘다. 갈색유리병에 넣어 질소로 치환하여 밀전한 후 냉암소에 보관하면 1개월간 사용할 수 있다 토콜 1) 표준용액 토콜 약 100 mg을 정밀히 취해 100 ml 부피플라스크에 넣는다 헥산을 넣어 표선까지 맞춘다 ml을 취하여 25 ml 부피플라스크에 넣는다 헥산을 넣어 표선까지 맞춘다. 갈색유리병에 넣어 질소로 치환하여 밀전한 후 냉암소에 보관하면 1개월간 사용할 수 있다. 5.3 시험용액 제조(일반식품) 토코페롤로서 약 0.2 mg에 상당하는 시료 2) 를 정밀히 취하여 증류플라스크 에 넣는다 에탄올 30 ml, 피로갈롤에탄올용액(1 10) 1 ml 3), 90% 수산화칼륨용액 3 ml 4) 을 넣고 수욕 중에 30분간 비누화 시킨다 신속히 냉각하여 물 30 ml을 가하여 200 ml 분액깔대기에 옮긴다 증류플라스크를 물 10 ml로 씻어 분액깔대기 5) 에 합친다 증류플라스크를 석유에테르 30 ml로 씻은 후 분액깔대기에 합한다 물층은 석유에테르 30 ml씩 2회 추출한다 위의 용액을 물 10 ml 1회, 이어 50 ml씩으로 씻는다. 페놀프탈레인시액 으로 정색이 되지 않을 때까지 씻는다 분액깔대기에서 물층을 충분히 분리한 석유에테르층을 취하여 무수황산나 트륨으로 탈수하여 증류플라스크에 옮긴다 황산나트륨을 석유에테르 10 ml씩으로 2회 씻은 후 [4.3.8]의 증류플라스 크에 가한다 석유에테르층을 40~45 에서 감압 농축한다 위의 잔류물에 헥산 1 ml을 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다. 5.4 시험용액 제조(유지식품) 시료가 유지인 경우에는 비누화 조작을 생략하고, 고속액체크로마토그래프에 직접 주입할 수 있다 유지 약 1 g을 정밀히 취해 50 ml부피플라스크에 넣는다 헥산을 넣어 표선까지 맞춘다 위 용액의 일정량을 취해 헥산으로 희석한 것을 시험용액으로 한다. 71

76 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항목 주입량 조건 10 μl 칼럼온도 35 이동상 핵산 : 이소프로판올(98 : 2) 검출기 6) 파장 여기파장 298 nm, 측정파장 325 nm 유량 0.5 ml/분 6.2 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 일반식품 토코페롤동족체의 양(mg/100g) = S (P toc /P int ) F (100/ W) S : 시험용액에 함유된 토콜의 함량(mg) S = V C V : 시료에 첨가된 토콜표준용액의 양(mL) C : 시료에 첨가한 토콜표준용액의 농도(mg/mL) P toc : 시험용액 중 토코페롤동족체 피크의 넓이 또는 높이 72

77 P int : 시험용액 중 토콜 피크의 넓이 또는 높이 W :시료 채취량(g) F : 환산계수 Fα-δ = (C st-toc / C st-int ) (P st-int / P st-toc ) C st-toc C st-int P st-int P st-toc : 표준용액 토코페롤 동족체의 농도 : 표준용액 토콜의 농도 : 표준용액 토콜의 피크의 높이 또는 넓이 : 표준용액 토코페롤동족체 피크의 높이 또는 넓이 유지식품 토코페롤동족체의 양(mg/100g) = S (50 / D) (P toc /P int ) F (100/W) S : 시험용액에 함유된 토콜의 함량(mg) S = V C V : 시료에 첨가된 토콜표준용액의 양(mL) C : 시료에 첨가한 토콜표준용액의 농도(mg/mL) D : 시험용액 취한 양(mL) P toc P int : 시험용액 중 토코페롤동족체 피크의 넓이 또는 높이 : 시험용액 중 토콜 피크의 넓이 또는 높이 W :시료 채취량(g) F : 환산계수 Fα-δ = (C st-toc / C st-int ) (P st-int / P st-toc ) C st-toc C st-int P st-int P st-toc : 표준용액 토코페롤 동족체의 농도 : 표준용액 토콜의 농도 : 표준용액 토콜의 피크의 높이 또는 넓이 : 표준용액 토코페롤동족체 피크의 높이 또는 넓이 7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 시험 주의사항 1) 2,2,5,7,8-pentamethyl-6-hydroxychroman (C 14 H 20 O 2 ) 2) 유지류는 그대로 시료로 하지만, 그외 검체는 chloroform methanol 혼합액 등으로 지질을 추출해서 시료로 한다. 3) 비타민 E는 알칼리에 대해 불안정하기 때문에, 산화방지의 목적으로 10 % pyrogallol ethanol 혼합액을 가한다. 4) 검화가 불충분할 경우에는 에탄올과 KOH 용액을 추가한다. 5) 직사일광이 비추는 방에서는, 갈색기구를 사용하지만, 블라인드 등을 사용해 73

78 직사일광을 차단할수 있으면 특별히 기구가 갈색일 필요는 없다. 통상 실내형 광불빛은 아주 가깝지 않은 이상 거의 영향을 미치지 않는다. 6) 형광검출기외에 UV검출기를 부착한 (290 nm) 고속액체크로마토그래피법으로 도 정량가능하지만, 형광검출기에 비하면, 감도는 1/10정도로 저하한다. 74

79 Ⅲ 비타민 K 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 지용성 물질인 비타민 K가 자외선 영역에서 빛을 흡수하는 성질을 이 용하여 시료 중 비타민 K를 비누화 및 추출하여 정제 칼럼을 통해 정제된 용액을 실 리카겔을 충진된 칼럼을 이용하여 비타민 K를 분리하는 방법으로 자외부흡광광도검 출기를 이용하여 비타민 K의 최대 흡수 파장인 254 nm에서 검출하여 정량한다. 혼합 감압농축 HPLC 자외부흡광광도검출기 2. 안전 주의 사항 디클로로메탄(Dichloromethane)은 호흡기도 자극, 피부 자극, 눈 자극, 혈액 이상, 중추 신경계통 억제의 위험성이 있으며 인체에 발암 위험이 있다. 또한 단기간 피 부 접촉 및 노출 시 흡수가 일어날 수도 있으니 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 용매용 일회용 실린지 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터 액체크로마토그래프용 유리병 증류플라스크(250 ml) 분액깔대기(500 ml) 감압농축기 정제칼럼(1.0 cm id 30 cm, 유리 칼럼) 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 순상형 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 Silica gel) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상용매는 디클로로메탄과 이소프로판올을 이소옥탄에 녹여 각각 30%, 0.02%가 되게 한다. 이것을 분당 0.5 ml씩 흘려줌으로써 기기와 칼럼을 안정화 시킨다. 75

80 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 Vitamin K 1 (2-Methyl-3-phytyl-1,4-naphthoquinone; 3-Phytylmenadione; Phylloquinone; Vitamin K 1(20) ) 분자식 : C 31 H 46 O 2, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 메탄올(Methanol) 디클로로메탄(Dichloromethane) 이소옥탄(Isooctane) 아세톤(Acetone) 이소프로판올(Isopropanol) 암모니아(Ammonia) 무수황산나트륨(Sodium sulfate anhydride) 5. 시험과정 5.1 시약 제조 Conditioning용액 이소프로판올을 이소옥탄에 녹여 0.01%가 되게 한다 용출용매(이동상) 디클로로메탄과 이소프로판올을 이소옥탄에 녹여 각각 15%, 0.02%가 되게 한다 정제칼럼 60~200 메쉬 실리카 5.0 g(100 오븐에서 하룻밤 동안 활성화시킴)을 정 제 칼럼(1.0 cm id 30 cm, 유리 칼럼)에 충전하고 그 위에 무수황산나트 륨 2.0 g(100 오븐에서 하룻밤 동안 활성화시킴)을 가한다. 5.2 표준용액 제조 비타민 K 1 표준물질 1) 이소옥탄에 녹여 5 μg/ml이 되게 한다 검량선을 작성할 수 있도록 이소옥탄으로 희석하여 사용한다. 5.3 시험용액 제조 시료 일정량 2) (비타민 K 1 으로서 3.5 μg함유)을 정밀히 취한다 정밀히 취한 시료를 500 ml 분액여두에 넣는다 암모니아수 4 ml을 가한 후 60초간 흔들어 혼합한다. 76

81 5.3.4 위의 용액에 메탄올 60 ml을 가하여 혼합 후 디클로로메탄 100 ml과 이소옥탄 50 ml 혼합액을 가하여 잘 흔들어 추출한다 층 분리 후 하층액을 250 ml증류플라스크에 옮긴다 [5.3.4]의 과정을 반복하여 하층액을 [5.3.5]의 용액과 합한다 위의 용액을 75 이하에서 감압농축한다 증류플라스크를 아세톤 20 ml로 씻고 다시 농축시킨다 [5.3.8]의 과정을 3회 반복 후 질소로 충전하여 차광한 채로 밀봉한다 정제칼럼에 conditioning 용액 20 ml을 주입하고 천천히 용출 시킨다 위의 잔류물에 conditioning 용액 10 ml로 녹인 후 칼럼에 통화시켜 비타 민 K 1 을 흡착시킨다 conditioning용매를 5 ml씩 2회에 걸쳐 증류플라스크를 씻어 정제칼럼에 통과시킨다 시료의 지방 함량에 따라 용출용매를 칼럼에 통과시킨다. 시료의 지방함량 이 0.72~0.80 g이면 100 ml의 용매를, 0.72 g 이하이면 예비실험을 통해 용출액의 양을 결정한다 용출액을 250 ml 증류플라스크에 받아 75 이하로 감압 농축한다 농축액을 이소옥탄 1~2 ml로 수 회 나누어 씻어 5 ml로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건 3) (예) 항목 주입량 조건 20 μl 칼럼온도 35 이동상 검출기 파장 유량 디클로로메탄과 이소프로판올을 이소옥탄에 녹여 각각 30%, 0.02%가 되게 한다. 254 nm 0.5 ml/분 77

82 6.2 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 비타민 K 1 함량(μg/100g)=C std F H s H std V S 100 C std : 표준용액의 농도(μg/mL) F : 비타민 K 1 표준용액에서 각각의 이성체의 비율 H s :시료의 비타민 K 1 각각의 이성체의 피크 면적 또는 높이 H std : 비타민 K 1 표준용액 각각의 이성체의 피크 면적 또는 높이 V : 시험용액의 전량(mL) S : 시료 채취량(g) ( * 비타민 K 1 표준품은 trans와 cis 이성체를 함유하므로 각각의 이성체 들을 분리하여 전체에 대한 cis형과 trans형의 피크 면적 비를 구한 다.) 7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 시험 주의사항 1) 비타민K 1 표준품은 trans와 cis 이성체를 함유하므로 각각의 이성체들을 분리하 여 전체에 대한 cis형과 trans형의 피크 면적 비를 구한다(불활성형 cis형을 20 %정도 함유함). 암소에서 보관한다. 2) 지방함량이 적은 시료일 경우 지방을 검화할 필요는 없지만, 지방함량이 많은 시료는 검화를 하여 검화물질을 제거해야 한다. 78

83 3) column이 이동상에 평형이 되도록 이동상을 column에 흘려 보낸다(보통 column 부피의 50배). 순상컬럼은 역상에 비해 물질의 머무름시간이 이동상에 함유된 미량의 극성용매에 의해 변동폭이 크다. 특히 물이나 Methanol이 HPLC용 용매에도 적은양 함유하고 있는데 이들이 머무름 시간에 미치는 영향 은 크므로 항상 같은 용매를 사용해야 하며, 주기적으로 순상 column은 regeneration해야한다. 비슷한 시료를 분획할 때는 시료간에 peak의 모양이 비 슷하므로 분획하는데 큰 어려움이 없으나 시료간에 peak의 모양이 다를 때는 매번 표준물질을 사용하여 분획한다. 한 시료의 분획이 끝나면 충분히 이동상 으로 column을 세척하여 다음의 시료에 전 시료가 오염되지 않도록 한다. 79

84 Ⅲ 비타민 B 1 Ⅲ 비타민 B 1 (제1법) 1. 시험방법의 원리 비타민 B 1 은 thiamin, aneurin으로도 불리며, 탄수화물대사에 조효소(coenzyme)의 형태 로 중요한 역할을 한다. 비타민 B 1 염산염은 흡습성이 강해 분자 1몰당 1몰의 물을 흡수한다. 흡수된 물은 100 가열로 제거될 수 있으며 건조된 상태에서는 100 에서도 안정하다. 3종의 티아민 인산에스테르는 물에 잘 녹으며 건조한 상태에서는 어둡고 차가운 곳에서 수 개월간 안정하다. 비타민 B 1 은 수용성으로서 알칼리성에는 불안정하여 분해되기 쉬우나, 산성에서는 가열에 대해서도 비교적 안정하다. ph 5이하의 산성용액에서는 가열 또는 110 멸 균에도 안정하나, 강알칼리용액에서는 페리시안칼륨(potassium ferricyanide), 브롬시안(cyanogen bromide), 염화수은(mercuric chloride) 등과 같은 산화제에 의해 산화되어 티오크롬이 된다. ph 8이상에서는 높은 형광을 나타내는 데 375 nm에서 여기되어 432~435 nm에서 최고 형광을 나타낸다. 이러한 성질은 티아민과 그 인산염 정량의 원리가 된다. 비타민 B 1 을 비교적 다량함유하고 있는 천연물로서는 쌀, 소맥배아, 양귀비열매, 해 바라기씨, 효모, 돈육, 뱀장어, 자라 등을 들 수 있다. 천연물 중에는 유리형(free)과 티아민일인산(TMP), 티아민이인산(TDP), 티아민삼인산(TTP) 3종의 B 1 인산에스테르 가 있다. 동물조직 중에 존재하는 티아민의 90 %이상은 TMP, TDP, TTP로서 이중 80~85 %가 TDP이나, 예외적으로 돼지와 닭의 골격근에는 TTP가 전체 티아민의 70~80 %를 차지한다. 식물체에는 유리형이 대부분을 차지한다. 이밖에 비타민 B 1 은 아미노산, 단백질, 함황화합물, 지방산 등에 강하고 단단하게 결합되어 있는 것 외에 전분에 흡착되어 있는 것도 있어 총 비타민 B 1 정량에 있어 서는 효소처리 등에 의해 결합형 B 1 이나 부가체를 유리형 B 1 으로 추출할 필요가 있 다. 한편, 비타민 B 1 강화제에는 B 1 염산염 이외에 난수용성염류로서, 질산염, 나프탈린 -1,5 (-2,6)-디설폰산염, 라우릴황산염, 로단산염, 프탈린염, 또한 B 1 유도체로서 디벤조 일티아민(DBT)과 그의 염산염(DBT-HCl) 등이 허가되어 있다. 이러한 강화제가 첨 가되어 있는 강화식품에서는 각 강화제에 상응하는 추출 및 유리형 B 1 의 처리를 행 할 필요가 있다. 본 시험법은 시료 중 비타민 B 1 을 황산이나 염산으로 추출하여 그 침출액 중에 함유되어 있는 티오크롬 반응 저해물질이나 티오크롬 형광 발색반응을 방해하는 형광물질을 퍼무티트에 이온교환시켜 침출액 중의 불순물을 제거한 후, 다카디아스타제로 효소분해를 하고 칼럼관을 통하여 정제 한 용액을 페리시안에 의 한 산화 및 티오크롬의 추출방법이나 브롬시안에 의한 산화 및 티오크롬의 추출 방 법을 사용하여 비타민 B 1 의 함량을 구한다. 80

85 가열추출 24hr 방치 형광광도계 2. 안전 주의 사항 염산(Hydrochloric acid)은 자극적인 냄새를 가지고 있고 피부 화상, 점막 화상, 호 흡 자극, 눈 자극 등의 건강 위험성이 있다. 물리적 위험으로는 용기가 열에 노출되 면 파열되거나 폭발할 수도 있고 물과 접촉 시 반응할 수 있다. 또한 흡입 시 자극 이 심한 경우도 있을 수 있으며 두통, 폐 울혈과 폐 이상이 생길 수 있다. 또한 피 부에 접촉 시 자극 및 동상과 눈 접촉 시에는 실명 및 동상 마지막으로 섭취 시에 는 화상, 구역, 구토 및 설사를 유발시킬 수 있으므로 환기가 잘되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 칼럼관 경질 유리제 흡착관의 S부의 밑에 소량의 유리솜을 채워 넣어 물을 가득 넣고 별도로 퍼무티트 1.3~1.5 g을 비커에 취한다. 물 약 20 ml를 가해 약하게 진탕해서 퍼무티트에 부착하고 있는 기포를 제거한 다음 물과 함께 전부를 흡착관에 유입, 계속해서 3% 초산 10 ml 및 물 20 ml를 각각 1분간에 1 ml의 유속으로 통해서 조정을 해 놓는다 원심분리기 메스플라스크(100 ml) 원심분리관(50 ml) 시험관(50 ml) 추출병 50~150 ml까지 10 ml마다 표선을 그려놓은 것이 쓰기에 편리하다. 3.2 분석장비 형광광도계 분광식의 여기파장을 375 nm, 수광부의 형광선택파장을 420 nm에 조정해 쓴 다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 81

86 4.1.1 Thiamine hydrochloride(aneurine hydrochloride; Vitamin B 1 hydrochloride) 분자식 : C 12 H 17 CIN 4 OS HCl, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 염산(Hydrochloric acid) 염화칼륨(Potassium chloride) 초산(Acetic acid) 질산은(Silver nitrate) 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 무수황산나트륨(Sodium sulfate anhydride, 형광이 없는 것) 이소부탄올(Isobutanol, 형광이 없는 것) 5. 시험과정 5.1 시약 제조 효소용액 1) 사용 시 다카디아스타제 2) 0.5 g에 0.1 N 염산 0.5 ml 및 물 10 ml를 가하여 용해 3) 한 후 여기에다 산성백토 0.2 g을 첨가하여 30초간 진탕 혼합하여 이것을 여과 또는 원심분리해서 그 상등액을 사용한다 % 염화칼륨 염산용액 0.1 N 염산에 염화칼륨을 25%의 비율로 녹인다. 결정이 석출하면 가온하여 완전히 녹여 사용한다 퍼무티트 4) 50~80 메쉬의 퍼무티트를 플라스크에 취해 약 4배의 열탕을 가해서 혼합, 정치한다. 상등액을 경사하여 버린다. 이 조작을 수 회 반복하여 상등액 이 거의 깨끗해질 때까지 행한다. 다음에 3%의 초산 약 4배량으로 전과 동일하게 2회 씻는다. 다시 25% 염화칼륨 염산용액을 약 3배량 가해서 비등 수욕 중 약 25분간 저어주면서 처리한다. 또 다시 3% 초산으로 2회 씻어내고 수세의 조작을 반복한다. 이 세액에 5% 질산은용액 2~3방울을 가해서 백탁되지 않을 때까지 행한다. 이것을 약 60 에서 건조해서 보 존한다. 다만, 퍼무티트 외에 엠버라이트 IRC 50을 사용할 수 있다 페리시안 수산화나트륨용액(제1법) 1% 페리시안용액 4 ml를 15% 수산화나트륨으로 녹여 100 ml로 한다. 사 82

87 용 전 4시간 이내에 제조한다 브롬시안용액(제2법) 특급의 브롬시안 4% 용액, 본액을 냉장고에 보존하여 그날 사용한다. 5.2 표준용액 제조 Thiamine hydrochloride 5) 를 염산산성의 물에 녹여 1 μg/ml로 한다. 5.3 시험용액 제조 시료 1~10 g을 정밀히 취하여 추출병 또는 100 ml 메스플라스크에 넣는다 증류수 약 20 ml을 가하여 혼한 후 0.1 N 염산 또는 0.1 N 황산 약 50 ml을 가하여 잘 섞은 후 끓는 수욕 상에서 30분간 가열 추출 6) 한다 추출액은 약 50 에 냉각시키고 4 M 초산나트륨액을 적가해 ph를 약 4.5 로 조정한다 효소용액 2 ml을 가하여 40~50 에 2~3시간 보온하거나 또는 톨루엔 5~6방울을 가해 37~40 의 항온기에 넣어서 하룻밤을 방치한다 분간 비등수욕에서 온침한 후 냉각하여 물을 가한 후 100 ml로 하고 원 심분리 또는 여과하여 상등액을 취한 것을 시료용액으로 한다 시료용액(pH 4.5)의 일정량(비타민B 1 으로서 약 5 μg 함유)을 칼럼에 조 심스럽게 주입하여 1 ml/분의 유속으로 흡착시킨다 ph 4.5의 염산 5 ml로 칼럼 R부 내면을 씻어낸다 흡착이 끝났다고 판단되면 공존되는 형광물질을 제거하기 위해 끓는 물을 칼럼에 주입하여 3~4 ml/분의 유속으로 흡착층을 씻는다. 세액을 형광이 나타나지 않을 때까지 물로 계속 씻어준다 칼럼이 따뜻할 동안에 비등 25% 염화칼륨염산용액 10 ml을 가하여 1초 에 1방울의 속도로 25 ml 부피플라스크에 용출시킨다 탈착액을 받아서 용출액이 퍼무티드 상단까지 달하면 다시 25% 염화칼 륨염산용액을 재차 주입하여 25 ml로 한다 냉각 후 물을 가하여 정확히 25 ml 표선에 맞춘다. 5.4 시험조작 7) (페리시안에 의한 산화 및 티오크롬의 추출) 시험용액 5 ml씩 T1, T2, T3 3개의 50 ml 원심분리관에 나누어 취한다. ( T1 : 첨가시험용, T2 : 주시험용, T3 : 공시험용) T1에는 표준용액 1 ml, T2, T3에는 물 1 ml을 가한다 T1, T2에 페리시안 수산화나트륨용액 3 ml, T3에는 30% 수산화나트륨용 액 3 ml을 가한 후 혼합한다 T1, T2, T3에 이소부탄올 15 ml을 가하여 1분간 격렬히 진탕 혼합한다 T1, T2, T3를 원심분리하여 상등액의 이소부탄올을 별도의 시험관에 취한다 계속해서 무수황산나트륨 1~2 g을 소량씩 첨가하여 진탕 혼합 후 정치해 서 깨끗한 이소부탄올을 얻는다. 5.5 시험조작(브롬시안에 의한 산화 및 티오크롬의 추출) 83

88 5.5.1 시험용액 5 ml씩 T1, T2, T3 3개의 50 ml 원심분리관에 나누어 취한다 T1에는 표준용액 1 ml, T2, T3에는 물 1 ml을 가한다 T1, T2에 브롬시안용액 3 ml, T3에는 30%수산화나트륨용액 3 ml을 가한 후 혼합한다 T1, T2, T3에 이소부탄올 15 ml을 가하여 1분간 격렬히 진탕 혼합한다 T1, T2, T3를 원심분리하여 상등액의 이소부탄올을 별도의 시험관에 취한다 계속해서 무수황산나트륨 1~2 g을 소량씩 첨가하여 진탕 혼합 후 정치해 서 깨끗한 이소부탄올을 얻는다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 전항의 이소부탄올액을 형광셀에 넣어 형광도를 측정한다. 6.2 계산 비타민 B 1 함량(mg/100g) = D T 2 - T 3 T 1 - T V 2 V 1 D :첨가 비타민 B 1 (μg) V 1 :시료용액의 채취량(mL) V 2 :시료용액 전량(mL) 100 시료채취량( g) 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 시험 주의사항 1) 결합형 B 1 을 분리형 B 1 으로 분해할 때 사용한다. B 1 정량을 위한 [타카디아스타 제 시판품]은 그대로 사용할 수 있지만, 일반품은 B 1 을 미량 함유하기 때문에 B 1 을 제거해서 사용한다. 제거법은 다카디아스타제를 물에 녹여 2 %로 하고, 퍼무티트 칼럼에 주입하여 다카디아스타제 중에 혼재하는 비타민 B 1 을 제거한 통과액을 사용한다. 2) Phosphatase 활성을 나타내는 효소(Takadiastase, Mylase P, Clarase)를 말한다. 3) 불용시에는 40 정도의 수욕상에서 가온한다. 4) 양이온 교환수지(Permutit T, Decalso F, Zepolite S/E)를 말한다. 퍼무티트 외 에 엠버라이트 IRC 50을 같은 목적으로 이용할 수 있다. 기지의 비타민 B 1 표준 용액을 사용하여 회수시험을 하고, 적하속도의 조정을 행함과 동시에 퍼무티트 성능을 확인해둔다. 5) 표준품은 흡습성이 강하므로, 오산화인(P 2 O 5 ) 또는 실리카겔 데시게이터에 1일 84

89 이상 건조시켜 사용한다. 6) 분말, 페이스트상 및 액상 이외의 검체는 막자사발 또는 분쇄기를 사용하여 마 쇄한다. 7) 정확하고 정밀한 결과를 얻기 위해서는 동일하고 균일화된 동작으로 시험을 수행해야 하며, 티오크롬이 파괴되지 않도록 빛을 차단해야 한다. 85

90 Ⅲ 비타민 B 1 (제2법) 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 시료 중 비타민 B 1 을 삼염화초산용액으로 균질화 시킨 후 원심분리를 하여 상등액을 채취하여 다카디아스타제 용액으로 효소분해를 한 용액을 Polyglycerylmethacrylate로 충진 된 칼럼을 이용하여 비타민 B 1 을 분리하는 방법으 로 형광검출기를 이용하여 비타민 B 1 의 여기파장인 375 nm와 측정파장 450 nm에서 검출하여 정량한다. 원심분리 진탕혼합 HPLC FLD 2. 안전 주의 사항 초산(Acetic acid)은 초산 냄새가 강하며 흡입 시 자극, 재채기, 콧물과 섭취시 출 혈, 구토, 설사를 유발하고 눈에 화상과 호흡기도 및 피부 자극에 위험성이 있어 환 기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 염산(Hydrochloric acid)은 자극적인 냄새를 가지고 있고 피부 화상, 점막 화상, 호 흡 자극, 눈 자극 등의 건강 위험성이 있다. 물리적 위험으로는 용기가 열에 노출되 면 파열되거나 폭발할 수도 있고 물과 접촉 시 반응할 수 있다. 또한 흡입 시 자극 이 심한 경우도 있을 수 있으며 두통, 폐 울혈과 폐 이상이 생길 수 있다. 또한 피 부에 접촉 시 자극 및 동상과 눈 접촉 시에는 실명 및 동상 마지막으로 섭취 시에 는 화상, 구역, 구토 및 설사를 유발시킬 수 있으므로 환기가 잘되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 칼럼관 원심분리기 부피플라스크(200 ml, 100 ml) 원심분리관(50 ml, 15 ml) 시험관(15 ml) 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 형광검출기(Fluorescence Detector, FLD) 비타민 B 1 분리용 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 86

91 Polyglycerylmethacrylate) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상으로 사용되는 0.1 M 제1인산나트륨용액을 분당 0.7 ml씩 흘려줌으로 써 기기와 칼럼을 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 Thiamine hydrochloride(aneurine hydrochloride; Vitamin B 1 hydrochloride) 분자식 : C 12 H 17 CIN 4 OS HCl, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 염산(Hydrochlonic acid) 염화칼륨(Potassium chloride) 초산(Acetic acid) 질산은(Silver nitrate) 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 무수황산나트륨(Sodium sulfate anhydride) 이소부탄올(Iso-butanol) 5. 시험과정 5.1 시약 제조 M 초산나트륨용액 5.44 g의 초산나트륨을 물에 녹여 10 ml로 한다 다카디아스타제용액 1) 다카디아스타제 2) 를 물에 녹여 3) 2%로 하여 퍼무티트(Purmutit) 4) 칼럼에 넣고 다카디아스타제 중에 존재하는 비타민 B 1 을 제거한 후 사용한다. 사용 시 제조한다 페리시안화칼륨 수산화나트륨용액 수산화나트륨 30 g을 물에 녹여 200 ml로 하고 이에 페리시안화칼륨 20 mg을 녹인다. 사용 시 제조한다. 5.2 표준용액 제조 Thiamine hydrochloride 5) 를 10% 삼염화초산용액에 녹여 0.01~1.0 87

92 mg/ml로 한다 용액, 4 M 초산나트륨용액, 2% 디카디아스타제용액을 20 : 3 : 1의 비율로 혼합한 용액을 표준용액으로 한다. 5.3 시험용액 제조(일반적 시료) 시료 1g 6) 을 정밀히 취하여 15 ml원심분리관에 넣는다 % 삼염화초산용액 5 ml을 넣고 균질화 시킨 후 다시 10% 삼염화초산 용액을 넣어 10 ml로 한다 ,000 rpm에서 30분간 원심분리를 한다 상징액 200 μl를 시험관에 취하여 4 M 초산나트륨 30 μl를 가한다.(pH 4.5~4.7) 이에 2% 디카디아스타제 용액 10 μl를 넣고 교반하면서 37 에서 8~10시 간 방치한 것을 시험용액 7) 으로 한다. 5.4 시험용액 제조(난용성 비타민 B 1 염류 및 비타민 B 1 유도체 강화시료) 시험용액 5 ml씩 T1, T2, T3 3개의 50 ml 원심분리관에 나누어 취한다. ( T1 : 첨가시험용, T2 : 주시험용, T3 : 공시험용) T1에는 표준용액 1 ml, T2, T3에는 물 1 ml을 가한다 T1, T2에 브롬시안용액 3 ml, T3에는 30%수산화나트륨용액 3 ml을 가한 후 혼합한다 T1, T2, T3에 이소부탄올 15 ml을 가하여 1분간 격렬히 진탕 혼합한다 T1, T2, T3를 원심분리하여 상등액의 이소부탄올을 별도의 시험관에 취한다 계속해서 무수황산나트륨 1~2 g을 소량씩 첨가하여 진탕 혼합 후 정치해 서 깨끗한 이소부탄올을 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항목 조건 주입량 50 μl 칼럼온도 35 이동상 0.1 M 제1인산나트륨용액 검출기 파장 여기파장 : 375 nm, 측정파장 : 450 nm 유량 0.7 ml/분 반응액 페리시안화칼륨 수산화나트륨용액(유속 : 0.7 ml/분) 88

93 6.2 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 비타민 B 1 의 함량(mg/100g) = S (a b) 시료채취량(g) 100 1,000 S:시험용액 중의 비타민 B 1 의 농도(μg/mL) a:시험용액의 전량(mL) b:시험용액의 희석배수 7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 시험 주의사항 1) 결합형 B 1 을 분리형 B 1 으로 분해할 때 사용한다. B 1 정량을 위한 [타카디아스타 제 B 시판품]은 그대로 사용할 수 있지만, 일반품은 B 1 을 미량 함유하기 때문 에 B1을 제거해서 사용한다. 제거법은 다카디아스타제를 물에 녹여 2 %로 하 고, 퍼무티트 칼럼에 주입하여 다카디아스타제 중에 혼재하는 비타민 B 1 을 제 거한 통과액을 사용한다. 2) Phosphatase 활성을 나타내는 효소(Takadiastase, Mylase P, Clarase)를 말한다. 3) 불용시에는 40 정도의 수욕상에서 가온한다. 4) 양이온 교환수지(Permutit T, Decalso F, Zepolite S/E)를 말한다. 퍼무티트 외 에 엠버라이트 IRC 50을 같은 목적으로 이용할 수 있다. 기지의 비타민 B 1 표 89

94 준용액을 사용하여 회수시험을 하고, 적하속도의 조정을 행함과 동시에 퍼무티 트 성능을 확인해둔다. 5) 표준품은 흡습성이 강하므로, 오산화인(P 2 O 5 ) 또는 실리카겔 데시게이터에 1일 이상 건조시켜 사용한다. 6) 본 법의 비타민 B 1 추출한계는 약 15 pg이기 때문에, 식품 중 비타민 B 1 함유 량에 상응하도록 하는 것이 좋다. 7) 다종 다량의 시료를 처리하는 고속액체크로마토그라피용 칼럼의 수명을 길게 하기 위해서는 퍼무티트 칼럼에 따라 정제조작을 가하는 것이 좋다. 90

95 Ⅲ 비타민 B 2 Ⅲ 비타민 B 2 (제1법) 1. 시험방법의 원리 비타민 B 2 는 수용성 비타민 B복합체의 일종으로 리보플라빈, 비타민 G, ovoflavin, lactoflavin, hepatoflavin, verdoflavin이라 불리는 황색의 결정이다. 수용액은 황색을 띠며 특유의 형광을 가지고 있다. 동식물체내에서는 리보플라빈 에스테르, 플라빈모노뉴클레오티드(FMN), 플라빈아데닌디뉴클레오티드(FAD)로 존 재한다. 이 중 FMN과 FAD는 플라빈효소의 보효소로서 생체내 산화환원계, 미토콘 드리아, 마이크로좀의 전자전달계에 관여한다. 자연계 중에는 우유, 유제품, 계란 및 육류에 풍부하다. 냉동, 탈수, 캔 가공 공정 등에는 비교적 안정한 편이나 빛에 불 안정하므로 건조 가공시 주의를 필요로 한다. 분말 리보플라빈은 오렌지색을 나타내며 565 nm에서 황록색 형광을 나타낸다. 광 선에 민감하며 산성조건하에서는 비교적 안정한 편이나, 알칼리용액에서는 광선에 의해 루미플라빈으로 전환된다. 본 시험법은 시료 중 비타민 B 2 를 물로 추출하여 알카리 조건에서 광분해를 하여 루 미플라빈으로 전환시킨 다음 이것을 산성으로 산화한 후 클로로포름 층으로 이행시 켜 추출하는 방법이다. 또한 처음 시료를 물로 추출하는 대신 Ⅲ 비타민 B 1 (제1법)의 5.3 시험용액의 제조 중 5.3.1~5.3.5 까지의 시험용액을 그대로 사용할 수 있다. 추출 및 진탕혼합 원심분리 형광광도계 2. 안전 주의 사항 클로로포름은 신경을 마비시키는 작용을 하므로 마취제로서 사용되지만 과량복용 이나 주사 시 심장을 멈춰 죽음에 이르게 하며, 장기간 복용이나 노출은 간, 폐, 신 장에 해를 주므로 환기가 잘되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여 야 한다. 수산화나트륨은 삼키면 유해하며 호흡기도, 피부, 눈, 점막에 화상을 입힐 수 있고 물과 접촉 시 반응 할 수 보안경으로 눈 보호, 실험복 착용 및 안전장갑 등의 안전 장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 91

96 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 광분해장치 막자사발 균질기 부피플라스크(100 ml) 원심분리기 원심분리관(50 ml) 시험관(15 ml) (사용되는 초자는 갈색의 유리기구를 사용한다.) 3.2 분석장비 형광광도계 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 Riboflavin Riboflavin(Lactoflavin; Vitamin B 2; Vitamin G) 분자식 : C 17 H 20 N 4 O 6, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 클로로포름(Chloroform) 증류수(Distilled water) 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 초산(Acetic acid) 과망간산칼륨(Potassium permanganate) 5. 시험과정 5.1 시약 제조 클로로포름 형광이 없는 것, 형광이 있는 것은 유리제의 증류장치를 써서 재증류한다. 갈색병에 넣어 물을 포화시켜 냉암소에 보존한다. 5.2 표준용액 1) 제조 Riboflavin을 4 mg을 정밀히 취한다 ml 부피플라스크에 물을 넣는다. 92

97 5.2.3 초산 수 방울을 가하여 표선에 맞춘다 사용 시에는 물로 희석을 하여 사용한다.(또한, 밝은 곳에 내놓지 않도록 주 의한다.) 5.3 시험용액 제조 시료 일정량을 취해 소량의 물을 가해서 균질기나 막자사발에 넣어 마쇄 한다. 지방이 많은 것은 미리 탈지과정을 거쳐 사용한다 물 수 ml ~ 수십 ml을 가해 수욕 중에서 15~20분간 추출한다 위의 용액을 비타민 B2가 0.2~1 μg함유하게 희석한다 T1, T2, T3 시험관중 T1에 시험용액을 가하고 나머지 두개의 시험관에는 물을 가하여 세 개의 시험관이 동량이 되게 한다 이 시험관에 1 N 수산화나트륨액을 같은 양 가해 혼합한다 광분해가 끝나면 세 개의 시험관에 초산 0.5 ml씩 가한다 세 개의 시험관에 4%과망간산칼륨용액 0.5 ml 2) 을 가해서 1분간 방치한 다. 필요하면 초산을 소량 가한다 계속해서 3% 과산화수소용액을 적가 3) 해 탈색하고 클로로포름 10 ml을 가하여 2분간 진탕 혼합한다 원심분리 후 클로로포름층을 분취한다. 6. 분석 및 계산 6.1 측정 클로로포름층을 측정셀에 옮기고 T1(첨가시험), T2(주시험), T3(공시험)의 형광광도 를 읽어 T1, T2, T3로 한다. 시료 중의 비타민 B 2 의 함량을 다음 식에 따라 구 한다. 6.2 계산 비타민 B 2 함량(mg/100g) = D T 2 - T 3 T 1 - T V 2 V 1 D :첨가 비타민 B 1 (μg) V 1 :시료용액의 채취량(mL) V 2 :시료용액 전량(mL) 100 시료채취량( g) 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 시험 주의사항 1) 표준품은 오산화인(P 2 O 5 ) 또는 실리카겔 데시게이터에 넣어 암소에 1일 이상 93

98 건조시켜 사용한다. 2) 산화시킬 물질을 과량 포함하는 경우 용량을 증가시킬 수 있다. 단, 각 시험관 에 동일량을 증가시킨다. 3) 각 시험관에 동일량을 가한다. 94

99 Ⅲ 비타민 B 2 (제2법) 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 시료에 증류수를 가하여 70~80 수욕 상에서 비타민 B 2 를 충분히 추 출한 후 고속액체크로마토그래프를 이용하여 분석하는 방법으로 형광검출기를 이용 하여 표준물질과 시료의 면적을 비교함으로써 정량한다. 균질화 추출 HPLC FLD 2. 안전 주의 사항 메탄올은 포름알데하이드 제조나 부동액으로 사용되는 독성을 갖는 무색의 가연성 알코올로서, 생체 내에서알코올탈수소효소에 의해 포름알데하이드나 포름산 이 되기 때문에 독성이 강하다. 30mL 이하를 섭취하더라도 사망에 이르며, 만성독 성으로는 실명을 초래하는 것으로 알려져 있으므로 환기가 잘되는 시설과 안전장비 를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 갈색공전병 균질기 또는 막자사발 항온수조 용매용 일회용 실린지 액체크로마토그래프용 유리병 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 형광검출기(Fluorescence Detector, FLD) 칼럼오븐 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상인 메탄올 : 10 mm NaH 2 PO 4 를 ph 5.5가 되게 35 : 65 (v : v)로 제조 후 용매를 분당 0.8 ml를 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다. 95

100 4. 표준물질 및 일반시약 표준물질 리보플라빈 분자식 (Riboflavin) : C17H20N4O6, 분자량 : , FMN(flavin mononucleotide) 분자식 : C17H20N4NaO9P 2H2O, FAD(flavin adenine 분자식 : 분자량 dinucleotide) C27H31N9Na2O15P2 xh2o, 일반시약 메탄올 (Methanol) NaH2PO4(Monosodium phosphate) 96 : : , CAS No. : 분자량 No. : CAS No. : (anhydrous basis), CAS

101 5. 시험과정 5.1 표준용액 제조 리보플라빈 1) 리보플라빈 4 mg을 100 ml 부피플라스크에 넣는다 증류수를 가하여 온탕에서 완전히 녹인다(40 μg/ml) 초산 수방울을 가해서 갈색 공전병에 넣어 냉장고에 보존한다 사용 시 증류수로 희석하여 0.2 μg/ml의 용액으로 만든다 FMN 2) 증류수에 녹여 0.2 μg/ml(리보플라빈으로 환산)의 용액을 만든다 FAD 2) 증류수에 녹여 0.5 μg/ml(리보플라빈으로 환산)의 용액으로 만든다. 5.2 시험용액 제조 시료 일정량을 달아 소량의 증류수를 가해 균질기 또는 막자사발에 미세 하게 분쇄하고 지방이 많을 경우 탈지한다 이에 증류수를 가해 70~80 의 수욕 상에서 잘 혼합하여 12~20분간 추 출한다 추출액을 식힌 후 1 ml 중 비타민 B 2 가 0.05~0.5 μg이 되도록 일정용량 으로 만들어 시험용액 3) 으로 사용한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항목 주입량 검출기 파장 조건 10 μl 여기파장 : 445 nm, 측정파장 : 530 nm 칼럼 온도 40 이동상 유속 메탄올 : 10 mm NaH 2 PO 4 (ph 5.5)(35 : 65) (1 N 수산화나트륨용액으로 ph 조정) 0.8 ml/min 97

102 6.2 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 비타민 B 2 (리보플라빈, FMN, FAD)(mg/100g) = C (a b)/s (100/1,000) C : 시험용액중의 비타민 B 2 의 농도(μg/mL) a : 시험용액의 양(mL) b : 시험용액의 희석배수 S : 시료 채취량(g) 100/1,000 : 단위 환산 계수 7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 시험 주의사항 1) 표준품은 흡습성이 강하므로, 오산화인(P 2 O 5 ) 또는 실리카겔 데시게이터에 1일 이상 건조시켜 사용한다. 2) 시판품을 크로마토그래피 등으로 정제하여 사용한다. DEAE 셀룰로오즈 칼럼 을 사용하는 방법이 있고 특히, FAD 표준품의 정제는 p-acetoxymercurianiline 을 고정화한 후 아가로오스 칼럼을 사용하는 방법이 있다. FMN, FAD 표준액 의 농도는 각각 450 nm의 분자흡광계수 , 을 사용해서 산정한 다. 98

103 3) 비타민 B 2 3가지형의 분리정량을 위해서는 FAD가 산성조건하에서 추출되어 가수분해되므로 HCl, H 2 SO 4 에 의한 추출은 부적당하며, 온수에 의한 추출이 적당하다. 단백질 제거를 위한 트리클로로초산처리에 의해서도 시간에 따라 FAD양이 감소하므로 즉시 정량하는 것이 바람직하다. 99

104 Ⅲ 나이아신 Ⅲ 나이아신(제1법) 1. 시험방법의 원리 나이아신은 니코틴산이라고 불리며 동식물체내에는 주로 Nicotinaminde adenine dinucleoptide(nad) 및 nicotinamide adenine dinucleotide phosphate(nadp)의 형태로서 존재하며 산화환원효소의 보효소로서 탈수소 반응(dehydrogenation)에 관여하고 있다. 이들 물질은 건조상태나 중성용액에서는 모두 안정하나, 니코틴산아미드는 흡습성이 있고, 산이나 알칼리 처리에 의해 니코틴산으로 전환된다. 천연식품 중에는 뉴클레오티드 또는 단백질과 결합된 형태가 대부분이기 때문에 정량시에는 이들을 가수분해하여 유리상태로 할 필요가 있다. 본 시험법은 시료 중 니코틴산을 가수분해 하여 중화시킨 후 탈색을 한 후에 다시 이것을 브롬시안용액과 파라아미노 아세토페논용액을 반응시켜 나타나는 황적 색의 색소를 분광광도계로 흡광도를 측정하는 방법으로 파장 420 nm에서 흡광도를 측정한다. 가수분해 원심분리 분광광도계 2. 안전 주의 사항 황산은 흡입 시 치명적이며, 점막에 심한 자극을 야기할 수 있고, 눈과 피부에 화 상을 야기할 수 있으므로 취급 후 철저히 씻어야 하고, 적절한 환기 하에서 사용해 야 한다. 또한 물과 위험한 반응을 일으킬 수 있으며, 연소물을 발화시킬 수 있으므 로 취급에 주의를 기울여야 한다. 염산은 자극적인 냄새를 가지고 있고 피부 화상, 점막 화상, 호흡 자극, 눈 자극 등의 건강 위험성이 있다. 물리적 위험으로는 용기가 열에 노출되면 파열되거나 폭 발할 수도 있고 물과 접촉 시 반응할 수 있다. 또한 흡입 시 자극이 심한 경우도 있을 수 있으며 두통, 폐 울혈과 폐 이상이 생길 수 있다. 또한 피부에 접촉 시 자 극 및 동상과 눈 접촉 시에는 실명 및 동상 마지막으로 섭취 시에는 화상, 구역, 구 토 및 설사를 유발시킬 수 있으므로 환기가 잘되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보 호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 100

105 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 부피플라스크(1000 ml, 100 ml) 원심분리관(100 ml) 시험관(15 ml) 원심분리기 비커(100 ml) 진공감압장치(Vacuum manifold) 여지(filter paper) 진공펌프(Vacuum pump) 3.2 분석장비 분광광도계 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 Nicotinic acid(3-picolinic acid; Niacin; Pellagra preventive factor; Pyridine-3-carboxylic acid; Vitamin B 3 ) 분자식 : C 6 H 5 NO 2, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 황산아연(Zinc sulfate) 증류수(Distilled water) 황산(Sulfuric acid) 염산(Hydrochloric acid) 아밀알콜(Amyl Alcohol) 5. 시험과정 5.1 시약 제조 포화황산아연용액 1) 황산아연(ZnSO 4 7H 2 O) 800 g을 물에 녹여서 1 L로 한다 브롬시안용액 2) 특급 브롬시안을 물에 녹여 10%로 한다 파라아미노 아세토페논용액 파라아미노 아세토페논 2 g을 소량의 염산에 녹여서 물을 가하여 100 ml로 101

106 한다. 5.2 표준용액 제조 니코틴산 표준물질 3) 을 약 100 mg을 정밀히 취한다 ml 부피플라스크에 넣고 10 N 황산액 1 ml을 가한다 물을 넣어 표선까지 맞춘다 사용 시에는 위의 원액을 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 2.5 ml씩 취하여 물을 가해 100 ml로 맞추어 사용한다 각 농도의 니코틴산 표준액의 1 ml을 취해 물 4 ml을 가해서 검량선을 작성한다. 5.3 시험용액 제조 니코틴산 400 μg상당의 시료를 100 ml 비커에 취한다 N 염산액 20 ml을 가해 비등 수욕 중에 60분간 침출하여 가수분해 4) 한 다 이것을 냉각 후 100 ml 부피플라스크에 옮기고 물로 100 ml이 되게 한 다 이것을 여과 혹은 원심분리하여 여액 또는 상등액을 시료용액으로 한다 시료용액 25 ml을 원심분리관에 취한다 페놀프탈레인시액 2방울을 가해서 6 N 수산화나트륨액 20 ml로 미산성이 될 때까지 중화 5) 한다 중화액에 포화 황산아연용액 2 ml을 가한다 소포제로서 아밀알콜 수 방울을 가한다 수산화아연의 침전이 생길 때까지 잘 진탕 혼합한다 M 수산화나트륨액과 1 N 수산화나트륨액을 가하여 중화한다 N 황산액을 가하여 6) ph 6.5가 되게 하고 물을 가하여 50 ml로 한다 진탕 혼합 후 10분간 방치하여 원심분리 또는 여과한 것을 시험용액으로 한다. 5.4 시험조작 시험용액 5 ml씩 2개의 시험관에 취하고 여기에 브롬시안용액 2 ml씩을 가하여 60~70 의 수욕에서 10~15분간 반응시킨다 얼음물에 냉각 시키면서 한쪽에 파라아미노 아세토페논용액 1 ml을 가한다 두개의 시험관에 물을 넣어 10 ml로 한다 위의 발색액을 얼음물 중에 냉각한 채로 암실에서 10~15분간 방치한다 파장 420 nm에서 흡광도를 측정한다. 6. 분석 및 계산 6.1 계산 계산식 102

107 총 니코틴산 함량( mg/g) = X mL 시료채취량( g) 1 1,000 X : 니코틴산의 농도(μg/mL) 7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 시험 주의사항 1) 녹을 때까지 교반하거나, 필요한 경우 가온하여 녹인다. 조제후 암소에 보관한 다. 2) 호흡독성이 강하므로 반드시 후드에서 실시하며, 피부에 닿지 않도록 주의한 다. 조제후 냉암소에 보존한다. 3) 표준품은 흡습성이 있으므로, 오산화인(P 2 O 5 ) 또는 실리카겔 데시게이터에 1일 이상 건조시켜 사용한다. 4) Ca(OH) 2 로 가수분해하면 수산화나트륨(NaOH)이나 산의 경우보다도 침출액에 착색이 덜된다. 5) Zn(OH) 2 이 침전하기 시작할 때까지는 3 mol/l NaOH를 사용하고, 페놀프탈 레인의 담홍색이 드러날 때까지는 1 mol/l NaOH를 사용하여 침전이 완전히 생기게 한다. 단, 중화점을 지나치지 않도록 주의한다. 6) 1 mol/l H 2 SO 4 를 1 4방울 적가하여 담홍색이 소멸될 때가 거의 ph 6.5에 있다. 중화에 주의하지 않으면, 변색 중에 흐려짐이 생겨 정량이 곤란하게 된 다. 103

108 Ⅲ 나이아신(제2법) 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 시료 중 나이아신을 미생물학적으로 함량을 구하는 방법으로 시료를 황산으로 추출 후 Lactobacillus planlarum 접종액을 넣어 배양하여 나온 배양액의 탁도를 분광광도계로 측정하거나 생산한 산의 함량을 적정으로 측정한 결과값을 가지고 시 료중의 나이아신의 함량을 측정하는 방법이다. 하지만 니코틴산 및 니코틴산아미드에 대해 같은 정도의 균의 증식 및 산생성을 보이기 때문에 양자의 분별정량으로는 적합하지 않 은 단점이 있다. 가압추출 Filtration 분광광도계 2. 안전 주의 사항 염산은 자극적인 냄새를 가지고 있고 피부 화상, 점막 화상, 호흡 자극, 눈 자극 등의 건강 위험성이 있다. 물리적 위험으로는 용기가 열에 노출되면 파열되거나 폭 발할 수도 있고 물과 접촉 시 반응할 수 있다. 또한 흡입 시 자극이 심한 경우도 있을 수 있으며 두통, 폐 울혈과 폐 이상이 생길 수 있다. 또한 피부에 접촉 시 자 극 및 동상과 눈 접촉 시에는 실명 및 동상 마지막으로 섭취 시에는 화상, 구역, 구 토 및 설사를 유발시킬 수 있으므로 환기가 잘되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보 호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 톨루엔은 섭취 시 기도에 치명적일 수 있으며 호흡기계에 자극을 일으키고 장기간 또는 반복노출 시 장기에 손상을 일으킨다. 또한 태아 혹은 생식능력에 손상을 일 으킬 수도 있으므로 환기장치를 설치하고 보안경으로 눈 보호, 실험복 착용 및 안 전장갑 등의 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 데시케이터 가온기(Heating Block) ph 적정기 시험관(15 ml) 멸균기 104

109 3.1.6 무균대 용매용 일회용 실린지 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터 3.2 분석장비 분광광도계 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 Nicotinic acid(3-picolinic acid; Niacin; Pellagra preventive factor; Pyridine-3-carboxylic acid; Vitamin B 3 ) 분자식 : C 6 H 5 NO 2, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 증류수(Distilled water) 염산(Hydrochloric acid) 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 톨루엔(Toluene,) 제1인산칼륨(Monopotassium Phosphate) 황산마그네슘(Magnesium sulfate) 염화나트륨(Sodium chloride) 황산제1철(Ferrous sulfate) 황산망간(Magnesium sulfate) 5. 시험과정 5.1 시약 제조 카제인 산분해용액 배지작성에 대하여 각 비타민, 무기염류, 카제인 산분해물 등은 적당한 농 도의 액을 만들어 냉장고 중에 보존하여 두면 편리하다. 이 보존액에 잡균 이 혼합되지 않게 하고, 보존액에서 배지를 작성함에 있어 각 비타민의 보존액에 다른 비타민이 혼입되지 않게 특히 주의한다. 배지를 만들 때에 는 일반적으로 각 성분을 혼합, 용해한 다음에 10% 염산용액 또는 수산화 나트륨용액을 사용하여 ph 3.5로 조정하고 약 20분간 비등 수욕 상에서 가온하고, 냉각 후 여과하여 물을 가해서 배양시의 2배 농도의 배지를 작성 한다. 다음에 공통성분의 염류용액과 카제인 산분해용액의 제법을 참고한 다. 105

110 5.1.2 아데닌, 구아닌, 우라실 용액 아데닌황산염, 구아닌염산염 및 우라실 각 0.1 g을 20% 염산용액 5 ml에 가열하면서 용해하고 냉각 후 물을 가하여 100 ml로 하고 톨루엔 소량을 가하여 약 10 에서 보존한다 시스틴, 트립토판용액 L-시스틴 2 g 및 L-트립토판 0.5 g(또는 DL-트립토판 1 g)을 물 350~400 ml에 현탁하고 70~80 에 가열하여 고형물이 용해할 때까지 20% 염산 용액을 적가한다. 냉각 후 물을 가하여 전량을 500 ml로 하고 톨루엔 소 량을 가하여 약 10 에서 보존한다 비타민 B 1, 비타민 B 2, 비오틴용액 비타민 B 1 염산염, 비타민 B 2 및 비오틴을 0.02 N 초산에 녹이고, 그 1 ml 가 비타민 B 1 염산염 10 μg, 비타민 B 2 20 μg 및 비오틴 0.04 μg을 함유하 게 한다. 이 용액은 톨루엔 소량을 가하여 광을 피해서 냉소에 보존한다 파라아미노 안식향산, 판토텐산칼슘, 비타민 B 6 용액 이 용액의 1 ml가 파라아미노 안식향산 10 μg, 판토텐산칼슘 20 μg 및 피리독신 염산염 40 μg을 함유하게 25% 에탄올에 녹인다 염류용액 A 및 염류용액 B (가) 염류용액 A 제1인산칼륨(KH 2 PO 4 ) 및 제2인산칼륨(K 2 HPO 4 ) 각 5 g을 물에 용해하여 전량을 100 ml로 하고 염산 1방울 및 톨루엔 소량을 가하여 보존한 다. (나) 염류용액 B 황산마그네슘(MgSO 4 7H 2 O) 2 g, 염화나트륨(NaCl) 0.1 g, 황산제1철 (FeSO 4 7H 2 O) 0.1 g 및 황산망간(MnSO 4 4H 2 O) 0.1 g을 물에 용해 하여 전량을 100 ml로 하고 염산 1방울 및 톨루엔 소량을 가하여 보 존한다. 5.2 기초배지의 조제 카제인 산분해용액 10 ml, 시스틴, 트립토판용액 10 ml, 아데닌, 구아닌, 우 라실용액 2 ml, 비타민 B 1, 비타민 B 2, 비오틴용액 2 ml, P-아미노안식향산, 판 토텐산칼슘, 비타민 B 6 용액 2 ml, 염류용액 A 2 ml 및 염류용액 B 2 ml를 혼 합하고 여기에 포도당 4 g 및 무수초산나트륨 2 g을 가하여 용해하고, 10% 수산화나트륨용액으로 ph를 6~8로 조정한다. 다음 물을 가하여 전량을 100 ml로 한다. 필요하면 여과한다(또는 Niacin Assay Medium, DIFCO사 제품을 사용할 수 있다). 5.3 접종용액의 조제 (1) Lactobacilllus plantarum의 보존균주 1) (2) 물 100 ml에 효모엑기스 2 g을 녹이고 여기에 포도당 0.5 g, 무수초산나트 106

111 륨 0.5 g을 가하여 ph 6.8로 조정한 다음, 수욕 상에서 10~20분간 가열하 고, 여과 후 한천 1.5 g을 가하고 한천이 용해될 때까지 수욕 상에서 흔들 어 혼합하면서 가열한다. 가열시 이 용액 약 10 ml씩을 시험관에 분주 하고, 솜마개를 하고, 1 kg/cm 2 에서 10분간 가압 멸균하고 시험관을 수 직의 위치에 보존하여 냉각한다. Lactobacillus plantarum ATCC, No8014의 보존균주로부터 멸균한 배지 10 ml에 접종하고 37 에서 16~24시간 배양 하고, 냉소에 보존한다. 보존균주는 매주 새로 조제한다. 1주 지난 것은 사 용하여서는 아니 된다 2) (또는 Lactobacilli agar, DIFCO사 제품을 사용할 수 있다). 5.4 배지 기초 배지 5 ml를 함유하는 시험관에 니코틴산 1 μg을 함유하게 하고 물을 가하여 솜마개를 하고 1 kg/cm 2 에서 10분간 가압 멸균하여 방냉한다(또는 Lactobacilli broth AOAC, DIFCO사 제품을 사용할 수 있다). 5.5 접종균액 Lactobacillus plantarum의 보존균주를 멸균한 배지 10 ml에 접종하고 37 에서 16~24시간 배양한다. 여기에서 얻은 배양액을 잘 진탕 혼합한 다음 그대로 접종균액으로 하여 사용한다 표준용액 제조 미리 건조시킨 니코틴산 표준물질 10 mg을 정밀히 측정한다 정밀히 측정한 표준물질을 100 ml 부피플라스크에 넣는다 에탄올을 넣어 표선까지 맞춘다 사용 시에는 물로 희석하여 사용한다. 5.7 시험용액 제조 염기성물질 함량이 적은 고체 또는 반고체시료 시료의 적어도 10배량의 1 N 황산을 가하여 잘 혼합한다. 이 용액 1 ml에는 니코틴산 5 mg이상 함유하여서는 안된다 N 황산으로 플라스크의 벽에 부착한 시료를 세척한다 kg/cm 2 에서 30분 동안 가압 추출한다 냉각 후 1 N 수산화나트륨액을 가하여 ph 6.5로 조정한다 물을 가하여 1 ml에 니코틴산이 약 0.1 μg함유하게 희석한다. 여과 가 필요할 시에는 여과를 한다 염기성물질 함량이 많은 고체 또는 반고체시료 시료에 물을 가하여 잘 혼합한다 N 황산을 가하여 ph 6으로 맞춘 다음 위 (1)의 방법에 따라 조제 한다 액체시료 시료에 1 N 황산 또는 1 N 수산화나트륨액을 가하여 ph 6으로 맞춘 107

112 다음 위 (2)의 방법에 따라 조제한다. 5.8 시험조작(산도적정법에 의한 적정법) 니코틴산 표준용액 계열을 만들기 위해 시험관 2개씩에 니코틴산 표준용 액 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 1.75, 2 ml을 취한다 시험용액의 계열을 만들기 위하여 시험관 3개씩에 시험용액 0.3, ml을 취한다 각 시험관에 기초배지 5 ml을 넣고 물을 넣어 전량을 10 ml로 한다 각 시험관 뚜껑을 닫고 혼합한다 kg/cm 2 에서 10분간 가압 멸균 3) 한다 냉각 후 각 시험관에 접종액 7 μl씩 무균 접종한다 에서 72시간 배양기에 넣어 배양한다 배양 후 각 시험관에 생긴 산을 0.1 N 수산화나트륨액으로 적정 4) 한다. (지시약 : 0.1% 페놀프탈레인시액 5) ) 5.9 시험조작(측정에 의한 정량법) 탁도 측정에 의한 정량법은 산도측정에 비하여 정밀도는 약간 낮지만 결과를 신속히 알게 되는 이점이 있다. 니코틴산의 검량선을 0~0.1 μg/4 ml로 하고, 시험용액 계열의 니코틴산 함량도 거기에 따라서 감해지면 좋다. 그러나, 균의 배양시간은 20~40시간으로 한다. 탁도는 570~650 nm에서 흡광도를 측정한다. 6. 분석 및 계산 6.1 정량시험(산도적정법에 의한 적정법) 니코틴산 표준계열의 각 단계에 따른 측정치의 평균치를 각 시험관에 가한 니코 틴산의 μg수에 대한 검량선을 작성한다. 다음에 이 검량선을 사용하여 내삽법에 따라서 시료 계열의 각관 중의 니코틴산 함량을 구한다. 이 때의 측정치가 0.15 μg 이상 및 μg 이하의 것이 있으면 제외하고 남은 각 시험관에 대 해서 시험용액 1 ml에 대한 니코틴산의 함량을 구한다. 6개 이상 6) 의 관으로 부터 얻어진 각각의 수치가 그의 평균치보다 ±10%를 초과하는 것이 없는 것 을 확인한 다음에 다시 이것만의 평균치를 구하고, 다음에 시료 중의 니코틴 산 함량을 산출한다. 7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회,

113 8. 시험 주의사항 1) 니코틴산과 니코틴산아미드 분별정량이 필요한 경우는 Leuconostoc mesenteroides ATCC No.9135를 이용해서 니코틴산만을 정량하는 방법이 있다. 2) 통상접종균액을 조제할 때에는 전 배양한 균을 멸균생리식염수로 수회 세정 후 5 100배로 희석하여 사용하고 있지만, 적어도 본 법에 한해서는 결과에 큰 차이가 없어 위 조작을 필요하지 않는다. 3) 가압멸균 시 압력과 시간이 과도 할 경우는 배지 중 특히 비타민류의 손실을 초래하고 증식도에 영향을 미치기 때문에 주의한다. 4) 공시험의 적정치가 1.5 ml을 초과할 경우에는 기초배지의 ph조정 등이 부적 당하다고 생각되므로 다시 할 필요가 있다. 5) 일반적으로 브롬티몰블루가 사용되었지만, 시험용액이 착색되어있는 경우에는 종말점이 불명확하게 되는 경우가 있다. 6) 5개 이하일 경우는 다시 한다. 109

114 Ⅲ 나이아신(제3법) 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 N-vinylpyrolidine과 divinylbenzene이 copolymer 형태로 결합된 고정 상이 충전되어 있는 일회용 카트리지인 HLB 카트리지를 이용하여 시료 중 니코틴 산(나이아신)을 이동상으로 추출, 정제한 후 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출 기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대 흡수 파장인 260nm에서 정량 분석한다. 균질화 초음파 추출 원심분리 filtration 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 칼럼오븐 옥타데실실릴화한 칼럼 2. 안전 주의 사항 이동상으로 사용되는 메탄올은 포름알데하이드 제조나 부동액으로 사용되는 독성 을 갖는 무색의 가연성 알코올로서, 생체 내에서알코올탈수소효소에 의해 포름알데 하이드나 포름산이 되기 때문에 독성이 강하다. 30mL 이하를 섭취하더라도 사망에 이르며, 만성독성으로는 실명을 초래하는 것으로 알려져 있으므로 환기가 잘되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 카트리지 세척 시 사용되는 헥산은 상기도를 약간 자극하고 중추신경계를 억제한 다. 만성폭로하면 말초신경장해를 초래한다. 2,000ppm 농도에 10분 폭로될 때에는 아무런 작용이 없으나 5,000ppm 에서는 현기증이 생긴다. 구역, 두통, 눈과 목의 자 극증상이 1,400~1,500ppm 농도에서 생기며 탈지작용이 있으므로 오래 동안 폭로되 면 피부를 자극하게 된다. 피부에 닿으면 바로 물로 씻어내고 사용할 때에는 충분 히 환기를 해야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 용매용 일회용 실린지 HLB 카트리지 : N-vinylpyrolidine과 divinylbenzene이 copolymer 형태로 결합된 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 3mL) 또는 이와 동등한 것 여과용 멤브레인 필터 액체크로마토그래프용 유리병 부피플라스크(100 ml) 원심분리기 110

115 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 칼럼오븐 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상은 A용액(5 mm Sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액), B용액( 5 m M Sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액 : 메탄올 (35 : 65))을 이용하여 용 매를 분당 1.0 ml로 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 Nicotinic acid(3-picolinic acid; Niacin; Pellagra preventive factor; Pyridine-3-carboxylic acid; Vitamin B 3 ) 분자식 : C 6 H 5 NO 2, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 초산(Acetic acid) 헥산설폰산나트륨(Sodium hexanesulfonate) 메탄올(Methanol) 헥산(n-Hexane) 증류수(Distilled water) 5. 시험과정 5.1 시약제조 mm sodium hexanesulfonate 용액 Sodium hexanesulfonate mg을 증류수 500 ml에 녹여 증류수로 1 L가 되 게 한다. 5.2 표준용액 1) 의 조제 니코틴산 및 니코틴산아미드를 각각 증류수로 녹여 100 mg/l 로 제조하여 111

116 표준원액으로 한다 표준원액을 증류수로 적당히 희석 2) 하여 표준용액으로 만든다. 5.3 시험용액의 조제 시료를 취하여 균일하게 잘게 부순 후 적당량(1~10g)을 취한다 ml 부피플라스크에 넣고 5 mm Sodium hexanesulfonate 용액을 넣 는다 분간 초음파 추출한다 mm Sodium hexanesulfonate 용액을 넣어 표선까지 맞춘다 , 15,000 G로 30분간 원심분리하여 상등액을 취해 0.2 μm 멤브레인 필터 로 여과한다 HLB 카트리지를 준비하고 메탄올 5 ml과 증류수 5 ml을 연속으로 통과 시킨 후 카트리지에 여과액 10 ml를 통과시켜 니코틴산 및 니코틴산아미드 가 카트리지에 흡착되도록 한다 카트리지는 5 ml의 n-헥산으로 세척한 후 80% 메탄올용액 5 ml로 용출한다 용출액은 10 ml 부피플라스크에 모으고 증류수를 가하여 10 ml로 정용한 것 을 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항목 조건 주입량 10 μl 칼럼온도 40 A : 5 mm Sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액 이동상 B : 5 mm Sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액 : 메탄올 (35 : 65) 검출기 파장 260 nm 유량 1.0 ml/분 표 2. 이동상 조건(예) 시간(분) A용액(%) B용액(%)

117 6.2 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 니코틴산(mg/100g) = C (a b)/s 100/1,000 C : 시험용액 중의 니코틴산의 농도(ug/mL) a : 시험용액의 전량(mL) b : 희석배수 S : 시료 채취량(g) 7. 참고문헌 7.1 Z. Z. Cheng, Y. H. Wang, H. N. Xu, Z. H. Jia, H. Li, R. L. Hu : Observation of Nicotinic Acid in Nicorandil Samples and Simultaneous Determination of Nicorandil and Its Three Degradation Products in Raw Drug and Tablet Form by High Performance Liquid Chromatography, Journal of Analytical Chemistry, 64(10), , 시험 주의사항 1) 표준품은 흡습성이 있으므로, 오산화인(P 2 O 5 ) 또는 실리카겔 데시게이터에 1일 이상 건조시켜 사용한다. 2) 표준원액을 희석하여 표준용액 조제 시 조작오차를 방지하기 위하여 반드시 정해진 용량의 홀 피펫과 부피 프라스크를 사용하여야 한다. 113

118 Ⅲ 판토텐산 Ⅲ 판토텐산(제1법) 1. 시험방법의 원리 판토텐산은 모든 식품에 함유되어 있지만, 천연물에는 로얄제리, 효모, 간장 등에 특히 많고 곡류, 감자류, 야채류에도 비교적 많다. 동물조직에는 대부분 활성형의 CoA로서 존재한다. 일 반적으로 안정한 비타민으로 알려져 있지만, 산 및 알칼리로 가열처리하면 가수분해될 수 있 고, 인체 내에서 장내세균에 의해 합성되므로 사람의 결핍증은 특수한 경우를 제외하면 일어 나지 않는다. 식품 중에는 유리형과 CoA 등의 결합형으로서 존재하지만, 본 법은 칼슘염 등 의 유리형 판토텐산을 함유하는 시료에 대해서 사용할 수 있다. 결합형 판토텐산의 측정은 특수한 효소처리 등을 사용할 필요가 있다. 본 시험법은 시료 중 판토텐산을 미생물학 적으로 함량을 구하는 방법으로 시료를 황산으로 추출 후 효모나 유산균 접종액을 넣어 배양한 배양액의 흡광도 측정치를 가지고 시료중의 판토텐산의 함량을 측정한 다. 혼합 및 가압멸균 무균 접종 및 배양 분광광도계 2. 안전 주의 사항 염산은 자극적인 냄새를 가지고 있고 피부 화상, 점막 화상, 호흡 자극, 눈 자극 등의 건강 위험성이 있다. 물리적 위험으로는 용기가 열에 노출되면 파열되거나 폭 발할 수도 있고 물과 접촉 시 반응할 수 있다. 또한 흡입 시 자극이 심한 경우도 있을 수 있으며 두통, 폐 울혈과 폐 이상이 생길 수 있다. 또한 피부에 접촉 시 자 극 및 동상과 눈 접촉 시에는 실명 및 동상 마지막으로 섭취 시에는 화상, 구역, 구 토 및 설사를 유발시킬 수 있으므로 환기가 잘되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보 호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 톨루엔은 섭취 시 기도에 치명적일 수 있으며 호흡기계에 자극을 일으키고 장기간 또는 반복노출 시 장기에 손상을 일으킨다. 또한 태아 혹은 생식능력에 손상을 일 으킬 수도 있으므로 환기장치를 설치하고 보안경으로 눈 보호, 실험복 착용 및 안 전장갑 등의 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 항온기 건조기 114

119 3.1.3 멸균기 무균대 시험관 3.2 분석장비 분광광도계 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 D-Pantothenic acid 1) (Calcium D-pantothenate; Vitamin B 5 ) 분자식 :HOCH 2 C(CH 3 ) 2 CH(OH)CONHCH 2 CH 2 CO 2 1/2Ca 분자량 : , CAS No. : 일반시약 증류수(Distilled water) 염산(Hydrochloric acid) 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 톨루엔(Toluene) 제1인산칼륨(Monopotassium phosphate) 황산마그네슘(Magnesium sulfate) 염화나트륨(Sodium chloride) 황산제1철(Ferrous sulfate) 황산망간(Magnesium sulfate) 5. 시험과정 5.1 일반정량조작법 시약 사용 시약류는 가능한 한 순수한 시판품을 이용하고 검량선 작성을 위한 표준물질은 표준비타민을 이용한다 시험균의 보존 유산균류는 고층한천배지에, 효모류는 사면한천배지에 보존하며, 유산균과 효모용 보존배지의 조성은 다음과 같다. 유산균은 효모엑기스 분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트륨 1%, KH 2 PO 4 0.2%, 한천 1.5%의 조성 으로 하고, 효모용은 맥아엑기스분말 3%, 한천 1.5%로 한다. 한천을 가하 기 전에 각 성분을 잘 녹이고 ph를 6.8~7.0으로 조정하여 여과한 후, 한천 115

120 을 가하여 가온 상태에서 10 ml씩 시험관에 분주하여 멸균한다. 균은 접종하여 유산균은 37, 효모는 30 에서 약 20시간 배양한다. 배양 후 5 에 보존하면서 1~3주 간격으로 새로 배양한다. 사용하지 않을 때에 는 동결건조법에 의해 보존한다 접종균액 유산균 접종배지는 효모엑기스분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트륨 1%, 염류용액 A와 B는 기초배지의 1/2 양으로 사용한다. 이 액체배지에 보존균을 접종한다. 필요하면 16~24시간 정도 같은 배지에 2~3회 배양한다. 증식된 균체는 3,000 rpm에서 원심분리하여 0.9% NaCl용액으로 3회 세정 한 후, 적당한 농도의 균액(배지의 5~100배 용량의 0.9% NaCl용액을 가 한다)이 될 때까지 희석하여 접종균액으로 한다. 이 균액을 접종하는 모든 실험 조작은 무균적으로 행해야 한다 정량용 기초배지 (가) 염류용액 A KH 2 PO 4 와 K 2 HPO 4 각 5 g을 물에 녹여 전량을 100 ml로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다. (나) 염류용액 B MgSO 4 7H 2 O 2 g, NaCl 0.1 g, FeSO 4 7H 2 O 0.1 g 및 MnSO 4 4H 2 O 0.1 g을 물에 녹여 전량을 100 ml로 하여 HCl 1방울 및 톨루 엔 소량을 가해서 보존한다. (다) 카제인 산분해용액 비타민이 포함되어 있지 않은 카제인 100 g을 95% 알코올로 2회 세정 하여, 5배 양의 20% HCl을 가해서 8~12시간 동안 가열 환류하거나 또는 멸균기에서 121 로 8~12시간 가열한다. 계속해서 점액의 형태 가 될 때까지 감압하여 HCl을 제거하고, 여기에 물 200 ml를 가해 감압 하에서 HCl을 제거한다. 잔류물을 물에 녹이고 10% NaOH를 가 하여 ph를 3.5±0.1로 조정하고 여기에 물을 가하여 1 L로 만든다. 계 속해서 활성탄 20 g을 가해 1시간 정도 혼합한 후 여과한다. 여액이 담 황색 또는 무색이 될 때까지 이 조작을 되풀이한 후, 소량의 톨루엔 을 가하여 냉암소에 보관한다. 보관 중 침전이 생기면 여과해서 사용 한다 시험조작 특별한 기준이 없을 경우, 배양액은 5 ml 또는 10 ml로 한다. 정량하고 자 하는 비타민의 표준계열은 동질, 동형의 시험관을 사용하고, 각 농도에 관해서 2~3개씩 4~8단계로 하며, 비타민표준용액을 포함하지 않는 시험 관을 공시험용으로 하여 4~6개 준비한다. 총량이 5 ml일 경우 기초배지 는 2.5 ml를 사용하고, 10 ml일 경우 기초배지는 5 ml를 가한 후, 물을 116

121 가해서 각각 5 ml 또는 10 ml로 만든다. 시험용액의 계열은 각 시험법 에 규정된 방법으로 제조한 시험용액에 관해서 각 농도별로 시험관을 각각 2~3개씩 보통 4단계로 하고 표준계열과 같은 방법으로 동량의 기초배지 를 가한 후 물을 가해서 표준계열과 동량으로 한다. 분주가 끝나면 면전 하여 121 의 조건에서 5분간 가압 살균한다. 표준용액을 포함하지 않은 시험관은 1조(2~3개)를 제거하고, 각 시험관에 접종액 1방울씩을 무균적으 로 가한 후, 30~37 에서 16~24시간 배양 후 탁도법에 의하여 증식도를 측정한다. 증식도를 탁도법으로 측정할 때는 각 시험관의 내용물을 10 mm 직경의 흡수 cell에 옮기고 비타민 표준용액을 포함하지 않고 또한 균액을 접종하지 않는 시험관의 투과도를 100%로 하여, 분광광도기에서 540~610 nm의 파장으로 투과도 또는 흡광도를 구한다. 잡균이 혼입된 것이 밝혀진 경우나 기초배지 또는 접종균액 중에 정량하고자 하는 비타민이 혼재해 서 표준용액을 넣지 않은 대조 시험관에서의 증식이 느린 경우(투과율 90% 이하) 및 표준계열에 의한 최고의 증식이 소정의 증식도에 달하지 않을 때(투과율 40% 이상)는 다시 시험한다 탁도법에 의한 계산 검량선을 작성할 때는 횡축에는 표준용액의 농도 또는 ml 수의 대수를, 종축에는 투과도 또는 흡광도를 취한다. 표준용액의 각 농도단계에 관해서 얻어진 투과도 또는 흡광도의 평균치를 구해, 그 값(y)을 정점으로 해서 직 선을 그린다. 계속해서 시험용액의 각 농도단계에 관해서 투과도 또는 흡 광도를 구해, 횡축에 시료의 g 수 또는 시료용액 ml 수의 대수를 임의 로 취하여 실험치 y를 정점으로 하여 직선을 그린다. 이 때 적어도 3점 이상이 직선을 구성하여야 한다. 표준용액 및 시험용액 은 직선으로 평행하는 부분에 관해서 시험용액 1 ml 또는 시료 1 g당의 함유량을 구해 다음의 계산법에 따라 시료의 비타민 함량을 산출한다 계산식 비타민함량 = 시험용액의 비타민함량 희석농도 시료채취량 5.2 시약 제조 카제인 산분해용액 Ⅲ 판토텐산(제1법) 5.시험과정 5.1 일반정량조작법 정량용기초 배지에 따른다 시스틴-트립토판 용액 L-시스틴 2 g 및 L-트립토판 0.5 g을 350~400 ml의 물로 녹이고 70~80 로 가열하여 고형물이 완전히 녹을 때까지 20% HCl을 떨어뜨린다. 식힌 후 물을 가해서 전량을 500 ml로 만들고 톨루엔 소량을 가하여 약 1 0 에서 보존한다. 117

122 5.2.3 아데닌-구아닌-우라실용액 아데닌황산염, 구아닌염산염 및 우라실 각 0.1 g을 20% HCl 5 ml로 가열하면 서 녹이고 식힌 후 물을 가하여 100 ml로 만든다. 톨루엔 소량을 가해 서 약 10 로 보존한다 비타민 B 1 -비타민 B 2 -비오틴용액 비타민 B 1 염산염, 비타민 B 2 및 비오틴을 0.02 N 초산에 용해하여, 그 1 ml 에 비타민 B 1 염산염 10 μg, 비타민 B 2 20 μg 및 비오틴 0.04 μg을 포함하 도록 한다. 톨루엔을 소량 가하여 빛을 차단하고 냉소에 보관한다 염류용액 A Ⅲ 판토텐산(제1법) 4.시험과정 4.1 일반정량조작법 정량용기초 배지에 따른다 염류용액 B Ⅲ 판토텐산(제1법) 4.시험과정 4.1 일반정량조작법 정량용기 초배지에 따른다 파라아미노안식향산-니코틴산-비타민 B 6 용액 보존용액 1 ml에 파라아미노안식향산 10 μg, 니코틴산 20 μg 및 피리독 신염산염 40 μg을 포함하도록 25% 에탄올로 용해하여 냉소에 보관한다. 5.3 기초배지의 조제 카제인 산분해용액 10 ml, 시스틴-트립토판용액 10 ml, 아데닌-구아닌-우라 실용액 2 ml, 비타민 B 1 -비타민 B 2 -비오틴용액 2 ml, 파라아미노안식향산-니코 틴산-비타민 B 6 용액 2 ml, 염류용액 A 2 ml 및 염류용액 B 2 ml를 혼합하여 여기에 포도당 4 g 및 무수초산나트륨 2 g을 가해서 녹이고, 10% NaOH용액 으로 ph를 6.8로 조정한 후 물을 가해서 전량을 100 ml로 만든다. 불용물질 이 있으면 여과한다. Pantothenate medium(difco)을 사용할 수 있다. 5.4 접종용액의 조제 (1) Lactobacillus plantarum의 보존균주 물 100 ml에 효모엑기스 2 g을 녹이고, 여기에 포도당 0.5 g, 무수초산나트 륨 0.5 g을 가해 ph를 6.8로 조정한 후 수욕 상에서 10~20분간 가열하여 여 과한다. 한천 1.5 g을 가해 한천이 녹을 때까지 수욕 상에서 세게 진탕하면 서 가열한다. 뜨거운 상태에서 10 ml씩 시험관에 분주하여 면전하고, 121 에서 10분간 가압멸균한 후 시험관을 똑바로 놓고 식힌다. Lactobacillus plantarum ATCC 8014의 보존균주로부터 멸균된 배지에 접종한 후 37 에 16~24시간 배양하여 냉소에 보관한다. 보존균주는 매주 새로 조제하고 1주가 넘은 것은 사용하지 않는다. (2) 배지 기초배지 5 ml를 넣은 시험관에 판토텐산칼륨 0.2 μg을 포함한 물 5 ml를 가하고 면전을 하여, 121 에서 10분간 가압멸균한 후 식힌다. Bacto micro 118

123 inoculum broth(difco)를 사용할 수 있다. (3) 접종균액 Lactobacillus plantarum의 보존균주를 멸균된 배지 10 ml에 접종하여 37 에서 16~24시간 배양한다. 배양액을 잘 진탕 혼합한 후 그대로 접종균액 으로 사용한다. 5.5 표준용액 제조 판토텐산칼륨 50 mg을 정밀하게 취하여 1 L 부피플라스크에 넣는다 물을 가하여 용해시킨다 N 초산 10 ml, 2% 초산나트륨 100 ml, 물을 넣어 표선 근처까지 맞춘 다 톨루엔을 소량 가하여 표선에 맞춘다 사용 시에는 0.5 μg/ml이 되게 희석하여 사용한다. 5.6 시험용액 제조 2) 시료의 적어도 10배량의 물을 가하여 잘 혼합한다 초산 및 초산나트륨용액으로 ph를 5.6~5.7로 조정한다 가압멸균기에 넣고 121 에서 약 5분간 가열 후 식힌다. 필요하면 10% HCl 을 가해 ph를 4.0~4.5로 조정하여 단백질 등을 침전, 제거시키고 투명한 액으로 만든다 수산화나트륨용액을 가해서 ph 6.8로 조정한다 물을 가하여 1 ml에 판토텐산이 약 0.05 μg함유하게 희석한다. 5.7 시험조작 판토텐산 표준용액 계열을 만들기 위해 시험관 2개씩에 니코틴산 표준용액 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 1.75, 2 ml을 취한다 시험용액의 계열을 만들기 위하여 시험관 3개씩에 시험용액 0.5, 1.0, 1.5 ml을 취한다 각 시험관에 기초배지 2 ml을 넣고 물을 넣어 전량을 4 ml로 한다 각 시험관 뚜껑을 닫고 혼합한다 에서 5분간 가압 멸균한다 냉각 후 각 시험관에 접종균액 한방울씩 무균 접종한다 에서 20~24시간 3) 배양기에 넣어 배양한다 배양 후 각 시험관의 내용물이 잘 진탕 혼합하여 균일한 부유액으로 만든 후 540~660 nm의 파장에서 흡광도를 측정 4) 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 정량시험 판토텐산칼륨 표준계열에 의한 흡광도의 평균치로부터 검량선을 작성한다. 이 검량선을 이용하여 시료계열의 각 시험관의 판토텐산칼륨 함량을 구한다. 이 119

124 때 값이 0.09 μg 이상 또는 0.01 μg 이하의 것이 있으면 제외하고, 남은 각 관 에 대하여 시험용액 1 ml에 대한 판토텐산칼륨의 함량을 계산한다. 6개 이 상 5) 의 시험관으로부터 얻어진 각각의 값이 그들의 평균치보다 10% 이상 벗어 나지 않는 것을 확인한 다음에 이 값만의 평균치를 구하여 시료 중의 판토텐산 칼륨의 함량을 산출한다. 그 다음에 여기에서 얻은 값으로 환산계수 ) 을 곱해서 판토텐산 함량을 구한다. 7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 시험 주의사항 1) USP의 reference standard 또는 이에 준하는 것 2) 분해를 방지하기 위해서 조작 중 용액의 ph를 항상 지정 ph로 조정할 필요 가 있다. 3) 37 에서 72시간 배양한 후 산도적정에 따라 정량을 하는 것도 좋다. 4) 탁도 측정시 대조액으로 균말접종한 것을 사용한다. 5) 5개 이상일 때는 시험조작을 처음부터 다시 한다. 6) 판토텐산 및 판토텐산 칼슘의 분자량은 각각 및 이며, 환산계수는 /(476.54/2)=0.916이 된다. 120

125 Ⅲ 판토텐산(제2법) 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 판토텐산이 특정파장의 자외선을 흡수하는 성질을 이용하여 시료 중 존재하는 판토텐산을 20 mm 인산완충용액으로 추출하여 옥타데실실릴화한 컬럼으 로 판토텐산을 분리한 후 자외부흡광광도검출기를 이용하여 판토텐산의 최대 흡수 파 장인 200 nm에서 검출하여 정량한다. 마쇄 초음파추출 원심분리 filtration 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 2. 안전 주의 사항 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴(Acetonitrile)은 흡입이나 섭취시 구토, 구역질, 혈압변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의식불명 등의 증상 이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 용매용 일회용 실린지 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터 액체크로마토그래프용 유리병 부피플라스크(50 ml) 원심분리기 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 칼럼오븐 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 1.5 mm, 길이 250 mm, 충진재 Octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상은 2개의 용매가 사용 되는데 A용액(20 mm 인산칼륨용액(pH 2.1)), B 용액(20 mm 인산칼륨용액 : 아세토니트릴(80 : 20))으로 A : B 용액의 비율을 94 : 6의 비율로 분당 120 μl씩 충분한 시간동안 흘려 칼럼과 기기를 안정화 121

126 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 D-Pantothenic acid 1) (Calcium D-pantothenate; Vitamin B 5 ) 분자식 :HOCH 2 C(CH 3 ) 2 CH(OH)CONHCH 2 CH 2 CO 2 1/2Ca 분자량 : , CAS No. : 일반시약 인산(Phosphoric acid) 인산칼륨(Monopotassium phosphate) 증류수(Distilled water) 5. 시험과정 5.1 시약 제조 mm 인산칼륨용액 인산칼륨 2.7 g을 증류수에 녹이고 인산으로 ph 2.1로 조절한 후 전량을 1 L가 되게 한다. 5.2 표준용액 제조 2) 판토텐산 표준물질 5 mg을 정밀히 취해 50 ml 부피플라스크에 넣는다 표준용액을 증류수로 적당히 희석하여 사용한다. 5.3 시험용액 제조 시료 적당량을 취하여 마쇄기를 이용하여 잘게 부순 후 적당량을 취한다 ml 부피플라스크에 넣고 20 mm인산칼륨용액을 넣는다 분 동안 초음파 추출 한다 mm인산칼륨용액을 넣어 표선까지 맞춘다 rpm에서 원심분리를 하여 상등액을 취해 0.45 μm 멤브레인 필터로 여 과한 것을 시험용액으로 한다. 122

127 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항목 주입량 조건 10 μl 칼럼온도 35 이동상 검출기 파장 A : 20 mm 인산칼륨용액 B : 20 mm인산칼륨 : ACN (80 : 20) 200 nm 유량 120 μl/분 표 2. 이동상 조건 시간(분) 이 동 상 (%) A 용액 B 용액 표준물질 크로마토그램 123

128 6.3 계산 계산식 판토텐산(mg/100 g) = S a b 시료 채취량(g) S : 시험용액 중의 판토텐산의 농도(μg/mL) a : 시험용액의 전량(mL) b : 시험용액의 희석배수 7. 참고문헌 7.1 Zhi Chen, Bo Chen, Shouzhuo Yao : High-performance liquid chromatography/electrospray ionization-mass spectrometry for simultaneous determination of taurine and 10 water-soluble vitamins in multivitamin tablets, analytica chimica acta, 569, , 시험 주의사항 1) USP의 reference standard 또는 이에 준하는 것 2) 표준용액 조제 시 조작오차를 방지하기 위하여 반드시 정해진 용량의 홀 피펫과 부피 프라스크를 사용하여야 한다. 124

129 Ⅲ 비타민 B 6 Ⅲ 비타민 B 6 (제1법) 1. 시험방법의 원리 비타민 B 6 는 항 피부염 인자로서 pyidoxine(=pyridoxol), pyridoxal, pyridoxamine의 3종이 있고 대부분, 인산 에스테르로서 존재한다. 비타민 B 6 는 산성에서는 안정하지만 중성 및 알칼 리성에서는 불안정하고 빛이나 열에 의해서 분해되기 때문에 주의가 필요하다. 비타민 B 6 함 량이 많은 천연물에는 효모, 간장, 육류, 곡류, 두류가 있다. 비타민 B 6 의 이화학적 정량법은 전 처리조건으로서 비교적 순수한 형으로 비타민 B 6 를 추출 하는데 제한이 있어서 모든 검체에 광범위하게 적용하기에는 곤란한 경우가 많기 때문에 미 생물학적 정량법이 널리 이용되고 있다. 본 시험법은 시료 중 존재하는 피리독신염산염 을 증류수에 녹여 추출하여 옥타데실실릴화한 칼럼으로 피리독신염산염을 분리하는 방법으로 형광검출기를 이용하여 피리독신염산염의 여기파장인 290 nm, 측정파장 396 nm에서 검출하여 정량한다. 초음파 추출 여과 HPLC FLD 2. 안전 주의 사항 염산(Hydrochloric acid)은 자극적인 냄새를 가지고 있고 피부 화상, 점막 화상, 호 흡 자극, 눈 자극 등의 건강 위험성이 있다. 물리적 위험으로는 용기가 열에 노출되 면 파열되거나 폭발할 수도 있고 물과 접촉 시 반응할 수 있다. 또한 흡입 시 자극 이 심한 경우도 있을 수 있으며 두통, 폐 울혈과 폐 이상이 생길 수 있다. 또한 피 부에 접촉 시 자극 및 동상과 눈 접촉 시에는 실명 및 동상 마지막으로 섭취 시에 는 화상, 구역, 구토 및 설사를 유발시킬 수 있으므로 환기가 잘되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 용매용 일회용 실린지 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터 액체크로마토그래프용 유리병 부피플라스크(50 ml) 원심분리기 125

130 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 형광검출기(Fluorescence Detector, FLD) 칼럼오븐 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 1.5 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상으로 사용되는 50 mm 인산나트륨(pH 2.5)용액을 분당 1.0 ml씩 흘려줌 으로써 기기와 칼럼을 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 Pyridoxine hydrochloride 1) (Adermine hydrochloride; PN HCl; Pyridoxol hydrochloride; Vitamin B 6 hydrochloride) 분자식 :C 8 H 11 NO 3 HCl, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 염산(Hydrochlonic acid) 인산나트륨(Sodium phosphate,) 증류수(Distilled water) 5. 시험과정 5.1 시약 제조 mm 인산나트륨용액 인산나트륨 6.0 g을 증류수에 녹이고 염산으로 ph 2.5로 조절한 후 전량을 1 L가 되게 한다. 5.2 표준용액 제조 2) 피리독신염산염 표준물질 5 mg을 정밀히 취해 50 ml 부피플라스크에 넣 는다 표준용액을 증류수로 적당희 희석하여 사용한다. 5.3 시험용액 제조 126

131 5.3.1 시료 적당량을 취하여 마쇄기를 이용하여 잘게 부순 후 적당량을 취한다 테스트튜브에 넣고 증류수 25 ml을 넣는다 분 동안 초음파 추출 한다 원심분리후 상등액을 50 ml 부피플라스크에 넣는다 [5.2.2]~[5.2.4]의 방법을 1회 반복한다 증류수를 넣어 표선까지 맞춘다 이 액을 0.45 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항목 주입량 조건 10 μl 칼럼온도 35 이동상 50 mm 인산나트륨용액(pH 2.5) 검출기 파장 유량 여기파장 : 290 nm, 측정파장 : 396 nm 1.0 ml/분 6.2 표준물질 크로마토그램 127

132 6.3 계산 계산식 비타민 B 6 함량( 피리독신,mg/100g) =S a b 시료채취량( g) 100 1,000 S : 시험용액 중의 비타민 B 6 (피리독신)의 농도(μg/mL) a : 시험용액의 전량(mL) b : 시험용액의 희석배수 7. 참고문헌 7.1. HPLC Assay of Water-Soluble Vitamins, Fat-Soluble Vitamins, and a Preservative in Dry Syrup Multivitamin Formulation 8. 시험 주의사항 1) USP의 reference standard 또는 이에 준하는 것 2) 표준용액 조제 시 조작오차를 방지하기 위하여 반드시 정해진 용량의 홀 피펫 과 부피 프라스크를 사용하여야 한다. 128

133 Ⅲ 비타민 B 6 (제2법) 1. 시험방법의 원리 비타민의 미생물학적 분석법은 해당비타민을 생육 불가결의 인자로서 요구하는 미생물을 이 용하여 분석하려는 비타민만을 제외한 배양기를 만들어 시료용액을 첨가하여 배양하고, 그 증식도를 표준비타민을 첨가하여 배양한 경우의 증식도와 비교하여 정량하는 방법이다. 따라 서 정량시 미생물의 증식도는 첨가 비타민의 양에 비례하도록 되어야 하며, 증식도 측정은 비탁법 또는 생성산도의 적정법에 의하여 실시한다. 본 시험법은 시료 중 피리독신염산 염을 미생물학적으로 함량을 구하는 방법으로 시료를 염산과 물로 추출 후 접종액 을 넣어 배양하여 나온 측정치를 가지고 시료중의 피리독신염산염의 함량을 측정한 다. 혼합 및 가압멸균 무균 접종 및 배양 2. 안전 주의 사항 염산은 자극적인 냄새를 가지고 있고 피부 화상, 점막 화상, 호흡 자극, 눈 자극 등의 건강 위험성이 있다. 물리적 위험으로는 용기가 열에 노출되면 파열되거나 폭 발할 수도 있고 물과 접촉 시 반응할 수 있다. 또한 흡입 시 자극이 심한 경우도 있을 수 있으며 두통, 폐 울혈과 폐 이상이 생길 수 있다. 또한 피부에 접촉 시 자 극 및 동상과 눈 접촉 시에는 실명 및 동상 마지막으로 섭취 시에는 화상, 구역, 구 토 및 설사를 유발시킬 수 있으므로 환기가 잘되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보 호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 톨루엔은 섭취 시 기도에 치명적일 수 있으며 호흡기계에 자극을 일으키고 장기간 또는 반복노출 시 장기에 손상을 일으킨다. 또한 태아 혹은 생식능력에 손상을 일 으킬 수도 있으므로 환기장치를 설치하고 보안경으로 눈 보호, 실험복 착용 및 안 전장갑 등의 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 항온기 건조기 멸균기 무균대 시험관 129

134 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 Pyridoxine hydrochloride(adermine hydrochloride; PN HCl; Pyridoxol hydrochloride; Vitamin B 6 hydrochloride) 분자식 : C 8 H 11 NO 3 HCl, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 증류수(Distilled water) 염산(Hydrochloric acid) 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 톨루엔(Toluene) 제1인산칼륨(Monopotassium phosphate) 황산마그네슘(Magnesium sulfate) 염화나트륨(Sodium Chloride) 황산제1철(Ferrous sulfate) 황산망간(Magnessium sulfate) 5. 시험과정 5.1 일반정량조작법 시약 사용 시약류는 가능한 한 순수한 시판품을 이용하고 검량선 작성을 위한 표준물질은 표준비타민을 이용한다 시험균의 보존 유산균류는 고층한천배지에, 효모류는 사면한천배지에 보존하며, 유산균과 효모용 보존배지의 조성은 다음과 같다. 유산균은 효모엑기스 분말 1%, 펩 톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트륨 1%, KH 2 PO 4 0.2%, 한천 1.5%의 조성으 로 하고, 효모용은 맥아엑기스분말 3%, 한천 1.5%로 한다. 한천을 가하기 전에 각 성분을 잘 녹이고 ph를 6.8~7.0으로 조정하여 여과한 후, 한천을 가하여 가온 상태에서 10 ml씩 시험관에 분주하여 멸균한다. 균은 접 종하여 유산균은 37, 효모는 30 에서 약 20시간 배양한다. 배양 후 5 에 보존하면서 1~3주 간격으로 새로 배양한다. 사용하지 않을 때에는 130

135 동결건조법에 의해 보존한다 접종균액 유산균 접종배지는 효모엑기스분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트 륨 1%, 염류용액 A와 B는 기초배지의 1/2 양으로 사용한다. 이 액체배지 에 보존균을 접종한다. 필요하면 16~24시간 정도 같은 배지에 2~3회 배 양한다. 증식된 균체는 3,000 rpm에서 원심분리하여 0.9% NaCl용액으로 3 회 세정한 후, 적당한 농도의 균액(배지의 5~100배 용량의 0.9% NaCl용 액을 가한다)이 될 때까지 희석하여 접종균액으로 한다. 이 균액을 접종하 는 모든 실험 조작은 무균적으로 행해야 한다 정량용 기초배지 (가) 염류용액 A KH 2 PO 4 와 K 2 HPO 4 각 5 g을 물에 녹여 전량을 100 ml로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다. (나) 염류용액 B MgSO 4 7H 2 O 2 g, NaCl 0.1 g, FeSO 4 7H 2 O 0.1 g 및 MnSO 4 4H 2 O 0.1 g을 물에 녹여 전량을 100 ml로 하여 HCl 1방울 및 톨루 엔 소량을 가해서 보존한다. (다) 카제인 산분해용액 비타민이 포함되어 있지 않은 카제인 100 g을 95% 알코올로 2회 세정 하여, 5배 양의 20% HCl을 가해서 8~12시간 동안 가열 환류하거나 또는 멸균기에서 121 로 8~12시간 가열한다. 계속해서 점액의 형태 가 될 때까지 감압하여 HCl을 제거하고, 여기에 물 200 ml를 가해 감압 하에서 HCl을 제거한다. 잔류물을 물에 녹이고 10% NaOH를 가 하여 ph를 3.5±0.1로 조정하고 여기에 물을 가하여 1 L로 만든다. 계 속해서 활성탄 20 g을 가해 1시간 정도 혼합한 후 여과한다. 여액이 담황색 또는 무색이 될 때까지 이 조작을 되풀이한 후, 소량의 톨루 엔을 가하여 냉암소에 보관한다. 보관 중 침전이 생기면 여과해서 사 용한다 시험조작 특별한 기준이 없을 경우, 배양액은 5 ml 또는 10 ml로 한다. 정량하고자 하는 비타민의 표준계열은 동질, 동형의 시험관을 사용하고, 각 농도에 관 해서 2~3개씩 4~8단계로 하며, 비타민표준용액을 포함하지 않는 시험관 을 공시험용으로 하여 4~6개 준비한다. 총량이 5 ml일 경우 기초배지는 2.5 ml를 사용하고, 10 ml일 경우 기초배지는 5 ml를 가한 후, 물을 가 해서 각각 5 ml 또는 10 ml로 만든다. 시험용액의 계열은 각 시험법에 규정된 방법으로 제조한 시험용액에 관해서 각 농도별로 시험관을 각각 2~ 3개씩 보통 4단계로 하고 표준계열과 같은 방법으로 동량의 기초배지를 131

136 가한 후 물을 가해서 표준계열과 동량으로 한다. 분주가 끝나면 면전하여 121 의 조건에서 5분간 가압 살균한다. 표준용액을 포함하지 않은 시험 관은 1조(2~3개)를 제거하고, 각 시험관에 접종액 1방울씩을 무균적으로 가한 후, 30~37 에서 16~24시간 배양 후 탁도법에 의하여 증식도를 측 정한다. 증식도를 탁도법으로 측정할 때는 각 시험관의 내용물을 10 mm 직 경의 흡수 cell에 옮기고 비타민 표준용액을 포함하지 않고 또한 균액을 접 종하지 않는 시험관의 투과도를 100%로 하여, 분광광도기에서 540~610 nm 의 파장으로 투과도 또는 흡광도를 구한다. 잡균이 혼입된 것이 밝혀진 경우나 기초배지 또는 접종균액 중에 정량하고자 하는 비타민이 혼재해서 표준용액을 넣지 않은 대조 시험관에서의 증식이 느린 경우(투과율 90% 이하) 및 표준계열에 의한 최고의 증식이 소정의 증식도에 달하지 않을 때(투과율 40% 이상)는 다시 시험한다 탁도법에 의한 계산 검량선을 작성할 때는 횡축에는 표준용액의 농도 또는 ml 수의 대수를, 종축에는 투과도 또는 흡광도를 취한다. 표준용액의 각 농도단계에 관해서 얻어진 투과도 또는 흡광도의 평균치를 구해, 그 값(y)을 정점으로 해서 직 선을 그린다. 계속해서 시험용액의 각 농도단계에 관해서 투과도 또는 흡 광도를 구해, 횡축에 시료의 g 수 또는 시료용액 ml 수의 대수를 임의로 취하여 실험치 y를 정점으로 하여 직선을 그린다. 이 때 적어도 3점 이상이 직선을 구성하여야 한다. 표준용액 및 시험용액 은 직선으로 평행하는 부분에 관해서 시험용액 1 ml 또는 시료 1 g당의 함유량을 구해 다음의 계산법에 따라 시료의 비타민 함량을 산출한다 계산식 비타민함량 = 시험용액의 비타민함량 희석농도 시료채취량 5.2 시약 제조 카제인 산분해용액 정량용 기초배지에 따른다 비타민 B 1 용액 비타민 B 1 염산염 10 mg을 물에 용해해서 1,000 ml로 만든다. 이 용액 1 ml는 비타민 B 1 염산염 10 μg을 포함한다 이노시톨용액 이노시톨 100 mg을 물에 용해해서 100 ml로 만든다. 이 용액 1 ml는 이 노시톨 1 mg을 포함한다 비오틴용액 비오틴 25 mg을 물에 용해해서 1,000 ml로 만든 후 이 중 40 ml를 취해 물 을 가하여 1,000 ml로 만든다. 이 용액 1 ml는 비오틴 1 μg을 포함한다. 132

137 5.2.5 판토텐산칼륨용액 판토텐산칼륨 20 mg을 물에 용해해서 100 ml로 만든다. 이 용액 1 ml는 판토텐산칼륨 0.2 mg을 포함한다 니코틴산용액 니코틴산 100 mg을 물에 용해해서 100 ml로 만든다. 이 용액 1 ml는 니 코틴산 1 mg을 포함한다 염류용액 KH 2 PO g, KCl 1.7 g, CaCl 2 2H 2 O 0.5 g, MgSO 4 7H 2 O 0.5 g, MnSO 4 4H 2 O 0.01 g 및 FeCl g을 물에 용해해서 전량을 100 ml로 만든다. 불용물질이 있으면 여과한다 구연산완충액 구연산칼륨 10 g과 구연산 2 g을 물에 녹여 전량을 100 ml로 만든다. 5.3 기초배지의 조제 카제인 산분해용액 10 ml, 비타민 B 1 용액 5 ml, 이노시톨용액 5 ml, 비오틴용 액 2 ml, 판토텐산칼륨용액 2.5 ml, 니코틴산용액 0.5 ml, 염류용액 50 ml 및 구연산완충액 10 ml를 혼합하고 여기에 포도당 10 g을 가하여 녹인다. 10% NaCl 용액으로 ph를 5.0~5.2로 조정한 후 물을 가하여 전량을 100 ml 로 만든다. 용해되지 않은 물질이 있으면 여과한다. Pyridoxine assay medium(difco)을 사용할 수 있다. 5.4 접종용액의 조제 Saccharomyces pastorianus의 보존균주 Saccharomyces pastorianus 1) ATCC 9080을 효모용 한천사면배지 또는 Wort agar(difco)에 접종하여, 30 에서 16~24시간 배양 후 냉소에 보관한다. 보관균주는 2주 간격으로 새로 배양한다 배지 기초배지 100 ml에 피리독신염산염 1 μg을 포함한 물 100 ml를 가하여 접종균액 조제용 배지로 한다. 이 배지를 소시험관에 2 ml씩 분주하여 면전한 후 121 에서 10분간 가압 멸균하여 방냉한다 접종균액 Saccharomyces pastorianus의 보존균주를 멸균된 배지에 접종하여 30 에서 16~24시간 배양한다. 배양균을 원심분리하여 취한 후 이를 0.9% NaCl 용액으로 2회 세척하고, 0.9% NaCl 용액을 이용해서 약 20배로 희석하여 접종용액으로 한다. 5.5 표준용액 제조 피리독신염산염 50 mg을 정밀하게 취하여 500 ml 부피플라스크에 넣는다 N 염산용액을 가하여 표선을 맞춘다 사용 시에는 5 μg/ml이 되게 증류수로 희석하여 사용한다. 133

138 5.6 시험용액 제조 시료 약 2 g을 500 ml 삼각플라스크에 취한다 N 염산용액 1 ml, 물 180 ml을 가하여 뚜껑을 닫는다 에서 4시간 감압 추출한다 냉각 후 10% 수산화나트륨용액으로 ph4.5로 조정한다 물을 가하여 전량을 200 ml로 만든다. 필요시 여과한다 비타민 B 6 가 약 6 μg/ml을 포함하도록 물로 희석하여 시험용액으로 사용 한다 시험조작 비타민 B 6 표준용액 계열을 만들기 위해 시험관 2) 2개씩에 비타민 B 6 표준 용액 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0 ml을 취한다 시험용액의 계열을 만들기 위하여 시험관 3개씩에 시험용액 1.0, 1.5, 2.0 ml을 취한다 각 시험관에 기초배지 5 ml을 넣고 물을 넣어 전량을 10 ml로 한다 각 시험관 뚜껑을 닫고 혼합한다 에서 10분간 가압 멸균한다 냉각 후 각 시험관에 접종균액 한 방울씩 무균 접종한다 에서 16~24시간 배양기에 넣어 배양한다 배양 후 균의 증식을 정지시키기 위해 100 에서 5분간 멸균한 후 탁도법 에 의하여 균의 증식을 측정한다. 6. 참고문헌 6.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 실험 주의사항 1) 이 효모는 비타민 B 6 3종류에 거의 같은 정도로 반응하여 증식하고 사람에 대해서도 3 종의 비타민 B 6 는 같은 비타민 활성을 갖는 것으로 간주하고 있기 때문에, 식품 중의 총 비타민 B 6 함량측정에는 이 효모가 이용된다. 비타민 B 6 3종을 분별정량할 필요가 있는 경우에는 3종에 대해 활성에 있어 차이가 있는 시험균을 이용한다. 2) 시험관(16 mm i.d. 180 mm)을 사용하고 15 정도의 경사로 정치배양 하든가 또는 진탕하여 배양해도 좋다. 134

139 Ⅲ 엽산 Ⅲ 엽산(제1법 1) ) 1. 시험방법의 원리 엽산 합유량이 많은 식품으로는 녹엽채류, 효모, 두류, 간장, 육류 등을 들 수 있다. 엽산은 중성, 약알칼리성에는 안정하지만 산성에서 가열하면 분해되므로 정량 조작상 주의를 요한다. 본 시험법은 미생물의 생육 제한인자로 엽산을 사용하여 엽산 제한배지에서 배양되 는 정도로 시료중의 엽산의 함량을 측정하는 방법이다. 유산균 Lactobacillus casei와 S treptococcus faecalis가 이용할 수 있으나 전자의 경우는 감도가 높지만, 후자의 경우는 재현성 이 우세하여 보통 후자가 사용된다. 가압멸균 24hr 배양 분광광도기 2. 안전 주의 사항 수산화나트륨은 삼키면 유해하며 호흡기도, 피부, 눈, 점막에 화상을 입힐 수 있고 물과 접촉 시 반응 할 수 보안경으로 눈 보호, 실험복 착용 및 안전장갑 등의 안전 장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 염산은 자극적인 냄새를 가지고 있고 피부 화상, 점막 화상, 호흡 자극, 눈 자극 등의 건강 위험성이 있다. 물리적 위험으로는 용기가 열에 노출되면 파열되거나 폭 발할 수도 있고 물과 접촉 시 반응할 수 있다. 또한 흡입 시 자극이 심한 경우도 있을 수 있으며 두통, 폐 울혈과 폐 이상이 생길 수 있다. 또한 피부에 접촉 시 자 극 및 동상과 눈 접촉 시에는 실명 및 동상 마지막으로 섭취 시에는 화상, 구역, 구 토 및 설사를 유발시킬 수 있으므로 환기가 잘되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보 호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 톨루엔은 섭취 시 기도에 치명적일 수 있으며 호흡기계에 자극을 일으키고 장기간 또는 반복노출 시 장기에 손상을 일으킨다. 또한 태아 혹은 생식능력에 손상을 일 으킬 수도 있으므로 환기장치를 설치하고 보안경으로 눈 보호, 실험복 착용 및 안 전장갑 등의 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 항온기 135

140 3.1.2 건조기 멸균기 무균대 시험관 피펫 원심분리기 데시케이터 메스플라스크 3.2 분석장비 분광광도기 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 Folic acid 분자식 : C 19 H 19 N 7 O 6, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 수산화나트륨(Sodium chloride) 톨루엔(Toluene) 증류수(Distilled water) 염산(Hydrochloric acid) 암모니아수(Ammonia water) 5. 시험과정 <일반정량조작법> 5.1 시험균의 보존 유산균류는 고층한천배지에 보존하며, 효모엑기스 분말 1%, 펩톤 0.5%, 포 도당 1%, 초산나트륨 1%, KH 2 PO 4 0.2%, 한천 1.5%의 조성으로 한다 효모류는 사면한천배지에 보존하며, 효모용은 맥아엑기스분말 3%, 한천 1.5% 조성으로 한다 위의 배지에 한천을 가하기 전에 각 성분을 잘 녹이고 ph를 6.8~7.0으로 조정하여 여과한 후, 한천을 가하여 가온 상태에서 10 ml씩 시험관에 분 136

141 주하여 멸균한다 균은 접종하여 유산균은 37, 효모는 30 에서 약 20시간 배양한다. 배양 후 5 에 보존하면서 1~3주 간격으로 새로 배양한다. 사용하지 않을 때에 는 동결건조법에 의해 보존한다. 5.2 접종균액 유산균 접종배지는 효모엑기스분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트 륨 1%, 염류용액 A와 B는 기초배지의 1/2 양으로 사용한다 액체배지에 보존균을 접종한다. 필요하면 16~24시간 정도 같은 배지에 2~3회 배양한다 증식된 균체는 3,000 rpm에서 원심분리하여 0.9% NaCl용액으로 3회 세정 한 후, 적당한 농도의 균액(배지의 5~100배 용량의 0.9% NaCl용액을 가 한다)이 될 때까지 희석하여 접종균액으로 한다. 이 균액을 접종하는 모든 실험 조작은 무균적으로 행해야 한다. 5.3 기초배지 염류용액 A KH 2 PO 4 와 K 2 HPO 4 각 5 g을 물에 녹여 전량을 100 ml로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다 염류용액 B MgSO 4 7H 2 O 2 g, NaCl 0.1 g, FeSO 4 7H 2 O 0.1 g 및 MnSO 4 4H 2 O 0.1 g을 물에 녹여 전량을 100 ml로 하여 HCl 1방울 및 톨 루엔 소량을 가해서 보존한다 카제인 산분해용액 2) 비타민이 포함되어 있지 않은 카제인 100 g을 95% 알코올로 2회 세정 한다 배 양의 20% HCl을 가해서 8~12시간 동안 가열 환류하거나 또는 멸균기에서 121 로 8~12시간 가열한다 점액의 형태가 될 때까지 감압하여 HCl을 제거하고, 여기에 물 200 ml를 가해 감압 하에서 HCl을 제거한다. 5.4 시험조작 특별한 기준이 없을 경우, 배양액은 5 ml 또는 10 ml로 한다. 정량하고 자 하는 비타민의 표준계열은 동질, 동형의 시험관을 사용한다 각 농도에 관해서 2~3개씩 4~8단계로 하며, 비타민표준용액을 포함하지 않는 시험관을 공시험용으로 하여 4~6개 준비한다 총량이 5 ml일 경우 기초배지는 2.5 ml를 사용하고, 10 ml일 경우 기초 배지는 5 ml를 가한 후, 물을 가해서 각각 5 ml 또는 10 ml로 만든다 시험용액의 계열은 각 시험법에 규정된 방법으로 제조한 시험용액에 관해 서 각 농도별로 시험관을 각각 2~3개씩 보통 4단계로 하고 표준계열과 137

142 같은 방법으로 동량의 기초배지를 가한 후 물을 가해서 표준계열과 동량으 로 한다 분주가 끝나면 면전하여 121 의 조건에서 5분간 가압 살균한다 표준용액을 포함하지 않은 시험관은 1조(2~3개)를 제거하고, 각 시험관에 접종액 1방울씩을 무균적으로 가한 후, 30~37 에서 16~24시간 배양 후 탁도법에 의하여 증식도를 측정한다 증식도를 탁도법으로 측정할 때는 각 시험관의 내용물을 10 mm 직경의 흡 수 cell에 옮기고 비타민 표준용액을 포함하지 않고 또한 균액을 접종하 지 않는 시험관의 투과도를 100%로 하여, 분광광도기에서 540~610 nm의 파장으로 투과도 또는 흡광도를 구한다 잡균이 혼입된 것이 밝혀진 경우나 기초배지 또는 접종균액 중에 정량하고 자 하는 비타민이 혼재해서 표준용액을 넣지 않은 대조 시험관에서의 증식이 느린 경우(투과율 90% 이하) 및 표준계열에 의한 최고의 증식이 소정의 증식도에 달하지 않을 때(투과율 40% 이상)는 다시 시험한다. <엽산정량조작법> 5.1 시액 및 표준용액의 조제 엽산 보존용액 P 2 O 5 를 넣은 데시케이터에서 건조시킨 엽산 표준물질 50 mg을 정확하게 취하여 500 ml의 메스플라스크에 넣어 0.01 N NaOH 용액 약 30 ml로 녹인다 물 약 300 ml를 가한 후 HCl로 ph를 7~8로 조정하고 물을 가하 여 500 ml로 만든다 톨루엔을 가하여 약 10 로 보존한다. 이 용액 1 ml는 엽산 100 μg을 포함한다 엽산 표준용액 엽산 보존용액을 물로 희석해서 1 ml에 엽산 2 μg을 포함하도록 한다. 사용 시 조제한다 시스틴 트립토판용액 L-시스틴 2 g 및 L-트립토판 0.5 g(또는 DL-트립토판 1 g)을 350~400 ml의 물로 희석한다 ~80 로 가열하고, 고형물이 녹을 때까지 20% HCl을 첨가한다 식힌 후 물을 가해서 전량을 500 ml로 만들고, 톨루엔 소량을 가 하여 10 에 보관한다 아데닌-구아닌-우라실용액 아데닌황산염, 구아닌염산염 및 우라실 각 0.1 g을 20% HCl 5 ml 로 가열하면서 녹인다. 138

143 식힌 후 물을 가하여 100 ml로 만들고, 톨루엔 소량을 가하여 1 0 에 보관한다 카제인 산분해용액 Ⅲ 판토텐산(제1법) 4.시험과정 4.1 일반정량조작법 정량용기초 배지에 따른다 염류용액 B Ⅲ 판토텐산(제1법) 4.시험과정 4.1 일반정량조작법 정량용기초 배지에 따른다 크산틴용액 물 약 80 ml에 크산틴 0.4 g을 가한다 로 가열하면서 10% 암모니아수 12 ml를 가하여 크산틴이 녹을 때까지 젓는다 식힌 후 물을 가하여 400 ml로 만든다. 톨루엔을 가하여 보존한다 비타민용액 파라아미노안식향산 10 mg, 피리독신염산염 40 mg, 비타민 B 1 염산염 4 mg, 판토텐산 칼륨 8 mg, 니코틴산 8 mg 및 비오틴 0.2 mg을 약 300 ml의 물로 녹인다 비타민 B mg을 0.02 N 초산으로 녹인 용액 200 ml를 가한다 무수초산나트륨 1.9 g과 초산 1.6 ml를 40 ml의 물로 녹인 용액을 가한 후, 물을 가해서 2 L로 만든다. 톨루엔을 가하여 보존한다 아스파라긴 용액 L-아스파라긴 8 g을 물에 용해해서 800 ml로 만든다. 톨루엔을 가하여 보존한다 MnSO 4 용액 MnSO 4 4H 2 O 2 g을 물에 용해해서 200 ml로 만든다. 톨루엔을 가하여 보존한다 폴리솔베이트 80 용액 폴리솔베이트 80(Polyoxyethylene sorbitan monooleate) 25 g을 에 탄올로 녹여 250 ml로 만든다. 5.2 기초배지의 제조 카제인 산분해용액 10 ml, 시스틴-트립토판용액 20 ml, 아스파라긴용액 3 ml, 아데닌-구아닌-우라실용액 1 ml, 크산틴용액 2 ml, 비타민용액 20 ml, 염류용액 B 2 ml, MnSO 4 용액 2 ml 및 폴리솔베이트 80 용액 0.1 ml를 잘 섞고바릴티로신 표준물질 6 mg을 정밀히 측정한다 포도당 4 g, 인산이칼륨(K 2 HPO 4 ) 0.64 g 및 구연산나트륨(C 6 H 5 O 7 Na 3 2H 2 O) 5.2 g을 가하여 녹인다 % NaOH용액으로 ph를 6.8로 조정한 후, 물을 가하여 100 ml로 만든다. 139

144 불용물질이 있으면 여과한다 Folic acid assay medium(difco)을 사용할 수 있다. 5.3 접종균액의 제조 Streptococcus faecalis의 보존균주 물 100 ml에 효모엑기스 2 g을 녹이고 여기에 포도당 0.5 g, 무수초산 나트륨 0.5 g을 가하여 ph를 6.8로 조정한다 수욕 상에서 10~20분간 가열하여 여과한 후 한천 1.5 g을 가하여 한천이 용해될 때까지 수욕 상에서 세게 혼합하면서 가열한다 뜨거운 상태에서 10 ml씩을 시험관에 분주하여 면전하고 121 에 서 10분간 가압멸균한 후 시험관을 수직으로 세워 식힌다 Streptococcus faecalis ATCC 8043의 보존균주를 멸균된 배지 10 ml에 접종하여 37 에서 16~24시간 배양하여 냉소에 보관한다 보존균주는 매주 새로 배양하고 1주를 넘은 것은 사용하지 않는다 배지 천을 제외한 보존배지로 조제한 액체배지 2 ml를 소시험관에 분주하여 면전한다 에서 10분간 가압 멸균하여 방냉한다 접종균액 Streptococcus faecalis의 보존균주로부터 멸균된 배지에 접종한다 에서 16~24시간 배양 후 증식된 균체를 무균적으로 원심분리한 다 % NaCl 용액으로 2회 세척한 후, 0.9% NaCl 용액 약 2 ml를 가해서 접종균액으로 한다. 5.4 시험용액 제조 일정량의 시료를 플라스크에 넣고, 여기에 적어도 시료의 10배량의 물 을 가한다. 이 때 이 액 1 ml는 엽산 1 mg 이상을 포함하여야 한다 약 10% 암모니아수를 100 ml당 2 ml의 비로 가해서 잘 섞고, 가압멸균 기에 넣어 121 에서 약 15분간 가열한 후 식힌다 물을 가해 일정량으로 하여 여과 또는 원심분리하여 투명한 용액으로 만 든다 ph를 6.8로 조정한 후, 물을 가하여 적당히 희석한 것을 시험용액으로 한다. 시험용액 1 ml는 엽산 약 2 μg을 포함하도록 조제한다. 5.5 시험조작 엽산표준용액의 계열을 만들기 위해서 시험관 2개씩에 엽산표준용액 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 1.75 및 2.0 ml를 취하여 각 시험관에 기초배지 2 ml 및 물을 가해서 각각 4 ml로 만든다 시험용액의 계열은 시험관 3개씩에 시험용액 0.5, 1.0 및 1.5 ml를 가하고 140

145 각 시험관에 기초배지 2 ml 및 물을 가하여 4 ml로 만든다 시험관의 내용물을 잘 섞어 면전하고 121 에서 5분간 가압 멸균하여 식힌 후 각 시험관에 접종균액 1방울씩을 무균적으로 접종하여 37 에서 20~24 시간 배양한다 탁도법에 의하여 균의 증식도를 측정한다. 6. 분석 및 계산 6.1 탁도법에 의한 계산 검량선을 작성할 때는 횡축에는 표준용액의 농도 또는 ml 수의 대수를, 종축에는 투과도 또는 흡광도를 취한다 표준용액의 각 농도단계에 관해서 얻어진 투과도 또는 흡광도의 평균치를 구해, 그 값(y)을 정점으로 해서 직선을 그린다 실험용액의 각 농도단계에 관해서 투과도 또는 흡광도를 구해, 횡축에 시 료의 g 수 또는 시료용액 ml 수의 대수를 임의로 취하여 실험치 y를 정점으로 하여 직선을 그린다. 적어도 3점 이상이 직선을 구성하여야 한 다 표준용액 및 시험용액은 직선으로 평행하는 부분에 관해서 시험용액 1 ml 또는 시료 1 g당의 함유량을 구해 계산식에 따라 시료 중의 비타민 함 량을 산출한다. 6.2 탁도법에 의한 계산식 [계산식] 비타민함량 = 시험용액의 비타민함량 희석농도 시료채취량 7. 참고 문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 실험 주의사항 1) 본 법은 유리형 엽산(pteroylmonoglutamic acid)을 함유하는 시료에 사용할 수 있다. 결 합형 엽산을 함유하는 시료에 대해서는 특별히 효소처리 등의 전처리를 사용할 필요가 있다. 2) 시판 비타민 미함유 카자미노산을 사용하는 경우는 1 g을 사용한다. 141

146 Ⅲ 엽산(제2법) 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 이동상으로 시료 중 엽산을 충분히 추출하여 액체크로마토그래프/자 외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대 흡수파장인 280 nm에서 정량 분석한다. 초음파추출 원심분리 filtration 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 2. 안전 주의 사항 이동상으로 사용되는 메탄올의 경우 포름알데하이드 제조나 부동액으로 사용되는 독성을 갖는 무색의 가연성 알코올로서, 생체 내에서알코올탈수소효소에 의해 포름 알데하이드나 포름산이 되기 때문에 독성이 강하다. 30mL 이하를 섭취하더라도 사 망에 이르며, 만성독성으로는 실명을 초래하는 것으로 알려져 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1. 실험실 장비 및 소모품 부피플라스크(50 ml) 여과용 멤브레인 필터 용매용 일회용 실린지 액체크로마토그래프용 유리병 원심분리기 3.2. 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 칼럼오븐 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상은 A용액(5 mm sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액), B용액(5 mm sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액: 메탄올(70:30))을 이용하여 분당 1.0 ml로 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다. 142

147 4. 표준물질 및 일반시약 4.1. 표준물질 엽산 1) (Folic acid) 분자식 : C 19 H 19 N 7 O 6, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 수산화나트륨(Sodium chloride) 증류수(Distilled water) 헥산설폰산나트륨(Sodium hexanesulfonate) 초산(Acetic acid) 메탄올(Methanol) 5. 시험과정 5.1 시약 제조 N 수산화나트륨 용액(Sodium hydroxide) 1 N 수산화나트륨액을 취하여 증류수로 10배 용량으로 희석하여 사용하거 나 수산화나트륨 4.5 g을 취하여 일정량의 증류수에 녹이고 1 L 부피플라스크 에 옮겨 담은 후 증류수를 표선까지 채운 다음 표정하여 사용한다 mm Sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액 Sodium hexanesulfonate mg을 증류수 500 ml에 녹이고 초산 1 ml를 첨가한 후 증류수에 녹여 1 L가 되게 한다. 5.2 표준용액의 조제 엽산 표준물질을 0.1 N 수산화나트륨 용액에 녹여 1000 mg/l가 되도록 조제한다 표준원액 2) 을 증류수로 희석하여 표준용액으로 사용한다. 5.3 시험용액의 조제 시료 일정량을 정밀히 취한다 위의 시료를 50 ml 부피플라스크에 넣고 5 mm Sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액을 넣는다 분 동안 초음파 추출한다 mm Sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액을 넣어 표선까지 맞춘다 ,000 G로 10분간 원심분리를 하고 상등액을 취해 0.2 um 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다. 143

148 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표.1 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항목 주입량 조건 10 μl 칼럼온도 40 이동상 검출기파장 유속 A : 5 mm sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액 B : 5 mm sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액 : 메탄올(35:65) 280 nm 1.0 ml/분 표 2. 이동상 조건(예) 시간(분) A용액(%) B용액(%) 표준물질 크로마토그램 144

149 6.3 계산 엽산(mg/100g) = C (a b) / S 100 / 1,000 C : 시험용액 중의 엽산의 농도(ug/mL) a : 시험용액의 전량(mL) b : 희석배수 S : 시료 채취량(g) 7. 참고문헌 7.1 Liisa T. Vahteristo,* Velimatti Ollilainen, Pekka E. Koivistoinen, Pertti Varo : Improvements in the Analysis of Reduced Folate Monoglutamates and Folic Acid in Food by High-Performance Liquid Chromatography, Journal of Agricultural and food chemistry, 44(2), , 시험 주의사항 1) USP의 reference standard 또는 이에 준하는 것 2) 표준용액 조제 시 조작오차를 방지하기 위하여 반드시 정해진 용량의 홀 피펫 과 부피 프라스크를 사용하여야 한다. 145

150 Ⅲ 비타민 B 12 Ⅲ 비타민 B 12 (제1법) 1. 시험방법의 원리 비타민 B 12 는 건조상태나 ph 4 7의 액상에서 120 멸균처리에도 안정하지만 강한 가시광 이나 자외선에 의해 서서히 분해되므로 조작상 주의를 요한다. 비타민 B 12 함유량이 많은 식 품으로는 간장, 신장, 심장 등의 육류 등을 들 수 있다. 본 시험법은 시료 중 존재하는 비 타민용액Ⅰ을 준비된 배지에 가한 후 균을 접종하여 배양 후 탁도법에 의한 증식도를 측정한 후, 공시험을 투과도 100%로 하여 분광광도기에서 540~610 nm의 파장으로 흡광도를 구하여 탁도 측정에 의해 정량한다. 고압멸균 무균접종 분광광도계 2. 안전 주의 사항 염산(Hydrochloric acid)은 자극적인 냄새를 가지고 있고 피부 화상, 점막 화상, 호 흡 자극, 눈 자극 등의 건강 위험성이 있다. 물리적 위험으로는 용기가 열에 노출되 면 파열되거나 폭발할 수도 있고 물과 접촉 시 반응할 수 있다. 또한 흡입 시 자극 이 심한 경우도 있을 수 있으며 두통, 폐 울혈과 폐 이상이 생길 수 있다. 또한 피 부에 접촉 시 자극 및 동상과 눈 접촉 시에는 실명 및 동상 마지막으로 섭취 시에 는 화상, 구역, 구토 및 설사를 유발시킬 수 있으므로 환기가 잘되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 수산화나트륨(Sodium hydroxide)은 삼키면 유해하며 호흡기도, 피부, 눈, 점막에 화상을 입힐 수 있고 물과 접촉 시 반응 할 수 보안경으로 눈 보호, 실험복 착용 및 안전장갑 등의 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 항온기 건조기 멸균기 무균대 시험관 피펫 146

151 원심분리기 데시케이터 메스플라스크 분석장비 분광광도계 표준물질 및 일반시약 표준물질 Cyanocob(III)alamin α-(5,6-dimethylbenzimidazolyl)cyanocobamide 분자식 4.2 : C63H88CoN14O14P, 일반시약 에탄올 초산 염산 수산화나트륨 분자량 : , CAS No. : (Ethanol) (Acetic acid) (Hydro chloride) (Sodium chloride) 시험과정 일반정량조작법 시험균의 보존 유산균류는 고층한천배지에 보존하며 효모엑기스 분말 펩톤 포 도당 초산나트륨 한천 의 조성으로 한다 효모류는 사면한천배지에 보존하며 효모용은 맥아엑기스분말 한천 조성으로 한다 위의 배지에 한천을 가하기 전에 각 성분을 잘 녹이고 를 으로 조정하여 여과한 후 한천을 가하여 가온 상태에서 씩 시험관에 분 주하여 멸균한다 5. < > , 1%, 1%, KH2PO4 0.2%, %, 1.5%., 1.5% 0.5%, 3%, ph, ml

152 5.1.4 균은 접종하여 유산균은 37, 효모는 30 에서 약 20시간 배양한다. 배양 후 5 에 보존하면서 1~3주 간격으로 새로 배양한다. 사용하지 않을 때에 는 동결건조법에 의해 보존한다. 5.2 접종균액 유산균 접종배지는 효모엑기스분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트 륨 1%, 염류용액 A와 B는 기초배지의 1/2 양으로 사용한다 액체배지에 보존균을 접종한다. 필요하면 16~24시간 정도 같은 배지에 2~3회 배양한다 증식된 균체는 3,000 rpm에서 원심분리하여 0.9% NaCl용액으로 3회 세정 한 후, 적당한 농도의 균액(배지의 5~100배 용량의 0.9% NaCl용액을 가 한다)이 될 때까지 희석하여 접종균액으로 한다. 이 균액을 접종하는 모든 실험 조작은 무균적으로 행해야 한다. 5.3 기초배지 염류용액 A KH 2 PO 4 와 K 2 HPO 4 각 5 g을 물에 녹여 전량을 100 ml로 하여 HCl 1방 울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다 염류용액 B MgSO 4 7H 2 O 2 g, NaCl 0.1 g, FeSO 4 7H 2 O 0.1 g 및 MnSO 4 4H 2 O 0.1 g 을 물에 녹여 전량을 100 ml로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가 해서 보존한다 카제인 산분해용액 비타민이 포함되어 있지 않은 카제인 100 g을 95% 알코올로 2회 세정 한다 배 양의 20% HCl을 가해서 8~12시간 동안 가열 환류하거나 또 는 멸균기에서 121 로 8~12시간 가열한다 점액의 형태가 될 때까지 감압하여 HCl을 제거하고, 여기에 물 200 ml를 가해 감압 하에서 HCl을 제거한다. 5.4 시험조작 특별한 기준이 없을 경우, 배양액은 5 ml 또는 10 ml로 한다. 정량하고 자 하는 비타민의 표준계열은 동질, 동형의 시험관을 사용한다 각 농도에 관해서 2~3개씩 4~8단계로 하며, 비타민표준용액을 포함하지 않는 시험관을 공시험용으로 하여 4~6개 준비한다 총량이 5 ml일 경우 기초배지는 2.5 ml를 사용하고, 10 ml일 경우 기초 배지는 5 ml를 가한 후, 물을 가해서 각각 5 ml 또는 10 ml로 만든다 시험용액의 계열은 각 시험법에 규정된 방법으로 제조한 시험용액에 관해서 각 농도별로 시험관을 각각 2~3개씩 보통 4단계로 하고 표준계열과 같 은 방법으로 동량의 기초배지를 가한 후 물을 가해서 표준계열과 동량 148

153 으로 한다 분주가 끝나면 면전하여 121 의 조건에서 5분간 가압 살균한다 표준용액을 포함하지 않은 시험관은 1조(2~3개)를 제거하고, 각 시험관에 접종액 1방울씩을 무균적으로 가한 후, 30~37 에서 16~24시간 배양 후 탁도법에 의하여 증식도를 측정한다 증식도를 탁도법으로 측정할 때는 각 시험관의 내용물을 10 mm 직 경의 흡수 cell에 옮기고 비타민 표준용액을 포함하지 않 고 또한 균액을 접종하지 않는 시험관의 투과도를 100%로 하여, 분광광도기에서 540~ 610 nm의 파장으로 투과도 또는 흡광도를 구한다 잡균이 혼입된 것이 밝혀진 경우나 기초배지 또는 접종균액 중 에 정량 하고자 하는 비타민이 혼재해서 표준용액을 넣지 않은 대조 시험관에서 의 증식이 느린 경우(투과율 90% 이하) 및 표준 계열에 의한 최고의 증 식이 소정의 증식도에 달하지 않을 때(투 과율 40% 이상)는 다시 시험한 다. <비타민 B 12 정량조작법> 5.1 시액 및 표준용액의 조제 시아노코발아민 보존용액 데시케이터 중에서 건조시킨 시아노코발아민 표준물질을 시아노코 발아민의 양이 50~60 μg에 해당되도록 정확히 칭량하여 25% 알코 올을 가한 후 ml당 100 ng의 농도가 되도록 표준용액 농축액을 만 든다. 농축액은 10 에 보관한다 시아노코발아민 표준용액 용액에 일정량의 증류수를 가하여 500 ml로 희석한다 표준용액의 농도는 ml당 0.01~0.04 ng에 해당하는 농도로서, 시료 의 농도와 유사하도록 한다 위와 같은 방법으로 시료 중의 비타민 B 12 농도보다 높은 농도 및 낮은 농도(예 : ng/ml와 ng/ml)의 표준용액을 준비한 다 아데닌-구아닌-우라실 용액 아데닌황산염, 구아닌염산염, 우라실 1.0 g을 50 ml의 가온한 HCl 로 용해하고(1+1) 물을 가하여 1 L로 만든다 아스파라긴 용액 L-아스파라긴 10 g을 물로 녹이고 1 L로 만든다 폴리솔베이트 80 용액 폴리솔베이트 g을 알코올로 녹여 250 ml로 만든다 염류용액 A Ⅲ 판토텐산 1) 일반정량조작법 (5) 정량용 기초배지에 따른다. 149

154 5.1.7 염류용액 B Ⅲ 판토텐산 1) 일반정량조작법 (5) 정량용 기초배지에 따른다 비타민용액 비타민 B 2 25 mg, 비타민 B 1 염산염 25 mg, 비오틴 0.25 mg, 나이아신 50 mg을 0.02 N 초산으로 녹이고 1 L로 만든다 비타민용액 Ⅱ 파라아미노벤조산(PABA) 50 mg, 판토텐산 25 mg, 피리독신염산염 100 mg, 피리독살염산염 100 mg, 피리독사민염산염 20 mg, 엽산 5 mg을 25% 알코올로 녹이고 1 L로 만든다 부유배지(Suspension medium) 기초배지 5 ml를 동량의 물로 희석하여 시험관에 넣고 면전한다 에서 15분간 멸균한 후 빨리 식힌다. 10 의 암소에 저장한 다 크산틴용액 크산틴 1.0 g을 150~200 ml의 물로 녹이고 약 70 로 가열하면 서, 30 ml의 NH 4 OH(2+3)를 넣고 완전히 녹을 때까지 저은 후 물을 가하여 1 L로 만든다 카제인 산분해용액 Ⅲ 판토텐산 1) 일반정량조작법 (5) 정량용 기초배지에 따른다. 5.2 기초배지의 제조 비타민 B 12 가 포함되어 있지 않은 2배농도의 기초배지 1 L를 준비하기 위 하여 다음의 물질들을 순서대로 첨가한다 아데닌-구아닌-우라실용액 20 ml, 아스파라긴용액 20 ml, 염류용액 A 20 ml, 염류용액 B 20 ml, 비타민용액 Ⅰ 40 ml, 비타민용액 Ⅱ 40 ml, 크산틴용액 20 ml, 폴리솔베이트 80 용액 20 ml를 넣은 후 증류수를 가 하여 약 800 ml로 만든다 산가수분해카제인 10 g, L-시스틴 0.4 g, DL-트립토판 0.4 g을 최소량의 묽 은 염산(236 ml 진한염산/L)으로 녹인 용액과 포도당 40 g, sodium acetate trihydrate 33.2 g, 아스코르빈산 4 g을 순서대로 넣는다. 아스코 르빈산을 가한 후에는 강하게 교반하지 않아야 한다 모든 고형분이 완전히 녹을 때까지 가볍게 젓는다 HCl 또는 NaOH를 사용하여 ph를 6.0으로 조정한다. 지시약을 사용할 때 는 지시약이 폴리솔베이트를 흡수하기 때문에 ph를 조정한 후 폴리솔베 이트용액을 넣는다. vitamin B 12 assay medium(difco)을 사용할 수 있다. 5.3 접종균액의 제조 Lactobacillus leichmannii 1) 의 보존균주 Lactobacillus leichmannii ATCC 7830은 배양배지에 천자배양(stab 150

155 culture)한다. 37 에서 6~24시간 배양하여 10 의 암소에 저장한 다 분석하기 전 1~2주 간격으로 계속 배양하고, 최소한 1주일에 1번 정도로 새로 준비한다 액체배양배지 Peptonized milk 15 g, 효모엑기스 5 g, 포도당 10 g, KH 2 PO 4 2 g 을 600 ml의 물로 용해한다 여과한 tomato juice 100 ml를 가한 후 NaOH로 ph를 6.5~6.8로 조정한다 저으면서 10 ml의 폴리솔베이트 80을 첨가하고 물로 희석하여 1 L로 만든다. Lactobacilli broth AOAC(Difco)를 사용할 수 있다 ml당 1 ng의 비타민 B 12 를 포함하도록 동량의 물로 희석하여 시험 관에 10 ml씩 분주한 후, 면전하여 121 에서 15분간 멸균하여 빨 리 식히고 냉장고에 보관한다 배양배지 액체배양배지 500 ml에 5~7.5 g의 agar를 넣고 agar가 녹을 때까 지 수욕 상에서 젓는다 뜨거운 상태에서 10 ml를 취하여 시험관에 넣고 121 로 15분간 멸 균한 후 똑바로 세워 빨리 식히고 10 의 암소에 저장한다. Lactobacilli agar AOAC(Difco)를 사용할 수 있다 접종균액 L. leichmannii의 보관균주를 2개의 액체배양배지에 접종하여 37 에서 6~24시간 배양 후 원심분리하여 상등액은 버리고 0.9% NaCl 용액 또는 부유배지 10 ml로 3회 세척한다 부유배지를 100% T로 고정하고 이에 대하여 판독할 때, 시험관 당 0.50~0.75의 건조량에 상응되는 T 값이 주어지도록 0.9% NaCl 용 액 또는 부유배지로 일정량을 희석한다 위와 같이 준비한 것을 접종액으로 한다. 5.4 시험용액 제조 Na 2 HPO g, 구연산 1.2 g, sodium metabisulfite(na 2 S 2 O 5 ) 1.0 g 을 넣 은 용액 100 ml를 사용 전에 준비한다 비타민 B 12 의 농도가 50~100 ng이 되도록 시료의 양을 취한 후 ml당 0.01에서 0.04 ng의 비타민 B 12 최종분석 농도에서 추출용액을 sodium metabisulfite의 농도가 ml당 0.03 mg을 넘지 않도록 첨가 2) 한다 액상으로 시료용액을 완전히 분산시키고 물로 비커의 아랫부분을 세정하여 혼합물을 121 에서 10분간 멸균하여 식힌다. 만일 덩어리가 생기면 입자 가 완전히 녹을 때까지 혼합물을 젓는다. 151

156 5.4.4 세게 흔들면서 ph를 4.5로 조정하고, 비타민 B 12 의 농도가 ml당 0.2 ng이 되도록 물로 희석하여 여과한다 ph를 6.0으로 조정한 후 물을 가하여 적당히 희석한 것을 시험용액으로 한다. 시험용액 1 ml는 비타민 B ng을 포함하도록 조제한다. 5.5 시험조작 비타민 B 12 의 표준용액과 분석용액의 계열을 다음과 같이 준비한다. 두 개 의 시험관에 표준용액을 0(비접종 blank), 0(접종 blank), 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 과 5.0 ml씩 넣는다 분석시료는 2개 시험관에 분석용액을 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 ml씩 넣는다. 표 준용액과 분석용액의 각 시험관에 물을 넣어 5 ml로 만든 후, 5 ml의 기초배지를 넣고 잘 섞는다 면전하여 121 에서 10분간 고압 멸균하여 빨리 식힌다. 비접종 공시험용 시험관을 제외한 각 시험관에 접종액 1방울씩을 무균적으로 접종하여 37 에서 16~24시간 배양한다 각 시험관의 내용물을 완전히 혼합하여 흡수 cell에 옮기고, 비접종 시험관 의 투과도를 100%로 고정하여 각 시험관의 투과도를 구한다 시아노코발아민 표준계열에 의한 흡광도의 평균치로부터 검량선을 작성한다. 표준곡선으로부터 분석용액의 각 시험관의 비타민양을 정한다. 표준용액의 T값이 0.5 ml 이하 또는 4.5 ml 이상으로 관찰되면 무시한다 시험에 사용한 분석용액의 농도(비타민함량/mL)를 계산한다. 각 시험관 결과치의 평균을 구하되, 평균으로부터 10%이내의 오차를 보이는 결과만을 취하여 계산한다 분석용액의 4단계에 사용한 시험관 중 2/3미만이 적합한 결과를 보인 경 우, 이 결과는 시료의 비타민 B 12 함량 결정에는 불충분하다. 2/3 이상의 시험관의 결과가 적합한 경우라면, 그 평균값으로부터 시료의 역가를 구 한다. 6 분석 및 계산 6.1. 탁도법에 의한 계산 검량선을 작성할 때는 횡축에는 표준용액의 농도 또는 ml 수의 대수를, 종축에는 투과도 또는 흡광도를 취한다 표준용액의 각 농도단계에 관해서 얻어진 투과도 또는 흡광도의 평균치를 구해, 그 값(y)을 정점으로 해서 직선을 그린다 실험용액의 각 농도단계에 관해서 투과도 또는 흡광도를 구해, 횡축에 시 료의 g수 또는 시료용액 ml 수의 대수를 임의로 취하여 실험치 y를 정 점으로 하여 직선을 그린다. 적어도 3점 이상이 직선을 구성하여야 한 다. 152

157 6.1.4 표준용액 및 시험용액은 직선으로 평행하는 부분에 관해서 시험용액 1 ml 또는 시료 1 g당의 함유량을 구해 계산식에 따라 시료 중의 비타민 함 량을 산출한다. 6.2 탁도법에 의한 계산식 [계산식] 비타민함량 = 시험용액의 비타민함량 희석농도 시료채취량 7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 실험 주의사항 1) Lactobacillus leichmannii 이외에 Escherichia coli, EugleNa gracilis, OchromoNas malhamensis가 이용될 수 있다. Escherichia는 Lactobacillus보다 감도가 낮지만 EugleNa와 OchromoNas 보다는 감도가 높고 특이적으로 반응하는 장점이 있지만 성장속도가 매우 느린 단점이 있다. 2) Bisulfite의 양이 과도하면 미생물에 영향을 미칠 수 있으므로 선행 시험을 통 하여 적절한 양을 가하여야 한다. 153

158 Ⅲ 비타민 B 12 (제2법) 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 비타민B 12 가 특정 자외선 파장에서 흡광하는 성질을 이용하여 시료 중 존재하는 비타민B 12 을 옥타데실화한 칼럼으로 피리독신염산염을 분리하는 방법 으로 비타민B 12 의 측정파장 550 nm에서 검출하여 정량한다. 분쇄 초음파추출 원심분리 filtration 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 2. 안전 주의 사항 시료의 지방층 제거 시 사용되는 클로로포름은 신경을 마비시키는 작용을 하므로 마취제로서 사용되지만 과량복용이나 주사 시 심장을 멈춰 죽음에 이르게 하며, 장 기간 복용이나 노출은 간, 폐, 신장에 해를 주므로 환기가 잘되는 시설과 안전장비 를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 이동상으로 사용되는 메탄올의 경우 포름알데하이드 제조나 부동액으로 사용되는 독성을 갖는 무색의 가연성 알코올로서, 생체 내에서알코올탈수소효소에 의해 포름 알데하이드나 포름산이 되기 때문에 독성이 강하다. 30mL 이하를 섭취하더라도 사 망에 이르며, 만성독성으로는 실명을 초래하는 것으로 알려져 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1. 실험실 장비 및 소모품 용매용 일회용 실린지 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터 액체크로마토그래프용 유리병 부피플라스크(50 ml) 원심분리기 3.2. 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 Capcellpak MF C 8 (안지름 4.6 mm, 길이 150 mm, 충진입자 크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것 Capcellpak MG C 18 (안지름 2.0 mm, 길이 35 mm, 충진입자 크기 5 μm) 154

159 또는 이와 동등한 것 안지름 또는 이와 동등한 것 분석장비의 준비 이동상으로 사용되는 기와 칼럼을 안정화 시킨다 Capcellpak UG C18 ( 1.5 mm, 길이 250 충진입자 크기 mm, 5 μ m) mm KH2PO4 용액을 분당 500 씩 흘려줌으로써 기 μl. 표준물질 및 일반시약 표준물질 α Cyanocob(III)alamin( -(5,6-Dimethylbenzimidazolyl)cyanocobamide) 분자식 4.2 : C63H88CoN14O14P, : , CAS No. : 일반시약 인산완충용액 클로로포름 증류수 메탄올 (Phosphoric acid) 분자량 (Chloroform) (Distilled water) (Methanol) 시험과정 시약 제조 mm KH2PO4 KH2PO g 을 증류수에 녹이고 전량을 가 되게 한다 1 L. 표준용액 제조 표준원액 비타민 을 에 녹여 표준원액 을 조제한다 표준용액 표준원액을 증류수로 적당히 희석하여 표준용액을 만든다 시험용액 제조 B12(Cyanocobalamin) g/ml) 5 mm KH2PO4 ( μ

160 5.3.1 검체 적당량을 취하여 마쇄기를 이용하여 잘게 부순 후 5 mm 인산완충용 액을 가하여 10분간 초음파 진탕기로 추출한 후 50 ml로 맞춘다 ,000 rpm에서 원심분리한다 분리 후 간층을 취해서 21,000 rpm에서 다시 원심분리하고, 중간층을 시 험관에 옮겨 클로르포름 3 ml을 첨가하여 지방층을 제거(2,000 rpm)한 물층을 다시 21,000 rpm에서 10분간 원심분리한다 마지막으로 맑은 액층을 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으 로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항목 주입량 조건 10 μl 칼럼온도 35 이동상 5 mm KH 2 PO 4 /Methanol (80/20) 검출기 파장 유량 550 nm 120 μl/분 6.2 표준물질 크로마토그램 156

161 6.3 계산 계산식 비타민 B 12(μg/100 g) = S a b 100 검체량(g) 1000 S : 시험용액 중의 비타민 B 12 의 농도(ng/mL) a : 시험용액의 전량(mL) b : 시험용액의 희석배수 7. 참고문헌 7.1 Shahnaz Perveen, Arfa Yasmin, Khalid Mohammed Khan : Quantitative Simultaneous Estimation of Water Soluble Vitamins, Riboflavin, Pyridoxine, Cyanocobalamin and Folic Acid in Neutraceutical Products by HPLC, The Open Analytical Chemistry Journal, 3, 1-5, 실험 주의사항 1) USP의 reference standard 또는 이에 준하는 것 2) 표준용액 조제 시 조작오차를 방지하기 위하여 반드시 정해진 용량의 홀 피펫 과 부피 프라스크를 사용하여야 한다. 157

162 Ⅲ 비오틴 Ⅲ 비오틴(제1법) 1. 시험방법의 원리 비오틴은 간장, 효모, 우유, 야채류 등에 비교적 많이 함유되어 있고 육류, 곡류 중 함량은 일반적으로 낮다. 비교적 안정한 비타민으로서 중성부근에서는 가열해도 분해되지 않지만, 강 산 또는 알칼리에서는 장시간 가열에 의해 분해된다. 본 시험법은 시료 중 존재하는 비오 틴을 비오틴 제한배지에 가한 후 유산균은 Lactobacillus plantarum를 아니면 효모균을 접종하여 배양하여 탁도법에 의한 증식도를 측정한 후, 공시험을 투과도 100%로 하 여 분광광도계에서 540~610 nm의 파장으로 흡광도를 구하여 탁도 측정에 의해 정량 한다. 가압멸균 무균접종 분광광도계 2. 안전 주의 사항 염산(Hydrochloric acid)은 자극적인 냄새를 가지고 있고 피부 화상, 점막 화상, 호 흡 자극, 눈 자극 등의 건강 위험성이 있다. 물리적 위험으로는 용기가 열에 노출되 면 파열되거나 폭발할 수도 있고 물과 접촉 시 반응할 수 있다. 또한 흡입 시 자극 이 심한 경우도 있을 수 있으며 두통, 폐 울혈과 폐 이상이 생길 수 있다. 또한 피 부에 접촉 시 자극 및 동상과 눈 접촉 시에는 실명 및 동상 마지막으로 섭취 시에 는 화상, 구역, 구토 및 설사를 유발시킬 수 있으므로 환기가 잘되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 수산화나트륨(Sodium hydroxide)은 삼키면 유해하며 호흡기도, 피부, 눈, 점막에 화상을 입힐 수 있고 물과 접촉 시 반응 할 수 보안경으로 눈 보호, 실험복 착용 및 안전장갑 등의 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 항온기 건조기 멸균기 무균대 시험관(10~15 ml) 158

163 3.1.6 피펫 삼각플라스크(50 ml) 3.2 분석장비 분광광도계 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 Biotin 1) 분자식 : C 10 H 16 N 2 O 4 S, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 에탄올(Ethanol) 염산(Hydrochloric acid) 증류수(Distilled water) 초산(Acetic acid) 수산화나트륨(Sodium chloride) 5. 시험과정 <일반정량조작법> 5.1 시험균의 보존 유산균류는 고층한천배지에 보존하며, 효모엑기스 분말 1%, 펩톤 0.5%, 포 도당 1%, 초산나트륨 1%, KH 2 PO 4 0.2%, 한천 1.5%의 조성으로 한다 효모류는 사면한천배지에 보존하며, 효모용은 맥아엑기스분말 3%, 한천 1.5% 조성으로 한다 위의 배지에 한천을 가하기 전에 각 성분을 잘 녹이고 ph를 6.8~7.0으로 조정하여 여과한 후, 한천을 가하여 가온 상태에서 10 ml씩 시험관에 분 주하여 멸균한다 균은 접종하여 유산균은 37, 효모는 30 에서 약 20시간 배양한다. 배양 후 5 에 보존하면서 1~3주 간격으로 새로 배양한다. 사용하지 않을 때에 는 동결건조법에 의해 보존한다. 5.2 접종균액 유산균 접종배지는 효모엑기스분말 1%, 펩톤 0.5%, 포도당 1%, 초산나트 159

164 륨 1%, 염류용액 A와 B는 기초배지의 1/2 양으로 사용한다 액체배지에 보존균을 접종한다. 필요하면 16~24시간 정도 같은 배지에 2~3회 배양한다 증식된 균체는 3,000 rpm에서 원심분리하여 0.9% NaCl용액으로 3회 세정 한 후, 적당한 농도의 균액(배지의 5~100배 용량의 0.9% NaCl용액을 가 한다)이 될 때까지 희석하여 접종균액으로 한다. 이 균액을 접종하는 모든 실험 조작은 무균적으로 행해야 한다. 5.3 기초배지 염류용액 A KH 2 PO 4 와 K 2 HPO 4 각 5 g을 물에 녹여 전량을 100 ml로 하여 HCl 1방 울 및 톨루엔 소량을 가해서 보존한다 염류용액 B MgSO 4 7H 2 O 2 g, NaCl 0.1 g, FeSO 4 7H 2 O 0.1 g 및 MnSO 4 4H 2 O 0.1 g을 물에 녹여 전량을 100 ml로 하여 HCl 1방울 및 톨루엔 소량을 가해 서 보존한다 카제인 산분해용액 비타민이 포함되어 있지 않은 카제인 100 g을 95% 알코올로 2회 세 정한다 배 양의 20% HCl을 가해서 8~12시간 동안 가열 환류하거나 또는 멸균기에서 121 로 8~12시간 가열한다 점액의 형태가 될 때까지 감압하여 HCl을 제거하고, 여기에 물 200 ml를 가해 감압 하에서 HCl을 제거한다. 5.4 시험조작 특별한 기준이 없을 경우, 배양액은 5 ml 또는 10 ml로 한다. 정량하고 자 하는 비타민의 표준계열은 동질, 동형의 시험관을 사용한다 각 농도에 관해서 2~3개씩 4~8단계로 하며, 비타민표준용액을 포함하지 않는 시험관을 공시험용으로 하여 4~6개 준비한다 총량이 5 ml일 경우 기초배지는 2.5 ml를 사용하고, 10 ml일 경우 기초 배지는 5 ml를 가한 후, 물을 가해서 각각 5 ml 또는 10 ml로 만든다 시험용액의 계열은 각 시험법에 규정된 방법으로 제조한 시험용액에 관해 서 각 농도별로 시험관을 각각 2~3개씩 보통 4단계로 하고 표준계열과 같은 방법으로 동량의 기초배지를 가한 후 물을 가해서 표준계열과 동량으 로 한다 분주가 끝나면 면전하여 121 의 조건에서 5분간 가압 살균한다 표준용액을 포함하지 않은 시험관은 1조(2~3개)를 제거하고, 각 시험관에 접종액 1방울씩을 무균적으로 가한 후, 30~37 에서 16~24시간 배양 후 탁도법에 의하여 증식도를 측정한다. 160

165 5.4.7 증식도를 탁도법으로 측정할 때는 각 시험관의 내용물을 10 mm 직경의 흡 수 cell에 옮기고 비타민 표준용액을 포함하지 않고 또한 균액을 접종하 지 않는 시험관의 투과도를 100%로 하여, 분광광도기에서 540~610 nm의 파장으로 투과도 또는 흡광도를 구한다 잡균이 혼입된 것이 밝혀진 경우나 기초배지 또는 접종균액 중에 정량하고 자 하는 비타민이 혼재해서 표준용액을 넣지 않은 대조 시험관에서의 증식이 느린 경우(투과율 90% 이하) 및 표준계열에 의한 최고의 증식이 소정의 증 식도에 달하지 않을 때(투과율 40% 이상)는 다시 시험한다. <비오틴 정량조작법> 5.1 시액 및 표준용액의 조제 비오틴 보존용액 비오틴 표준물질을 50% 에탄올에 녹여, 그 1 ml에 비오틴 20 μg이 함유되도록 한다. 이 용액은 냉소에 보관한다 비오틴 표준용액 사용 시 비오틴 보존액을 물로 희석하여, 그 1 ml에 비오틴 0.2 μg이 함유되도록 한다 카제인 산분해용액 Ⅲ 판토텐산(제1법) 4.시험과정 4.1 일반정량조작법 정량 용기초배지에 따른다 아데닌-구아닌-우라실용액 아데닌황산염, 구아닌염산염 및 우라실 각 0.1 g을 20% HCl 5 ml 로 가열하면서 녹인다 식힌 후 물을 가하여 100 ml로 만들고, 톨루엔 소량을 가하여 1 0 에 보관한다 시스틴 트립토판 용액 L-시스틴 2 g 및 L-트립토판 2) 0.5 g(또는 DL-트립토판 1 g)을 350~400 ml의 물로 희석하여 70~80 로 가열하고, 고형물이 녹을 때까지 20% HCl을 첨가한다 식힌 후 물을 가해서 전량을 500 ml로 만들고, 톨루엔 소량을 가 하여 10 에 보관한다 비타민 B 1 비타민 B 2 용액 비타민 B 1 염산염, 비타민 B 2 를 0.02 N 초산에 녹여, 그 1 ml가 비타민 B 1 염산염 10 μg 및 비타민 B 2 20 μg을 함유하도록 한다. 이 용액은 톨루엔을 소량 가하여, 빛을 차광하여 냉소에 보관한다 p-아미노안식향산 니코틴산 판토텐산칼슘 비타민 B 6 용액 용액 1 ml가 p-아미노안식향산 10 μg, 니코틴산 20 μg, 판토텐산 161

166 칼슘 20 μg, 피리독신염산염 40 μg을 함유하도록 25% 에탄올에 녹인 다. 이 용액은 냉소에 보관한다 염류용액 A 및 B Ⅲ 판토텐산(제1법) 5.시험과정 5.1 일반정량조작법 정량 용기초배지에 따른다. 5.2 기초배지의 제조 카제인 산분해용액 10 ml, 시스틴-트립토판용액 20 ml, 아스파라긴용액 3 ml, 아데닌-구아닌-우라실용액 1 ml, 크산틴용액 2 ml, 비타민용액 20 ml, 염류용액 B 2 ml, MnSO 4 용액 2 ml 및 폴리솔베이트 80 용액 0.1 ml 를 잘 섞고 바릴티로신 표준물질 6 mg을 정밀히 측정한다 포도당 4 g, 인산이칼륨(K 2 HPO 4 ) 0.64 g 및 구연산나트륨 (C 6 H 5 O 7 Na 3 2H 2 O) 5.2 g을 가하여 녹인다 % NaOH용액으로 ph를 6.8로 조정한 후, 물을 가하여 100 ml로 만든다. 불용물질이 있으면 여과한다 Folic acid assay medium(difco)을 사용할 수 있다. 5.3 접종균액의 제조 Lactobacillus plantarum 보존균주 효모엑기스 0.5 g, 펩톤 1 g, 포도당 1 g 및 초산나트륨(3H 2 O) 1 g 을 물 60~70 ml에 녹여, 1~2분 끓인다 냉각 후, 염류용액 A 및 B 각 0.5 ml를 가하고 10% 수산화나트륨용 액으로 ph 6.8로 조정한다 물을 가하여 100 ml로 하고, 이것에 분말한천 2 g을 녹여, 10~15 ml씩 시험관에 분주하여 1 kg/cm 2 로 15분간 가압 멸균하여, 시험 관을 수직으로 보존하여 방냉한다 Lactobacillus plantarum ATCC No. 8014의 순수배양에서 상기의 균 주보존용 배지에 균을 접종하고, 37 에서 16~24시간 배양하여, 냉 소에 저장하여, 1주간마다 이식한다 접종용배지 [5.3.1]의 균주보존용 배지의 조제법에 따라서, 최후에 분말한천을 가 하지 않고 불용잔사를 여과하여 없애고 5 ml씩 시험관에 분주하고 1 kg/cm 2 15분간 가압멸균하여 방냉하여 접종용 배지로 한다 접종균액 Lactobacillus plantarum의 보존균주를 접종용 배지에 이식한다 에서 16~24시간 배양하고, 증식한 균액을 무균적으로 원심분리 한다 상등액을 비스듬하게 하여 제거하고, 여기에 멸균생리식염수 약 5 ml로 현탁시켜 다시 원심분리하여 상층액을 제거하고, 이 조작을 162

167 2회 반복하여 균을 세정한다 세정이 끝난 균액을 멸균생리식염수로 10~100배로 희석하여 접종 균액으로 한다. 5.4 시험용액 제조 비오틴 약 200 μg을 함유하는 시료를 50 ml의 삼각플라스크에 취하고 6 N 황산용액 25 ml를 가하여 1 kg/cm 2 로 1시간 가압한다 냉각 후, 10% 수산화나트륨용액으로 ph 6.8로 조정한다 원심분리 또는 여과한 후 물을 가하여 용액 1 ml 중에 비오틴 약 0.2 μg 을 함유하도록 희석한다. 5.5 시험조작 시험관 각 2개씩에 비오틴 표준용액 0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2.0 및 2.5 ml를 넣고, 각 시험관에 기초배지 2.5 ml 및 물을 가해 전량을 5 ml로 하여 표준용액 계열로 한다 별도로 시험관 각 3개씩에 시험용액 0.5, 1 및 2 ml를 취하고 각 시험관 에 기초배지 2.5 ml 및 물을 가해 전량을 5 ml 3) 로 한 것을 시험용액 계 열로 한다 양 계열의 시험관의 내용물을 잘 혼합하여, 알루미늄 뚜껑을 씌우고, 1 kg/cm 2 로 10분간 가압 멸균한다 냉각 후, 각 시험관에 접종균액을 1방울씩 무균적으로 접종하고, 산도적정 에 의한 정량에는 37, 72시간, 탁도측정에 의한 정량에는 37, 16~24 시간 배양한다 배양 후, 각 시험관에 생긴 산 또는 탁도를 Ⅲ 나이아신 <제2법 미생 물학적 시험법> 의해 정량한다. 6. 분석 및 계산 6.1 탁도법에 의한 계산 검량선을 작성할 때는 횡축에는 표준용액의 농도 또는 ml 수의 대수를, 종축에는 투과도 또는 흡광도를 취한다 표준용액의 각 농도단계에 관해서 얻어진 투과도 또는 흡광도의 평균치를 구해, 그 값(y)을 정점으로 해서 직선을 그린다 실험용액의 각 농도단계에 관해서 투과도 또는 흡광도를 구해, 횡축에 시 료의 g수 또는 시료용액 ml 수의 대수를 임의로 취하여 실험치 y를 정점 으로 하여 직선을 그린다. 적어도 3점 이상이 직선을 구성하여야 한다 표준용액 및 시험용액은 직선으로 평행하는 부분에 관해서 시험용액 1 ml 또는 시료 1 g당의 함유량을 구해 계산식에 따라 시료 중의 비타민 함량을 산출한다. 163

168 6.2 탁도법에 의한 계산식 [계산식] 비타민함량 = 시험용액의 비타민함량 희석농도 시료채취량 7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 실험 주의사항 1) USP의 reference standard 또는 이에 준하는 것 2) 시판 비타민 미함유 카자미노산 분말을 사용하는 경우 1g을 사용한다. 3) 산도적정에 따라 정량을 행할 때는 배양액 전량을 2 또는 10 ml 증감시켜도 좋다. 이 때 접종균액을 가감할 필요가 있다. 일반적인 산도 적정법은 탁도 측 정법보다 정량범위가 넓은 잇점이 있다. 164

169 Ⅲ 비오틴(제2법) 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 시료 중 비오틴을 octadecyl silica 칼럼으로 전처리, 농축, 분리 및 분 석을 한 스텝으로 행하는 방법으로 전처리 컬럼은 Capcellpak MF SCX, SG80을 농 축 컬럼으로는 Capcellpak C18 UG120V을 그리고 분석 컬럼은 Capcellpak C18 UG120V을 이용하며, 이동상으로 충분히 추출하고 액체크로마토그래프(육방전환밸 브시스템)/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대 흡수파장인 200 nm에서 정량분석 한다. 균질화 초음파추출 원심분리 filtration 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 2. 안전 주의 사항 이동상으로 사용되는 메탄올의 경우 포름알데하이드 제조나 부동액으로 사용되는 독성을 갖는 무색의 가연성 알코올로서, 생체 내에서알코올탈수소효소에 의해 포름 알데하이드나 포름산이 되기 때문에 독성이 강하다. 30mL 이하를 섭취하더라도 사 망에 이르며, 만성독성으로는 실명을 초래하는 것으로 알려져 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1. 실험실 장비 및 소모품 부피플라스크(50 ml) 여과용 멤브레인 필터 용매용 일회용 실린지 액체크로마토그래프용 유리병 원심분리기 3.2. 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 육방전환밸브시스템 칼럼오븐 칼럼 전처리 컬럼 : Capcellpak MF SCX, SG80(안지름 4.6 mm, 길이

170 mm) 또는 이와 동등한 것 농축 컬럼 : Capcellpak C18 UG120V(안지름 2.0 mm, 길이 35 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 분석 컬럼 : Capcellpak C18 UG120V(안지름 1.5 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상은 0.01 M 인산이수소칼륨용액과 0.01 M 인산이수소칼륨용액:메탄올 (80:20)을 이용하여 전처리칼럼은 분당 500 ul, 분석칼럼은 분당 100 ul를 충분 한 시간동안 흘려 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1. 표준물질 비오틴(Biotin) 1) 분자식 : C 10 H 10 N 2 O 3 S, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 인산이수소칼륨(Potassium dihydrogen phosphate) 증류수(Distilled water) 메탄올(Methanol) 5. 시험과정 5.1 시약 제조 M 인산이수소칼륨 용액(pH 4.8) 인산이수소칼륨 1.35 g을 증류수에 녹여 1 L로 한다. 5.2 표준용액의 조제 비오틴 표준물질을 0.01 M 인산이수소칼륨용액에 녹여 1,000 mg/l가 되 도록 조제한다. (4 이하 암소 보관) 상기 표준원액을 0.01 M 인산이수소칼륨용액으로 희석 2) 하여 표준용액으로 사용한다.(사용시 제조) 5.3 시험용액의 조제 균질화한 시료 3) 일정량(약 5g)을 정밀히 취한다 위의 시료를 50 ml 갈색 부피플라스크에 넣고 0.01 M 인산이수소칼륨용 액을 넣는다. 166

171 분 동안 초음파 추출한다 M 인산이수소칼륨용액 넣어 표선까지 맞춘다 추출액을 원심분리관으로 옮겨 10분간 shaker에서 격렬하게 흔든다 에서 35,000 G로 30분간 원심분리한 후 상층액을 취한다 이 액을 0.2 μm 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항목 조건 주입량 100 μl 칼럼온도 40 이동상 전처리컬럼 : 0.01 M 인산이수소칼륨용액 분 석 컬 럼 : 0.01 M 인산이수소칼륨용액/메탄올(80:20) 검출기파장 200 nm 유속 전처리컬럼 : 500 μl/분 분석컬럼 : 100 μl/분 6.2 표준물질 크로마토그램 167

172 6.3 계산 비오틴(mg/100g) = C (a b) / S 100 / 1,000 C : 시험용액 중의 비오틴의 농도(ug/mL) a : 시험용액의 전량(mL) b : 희석배수 S : 시료 채취량(g) 7. 참고문헌 7.1 Andrzej Przyjazny, Nathaniel G. Hentz, Leonidas G. Bachas : Sensitive and selective liquid chromatographic postcolumn reaction detection system for bi otin and biocytin using a homogeneous fluorophore-linked assay, Journal of Chromatography A, 654, 79-86, 시험 주의사항 1) USP의 reference standard 또는 이에 준하는 것 2) 표준원액을 희석하여 표준용액 조제 시 조작오차를 방지하기 위하여 반드시 정해진 용량의 홀 피펫과 부피 프라스크를 사용하여야 한다. 3) 시료는 대부분 용기 포장 등에 담겨 있으므로 채취시에는 분석결과에 영향을 미치지 않는 적절한 기구 및 용기를 준비 사용해야한다. 168

173 Ⅲ 비타민 C Ⅲ 비타민 C(제1법) 1. 시험방법의 원리 천연에 존재하는 비타민 C에는 환원형(L-ascorbic acid, AA)과 산화형 (L-dehydroascorbic acid, DHAA)이 있다. 항 괴혈병 비타민으로서 알려졌지만 상세 한 생리작용은 아직 명확하지 않지만 현재까지 작용기작이 밝혀져 있는 바로는 콜 라겐 등의 결합조직의 합성과 유지에 관여하며, 항 괴혈병작용과 관련된 생리작용 은 양자가 동등하다고 여겨지고 있으므로 비타민 C 정량은 환원형(AA)과 산화형 (DHAA)을 합쳐서 측정할 필요가 있다. 환원형(AA)은 열과 빛에 민감하여 산화형(DHAA)으로 빠르게 전환된다. ph 에서는 대부분 안정하나 Fe 또는 Cu 같은 금속이온에 의해 촉매되어 분해된 다. 산화형(DHAA)은 환원형(AA)을 활성탄(activated charcoal), 할로겐(halogens), 염화제2철(ferric chloride), 과산화수소(hydrogen peroxide), 2-6- 디클로로페놀인도 페놀(2,6-dichlorophenol-indophenol, DCP)과 같은 산화제에 의해 생성되는데, 이러 한 성질은 비타민 C정량의 분석원리로 이용된다. 본 시험법은 메타인산용액으로 추 출한 환원형 비타민 C를 2,6-dichlorophenol-indophenol(DCP)로 산화시켜 산화형(DHAA) 으로 만든 다음 2,4-dinitrophenyl hydrazine(dnp)를 가해 적색의 오사존(osazone)을 형 성시킨 후 황산을 가해 탈수시키면 등적색의 무수물 bis-2,4-dinitrophenylhydrazine 으로 전환되어 안정된 정색반응을 나타내는데, 이를 파장 510~540 nm에서 공시험 을 투과도 100%로 하여 표준용액과의 흡광도를 측정하여 정량하는 방법이다. 산화 혼합냉각 및 방치 분광광도계 2. 안전 주의 사항 황산은 흡입 시 치명적이며, 점막에 심한 자극을 야기할 수 있고, 눈과 피부에 화 상을 야기할 수 있으므로 취급 후 철저히 씻어야 하고, 적절한 환기 하에서 사용해 야 한다. 또한 물과 위험한 반응을 일으킬 수 있으며, 연소물을 발화시킬 수 있으므 로 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 항온기 169

174 3.1.2 건조기 멸균기 무균대 시험관 피펫 원심분리기 데시케이터 메스플라스크 3.2 분석장비 분광광도계 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 L-Ascorbic acid, L-Threoascorbic acid 분자식 : C 6 H 8 O 6, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 초산(Acetic acid) 디니트로페닐하이드라진용액(DNP) 증류수(Distilled water) 황산용액(Sulfuric acid) 5. 시험과정 5.1 시액 및 표준용액의 조제 메타인산-초산용액 메타인산 15 g을 초산 40 ml 및 물 200 ml로 잘 진탕 혼합하여 녹여서 물을 가해 250 ml로 한다. 이 용액은 냉장고에 보관하면 1 주간 1) 사용할 수 있다 묽은 메타인산-초산용액 메타인산-초산용액을 같은 양의 물로 혼합한다. (사용 시 조제) % 메타인산용액 냉장고에 보존한다 % 메타인산용액 냉장고에 저장, 2주간 사용할 수 있다. 170

175 % 메타인산용액 사용할 때 조제한다 인도페놀용액 ,6-디클로로페놀 인도페놀나트륨염 0.2 g을 더운물에 녹여 100 ml 로 한다. 필요하면 여과한다. 본 용액은 냉장고에 보존하고 2주간 사용할 수 있다 메타인산-티오요소용액 % 메타인산용액 50 ml에 티오요소 2 g을 녹인다. 물을 가해 100 ml로 한다(사용 시 조제) 디니트로페닐하이드라진용액 , 4-디니트로페닐하이드라진 2 g을 9 N 황산액 100 ml에 녹인다. 유리여과기로 여과한다. 본 용액은 냉장고에 보존하면 2주간 사용 할 수 있다 비타민 C 표준용액 비타민 C 표준물질 2) 100 mg을 정밀히 단다 메스플라스크에 넣어 5% 메타인산용액에 녹여서 100 ml로 한다 , 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 및 2.5 ml를 각각 메스플라스크에 취해 5% 메타인산용액을 가해서 100 ml로 한다(사용 시 조제). 5.2 실험용액의 제조 시료의 일정량을 정밀히 단 후 정확히 같은 양의 메타인산-초산용액 3) 을 잘 혼합해서 균등한 죽 상태 4) 로 한다 환원형 비타민 C로서 1~5 mg 함유되도록 균등한 죽상태의 일정량(W g)을 100 ml의 메스플라스크에 옮기고 묽은 메타인산-초산용액으로 100 ml로 한다 용액을 여과하여 처음의 수 ml를 제거해서 그 후의 여액을 취하거나 또 는 원심분리해서 상등액을 취하여 시험용액으로 한다. 다만, 조작은 모두 신 속히 행한다. 5.3 시험조작 산화 시험용액 2 ml를 시험관 T 1, T 2 및 T 3 에 취해 T 1 에 인도페놀용액 1 방울 5) 을 혼합해서 이것이 적색을 나타내는지 확인하고, T 1, T 2 및 T 3 에 메타인산-티오요소용액 6) 2 ml씩 가한다 오사존의 생성 시험관 T 1 및 T 2 에 디니트로페닐하이드라진용액 1 ml씩을 가해 37 (±0.5 ) 항온 수욕 중에서 정확히 3시간 방치 7) 하고 T 3 와 함께 얼음물 중에 침적한다. 171

176 5.3.3 오사존의 용해 얼음물 중에서 냉각하면서 T 1, T 2 및 T 3 에 85% 황산용액 5 ml를 조 금씩 8) 적가해서 1분간 얼음물 중에서 내용액을 잘 혼합 냉각한다 차가운 상태에서 T 3 에 디니트로페닐하이드라진용액 1 ml를 혼합한다 T 1, T 2 및 T 3 의 내용액을 재차 혼합한 후 얼음물로부터 꺼내서 실 온에서 30~40분간 방치한다. 6. 분석 및 계산 6.1 비색 T 1 및 T 2 의 내용액에 대해서 510~540 nm에서 흡광도를 측정하고, T 1 및 T 2 로 한다. 대조액은 T 3 로 한다. 6.2 검량선의 작성 비타민 C 표준용액의 각 2 ml씩을 시험관에 취하고 위의 시험조작에 따 라서 조작한다. 각각 흡광도를 구하고 검량선을 그린다. 6.3 흡광도에 따른 계산 시험용액 2 ml 중의 총 비타민 C량 및 산화형 비타민 C량을 각각의 환 원형 비타민 C량(μg)으로 나타낸 수치를 검량선에서 찾아서 T 1 및 T 2 에 대 응하는 점으로부터 구하여 C 1 및 C 2 로 한다. 시료 중의 비타민 C함량은 다 음 식으로 구한다. [계산식] 총 비타민 C 함량(mg/100 g) = C 1 50 시료 채취량(g) ,000 W 시료 채취량(g) 산화형 비타민 C 함량(mg/100 g) = C 2 50 시료 채취량(g) ,000 W 시료 채취량(g) 환원형 비타민 C 함량(mg/100 g) = 총 비타민 C함량(mg/100 g) - 산화형 비타민 C 함량 (mg/100 g) 7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 실험 주의사항 1) H 3 PO 3 는 H 3 PO 4 로 서서히 변화하나, 냉장보관하면 7 10일간 안정하다. 2) 직사광선을 피하여 데시케이터에 보관한 것을 사용한다. 3) 비타민 C 추출용매로 보고된 예로는 metaphosphoric acid, perchloric acid, EDTA 또는 sodium metabisulfite를 첨가한 0.1 % 2,3-dimercapto-1-propanol ortho-phosphoric acid, pyrogallol을 첨가한 3 % citric acid, 0.3 M 172

177 trichloroacetic acid 등이 있다. 4) 시료의 분쇄에 믹서 등을 사용하는 경우 금속이온이 녹아들거나, 조작 중에 뜨거워지지 않도록 주의한다. 액상인 경우 이 조작을 생략하고 다음 조작을 행 한다. 5) 인도페놀용액이 부족하면 산화가 불완전하게 일어나므로 과잉의 양을 가하는 것이 좋다. 단, 4방울 이상 들어가면 시료의 농도가 너무 높은 것에 해당되므 로 시험용액을 다시 희석하여 다음 조작을 행한다. 6) 반응의 속도를 조절하고 비타민 C의 산화를 방지한다. 7) 시간을 단축하려면 50 에서 70분간 반응시킬 수 있으나, 당류가 많은 경우는 37 를 유지하는 것이 좋다. 8) 5 ml를 한번에 가하면 내용물이 타는 경우가 있으므로, 얼음물 중에서 격렬히 흔들면서서서히 조작한다. 173

178 Ⅲ 비타민 C(제2법) 1. 시험방법의 요약 본 시험법은 비타민 C가 산성 수용액 중에서 인도페놀용액(2,6-dichlorophenolindophenol, DCP)를 환원시켜 탈색하는 것에 기초하여 시료 중의 비타민C와 인도페놀용액을 반응시 켜 적색이 5초간 지속 될 때까지의 투입량을 이용하여 정량하는 방법 1) 이다. 용해 / 냉각 차광 / 냉소 인도페놀용액 소비량 계산 2. 안전 주의 사항 디하이드로페닐하이드라진은 무채색의 액체로서 신체에 접촉하면 접촉부위에 화상 을 일으키고 장기간 노출되면 위장장애, 신자과 간 등장기에 손상을 주고 단기간 노출 시에도 구토, 호흡곤란, 두통과 현기증을 일으키며 휘발성이 강하여 폭발의 위험성이 높으므로 취급에 주의하여야한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 피펫 메스플라스크 삼각플라스크 타이머 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 L-Ascorbic acid L-Threoascorbic acid 분자식 : C 6 H 8 O 6, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 증류수(Distilled water) 174

179 4.2.2 초산(Acetic acid) ,6-디클로로페놀 인도페놀나트륨염(2,6-Dichloroindophenol sodium salt dihydrate) 디하이드로페닐하이드라진용액(DNP) 5. 시험과정 5.1 시액 조제 인도페놀용액 미리 탄산수소나트륨 약 50 mg을 더운물 약 150 ml에 용해한다 , 6-디클로로페놀 인도페놀나트륨염 약 50 mg을 용해시키고 냉 각 후 물로 200 ml로 한다 여과 후 차광하여 냉소에 저장하면 일주간 2) 사용할 수 있다. 단, 다음 방법에 따라 사용할 때 적정한다 비타민 C 표준물질 3) 100 mg을 정밀히 달아서 500 ml의 메스플라 스크에 넣어 묽은 메타인산-초산용액으로 500 ml로 한다. 그 5 ml를 정밀히 취하여 묽은 메타인산-초산용액 5 ml를 가하고 인도페놀용 액으로 액이 적어도 5초간 적색이 지속될 때까지 적정한다. 여기에 적정된 인도페놀용액의 소비량을 T ml로 한다 시험조작 (조작은 모두 신속히 행한다.) 환원형 비타민 C의 적정 디니트로페닐하이드라진법에서 조제한 시험용액 10 ml를 삼각플라 스크에 정확히 취하여 즉시 인도페놀용액으로 액이 적어도 5초간 적 색이 지속될 때까지 적정한다. 이 때 적정된 인도페놀용액의 소비량 을 S ml로 한다. 6. 계산 시료 중의 환원형 비타민 C는 다음 식에 의해 구한다. [계산식] 환원형 비타민 C 함량(mg/100 g) = A S 시료 채취량(g) T W 시료 채취량(g) A(mg) : 인도페놀용액 T ml에 대응하는 아스코르빈산 량 7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회,

180 8. 시험 주의사항 1) 본 법은 환원형 비타민 C 정량법이어서 다른 환원성 물질이 함유된 시료나 추출액이 착색 또는 혼탁한 경우에는 적용하기 어렵다. 2) 만일, 조제해 둔 표정액의 양이 감소되었거나 변색되었다면 버리고 새롭게 조 제한다. 3) 직사광선을 피하여 데시케이터에 보관한 것을 사용한다. 176

181 Ⅲ 비타민 C(제3법) 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 시료 중 존재하는 비타민C을 메타인산으로 환원형 비타민 C를 추출 한 후 옥타데실화된 칼럼(역상분배형 칼럼)으로 분리하여 정량하는 방법 1) 으로 자외 부흡광광도검출기를 이용하여 최대 흡수 파장인 254 nm에서 검출한다. 균질화 원심분리 HPLC 자외부흡광광도검출기 2. 안전 주의 사항 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴(Acetonitrile)은 흡입이나 섭취시 구토, 구역질, 혈압변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의식불명 등의 증상 이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 용매용 일회용 실린지 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터 가지달린 삼각플라스크(Filter Flask) 여지(filter paper) 액체크로마토그래프용 유리병 부피플라스크(50 ml, 10 ml) 원심분리관 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 Jascopack Fine Sil-NH 2, Lichrosorb NH 2, Zipax SAX, Vydac SAX. Partisil-10SAX, μ-bondapak C 18, μ- Bondapak/CN, Pormaphase CPS 또 는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상은 2개의 용매가 사용 되는데 0.05 M KH 2 PO 4 : 아세토니트릴(60 : 40) 이 두 개의 용매을 분당 1 ml씩 충분한 시간동안 흘려 기기와 칼럼을 안정 화 시킨다. 177

182 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 L-Ascorbic acid L-Ascorbic acid(l-threoascorbic acid) 분자식 : C 6 H 8 O 6, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 메타인산(Metaphosphoric acid) 아세토니트릴(Acetonitrile) 증류수(Distilled water) 인산칼륨(Potassium phosphate) 5. 시험과정 5.1 시약 제조 % 메타인산용액 메타인산 10 g을 물에 녹여 100 ml로 한다. 불용물이 생기는 경우 여과하 여 사용한다. 냉장고에서 일주일까지 보관 2) 할 수 있다 % 메타인산용액 10% 메타인산용액을 물로 2배 희석한다. 사용시 조제한다. 5.2 표준용액 제조 표준원액 아스코르빈산 3) 10 mg을 정밀히 달아, 5% 메타인산용액에 녹여 100 ml로 한 것을 표준원액(100 ppm)으로 한다 표준용액 필요한 경우 표준원액에 5% 메타인산용액을 넣어 원하는 농도로 희석하여 사용 4) 한다. 사용 시 조제한다. 5.3 시험용액 제조 시료 일정량 5) (비타민 C함량이 50 mg/100 g 이상인 경우 2 g 정도, 10~50 mg/100 g인 경우 5~10 g 정도를 시료로 한다)을 정확히 단다 동량의 10% 메타인산용액을 가하여 10분간 현탁시킨 후 6) 적당량의 5% 메 178

183 타인산을 넣어 균질화 7) 한다 균질화된 시료를 100 ml 메스플라스크에 옮기고 소량의 5% 메타인산용 액으로 용기를 씻은 후 메스플라스크에 합하여 100 ml로 한다 ,000 rpm에서 10~15분간 원심분리를 행하여 상등액 8) 을 취하고 5% 메타 인산용액으로 적당히 희석하여 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항목 조건 주입량 10 μl 칼럼온도 실온 이동상 0.05 M KH 2 PO 4 : 아세토니트릴(60 : 40) 검출기 파장 254 nm 9) 유량 1.0 ml/min 6.2 표준물질 크로마토그램 6.3 정량시험 시험용액 및 표준용액을 각각 10 μl씩 주입하여 얻은 피크의 넓이 또는 높이를 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 비타민 C의 농도(μg/mL)를 구한다 계산식에 의해 시료 중 아스코르빈산의 함량(mg/100g)을 산출한다. L-아 179

184 6.3.3 계산식 스코르빈산 나트륨으로 환산하는 경우에는 L-아스코르빈산량에 계수 1.125를 곱한다. 비타민 C(μg/100 g) = S a b 100 검체량(g) 1000 S : 시험용액 중의 아스코로빈산의 농도(ng/mL) a : 시험용액의 전량(mL) b : 시험용액의 희석배수 7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 시험 주의사항 1) 산화형 비타민 C(DHAA)는 자외부에 흡수되지 않으므로 자외부 흡수검출기를 사용하 는 본 법으로는 검출할 수 없다. 시차굴절계를 사용하는 방법도 있지만 검출감도가 저 하되기 때문에 실용적이지 못하다. 단, 산화형 비타민 C(DHAA) 함량은 존재하는 산화 형 비타민 C (DHAA)를 황화수소나 디치오에리스리톨(Dithioerythritol) 등의 환원제를 사용하여 환원형 비타민 C(AA)로 전환시켜 정량한 후 환원제 처리를 행하지 않고 측정 한 환원형 비타민 C(AA)의 함량을 빼서 정량할 수 있다. 2) H 3 PO 3 는 H 3 PO 4 로 서서히 변화하나, 냉장보관하면 7 10일간 안정하다. 3) 직사광선을 피하여 데시케이터에 보관한 것을 사용한다. 표준품의 경우도 안정 하지 않으므로 필요한 경우 요소규정액, 또는 요소산칼륨규정액으로 표정하여 순도를 확인하는 것이 좋다. 표정은 아스코르빈산 표준품 약 0.2 g을 정밀하게 취해 이것을 200 ml 플라스크에 넣고 2 % 메타인산용액 50 ml에 녹인 다음 이것을 전분시약을 지시약으로 0.05 mol/l 요소액으로 적정한다 mol/l 요소액 1 ml는 mg의 아스코르빈산에 상당한다. 4) μg/ ml 농도가 적당하다. 5) 100g중 10 mg이하의 아스코르빈산 함유 식품에 있어서는 고속액체 크로마토그 라피에 시료용액의 주입량을 많게 하는 등 시료에 응하는 조작을 필요로 한다. 6) 동량의 10 %(w/v) 메타인산 용액을 가해도 충분히 현탁할 수 없는 시료에 대 해서는 적당량의 5 %(w/v)메타인산을 가하여 혼화한다. 메타인산의 첨가에 따 라 침전을 형성하지 않는 시료에 대해서는 원심분리를 생략하거나 여과지를 통한 여과로 바꿀 수 있다. 7) 시료의 분쇄에 믹서 등을 사용하는 경우 금속이온이 녹아들거나, 조작 중에 뜨 거워지지 않도록 주의한다. 액상인 경우 이 조작을 생략하고 다음 조작을 행한 180

185 다. 8) 시료에 따라서는 여과지 또는 0.45 μm 멤브레인필터 여과가 필요한 경우도 있 다. 9) 254 nm 또는 그 부근의 파장의 자외부 검출기를 가지고 있는 것, 이외 고감도 시차굴절검출기, 또는 전기화학적검출기 등도 사용할 수 있다. 181

186 Ⅲ.3.2. 무기질 Ⅲ 구리, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 셀렌, 크롬 Ⅲ 구리, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 셀렌, 크롬(제1법) 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 시료 중 존재하는 구리, 마그네슘, 망간, 몰리브덴을 건식으로 분해하 여 원자흡광광도법을 적용하여 정량한다. 이는 시험용액 중의 금속원소를 적당한 방법으로 해리시켜 원자 증기화하여 생성한 기저상태의 원자가 그 원자증기를 통과 하는 빛으로부터 측정파장의 빛을 흡수하는 현상을 이용하여 광전측정 등에 따라 목 적원소의 특정파장에 있어서 흡광도를 측정하고 시험용액 중의 목적원소의 농도를 구하는 방법이다. 시료를 원자화하는 일반적인 방법은 화염방식과 무염방식이 있다. 탄화 / 회화 건조 가온 Filtration 원자흡광광도계 2. 안전 주의 사항 시험용액 제조에 사용되는 염산(Hydrochloric acid)은 자극적인 냄새를 가지고 있 고 피부 화상, 점막 화상, 호흡 자극, 눈 자극 등의 건강 위험성이 있다. 물리적 위 험으로는 용기가 열에 노출되면 파열되거나 폭발할 수도 있고 물과 접촉 시 반응할 수 있다. 또한 흡입 시 자극이 심한 경우도 있을 수 있으며 두통, 폐 울혈과 폐 이 상이 생길 수 있다. 또한 피부에 접촉 시 자극 및 동상과 눈 접촉 시에는 실명 및 동상 마지막으로 섭취 시에는 화상, 구역, 구토 및 설사를 유발시킬 수 있으므로 환 기가 잘되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 도가니 또는 백금접시 회화로 수욕조 또는 오븐 유리여과기 또는 석면 시험관 182

187 3.1.6 피펫 3.2 분석장비 원자흡광광도계(Atomic Absorption Spectrophotometer, AAS) 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 Copper 분자식 : Cu, 분자량 : 63.55, CAS No. : Magnesium 분자식 : Mg, 분자량 : 24.31, CAS No. : Maganese 분자식 : Mn, 분자량 : 54.94, CAS No. : Molybdenum 분자식 : Mo, 분자량 : 95.94, CAS No. : Selenium 분자식 : Se, 분자량 : 78.96, CAS No. : Chromium 분자식 : Cr, 분자량 : 52.00, CAS No. : 일반시약 질산(Nitric Acid) 염산(Hydrochloric acid) 증류수(Distilled water) BTB시액(Bromothymol blue) 황산암모늄용액(Ammonium sulfate liquid) 암모니아수(Ammonia water) 5. 시험과정 5.1 시험용액의 제조(건식분해법 1) ) 시료(건조물) 약 5~20 g을 취해 건조하여 탄화시킨다 ~550 2) 에서 회화 3) 한다. 잘되지 않으면 일단 식혀 질산(1+1) 또는 50% 질산마그네슘용액 또는 질산알루미늄 40 g 및 질산칼륨 20 g을 물 100 ml에 녹인 액 2~5 ml로 적시고 건조한 다음 회화를 계속한다. 회화가 불충분할 때는 위의 조작을 1회 되풀이하고 필요하면 마지막으로 질산(1+1) 2~5 ml를 가하여 완전하게 회화를 한다 회분을 물로 적시고 염산 2~4 ml를 가하여 수욕 상 또는 건조장치에서 건조한다 염산 1~2 ml 또는 각 시험법에서 지정한 용매(원자흡광광도법 4) 에 의한 직 183

188 접법의 경우 Sn은 1 N 염산, 그 밖의 금속은 0.5 N 질산)를 가하여 가 온해서 녹이고 불용물이 있으면 석면 또는 유리여과기로 여과한 다음 일 정량으로 하여 시험용액으로 한다. 다만, 회화보조제로서 염산, 산화마그 네슘, 탄산나트륨 등을 사용해도 좋으나 Sn의 시험에 있어서는 질산염 또는 질산을 사용해서는 아니 되며 그 밖의 금속의 경우에도 시험조작 에 영향이 없을 때에만 사용하되 공시험용액에 대해서도 같은 조작을 하여 시험용액을 보정한다. 여기에 증류수 10mL을 가하고 10분간 교반 후 원심 분리(3,000rpm, 10min)한다. 5.2 시험조작 제1법 직접법 시험용액 및 공시험용액을 그대로, 혹은 희석 또는 농축한다 원자흡광 광도계에 주입하여 흡광도를 구하고 따로 표준용액 및 이 의 공시험용액에 대해서도 각각 시험용액의 경우와 같은 조작을 해서 검량선을 작성하여 시험용액의 농도를 구한다 제2법 용매추출법 시험용액 및 공시험용액을 각각 10~50 ml 취한다 % 구연산암모늄용액 2~10 ml 및 BTB시액 2방울을 가하여 액의 색이 황색에서 연한 녹색이 될 때까지 암모니아수로 중화한다 % 황산암모늄시액 2~10 ml 및 물을 가하여 일정량으로 한다 % DDTC용액 2~10 ml를 넣고 혼합하여 수 분간 방치한 다음 MIBK 10~20 ml를 가하여 격렬히 흔들어 섞는다 MIBK층을 분취하여 원자흡광광도계에 주입하여 각각의 원소측정파 장에 있어서 흡광도를 측정하고 따로 표준용액 및 공시험용액에 대 해서도 같은 조작을 하고 검량선을 작성하여 시험용액의 농도를 구 한다. 6. 참고문헌 6.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 시험 주의사항 1) 시료를 강열하게 가열하여 유기물을 공기산화하여 휘발시키는 방법이다. 또한, 조작 관 리가 습식회화법처럼 번잡하지 않기에 비교적 다수의 시료를 동시에 조작 할 수 있고 대량의 시료를 순차적으로 추가하여 회화하는 것도 가능하다. 산화제(분해제)를 이용하 지 않기에 이들 시약으로부터의 오염 위험이 적다. 2) 습식회화법과 비교해 회화온도가 높기에 거의 모든 원소에 대해 휘산 우려가 있다. 가 열온도는 450~550 가 일반적으로 이용되는데, 상기와 같은 손실을 적게 하기 위해서 184

189 는 500 이하가 바람직하다. 그러나 회화시간이 매우 길어지므로 화로내벽과 환경으로 부터의 오염 우려가 있으며, 불완전회화와 탄소입자에 의한 흡착 등에 의한 손실도 생 각할 수 있다. 3) 시료의 회화용기에는 일반적으로 석영제가 좋다. 오래 사용한 용기에서는 원소를 흡착 하기 쉽고 또 흡착원소를 용출할 우려도 있으며 회화보조제는 질산염과 HNO 3 외 Mg O, Mg(NO 3 ) 2, Na 2 CO 3, H 2 SO 4, HCl 등이 이용된다. 4) 원자흡광법에서 많이 이용되는 용매는 케톤, 에스테르, 알콜 등 분자내에 산소를 함유하 는 것이 좋다. 게다가 이들 가연성 유기용매는 용매효과라는 현상에서 감도 증대를 기 대할 수 있다. 용매효과의 원인에 대해서는 시료의 흡입량 증대에 따른 감도상승과 프 레임내에서의 원자화율에 대한 영향, 두 가지로 나눌 수 있다. 전자는 용매의 점성에 입 각한 것이며 후자는 분무의 미립화와 그에 따른 프레임내에서의 기화여기과정( 氣 化 勵 起 過 程 )이 촉진되는 것에 기인하는 것으로 보인다. 185

190 Ⅲ 구리, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 셀렌, 크롬(제2법) 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 아르곤 가스에 고주파를 유도결합방법으로 걸어 방전되어 얻어진 아 르곤 프라즈마에 시험용액을 주입하여 목적원소의 원자선 및 이온선의 발광광도를 측정하여 시험용액 중의 목적원소의 농도를 구하는 방법이다. 탄화 / 회화 건조 가온 Filtration 유도결합플라즈마검출기 2. 안전 주의사항 시험용액 제조에 사용되는 염산(Hydrochloric acid)은 자극적인 냄새를 가지고 있 고 피부 화상, 점막 화상, 호흡 자극, 눈 자극 등의 건강 위험성이 있다. 물리적 위 험으로는 용기가 열에 노출되면 파열되거나 폭발할 수도 있고 물과 접촉 시 반응할 수 있다. 또한 흡입 시 자극이 심한 경우도 있을 수 있으며 두통, 폐 울혈과 폐 이 상이 생길 수 있다. 또한 피부에 접촉 시 자극 및 동상과 눈 접촉 시에는 실명 및 동상 마지막으로 섭취 시에는 화상, 구역, 구토 및 설사를 유발시킬 수 있으므로 환 기가 잘되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 유도결합플라즈마검출기(Inductively Coupled Plasma, ICP) 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 각 표준용액 5. 시험과정 5.1 Ⅲ 의 방법에 따라 표준용액과 시험용액을 제조하고 및 공시험용액을 ICP에 주입하여 시험용액의 농도를 구한다. 6. 참고문헌 6.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청,

191 6.2 위생시험법 주해, 일본 약학회, 시험 주의사항 1) 시료를 강열하게 가열하여 유기물을 공기산화하여 휘발시키는 방법이다. 또한, 조작 관 리가 습식회화법처럼 번잡하지 않기에 비교적 다수의 시료를 동시에 조작 할 수 있고 대량의 시료를 순차적으로 추가하여 회화하는 것도 가능하다. 산화제(분해제)를 이용하 지 않기에 이들 시약으로부터의 오염 위험이 적다. 2) 습식회화법과 비교해 회화온도가 높기에 거의 모든 원소에 대해 휘산 우려가 있다. 가 열온도는 450~550 가 일반적으로 이용되는데, 상기와 같은 손실을 적게 하기 위해서 는 500 이하가 바람직하다. 그러나 회화시간이 매우 길어지므로 화로내벽과 환경으로 부터의 오염우려가 있으며, 불완전회화와 탄소입자에 의한 흡착 등에 의한 손실도 생각 할 수 있다. 3) 시료의 회화용기에는 일반적으로 석영제가 좋다. 오래 사용한 용기에서는 원소를 흡착 하기 쉽고 또 흡착원소를 용출할 우려도 있으며 회화보조제는 질산염과 HNO 3 외 Mg O, Mg(NO 3 ) 2, Na 2 CO 3, H 2 SO 4, HCl 등이 이용된다. 187

192 Ⅲ 칼슘 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 시료 중 존재하는 칼슘을 건식 습식으로 분해하여 과망간산 칼륨 적 정법이나 원자흡광광도법을 적용하여 정량한다. 원자흡광광도법의 원리는 앞에서 언급하였으며, 과망간산 칼륨적정법은 칼슘을 함유하는 용액에 수산염을 반응시켜 물에 난용인 수산칼슘(CaC 2 O 4 H 2 O)으로서 침전시키고 이 침전을 가온하여 약한 황산용액에 녹여 용액내의 수산을 KMnO 4 용액으로 적정하여 정량하는 방법으로 반응식은 다음과 같다. Ca C 2 O 4 = CaC 2 O 4 5CaC 2 O 4 + 8H 2 SO 4 + 2KMnO 4 = 2MnSO 4 + K 2 SO 4 + 5CaSO CO 2 + 8H 2 O 탄화 / 회화 염산 / 질산 분해 가열 Filtration 원자흡광광도계 2. 안전 주의 사항 건식분해법에서 사용되는 염산(Hydrochloric acid)은 자극적인 냄새를 가지고 있고 피부 화상, 점막 화상, 호흡 자극, 눈 자극 등의 건강 위험성이 있다. 물리적 위험으 로는 용기가 열에 노출되면 파열되거나 폭발할 수도 있고 물과 접촉 시 반응할 수 있다. 또한 흡입 시 자극이 심한 경우도 있을 수 있으며 두통, 폐 울혈과 폐 이상이 생길 수 있다. 또한 피부에 접촉 시 자극 및 동상과 눈 접촉 시에는 실명 및 동상 마지막으로 섭취 시에는 화상, 구역, 구토 및 설사를 유발시킬 수 있으므로 환기가 잘되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의 를 기울여야 한다. 습식분해법에서 사용되는 질산(Nitric Acid) 역시 극약이며 피부, 입, 식도, 위 등을 침식하고, 흡입할 경우 기관이 상하며 폐렴이 발생할 위험이 있으므로 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 과망간산칼륨 용량법에서 사용되는 황산(Sulfuric acid)은 흡입 시 치명적이며, 점 막에 심한 자극을 야기할 수 있고, 눈과 피부에 화상을 야기할 수 있으므로 취급 후 철저히 씻어야 하고, 적절한 환기 하에서 사용해야 한다. 또한 물과 위험한 반응 을 일으킬 수 있으며, 연소물을 발화시킬 수 있으므로 취급에 주의를 기울여야 한 다. 188

193 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 도가니 또는 백금접시 회화로 수욕조 부피플라스크 비커 유리봉 피펫 3.2 분석장비 원자흡광광도계 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 Calcium 분자식 : Ca, 분자량 : 40.08, CAS No. : 일반시약 수산암모늄용액(Ammonium water) 수산암모늄[(NH 4 ) 2 C 2 O 4 ] 3.0 g을 물을 가하여 100 ml로 한다 메틸레드지시약(Methyl red, 특급) 0.1% 메틸레드알코올용액 요소(Urea) 특급요소 70~80 의 저온으로 건조한 다음 흡습하지 않도록 보존한다 세척용 암모니아수(1 50) 황산용액(Sulfuric acid) N 과망간산칼륨용액 (Potassium permanganate) 증류수(Distilled water) 5. 시험과정 5.1 시험용액의 제조 제1법 건식분해법 1) 시료 적절량을 회화용기에 취하여 탄화시킨 후 550~600 의 온도에서 여러 시간 가열하여 백색~회백색의 회분 2) 이 얻어질 때까지 회화한다 회분을 방냉 후 주의하여 물로 적신 후 염산용액(1 2) 약 10 ml를 가해 수욕 상에서 완전 증발 건고시킨다 건고물에 염산용액(1 4) 약 8~10 ml를 가해 수 분 가열 후 100 ml 메스플라스크에 여과한다. 189

194 불용물은 여지와 같이 사용했던 회화용기에 옮겨 건고한 후 다시 회화한다. 이 회분을 물로 적시어 염산용액(1 4) 약 2 ml를 가해 물 약 5 ml로 희석한 후 수욕 상에서 가온하고, 여과한 액을 앞의 100 ml 메스플라스크에 채워 물을 가하여 100 ml로 하여 시험용 액으로 한다 제2법 습식분해법 3) 시료 적절량을 200~300 ml 분해 플라스크에 취하여 질산 5 ml를 가하여 서서히 약하게 가열하고 최초의 심한 반응이 끝난 후 다시 온도를 올려 가열시킨다 질산이 휘산되어 내용물이 거의 건고될 때까지 가열하고 질산용액(1 2) 10 ml와 70% 과염소산 10 ml를 4) 가하여 가열을 조절하면서 서서히 가열시킨다 고형물이 완전히 용해되고 액이 거의 무색이 될 때까지 가열을 계 속하여 분해한다. 만약, 액이 착색되어 있으면, 70% 과염소산 수 ml를 가하여 가열한다 분해 후 냉각하고 소량의 물로 희석한 후 직경이 9 cm의 자제증발 접시에 액을 씻어 옮기고 증발 건고하여 과염소산을 증발시킨다 잔류물에 염산용액(1 2) 약 10 ml를 가하고 동량의 물로 희석시켜 수욕 상에서 가온하여 완전히 녹인 후 100 ml 메스플라스크에 옮 겨 물을 가하여 전량을 100 ml로 하여 시험용액으로 한다. 5.2 시험조작 제1법 과망간산칼륨 용량법 시험용액의 조제에서 얻은 시험용액 중에 40 ml(ca 1~12 mg에 대응하는 양)를 200 ml의 비커에 취하여 메틸레드시액 수 방울 및 수산암모늄용액 10 ml를 가한 다음 요소 2~5 g을 가해 녹인다 비커를 시계접시로 덮고 약하게 가열을 계속시킨다. 메틸레드시액을 색이 적색에서 등황색으로 (ph 약 5.6) 되었을 때 가열을 중지하고 방냉 5) 한다. 이를 2시간 이상(침전이 적을 때는 하룻밤) 실온으로 방 치한다. 이 때의 액량은 약 20~30 ml정도이다 충분히 침전을 형성시킨 후 석출 전 수산칼슘 결정을 유리여과기 (15AG-4) 6) 로 흡입여과하고 세척용 암모니아수 30~40 ml를 수 회 나 누어 침전과 여지를 잘 씻는다 세척이 끝나면 침전 생성에 사용한 비커를 앞의 유리여과기의 밑에 놓고 여과에 사용한 유리봉을 유리여과기에 넣어 미리 70 이상으로 가온한 황산용액(1 25)을 유리여과기에 주입한다 유리봉으로 교반하여 잠시 방치하고 수산칼슘을 용해한 다음 흡입 한다. 다음 흡입을 그치고 가온한 황산용액(1 25) 약 5~7 ml를 190

195 유리여과기에 주입하고 유리봉으로 교반하여 내벽을 씻고 흡입한 다. 이 조작을 2회 반복한다 비커를 여과장치에서 들어내고 65~80 로 가열하여 0.02 N 과망간산 칼륨용액 7) 으로 적정한다. 공시험에 대하여도 같은 조작을 한다 제2법 원자흡광광도법 시험용액의 조제에 따라 처리한 시료를 물 대신 1 N 염산용액을 사용하여 칼슘 농도 1~5 μg/ml가 되도록 조정하여 Ⅲ (제1 법)에 따라 측정한다 사용될 1 N 염산용액에는 La으로서 1,000 ppm이 되도록 염화란탄 (LaCl 3 )을 첨가하거나 또는 Sr으로서 5,000 ppm이 되도록 염화스트론 티움(SrCl 2 )을 첨가하여 사용한다. 6. 분석 및 계산 6.1 과망간산칼륨 용량법의 계산 칼슘 함량( mg/g) = ( b - a) F V 시료채취량( g) a:공시험에 대한 0.02 N 과망간산칼륨용액의 소비 ml 수 b:검액에 대한 0.02 N 과망간산칼륨용액의 소비 ml 수 F:0.02 N 과망간산칼륨용액의 역가 V:시험용액의 희석배수 7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 시험 주의사항 1) 건식분해법은 시료를 취한 후 예비회화(수분이 많은 시료는 별도의 건조과정을 수행)를 한후 본회화과정을 거쳐 얻은 회분을 염산처리하여 시료용액으로 조제 한다. 회화는 전기 Muffle furnace내에서 400 이상 600 를 넘지 않는 온도 에서 실시하되 회화가 완료된 시료를 過 회화하면 회수율이 저하되므로 유의해 야 한다. 2) 공전에는 회화완료를 시료의 회분이 백색~회백색이 될 때까지로 기술하였지 만 Fe의 함량이 많은 시료의 회분은 황적색을 띤다. 3) 시료를 습식상태를 유지하면서 유기물질을 회화하게 되는데 자칫, 부주의로 용 액이 증발건고는 경우가 발생한다. 이 경우, 회화조건이 건식 분해법과 같은 조건이 되어 일부 무기원소의 회수율이 저하되는데 실험자는 분해용액이 습식 191

196 상태를 유지도록 세심한 주의를 기울여야한다. 4) 과염소산은 단백질이 풍부한 시료의 유기물을 분해하기에 적합하나 탄수화물 함량이 많은 시료에는 적당치 않다. 과염소산의 사용량이 미흡 할 경우 유기물 분해가 충분치 않고 게다가 과량이어서 잔존해 있을 경우에는 폭발할 우려가 있기에 충분히 주의할 필요가 있다. 5) 실온으로 방치시 충분한 방치를 하지 않으면 정량시 칼슘함량이 저하 될 수 있 으므로, 침전이 적을 때는 하룻밤 정도 충분하게 방치를 하여야 한다. 방냉 중 에 액은 황색을 띠는 경우가 많지만 시료에 따라서는 적색을 띠는 경우도 있 는데 둘 다 지장은 없다. 6) 시험조작중 유리여과기가 불량하면 흡입 여과시 모든 액이 빠져나가 칼슘정량 을 할 수 없게 되므로 시험에 적당한 유리여과기를 별도 관리하여 시험하는 것이 좋다. 7) 0.02 N 과망간산칼륨용액은 액성이 시간이 지남에 따라 변하므로 실험 전 반드 시 역가를 확인하여야 하는데 특히, 하절기에는 액성의 변화가 심하므로 사용 전에 바로 제조하는 것이 좋다. 192

197 Ⅲ 요오드 1. 시험방법의 원리 요오드(iodine, I 2 )는 상온에서 고체로 보라색의 결정을 가지며, 휘발성이 있고 자극 적인 냄새가 나는 승화성 물질로 유기용매에 잘 녹는다. 반응성이 높아 주로 요오 드화물(iodide)이나 요오드산염(iodate) 형태로 존재한다. 주로 다시마, 미역, 김 같은 해조류와 멸치, 굴 등의 어패류에 풍부하게 함유되어있다. 요오드는 갑상선 호르몬인 티록신(thyroxine, T 4 )을 합성하는데 필요하다. 티록신 (T 4 )은 표적세포에서 활성형인 T 3 로 전환되어야 하는데 이때에도 요오드가 필요하 다. 활성형인 갑상선 호르몬은 체내 대사율을 조절하여 에너지 대사에 관여한다. 또 한 갑상선 호르몬은 mrna와 단백질 합성을 촉진함으로써 중추신경계 발달에 중요 하다. 결핍 시 어린이에게는 성장이 지연되고 인지기능이 손상을 유발하며, 임신기 에 심한 요오드 결핍은 태아에서 크레틴병을 초래한다. 반대로 과다섭취하면 갑상 선 기능장애로 인해 갑상선 기능항진과 갑상선 악성종양을 악화시킬 수 있다. 본 시험법은 시료 중 존재하는 요오드를 건식 습식으로 분해하여 이온-선택 전 극법을 적용 정량한다. 건식 습식 분해 이온-선택 전극법 2. 안전 주의 사항 건식분해법에서 사용되는 염산(Hydrochloric acid)은 자극적인 냄새를 가지고 있고 피부 화상, 점막 화상, 호흡 자극, 눈 자극 등의 건강 위험성이 있다. 물리적 위험으 로는 용기가 열에 노출되면 파열되거나 폭발할 수도 있고 물과 접촉 시 반응할 수 있다. 또한 흡입 시 자극이 심한 경우도 있을 수 있으며 두통, 폐 울혈과 폐 이상이 생길 수 있다. 또한 피부에 접촉 시 자극 및 동상과 눈 접촉 시에는 실명 및 동상 마지막으로 섭취 시에는 화상, 구역, 구토 및 설사를 유발시킬 수 있으므로 환기가 잘되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의 를 기울여야 한다. 전극기울기 체크에 사용하는 질산니켈(Nikel nitrate)은 분말형태로 가연성 물질을 점화할 수 있으며 노출 시 호흡기도를 자극하거나 피부, 눈 자극과 알레르기 반응 을 일으키며 발암을 유발할 수 있으므로 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 도가니 또는 백금접시 회화로 193

198 3.1.3 수욕조 부피플라스크 비커 마그네틱바 피펫 여과지(Whatman. 541) ph 측정기 3.2 분석장비 전극 : 요오드전극, 기준 전극(Ag/AgCl전극) 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 Iodium 분자식 : I, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 빙초산(Acetic acid) 질산나트륨용액(Sodium nitrate liquid) 질산니켈(Nikel nitrate) 증류수(Distilled water) 5. 시험과정 5.1 시험용액의 제조 제1법 건식분해법 1) 시료 적절량을 회화용기에 취하여 탄화시킨 후 550~600 의 온도에서 여러 시간 가열하여 백색~회백색의 회분 2) 이 얻어질 때까지 회화한다 회분을 방냉 후 주의하여 물로 적신 후 염산용액(1 2) 약 10 ml를 가해 수욕 상에서 완전 증발 건고시킨다 건고물에 염산용액(1 4) 약 8~10 ml를 가해 수 분 가열 후 100 ml 메스플라스크에 여과한다 불용물은 여지와 같이 사용했던 회화용기에 옮겨 건고한 후 다시 회화한다. 이 회분을 물로 적시어 염산용액(1 4) 약 2 ml를 가해 물 약 5 ml로 희석한 후 수욕 상에서 가온하고, 여과한 액을 앞의 100 ml 메스플라스크에 채워 물을 가하여 100 ml로 하여 시험용 액으로 한다 제2법 습식분해법 3) 시료 적절량을 200~300 ml 분해 플라스크에 취하여 질산 5 ml를 가하여 서서히 약하게 가열하고 최초의 심한 반응이 끝난 후 다시 194

199 온도를 올려 가열시킨다 질산이 휘산되어 내용물이 거의 건고될 때까지 가열하고 질산용액(1 2) 10 ml와 70% 과염소산 10 ml를 4) 가하여 가열을 조절하면서 서서히 가열시킨다 고형물이 완전히 용해되고 액이 거의 무색이 될 때까지 가열을 계 속하여 분해한다. 만약, 액이 착색되어 있으면, 70% 과염소산 수 ml를 가하여 가열한다 분해 후 냉각하고 소량의 물로 희석한 후 직경이 9 cm의 자제증발 접시에 액을 씻어 옮기고 증발 건고하여 과염소산을 증발시킨다 잔류물에 염산용액(1 2) 약 10 ml를 가하고 동량의 물로 희석시켜 수욕 상에서 가온하여 완전히 녹인 후 100 ml 메스플라스크에 옮 겨 물을 가하여 전량을 100 ml로 하여 시험용액으로 한다 이온-선택 전극법 시료 100 ml(분말의 경우 10% 수용액)를 250 ml 메스플라스크에 넣고 3% 초산용액 10 ml를 가한 후 물로 정용한다. 이 액을 여과 하고 처음 10 ml는 버린다 %(v/v) 초산 용액 빙초산 15 ml를 물로 희석하여 500 ml가 되게 한다 전극 보관 용액 요오드 표준원액을 물로 희석하여 0.1 ml/l가 되게 한다. 요오드 전 극을 이 용액에 담가서 보관하며 매주 새 용액으로 교환한다. 차광보 관하며, 3개월간 보존가능하다 이온강도 조절액(5 M 질산나트륨용액, ISA:ionic strength adjuster) 질산나트륨 42.5 g을 물에 녹여 100 ml로 한다 M 질산니켈용액 질산니켈 6 수화물 58.2 g을 물에 녹여 100 ml가 되게 한다 요오드 표준물질 (요오드 g/l, 0.1 M) 요오드화나트륨 또는 요오드화칼륨 표준물질을 사용한다. 실온에서 차광 보관하며, 개봉 후 6개월간 보존 가능하다 요오드 표준원액 요오드 표준물질 8 ml를 물로 희석하여 1 L가 되게 한다(101.5 μ g/ml). 차광하여 보존하며 2주간 사용 가능하다 요오드 표준용액 Ⅰ 요오드 표준원액 5 ml를 물로 희석하여 500 ml가 되게 한다(1 μ g/ml). 차광하여 보존하며 2주간 사용 가능하다 요오드 표준용액 Ⅱ 요오드 표준용액 I를 물로 10배 희석한다. 차광하여 보존하며 2주간 195

200 사용 가능하다(0.1 μg/ml) 기지의 첨가 표준용액 요오드 표준원액 (2) 10 ml를 물로 희석하여 1 L가 되게 한다. 이 액 100 ml에 이온강도조절액(ISA), 2 M 질산니켈 용액, 물을 각각 1.0 ml씩 첨가한 후 잘 혼합한다. 사용 시 조제한다. 5.2 시험조작 전극 기울기체크 전극을 요오드 표준용액 Ⅱ 100 ml에 담그고 ISA, 2 M 질산니켈 용액, 물을 각각 1.0 ml씩 가하고 약 2~5분 후 reading 전위계가 안정되었을 때 E1 값을 측정한다 전극을 물로 씻고 건조시킨 후 요오드 표준용액 Ⅰ 100 ml에 담그고 ISA, 2 M 질산니켈 용액, 물을 각각 1.0 ml씩을 가하고, 약 2~5분 후 reading 전위계가 안정되었을 때 E2 값을 측정한다 전극을 물로 씻고 건조시킨다. 전극의 기울기(S)는 E2-E1로 계산된다. 매 4시간마다 기울기를 측정하며, 직전에 측정한 기울기를 사용하여 요오드 함량을 계산한다 측정 시험용액 100 ml를 비커에 넣고 마그네틱바로 저어주면서 ISA, 2 M 질산니켈 용액, 진한 질산을 각각 1 ml씩 가하고 전극을 담근 후 약 2분 후 reading 전위계가 안정되었을 때 E3 값을 측정한다 용액에 즉시 기지의 첨가 표준용액 10 ml를 가하고 약 2~5분 후 reading 전위계가 안정되었을 때, E4 값을 측정한다. 6. 분석 및 계산 6.1 요오드 용량법의 계산 요오드 함량(μg/100g) = Q V 100 Q = /{antilog[(E4-E3)/S]-0.912} :기지의 첨가 표준용액의 요오드 농도(μg/mL) V : 희석 배수 : 표준용액 첨가 ml수/(표준용액 첨가 전 총 ml수+표준용액 첨가 ml수)=10/(103+10) : 표준용액 첨가 전 총 ml수/(표준용액 첨가 전 총 ml수+표준용액 첨가 ml수)=103/(103+10) S : E2-E1 7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청,

201 7.2 위생시험법 주해, 일본 약학회, A. Flynn, O.Moreiras, P. Stehle, R. J. Fletcher, D. J. G. Muller, Valerie Rolla nd : Vitamins and minerals: A model for safe addition to foods, European J ournal of Nutrition, 42(2), , 시험 주의사항 1) 건식분해법은 시료를 취한 후 예비회화(수분이 많은 시료는 별도의 건조과정 을 수행)를 한후 본회화과정을 거쳐 얻은 회분을 염산처리하여 시료용액으로 조제한다. 회화는 전기 Muffle furnace내에서 400 이상 600 를 넘지 않는 온도에서 실시하되 회화가 완료된 시료를 過 회화하면 회수율이 저하되므로 유 의해야 한다. 2) 공전에는 회화완료를 시료의 회분이 백색~회백색이 될 때까지로 기술하였지 만 Fe의 함량이 많은 시료의 회분은 황적색을 띤다. 3) 시료를 습식상태를 유지하면서 유기물질을 회화하게 되는데 자칫, 부주의로 용 액이 증발건고는 경우가 발생한다. 이 경우, 회화조건이 건식분해법과 같은 조 건이 되어 일부 무기원소의 회수율이 저하되는데 실험자는 분해용액이 습식상 태를 유지도록 세심한 주의를 기울여야한다. 4) 과염소산은 단백질이 풍부한 시료의 유기물을 분해하기에 적합하나 탄수화물 함량이 많은 시료에는 적당치 않다. 과염소산의 사용량이 미흡 할 경우 유기물 분해가 충분치 않고 게다가 과량이어서 잔존해 있을 경우에는 폭발할 우려가 있기에 충분히 주의할 필요가 있다. 197

202 Ⅲ 철 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 시료 중 존재하는 철을 건식 습식으로 분해하여 올쏘 페난트로린 비색법 또는 원자흡광광도법을 적용하여 정량한다. 올쏘 페난트로린 비색법의 원리 는 Ortho-phenanthroline(C 12H 8n2)은 일정 범위의 ph하에서 시료용액 중에 있는 Fe 2+ 1원 자와 O-phenanthroline 3분자가 정량적으로 반응하여 적색의 착화합물 (C 12 H 8n2 ) 3 Fe 2+ 을 생성한다. 이 적색의 농도는 Fe 100~200 γ, ph 2.9~9.0 사이에서 Fe의 농도와 비례 하므로 비색정량에 의해 시료 중의 Fe 함량을 구할 수 있으며 반응식은 다음과 같다. 3C 12 H 8n2 + Fe 2+ (C 12 H 8n2 ) 3 Fe 2+ 탄화 / 회화 염산 / 질산 분해 가열 Filtration 분광광도계 원자흡광광도계 2. 안전 주의 사항 건식분해법에서 사용되는 염산(Hydrochloric acid)은 자극적인 냄새를 가지고 있고 피부 화상, 점막 화상, 호흡 자극, 눈 자극 등의 건강 위험성이 있다. 물리적 위험으 로는 용기가 열에 노출되면 파열되거나 폭발할 수도 있고 물과 접촉 시 반응할 수 있다. 또한 흡입 시 자극이 심한 경우도 있을 수 있으며 두통, 폐 울혈과 폐 이상이 생길 수 있다. 또한 피부에 접촉 시 자극 및 동상과 눈 접촉 시에는 실명 및 동상 마지막으로 섭취 시에는 화상, 구역, 구토 및 설사를 유발시킬 수 있으므로 환기가 잘되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의 를 기울여야 한다. 습식분해법에서 사용되는 질산(Nitric Acid) 역시 극약이며 피부, 입, 식도, 위 등을 침식하고, 흡입할 경우 기관이 상하며 폐렴이 발생할 위험이 있으므로 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 도가니 또는 백금접시 회화로 수욕조 부피플라스크 비커 198

203 3.1.6 마그네틱바 피펫 여과지(Whatman. 541) ph 측정기 3.2 분석장비 흡광광도계 원자흡광광도계 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 Iron 분자식 : Fe, 분자량 : 55.85, CAS No. : 일반시약 염산용액(Hydrochloric acid) 증류수(Distilled water) 질산용액(Nitric acid) 페난트로린(1,10-phenanthroline monohydrate) 하이드로퀴논용액(Hydroquinone) 구연산나트륨용액(Sodium citrate) 브롬페놀블루(Bromphenol blue) 수산화나트륨(Sodim chloride) 5. 시험과정 5.1 시험용액의 제조 제1법 건식분해법 1) 시료 적절량을 회화용기에 취하여 탄화시킨 후 550~600 의 온도에서 여러 시간 가열하여 백색~회백색의 회분 2) 이 얻어질 때까지 회화한다 회분을 방냉 후 주의하여 물로 적신 후 염산용액(1 2) 약 10 ml를 가해 수욕 상에서 완전 증발 건고시킨다 건고물에 염산용액(1 4) 약 8~10 ml를 가해 수 분 가열 후 100 ml 메스플라스크에 여과한다 불용물은 여지와 같이 사용했던 회화용기에 옮겨 건고한 후 다시 회화한다. 이 회분을 물로 적시어 염산용액(1 4) 약 2 ml를 가해 물 약 5 ml로 희석한 후 수욕 상에서 가온하고, 여과한 액을 앞의 100 ml 메스플라스크에 채워 물을 가하여 100 ml로 하여 시험용 액으로 한다. 199

204 5.1.2 제2법 습식분해법 3) 시료 적절량을 200~300 ml 분해 플라스크에 취하여 질산 5 ml를 가하여 서서히 약하게 가열하고 최초의 심한 반응이 끝난 후 다시 온도를 올려 가열시킨다 질산이 휘산되어 내용물이 거의 건고될 때까지 가열하고 질산용액(1 2) 10 ml와 70% 과염소산 10 ml를 4) 가하여 가열을 조절하면서 서서히 가열시킨다 고형물이 완전히 용해되고 액이 거의 무색이 될 때까지 가열을 계 속하여 분해한다. 만약, 액이 착색되어 있으면, 70% 과염소산 수 ml를 가하여 가열한다 분해 후 냉각하고 소량의 물로 희석한 후 직경이 9 cm의 자제증발 접시에 액을 씻어 옮기고 증발 건고하여 과염소산을 증발시킨다 잔류물에 염산용액(1 2) 약 10 ml를 가하고 동량의 물로 희석시켜 수욕 상에서 가온하여 완전히 녹인 후 100 ml 메스플라스크에 옮 겨 물을 가하여 전량을 100 ml로 하여 시험용액으로 한다 올쏘 페난트로린 비색법 페난트로린용액 올쏘 페난트로린 염산염(C 12 H 8 N 2 HCl H 2 O) 0.5 g을 물을 가하여 200 ml로 하여 냉소에 보존한다 하이드로퀴논용액 하이드로퀴논(C 2 H 6 O 2 )을 물에 녹여 쓰며 사용할 때마다 새로 만들어야 한다(희석배수 1%) 구연산나트륨용액 특급 구연산나트륨(Na 3 C 6 H 5 O 7 H 2 O) 50 g을 물을 가하여 200 ml로 한다. 필요하면 여과하여 냉소에 보존한다 브롬페놀블루시액 브롬페놀블루 0.1 g을 0.05 N 수산화나트륨액 3 ml로 녹이고 물을 가하여 250 ml로 한다 철표준액 특급 황산제1철 암모늄[Fe(NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2 6H 2 O] g을 약 1%의 염산에 용해하여 1 L로 한다. 이 액 1 L 중에는 철 0.1 mg을 함유한 다. 5.2 시험조작 제1법 올쏘 페난트로린 비색법 5) 시험용액의 조제에서 얻은 시험용액 중의 10 ml를 피펫으로 25 ml의 메스플라스크에 취하고 같은 10 ml를 시험관(혹은 작은 삼각플라스크)에 취한다. 후자는 ph조절용 대조액으로 쓴다. 200

205 시험관 쪽에는 브롬페놀블루시액 4방울을 가하고 25 ml 메스플라 스크 쪽에는 하이드로퀴논용액 1 ml와 또 페난트로린용액 2 ml를 피펫으로 가한다 구연산나트륨용액을 뷰렛 또는 5 ml 메스피펫으로 취하여 시험관의 액 중에 적가하고 액의 ph가 3.5가 되면 지시액을 가한 액의 색이 황 색에서 황록색으로 변하는 점에서 적가를 그치고 이 때까지 소요된 구연산나트륨용액의 ml수를 기록한다 [ ] 같은 용량의 구연산나트륨용액을 메스플라스크 쪽에 가하여 물로 25 ml의 표선까지 희석하여 20 이상의 온도에서 1시간 이상 방치한다. 하룻밤 방치해도 무방하다. 완전히 발색 6) 된 액은 적어도 48시간은 퇴색하지 않는다 분광광도계(Spectrophotometer)에서는 510 nm의 파장에서, 광전비색 계에서는 녹색필터를 이용해서 발색액의 흡광도를 측정하여 비흡광 계수를 구한다 [ ]를 미리 작성하여 놓은 검량선과 대조하여 철의 양을 구한 다. 검량선은 철표준액을 물로 정확히 10배로 희석하여 1, 2, 5, 10, 15 및 20 ml를 각각 1조씩 25 ml의 메스플라스크와 시험관 또는 작은 삼각플라스크에 취한다. 10 ml 안되는 것은 물을 추가하여 거 의 10 ml로 만든다 상기 발색조작과 동일하게 ph 3.5에서 각 메스플라스크에서 발색시켜 흡광도를 측정하며, 농도 흡광곡선을 작성하고 시료 중의 철 함량은 계산식에 따라 산출한다 제2법 원자흡광광도법 시험용액의 조제에 따라 처리한 시료를 물 대시 1 N 염산 용액을 사용하여 철 농도 1~4 μg/ml가 되도록 조정하여 Ⅲ (제1법) 중 직접법에 따라 측정한다. 6. 분석 및 계산 6.1 철 용량법의 계산 철 함량( mg/g) = S a 시료채취량( g) S:시험용액 중의 철의 양(mg/mL) a:시험용액의 전량(mL) 201

206 7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 시험 주의사항 1) 건식분해법은 시료를 취한 후 예비회화(수분이 많은 시료는 별도의 건조과정을 수행)를 한후 본회화과정을 거쳐 얻은 회분을 염산처리하여 시료용액으로 조제 한다. 회화는 전기 Muffle furnace내에서 400 이상 600 를 넘지 않는 온도 에서 실시하되 회화가 완료된 시료를 過 회화하면 회수율이 저하되므로 유의해 야 한다. 2) 공전에는 회화완료를 시료의 회분이 백색~회백색이 될 때까지로 기술하였지 만 Fe의 함량이 많은 시료의 회분은 황적색을 띤다. 3) 시료를 습식상태를 유지하면서 유기물질을 회화하게 되는데 자칫, 부주의로 용 액이 증발건고는 경우가 발생한다. 이 경우, 회화조건이 건식분해법과 같은 조 건이 되어 일부 무기원소의 회수율이 저하되는데 실험자는 분해용액이 습식상 태를 유지도록 세심한 주의를 기울여야한다. 4) 과염소산은 단백질이 풍부한 시료의 유기물을 분해하기에 적합하나 탄수화물 함량이 많은 시료에는 적당치 않다. 과염소산의 사용량이 미흡 할 경우 유기물 분해가 충분치 않고 게다가 과량이어서 잔존해 있을 경우에는 폭발할 우려가 있기에 충분히 주의할 필요가 있다. 5) Fe 측정에는 중량법, 용량법, 비색법, 원자흡광법 및 폴라로그래피에 의한 방법 등이 있으며, 처리방법에 따라 Fe 2+ 또는 Fe 3+ 로서 측정된다. 미량의 Fe인 경우 에는 비색법이 적용된다. 환원하여 Fe 2+ 로서 측정하는 방법에 올쏘 페난트로린 법, 디피리딜법, 티오글리콜산법 등이 있으며, 그리고 산화하여 Fe 3+ 로서 측정 하는 방법으로 티오시안산법, 8-oxyquinoline법 등이 있다. 함유량이 많은 경우 에는 Fe 2+ 로 한 뒤 KMnO 4 등의 산화제 표준액으로 적정하는 방법이 있다. 본 시험법에서 올쏘 페난트로린법을 채용한 이유는 조작이 쉽고 방해성도 적고 정색이 안정하며 감도, 정도가 좋은 점 등의 장점 때문이다. 각 시약의 첨가순 서는 발색에 영향을 미치기에 시험조작 순서대로 실시한다. 시험용액내에 산이 다량으로 잔류하여 있을 경우 콩고레드지가 적변하는 점까지 암모니아수로 중 화한다. 정량범위는 Fe 0.005~0.2 mg이며, 반복의 표준편차( %)는 10~2 %이 다. 6) 최고발색에 달하는 시간은 20~30분이 필요하며 ph 3~5에서 빠르고 완전히 발색하며 장시간 안정하므로 이를 준수하여 시험해야한다. 202

207 Ⅲ 아연 1. 시험방법의 원리 아연은 대개 2가 이온으로 존재하며 아미노산, 펩타이드, 단백질 및 뉴클레오타이 드와 쉽게 복합체를 형성한다. 이는 생체 내 200여 종 이상되는 효소의 구성 성분 이며, 체내에서 주요한 대사과정이나 반응을 조절하는데 관여한다. 인체 내에서의 아연은 세포를 구성하고 생리적인 기능을 조절하는 대표적인 무기물질 중 하나이 다. 부족하게 되면 출산 때 기형아나 저체중아를 낳을 수 있으며 성장발육에 문제 를 일으키게 되며 과잉섭취 시에도 미네랄 불균형 등의 문제가 발생한다. 본 시험법은 시료 중 존재하는 아연을 건식법으로 분해하여 원자흡광광도법을 적 용하여 정량한다. 건식 분해 원자흡광광도계 2. 안전 주의 사항 건식분해법에서 사용되는 염산(Hydrochloric acid)은 자극적인 냄새를 가지고 있고 피부 화상, 점막 화상, 호흡 자극, 눈 자극 등의 건강 위험성이 있다. 물리적 위험으 로는 용기가 열에 노출되면 파열되거나 폭발할 수도 있고 물과 접촉 시 반응할 수 있다. 또한 흡입 시 자극이 심한 경우도 있을 수 있으며 두통, 폐에 출혈과 이상이 생길 수 있다. 또한 피부에 접촉 시 자극 및 동상과 눈 접촉 시에는 실명 및 동상 마지막으로 섭취 시에는 화상, 구역, 구토 및 설사를 유발시킬 수 있으므로 환기가 잘되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의 를 기울여야 한다. 또한 칼륨 농도 조절 시 사용되는 질산(Nitric Acid) 역시 극약이며 피부, 입, 식도, 위 등을 침식하고, 흡입할 경우 기관이 상하며 폐렴이 발생할 위험이 있으므로 실 험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한 다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 도가니 또는 백금접시 회화로 수욕조 또는 오븐 유리여과기 또는 석면 시험관 203

208 3.1.6 피펫 3.2 분석장비 원자흡광광도계 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 Zinc 분자식 : Zn, 분자량 : 65.39, CAS No. : 일반시약 질산(Nitric Acid) 염산(Hydrochloric acid) 증류수(Distilled water) BTB시액(Bromothymol blue) 황산암모늄용액(Ammonium sulfate liquid) 암모니아수(Ammonia water) 5. 시험과정 5.1 시험용액의 제조 건식분해법 1) 시료 적절량을 회화용기에 취하여 탄화시킨 후 550~600 의 온도에서 여러 시간 가열하여 백색~회백색의 회분 2) 이 얻어질 때까지 회화 한다 회분을 방냉 후 주의하여 물로 적신 후 염산용액(1 2) 약 10 ml를 가해 수욕 상에서 완전 증발 건고시킨다 건고물에 염산용액(1 4) 약 8~10 ml를 가해 수 분 가열 후 100 ml 메스플라스크에 여과한다 불용물은 여지와 같이 사용했던 회화용기에 옮겨 건고한 후 다시 회화한다. 이 회분을 물로 적시어 염산용액(1 4) 약 2 ml를 가해 물 약 5 ml로 희석한 후 수욕 상에서 가온하고, 여과한 액을 앞의 100 ml 메스플라스크에 채워 물을 가하여 100 ml로 하여 시험용 액으로 한다. 5.2 시험조작 시험용액 <제1법 건식분해법>에 따라 처리한 시료를 0.5 N 질산용액으 로 칼륨 농도 1~10 μg/ml되게 조정하여 Ⅲ (제1법) 중 원자흡광광 도법에 따라 측정한다. 204

209 6. 참고문헌 6.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, LARS JORHEM : Determination of Metals in Foods by Atomic Absorption Spectrometry after Dry Ashing: NMKL1 Collaborative Study, JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL, 83(5), , 시험 주의사항 1) 건식분해법은 시료를 취한 후 예비회화(수분이 많은 시료는 별도의 건조과정 을 수행)를 한후 본회화과정을 거쳐 얻은 회분을 염산처리하여 시료용액으로 조제한다. 회화는 전기 Muffle furnace내에서 400 이상 600 를 넘지 않는 온도에서 실시하되 회화가 완료된 시료를 過 회화하면 회수율이 저하되므로 유 의해야 한다. 2) 공전에는 회화완료를 시료의 회분이 백색~회백색이 될 때까지로 기술하였지 만 Fe의 함량이 많은 시료의 회분은 황적색을 띤다. 205

210 Ⅲ 칼륨 1. 시험방법의 원리 칼륨(K)은 세포내액에 다량으로 들어있는 주요 양이온으로 세포막의 전위를 유지 하고 세포내액의 이온의 세기를 결정한다. 주로 가공하지 않은 곡류, 채소, 과일에 들어있으며 특히 토마토, 오이, 호박, 가지와 근채류에 가장 많고, 콩류, 사과, 바나 나, 우유, 육류에도 상당량 함유되어 있다. 칼륨은 세포외액의 나트륨 이온과 함께 세포의 삼투압과 수분평형을 유지하는 기능을 한다. 체액의 산-알칼리 균형을 유지 시켜 주며 혈당이 클리코겐으로 전환되어 저장되거나 단백질이 저장될 때 칼륨과 함께 저장된다. 또, 신경 및 근육세포의 흥분과 자극전달을 조절하여 근육의 수축과 이완을 조절하며, 다량 섭취 시 나트륨의 배설을 증가시켜 혈압을 강하시키는 효과 도 있다. 칼륨의 결핍증은 건강한 사람에서는 거의 없으나, 심한 설사나 장기간 굶 주렸을 때, 이요제 복용시 칼륨 결핌이 일어날 수 있는데, 식욕감퇴, 근육경련, 변 비, 불규칙한 심장박동의 증상을 보인다. 본 시험법은 시료 중 존재하는 칼륨을 건식법으로 분해하여 원자흡광광도법을 적 용하여 정량한다. 건식 분해 원자흡광광도계 2. 안전 주의 사항 건식분해법에서 사용되는 염산(Hydrochloric acid)은 자극적인 냄새를 가지고 있고 피부 화상, 점막 화상, 호흡 자극, 눈 자극 등의 건강 위험성이 있다. 물리적 위험으 로는 용기가 열에 노출되면 파열되거나 폭발할 수도 있고 물과 접촉 시 반응할 수 있다. 또한 흡입 시 자극이 심한 경우도 있을 수 있으며 두통, 폐에 출혈과 이상이 생길 수 있다. 또한 피부에 접촉 시 자극 및 동상과 눈 접촉 시에는 실명 및 동상 마지막으로 섭취 시에는 화상, 구역, 구토 및 설사를 유발시킬 수 있으므로 환기가 잘되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의 를 기울여야 한다. 또한 칼륨 농도 조절 시 사용되는 질산(Nitric Acid) 역시 극약이며 피부, 입, 식도, 위 등을 침식하고, 흡입할 경우 기관이 상하며 폐렴이 발생할 위험이 있으므로 실 험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한 다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 도가니 또는 백금접시 206

211 3.1.2 회화로 수욕조 또는 오븐 유리여과기 또는 석면 시험관 피펫 3.2 분석장비 원자흡광광도계 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 Potassium 분자식 : K, 분자량 : 39.10, CAS No. : 일반시약 질산(Nitric Acid) 염산(Hydrochloric acid) 증류수(Distilled water) BTB시액(Bromothymol blue) 황산암모늄용액(Ammonium sulfate liquid) 암모니아수(Ammonia water) 5. 시험과정 5.1 시험용액의 제조 제1법 건식분해법 1) 시료 적절량을 회화용기에 취하여 탄화시킨 후 550~600 의 온도에서 여러 시간 가열하여 백색~회백색의 회분 2) 이 얻어질 때까지 회화 한다 회분을 방냉 후 주의하여 물로 적신 후 염산용액(1 2) 약 10 ml를 가해 수욕 상에서 완전 증발 건고시킨다 건고물에 염산용액(1 4) 약 8~10 ml를 가해 수 분 가열 후 100 ml 메스플라스크에 여과한다 불용물은 여지와 같이 사용했던 회화용기에 옮겨 건고한 후 다시 회화한다. 이 회분을 물로 적시어 염산용액(1 4) 약 2 ml를 가해 물 약 5 ml로 희석한 후 수욕 상에서 가온하고, 여과한 액을 앞의 100 ml 메스플라스크에 채워 물을 가하여 100 ml로 하여 시험용 액으로 한다. 5.2 시험조작 시험용액 <제1법 건식분해법>에 따라 처리한 시료를 0.5 N 질산용액으 207

212 로 칼륨 농도 1~10 μg/ml되게 조정하여 Ⅲ (제1법) 중 원자흡광광 도법에 따라 측정한다. 6. 참고문헌 6.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 식품의약품안전청 : 칼륨 모노그래프, 1-3, 시험 주의사항 1) 건식분해법은 시료를 취한 후 예비회화(수분이 많은 시료는 별도의 건조과정 을 수행)를 한후 본회화과정을 거쳐 얻은 회분을 염산처리하여 시료용액으로 조제한다. 회화는 전기 Muffle furnace내에서 400 이상 600 를 넘지 않는 온도에서 실시하되 회화가 완료된 시료를 過 회화하면 회수율이 저하되므로 유 의해야 한다. 2) 공전에는 회화완료를 시료의 회분이 백색~회백색이 될 때까지로 기술하였지 만 Fe의 함량이 많은 시료의 회분은 황적색을 띤다. 208

213 Ⅲ.3.3 아미노산 및 단백질류 Ⅲ 조단백질 1. 시험방법의 원리 식품 중의 질소화합물로는 단백질, 헥산, 아미노당함유다당, 질소함유지질, 비타민, 햄골격, 생체아민, 요소, 암모니아 등 여러 가지로 되어있지만 대부분의 질소는 단 백질에 함유되어있다. 그러므로 총 질소로부터 역으로 단백질량을 추정하는 것이 가능하다. 단백질의 질소화합물은 평균 16 %로부터 총 질소량에 단백질환산계수(질 소계수) 100/16= 6.25를 곱하면 대략의 단백질량이 구해진다. 이렇게 구해진 단백질 량을 조단백질(crude protein)이라 하고 식품 중의 단백질량으로서 영양가 판정에 이용한다. 본 시험법은 킬달법이라 불리며 원리는 함질소 유기물을 촉매의 존재하 에서 H 2 SO 4 로 가열분해하면, 질소는 NH 3 로 변한다. 계속하여 NaOH를 가하여 알 카리성으로 하고, 유리된 NH 3 를 수증기 증류하여 희황산으로 포집한 후, 이 포집액 을 수산화나트륨용액으로 적정하여 NH 3 양을 구하는 방법이다. 황산 분해 가열 / 냉각 세미마이크로킬달장치 2. 안전 주의 사항 시료 분해시에 사용되는 황산은 흡입 시 치명적이며, 점막에 심한 자극을 야기할 수 있고, 눈과 피부에 화상을 야기할 수 있으므로 취급 후 철저히 씻어야 하고, 적 절한 환기 하에서 사용해야 한다. 또한 물과 위험한 반응을 일으킬 수 있으며, 연소 물을 발화시킬 수 있으므로 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 킬달플라스크 깔때기 수증기 유도관 냉각기 흡수용 플라스크 감압농축기 여과지(FH Type, pore size 0.5μm) 3.2 분석장비 세미마이크로킬달장치 209

214 그림 1. 세미마이크로킬달장치 A : 킬달플라스크 B : 수증기 발생기로서 황산 2~3방울을 넣은 물을 넣고 갑자기 끓는 것을 피하기 위하여 비등석을 넣는다. C : 알칼리용액을 넣는 깔때기 D : 수증기 유도관 E : 내용물이 튀어 올라오는 것을 막는다. F : 작은 구멍(관의 안지름과 거의 같다.) G, H : 갈아 맞춘 접속부위 I : 냉각기(바깥지름 200 mm, 안지름 350 mm, 아래 끝은 약 5 mm) J : 흡수용 플라스크 3.3 분석장비의 준비 세미마이크로킬달장치는 경질유리를 사용하며, 장치에 쓰는 고무는 수산화나 트륨시액 속에서 10~30분간 끓이고, 다음에 물에서 30~60분간 끓인 다음 물 로 씻어서 쓴다. 다만 동 시험법의 원리를 이용한 기타의 장치 또는 자동, 반 자동기기를 사용할 수 있다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 일반시약 분해 촉진제 1) : CuSO 4 : K 2 SO 4 (1 : 4) 부런스위크(Brunswik)시액 증류수(Distilled water) 황산(Sulfate acid) 과산화수소(Hydrogen peroxide) 수산화나트륨(Sodium chloride) 210

215 4.2 시액의 조제 분해촉진제 : CuSO 4 : K 2 SO 4 (1 : 4) 부런스위크(Brunswik)시액 2) 메틸레드 0.2 g 및 메틸렌블루 0.1 g을 에탄올 300 ml에 녹여서 여과하여 사용하고 갈색병에 보존한다. 5. 시험과정 5.1 시험용액의 조제 질소 함량이 2~3 mg에 해당하는 양의 시료를 킬달플라스크에 넣고 분해 촉진제 약 0.5 g을 넣은 후 황산 3~5 ml를 넣은 다음 흔들어 주면서 30% 과산화수소 3) 1 ml를 조금씩 넣는다 플라스크를 금망상에서 가열하고 분해액이 투명한 담청색이 되면 다시 1~ 2시간 가열 4) 한다 분해액을 냉각시킨 후 물 20 ml를 주의하여 가한 후 이 플라스크를 증류장치 에 연결한다 환류플라스크를 물 10 ml로 씻어 분액깔대기에 합친다. 5.2 시험조작 증류 및 적정 증류장치의 흡수플라스크에 0.05 N 황산 10 ml 5) 를 취하여 이에 부 런스위크시액 2~3방울을 떨어뜨려서 냉각기의 끝부분을 액면 밑에 담그고 작은 깔때기로부터 30% 수산화나트륨용액 25 ml를 가한다 수증기 발생기로부터 수증기증류 6) 를 하여 증류액 약 100 ml를 받은 후 냉각기의 끝을 액면에서 조금 떼어 다시 유액 수 ml를 유취하여 다 시 냉각기의 끝을 소량의 물로 수기 내에 씻어 넣는다 수기 내에 들어 있는 유액을 0.05 N 수산화나트륨액으로 부런스위 크시액이 녹색으로 변할 때까지 적정한다. 같은 방법으로 공시험을 한다 N 황산 1 ml = mg N 6. 계산 6.1 시료의 분해액을 전부 사용해서 적정했을 때의 식이므로 분해액의 일부를 사 용할 때에는 그 계수를 곱한다. 여기서 얻은 질소량에 질소계수(6.25)를 곱 하여 조단백질의 양으로 한다. 211

216 [계산식] N(%) = (a -b) 100 시료 채취량(mg) N : 질소 a : 공시험에서 중화에 소요된 0.05 N 수산화나트륨액의 ml수 b : 본시험에서 중화에 소요된 0.05 N 수산화나트륨액의 ml수 0.05N 황산 1 ml = mg N [계산식] 조단백질(%) = N(%) 질소계수(6.25) 7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 시험 주의사항 1) 분해에 사용되는 촉매로는, Se, Hg, Cu등이 있다. Hg는 Cu보다도 유효하므로 AOAC에서는 Hg랑 HgO를 이용한다. 그러나 독성을 고려하여 본 시험법에서 는 Cu를 채용하였다. 충분히 가열을 하면 수은제와 동등한 결과를 얻을 수 있 다. K 2 SO 4 는 황산의 비점을 높여 분해를 빨리하기 위해 가한다. 시판되는 분해 촉진제를 사용하면 분해시간을 단축 할 수 있다. 2) 이 혼합지시약은 ph5.2 이하에서는 자적색, 5.4부근에서는 무색, 5.6이상에서는 녹색을 나타낸다. 3) 산화제인 H 2 O 2 를 가하면 분해시간이 짧아지고, 분해액의 거품이 일어나는 것 도 줄인다. H 2 O 2 용해는 분해액을 반드시 냉각한 후 가하지 않으면 위험하다. 4) 분해flasks는 금망상 위에 비스듬히 세워 가열한다. 시료액의 탄화에 의해 생성 하는 탄소는 H 2 O 2 를 환원하여 SO 2 와 CO 2 를 생성한다. SO 2 는 시료의 탄화에 발생하는 수소와 같이 시료 중의 질소를 환원하여 NH 3 로 변하고, SO 3 로 되어 휘산한다. CO 2 의 휘산과 함께 분해액은 투명하게 되지만 투명하게 되어도 질 소화합물이 전부 NH 3 로 된 것은 아니므로 가열을 계속할 필요가 있다. 5) 유출한 NH 3 와 포집액이 충분히 냉각되면 NH 3 흡수에 반드시 강산의 용액을 필요로 하는 것은 아니다. 6) 수증기발생기의 물에 NH 3 를 포함한 경우에는 H 2 SO 4 를 몇 방울 가한다. 수증 기 증류가 격렬하면 증류액의 NaOH가 포집액으로 이동할 수 있으므로 주의 를 기울여야 한다. 212

217 Ⅲ 아미노산 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 시료 중 단백질을 동결건조 한 후 단백질 가수분해 장치를 이용하여 가 수분해 한 후 이온교환크로마토그라피에 의해 상호분리된 아미노산을 닌하이드린 발색시약으로 발색 후 440 nm와 570 nm에서 흡광도를 자동적으로 기록하고 각 아 미노산의 용출시간, 또는 흡광도의 비교에 의한 정성, peak면적에 의한 정량을 하는 분석방법이다. 동결건조 분말 균질화 에테르 침출 / 탈지 단백질 가수분해장치 아미노산 자동분석기 고속액체크로마토그래프 2. 안전 주의 사항 정량용 시험용액 제조에 사용되는 염산(Hydrochloric acid)은 자극적인 냄새를 가 지고 있고 피부 화상, 점막 화상, 호흡 자극, 눈 자극 등의 건강 위험성이 있다. 물 리적 위험으로는 용기가 열에 노출되면 파열되거나 폭발할 수도 있고 물과 접촉 시 반응할 수 있다. 또한 흡입 시 자극이 심한 경우도 있을 수 있으며 두통, 폐 울혈과 폐 이상이 생길 수 있다. 또한 피부에 접촉 시 자극 및 동상과 눈 접촉 시에는 실 명 및 동상 마지막으로 섭취 시에는 화상, 구역, 구토 및 설사를 유발시킬 수 있으 므로 환기가 잘되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 용매용 일회용 실린지 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터 액체크로마토그래프용 유리병 환류 플라스크(100 ml) 분액깔대기(Sperate funnel) 감압농축기 여과지(FH Type, pore size 0.5 μm) 3.2 분석장비 단백질 가수분해장치 아미노산 자동분석기 고속액체크로마토그래프 213

218 3.3 분석장비의 준비 단백질 가수분해장치 1) 는 정온가열로써 100~150 의 온도범위에서 ±1 로 제 어 가능한 것이어야 한다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 D-Cystine 분자식 : C 6 H 12 N 2 O 4 S 2, 분자량 : , CAS No. : D-Tryptophane 분자식 : C 11 H 12 N 2 O 2, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 염산(Hydro chloride 20%) 과개미산용액 (과산화수소: 개미산= 1:9) 수산화나트륨용액(Sodium chloride) 가용성전분(soluvle starch) 트리클로로초산용액(Trichloro acetic acid) 구연산나트륨 4.3 시액의 조제 N 염산 과개미산용액 30% 과산화수소(특), 88% 개미산(특)을 1 : 9의 비율로 혼합하여 실온에서 한 시간 방치 후 0 로 냉각한다. 사용 시 한다 N 수산화나트륨액 가용성전분 아세톤으로 세척 건조하여 사용한다 %(w/v)트리클로로초산용액 50%(w/v)트리클로로초산을 사용 시 희석하여 사용한다. 50% 트리클로로 초산용액은 냉암소에 보관한다. 5. 시험과정 5.1 표준용액 아미노산 표준용액을 0.2 N 구연산나트륨 완충액(pH 2.2) 또는 0.02 N 염 산용액으로 적당히 희석하여 사용한다. 5.2 시험용액 214

219 <단백질구성 아미노산> 시료는 동결건조를 한 후 분말로 하여 균질화한 것을 분석에 사용한다. 또 지방 함량이 높은 시료는 동결건조 후 에테르에 침출, 탈지하여 사용한다 시스틴, 트립토판 이외의 아미노산 정량용 시험용액 단백질로서 약 10 mg에 0.05%(w/v)2-멀캅토에탄올(C 2 H 6 SO)을 함유한 6 N 염산을 단백질 양에 대하여 약 1,000배량 즉, 10 ml를 가한다 드라이아이스 에탄올로 동결한 후 탈기장치에 장착하여 융해, 동결 을 반복하여 충분히 탈기한다 봉관 2) 하여 정온가열로 110 ±1, 22~24시간 가수분해 한 후 봉관 을 절단한다 즉시 감압하여 40 에서 농축건조를 반복하여 염산을 최대한 제거 한다 N 구연산나트륨 완충액(pH 2.2) 또는 0.02 N 염산용액으로 일정 량 만들어 시험용액으로 한다. 침전이 있는 경우에는 멤브레인 필터 를 사용하여 여과 3) 한다 시스틴 정량용 시험용액 단백질 약 10 mg 함유하는 시료를 정밀히 달아 미리 0 로 냉각시켜 과개미산 용액 10 ml를 가한다 단백질이 가용성인 경우 0 에서 4시간, 불용성인 경우 0 에서 하 룻밤 방치한다 방치 후 공기를 흡입하고 소량의 물을 가해 동결 건조한다 잔사를 0.05%(v/v) 2 머캅토에탄올 함유의 6 N 염산 10 ml를 사용하여 가수분해 시험관으로 옮긴다 동결한 후, 탈기장치에 장착하여 충분히 탈기한 후 봉관하여 110±1 에서 18시간 분해한다 시스틴, 트립토판 이외의 아미노산 정량용 시험용액에 따라 시험용액 을 조제 4) 한다 트립토판 졍량용 시험용액 단백질 약 10 mg 함유하는 시료를 가수분해 시험관에 정밀히 달 아 넣고, 가용성전분 100 mg을 가한 다음 4.2 N 수산화나트륨용액 3 ml를 가한다 동결시킨 후, 탈기장치에 장착하여 충분히 탈기하고 밀봉하여 135± 1 에서 22시간 가수분해한다 가수분해 후 봉관을 잘라 열고 6 N 염산으로 중화하여 0.2 N 구연 산나트륨완충액(pH 4.25)으로 일정량을 만들어 시험용액으로 한다 용액이 탁한 경우 30,000~40,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 상 등액을 취한다 5). 215

220 <유리 아미노산> 물에 의한 추출 - 고체 또는 페이스트상의 시료에 적용된다 균질한 시료 약 1 g을 정밀히 달아 약 10배량을 물을 가해 비등 수욕 상에서 가열하여 응고시킨 다음 여과하여 물층을 취한다 잔사는 2~3회 소량의 물로 세정하고, 세액은 앞서의 물과 합한다. 지방이 있는 경우에는 에테르로 추출하여 제거한다 물층을 감압 하에 농축 건조하여 얻은 잔사를 0.2 N 구연산나트륨 완 충액(pH 2.2) 또는 0.02 N 염산으로 용해하여 일정량으로 하여 시험 용액으로 한다 불용물질이 있는 경우에는 멤브레인 필터를 사용하여 여과 6) 한다 트리클로로초산법 - 액체상의 시료에 적용한다 시료 1.0~3.0 ml를 시험관에 달아 16% 트리클로로초산용액을 동 용량 가하여 15분간 진탕한다 ,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 아미노산 자동분석기 조건 완충액, 발색시약의 유무, 칼럼항온조의 온도를 점검하고, 자동완충액 전 환기구 및 정유량 펌프, 유량을 소정의 조건에 따라 설정하고 측정을 실 시한다 정성분석을 위하여 표준물질과 시험용액을 동일한 조건에서 분석하여 머 무름 시간이 일치하는 성분을 비교 동정한다 정량분석의 경우에는 미리 구해 놓은 농도의 아미노산표준의 피크 면적과 함 량으로부터 검량 곡선을 작성한 다음 시험용액으로부터 얻어진 피크면적으 로 시험용액 중의 아미노산 함량을 계산 7) 한다. 6.2 고속액체크로마토그래프에 의한 정성 및 정량 아미노산자동분석기에 의한 정량 및 정성에서와 같이 시험용액을 준비한다 각각의 고속액체크로마토그래프에서 주어진 조건에 맞추어 유도체를 만든 후 시료와 동일 조건하에 조제한 아미노산표준용액의 피크면적과 함량으 로부터 검량곡선을 작성한다 시험용액에서 얻어진 피크면적으로 시험용액 중의 아미노산 함량을 계산 한다 고속액체크로마토그래프 아미노산 표준물질 크로마토그램 216

221 7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 위생시험법 주해, 일본 약학회, 시험 주의사항 1) 단백질 가수분해장치의 구조 A:드라이아이스 에탄올 B:가수분해용 시험관 C:진공코오드 D:트랩 E:마노메타 F:펌프 2) 밀봉관내에 산소가 잔존하면 Try, Met, Cys, Trp, Ser, Thr의 산화분해가 일어 나므로 밀봉관내를 질소로 치환하여 탈기시키면 더욱 좋다. 3) 6 N HCl 가수분해에서는 Trp, Gln, Asn은 완전하게 분해한다. Asn과 Gln은 각각 Asp와 Glu로 변화하므로 아미노산분석에서 얻어진 결과는 Asp는 217

222 Asn+Asp, Glu는 Gln+Glu를 합한 것이다. Cys 및 Cys-SH는 각각의 화합물로 변화하여 정량성이 없다. Ser과 Thr은 분해비율이 일정하므로 48시간, 72시간 분해를 한다. 그것들의 수치로부터 0시간 분해 수치를 비교(외삽)하면 정확한 수치가 얻어진다. 4) 본 조작에서 Cys 및 CysSH는 시스테인산(CysSO 3 H)로 된다. 시스테인산은 매 우 안정되어 있다. 5) Trp은 알카리분해에 비교적 안정하다. 그러나 이 조건에서는 Arg, Ser, Thr, CysSH 등은 완전하게 분해한다. 안정한 Ala와 Leu과의 Trp양의 상대 몰비를 구하여 그 수치를 6 N HCl분해의 결과에 추가하여 전 아미노산의 조성을 결 정할 수 있다. 6) 유리아미노산을 정량하는 경우에는 Asn과 Gln, 디펩티드, 그 외 아민산류도 전부 존재하므로 이것들이 분리되지 않으므로 별도의 용리조건이 필요하다. 7) Pro은440 nm에서 측정하면 정량이 가능하다. Glu 뒤의 작은 peak가 Pro이다. 내부표준품을 이용하는 경우에는 2-아미노-3-구아니드프롤피온산과 놀로이신이 이용된다. 218

223 Ⅲ.3.4 당 및 탄수화물류 Ⅲ 글루코사민 Ⅲ 글루코사민(제1법) 1. 시험방법의 원리 글루코사민 제품은 갑각류(게, 새우 등)의 껍질, 연체류(오징어, 갑오징어 등)의 뼈, Aspergillus niger를 원재료로 하여 만든 제품으로 글루코사민 염산염 또는 황 산염이 980mg/g 이상 함유되어 있어야 한다. 글루코사민 제품은 관절 및 연골 건 강에 도움을 주는 기능성을 가지고 있으며 일일 섭취량은 글루코사민 염산염 또는 황산염으로서 1.5-2g 이다. 산업화 초기에 글루코사민은 키틴을 진한 염산으로 가수 분해하여 생성한 후 무수아세트산(acetic anhydride)을 이용하여 아세틸화 반응을 일으켜 만들었다. 그러나, 이 무수아세트산은 피부에 묻으면 물집이나 염증이 생기 는 등 안전성에 대한 문제가 있는 것으로 판명되어, 이 방법을 통해 만들어진 글루 코사민은 식품에 사용할 수 없었다. 이후 1999년에 최초로 효소를 이용하여 글루코 사민을 만드는 방법을 개발하였으며 이는 식품첨가물로 사용되고 있다. 이러한 글루코사민염산염 또는 황산염은 아세토니트릴에 용해되는 성질을 이용하 여 추출한 후, 액체크로마토그래프를 이용하여 분석하는 방법으로 시차굴절계 검출 기를 이용하여 정량분석 할 수 있다. 증류수로 용해 단백질 제거 원심분리 Filtration NH2-60 칼럼 액체크로마토그래피 시차굴절계 검출 2. 안전 주의 사항 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴(Acetonitrile)은 흡입이나 섭취시 구토, 구역질, 혈압변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의식불명 등의 증상 이 나타날 수 있으므로 환기가 잘되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기 울여야 한다. 219

224 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 부피플라스크(100 ml) 여과용 멤브레인 필터 용매용 일회용 실린지 액체크로마토그래프용 유리병 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 시차굴절계 검출기(Refractive Index Detector) 칼럼오븐 NH2-60칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상인 70% 아세토니트릴 용매를 분당 1.0 ml로 흘려 검출기를 충분히 안 정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 D-글루코사민 염산염(또는 황산염) D-글루코사민 염산염(D-glucosamine hydrochloride) 분자식 : C 6 H 13 NO 5 HCl, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 아세토니트릴(Acetonitrile) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 D-글루코사민 표준물질 0.5 g을 100 ml 부피플라스크에 넣는다 증류수 50 ml를 가하여 완전히 녹인다 아세토니트릴을 표선까지 채워 100 ml로 한다 상기 표준원액을 적절히 희석 1) 하여 표준용액을 준비한다. 220

225 5.2 시험용액의 조제 글루코사민으로서 0.5 g이 되도록 시료를 정밀히 취하여 100 ml 부피플라 스크에 넣는다(필요한 경우 탈지한다) 증류수 50 ml를 가하여 녹인 후 아세토니트릴을 표선까지 채운다 μm의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항목 주입량 조건 10 μl 칼럼 온도 40 이동상 증류수 : 아세토니트릴 (30 : 70) 유속 1.0 ml/분 6.2. 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 글루코사민 염산염(또는 황산염 2) ) 함량(mg/g) = C (a b) / S C : 시험용액중의 글루코사민 염산염(또는 황산염)의 농도(mg/mL) a : 시험용액의 전량(mL) b : 희석배수 S : 시료 채취량(g) 221

226 7. 참고문헌 7.1 J. Karkkainen, A. Lehtonen, T. Nikkari : Determination of glucosamine and galacosamine by gas chromatography, Journal of Chromatography, 20, , Yasser S. El-Saharty, Ahmed Abdel Bary. High-performance liquidchromatographic determination of neutraceuticals, glucosamine sulphate and chitosan, in raw materials and dosage forms. Analytica Chimica Acta., 462, , 강길진, 조정일, 키토올리고당의 측정법으로 비색법과 HPLC법의 비교 : KO REAN J. FOOD SCI. TECHNOL., 32(4), , Yu Shao, Rama Alluri, Mike Mummert, Uwe Koetter, Stanley Lech. A stability-indicating HPLC method for the determination of glucosamine in pharmaceutical formulations. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 35, , 시험 주의사항 1) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 2) 글루코사민 황산염은 사용원료가 나트륨염 인지 칼륨염 인지 확인하여 각각의 표준품을 사용하여야 한다. 223

227 Ⅲ 글루코사민(제2법) 1. 시험방법의 원리 글루코사민염산염 또는 황산염의 아세토니트릴에 용해되는 성질을 이용하여 50% acetonitrile/증류수로 추출한 후 0.45 μm의 멤브레인 필터로 여과 액체크로마토그래 프를 이용하여 분석하는 방법으로 증기화광산랑검출기를 이용하여 정량분석 할 수 있다. 증류수로 용해 Filtration NH2-60 칼럼 액체크로마토그래피 증기화광산란검출기 2. 안전 주의 사항 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴(Acetonitrile)은 흡입이나 섭취시 구토, 구역질, 혈압변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의식불명 등의 증상 이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 부피플라스크(100 ml) 여과용 멤브레인 필터 용매용 일회용 실린지 액체크로마토그래프용 유리병 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 증기화광산란검출기(Evaporative Light Scattering Detectors, ELSD) 칼럼오븐 NH2-60칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상인 완충용액 : 아세토니트릴 (50 : 50)을 분당 1.0 ml로 흘려 칼럼과 검 출기를 충분히 안정화 시킨다. 224

228 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 D-글루코사민 염산염(또는 황산염) D-글루코사민 염산염(D-glucosamine hydrochloride) 분자식 : C 6 H 13 NO 5 HCl, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 아세토니트릴(Acetonitrile) 개미산(Formic acid) 트리에틸아민(Triethylamine) 4.3 시액의 조제 완충용액 증류수 5 L에 개미산 4 ml를 넣어 섞은 후 트리에틸아민 12.5 ml을 넣어 ph 4.5로 맞춘다. 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 D-글루코사민 표준물질 0.5 g을 100 ml용 부피플라스크에 넣는다 증류수 50 ml를 가하여 완전히 녹인다 아세토니트릴을 표선까지 채워 100 ml로 한다 상기 표준원액을 적절히 희석 1) 하여 표준용액을 준비한다. 5.2 시험용액의 조제 글루코사민으로서 0.5 g이 되도록 시료를 정밀히 취하여 100 ml 부피플라 스크에 넣는다(필요한 경우 탈지한다) 증류수 50 ml를 가하여 완전히 녹인다 아세토니트릴을 표선까지 채워 100 ml로 한다 이를 0.45 μm의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다. 225

229 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항목 조건 주입량 40 μl 칼럼온도 40 Nebulization Temp. 70% Pressure (N 2 gas) 40psi Drift tube Temp. 85 이동상 완충용액 : 아세토니트릴 (50 : 50) 유량 1.0 ml/분 6.2. 표준물질과 시료분석 크로마토그램 226

230 6.3 계산 글루코사민염산염(또는 황산염 2) ) 함량(mg/g) = C (a b) / S C : 시험용액중의 D-글루코사민 염산염(또는 황산염)의 농도(mg/mL) a : 시험용액의 전량(mL) b : 희석배수 S : 시료 채취량(g) 7. 참고문헌 7.1 J. Karkkainen, A. Lehtonen, T. Nikkari : Determination of glucosamine and galacosamine by gas chromatography, Journal of Chromatography 20, , Yasser S. El-Saharty, Ahmed Abdel Bary : High-performance liquid chromatographicdetermination of neutraceuticals, glucosamine sulphate and chitosan, in raw materials and dosage forms, Analytica Chimica Acta, 462, , 시험 주의사항 1) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 2) 글루코사민 황산염은 사용원료가 나트륨염 인지 칼륨염 인지 확인하여 각각의 표준품을 사용하여야 한다. 227

231 Ⅲ N-아세틸글루코사민 1. 시험방법의 원리 N-아세틸글루코사민은 새우나 게 등 갑각류의 껍질을 구성하는 성분인 키틴을 가 수분해하여 얻어지는 것으로, 체내에서는 세포와 세포의 결합성분, 점막성분, 관절 윤활액 등의 성분인 글루코사미노글리칸, 당지질, 당단백 등을 구성하는 물질이다. 글루코사민은 단당류인 글루코오스의 아미노 유도체이며, N-아세틸글루코사민은 글루코사민의 아세틸화된 유도체로서, 아세토니트릴에 용해되는 성질을 이용하여 시료 중 존재하는 N-아세틸글루코사민을 아세토니트릴용액으로 추출하여 아민칼럼 을 통해 N-아세틸글루코사민을 분리하는 방법으로 시차굴절계를 이용하여 검출하여 정량분석 할 수 있다. 증류수로 용해 Filtration NH2P-50 칼럼 액체크로마토그래피 시차굴절계 검출 2. 안전 주의 사항 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴(Acetonitrile)은 흡입이나 섭취시 구토, 구역질, 혈압변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의식불명 등의 증상 이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 용매용 일회용 실린지 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터 부피플라스크(100 ml) 액체크로마토그래프용 유리병 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 시차굴절계(Refractive Index Detector) 칼럼오븐 NH2P-50 (안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 polyamine bonded polymer gel) 또는 이와 동등한 것 228

232 3.3 분석장비의 준비 이동상은 증류수와 아세토니트릴을 25 : 75로 조제하여 분당 0.8 ml씩 충분한 시간동안 흘려 기기와 칼럼을 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 N-아세틸글루코사민(N-Acetylglucosamine, 2-Acetamido-2-deoxy-D-glucose) 분자식 : C 8 H 15 NO 6, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 아세토니트릴(Acetonitrile) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 N-아세틸글루코사민 표준물질 500 mg을 정밀히 취한다 위의 표준물질을 100 ml 부피플라스크에 넣는다 증류수 50 ml을 가하여 녹인다 아세토니트릴을 넣어 표선까지 채운다 위의 용액을 아세토니트릴로 적절히 희석 1) 하여 표준용액으로 준비한 후 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 사용한다. 5.2 시험용액의 조제 시료(N-아세틸글루코사민으로서 200 mg) 일정량을 정밀히 취한다 위의 시료를 100 ml 부피플라스크에 넣는다 증류수 50 ml을 가하여 녹인다 아세토니트릴을 넣어 표선까지 채운다 이를 0.45 μm의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다. 229

233 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항목 조건 주입량 20 μl 칼럼온도 35~40 이동상 증류수 : 아세토니트릴(25 : 75) 유량 0.8 ml/분 6.2. 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 N-아세틸글루코사민 함량(mg/g) = C (a b) / S C : 시험용액 중의 N-아세틸글루코사민의 농도(mg/mL) a : 시험용액의 전량(mL) b : 희석배수 S : 시료 채취량(g) 7. 참고문헌 7.1 Goran Karlsson, Stefan Winge, Helena Sandberg : Separation of monosaccharides by hydrophilic interaction chromatography with evaporative light scattering detection, Journal of Chromatography A, 1092, , Miyoko Ueno, Tomoko Arai, Kyoko Kojima, Haruko K. Ogawa, Isamu Matsumoto and Nobuko Seno : Improved affinity chromatographic purification of Dmannose-N-acetyl-D-glucosamine-specific lectin from the bark of Sophora japonica eliminating the loss by sugar specific self-aggregation, Journal of Chromatography, 597, ,

234 8. 시험 주의사항 1) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 231

235 Ⅲ 베타글루칸 1. 시험방법의 원리 베타글루칸은 글루코오스나 그 유도체가 베타결합으로 연결된 중합체이므로, 아밀 라아제, 셀룰라아제, 아밀로글루코시다제 등으로 진탕하여 효소분해한 후, 침전시켜 원심분리하여 산분해하면 베타글루칸으로부터 글루코오스 형태로 분리할 수 있다. 반응용액을 알칼리성으로 만들어 발색을 증가시키기 위해서 글루코오스에 5% 페놀 용액을 넣어 발색을 증가시킨 후 UV Spectrophotometer로 정량할 수 있다. 이때 글루코오스를 표준물질로 사용하며, 최대흡수파장인 470nm에서 정량분석 한다. 물 추출 효소처리 페놀/황산 발색 UV Spectrophotometer 효소분해물 침전 후 원심분리 2. 안전 주의 사항 시험 중 ph측정에 주로 사용되는 수산화나트륨은 부식성이 강하여 피부에 접촉되 어 화상, 눈 손상, 실명될 수 있고 섭취 시 설사, 위통, 혼수 및 폐 손상을 야기 할 수 있으므로 피부에 접촉하지 않도록 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 삼각플라스크 ph 측정기 항온 진탕기 원심분리기 부피플라스크(100 ml) 3.2 분석장비 분광광도계 3.3 분석장비의 준비 분석 전 분광광도계를 충분히 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 글루코오스(D-(+)-glucose) 분자식 : C 6 H 12 O 6, 분자량 : , CAS No. :

236 4.2 일반시약 에탄올(Ethanol) 내열성 α-아밀라아제(α-amylase, Sigma A3306 또는 Termamyl 300L, Novo ) 셀룰라아제(Cellulase, Sigma C8546) 프로테아제(Protease, Sigma P3910) 아밀로글루코시다제(Amyloglucosidase, Sigma A9913) N 염산용액(0.1 N Hydrochloric acid) 4.3 시액의 조제 N 수산화나트륨 용액(Sodium hydroxide) 1 N 수산화나트륨액을 취하여 증류수로 10배 용량으로 희석하여 사용하거 나 수산화나트륨 4.5 g을 취하여 일정량의 증류수에 녹이고 1000 ml 부 피플라스크에 옮겨 담은 후 증류수를 표선까지 채운 다음 표정하여 사용한 다 % 페놀용액 페놀 5 g을 취하여 증류수를 가해 100 ml로 한다. 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 D-글루코오즈 표준물질 0.1 g을 100 ml 부피플라스크에 넣는다 증류수를 가하여 완전히 녹인 후 100 ml로 한 후 희석하여 표준원액으 로 한다 위의 용액을 증류수로 적절히 희석하여 표준용액으로 한다. 5.2 시험용액의 조제 (전처리 과정) 시험은 두개의 시료 및 공시험을 동시에 실시한다 시료 약 2~10 g을 정밀히 달아 삼각플라스크에 취한다(지방이 10%이상 인 경우 탈지하고, 당을 많이 함유한 경우 85% 에탄올 용액으로 시료 1 g당 10 ml씩으로 세척한다) 증류수 100 ml를 가한다. 233

237 5.2.4 여기에 아밀라아제(20unit) 약 40~200 mg을 취한다 N 수산화나트륨용액을 이용하여 ph 6.9로 한 후 20 에서 2시간동안 진탕하여 효소분해 시킨다 위의 용액에 0.1 N 염산용액으로 ph 5.0으로 맞추고 셀룰라아제(50unit)를 넣고 37 에서 2시간동안 진탕하여 효소 분해시킨다 위의 용액에 프로테아제(10unit) 약 15~80 mg을 넣고 0.1 N 수산화나트 륨용액으로 ph 7.5로 한 후 37 에서 2시간동안 진탕하여 효소분해 시킨 다 위의 용액에 아밀로글루코시다제(70unit) 약 20~100 mg을 넣고 0.1 N 염 산용액으로 ph 4.8로 한 후 60 에서 2시간동안 진탕하여 효소 분해시킨 다 효소분해물(5.2.8)에 95% 에탄올 400 ml를 가하여 4 에서 12시간동안 침전 시킨다 위의 용액을 원심분리(10,000 rpm, 10분)하여 시료의 침전물을 취한다 시료의 침전물[5.2.10]에 80% 에탄올 500 ml를 가하여 4 에서 1시간동 안 침전시킨다 위의 용액을 원심분리(10,000 rpm, 10분) 한다 원심분리된 침전물(5.2.12)에 증류수 20 ml를 가한 후 침전물을 혼합하여 균질화시킨다 위의 용액을 증류수로 100 ml가 되도록 한 후, 이를 적정농도가 되도록 희석하여 시험용액으로 한다. 5.3 시험용액의 조제 (발색 과정) ml 시험관을 농도별 표준용액과 시험용액(공시험포함)으로 구분하여 각각 5% 페놀용액 1 ml를 넣는다 위의 시험관에 농도별 표준용액(4.1)을 각각 1 ml씩 가하고, 시험용액은 시험용액(4.2) 0.1 ml과 증류수 0.9 ml를 가한다. 공시험은 증류수 1 ml 을 가한다. 이 용액들을 10초간 잘 흔들어 섞는다 위의 시험관에 각각 황산 5 ml을 가하여 혼합한다 실온에서 20분간 반응시킨다. 6. 분석 및 계산 6.1 흡광도 측정 파장 470 nm에서 흡광도를 측정 1) 한다. 234

238 6.2 계산 베타글루칸함량 2) (mg/g) = C a/s 10 1/1, C : 시험용액중의 글루코오스 농도(μg/mL) a : 시험용액의 전량(mL) 10 : 희석배수 S : 시료 채취량(g) 1/1,000 : 단위 환산 계수 0.9 : 베타글루칸 전환계수(162/180) 7. 참고문헌 7.1 Pamela Manzi, Laura Pizzoferrato : Beta-glucans in edible mushrooms, Food Chemistry, 68, , Sook Jong Rhee, Seung Yong Cho, Ki Myong Kim, Dong-Su Chaa, Hyun-Jin Park : A comparative study of analytical methods for alkali-soluble b-glucan in medicinal mushroom, Chaga (Inonotus obliquus), LWT, 41, , 시험 주의사항 1) 흡광도 측정시 공시험액을 대조액으로 하여야 한다. 2) 효소법으로 측정한 결과는 베타글루칸의 총량을 측정대상으로 하기 때문에 유 효성분으로 알려진 1-3 베타글루칸과 1-6 베타글루칸을 구별 하지는 못한다. 1-4베타글루칸인 셀룰로스와 헤테로 글루칸 등도 광범위하게 측정된다. 235

239 Ⅲ 식이섬유 Ⅲ 식이섬유(제1법) 1. 시험방법의 원리 식이섬유란 고등동물이 소화 및 흡수 할 수 없는 식품성분으로서, 협의로는 cellulose, hemicellulose, xylan 등의 고분자 불용성 다당류와 lignin, 펙틴, konjak mannan, sodium alginate 등의 고분자 수용성 다당류, 난소화성 전분을 의미하지 만, 광의로는 동물성 다당류, 난소화성 dextrin이나 polydextrose 같은 저분자수용성 다당류, 당알코올이나 난소화성 올리고당 같은 저분자당, 난소화성 단백질, 난흡수 성 미네랄 등이 포함되는 경우가 있다. 따라서 식품 중의 식이섬유 정량방법은 다 양하며, 각각 다른 식이섬유분획을 구하는 방법으로 되어 있다. 본 시험법은 함질소화합물 중 단백질의 비율이 비교적 높은 시료에 적당하다. 시 료 중 존재하는 지질을 탈지하고 당을 세척한 후, 효소에 저해작용이 없는 완충용 액인 MES/TRIS용액으로 교반하여 분산시키고 식이섬유가 소화효소로 가수분해 되지 않는 특성을 이용하여, 내열성 α-아밀라아제, 프로테아제, 아밀로글루코시다아 제로 효소분해 시킨 뒤 95% 에탄올로 침전시키며 셀라이트로 여과하여 남은 잔사 물의 중량을 측정한다. 이때 조단백질량, 회분량을 측정하여 잔사물의 중량에서 빼 주는 방법으로 식이섬유의 함량을 정량한다. 교반 효소처리 ph조정 여과 및 세척 잔사물의 중량측정 2. 안전 주의 사항 시험 중 잔사의 세척에 사용되는 아세톤은 휘발성이 강하고 폭발의 위험이 있으 며, 증기 상태로 흡입 시 코, 인후, 폐, 눈에 염증을 일으킬 수 있으며 기도자극, 기 침, 어지러움, 두통, 발열 등의 증상이 나타날 수 있고, 섭취시 복통, 구역질, 구토, 설사, 내출혈, 의식불명 등의 증상이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안 전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 유리여과기(기공 40~60 μm, 용량 60 ml) 525 에서 한 시간 가열한 다음 식혀 물로 세척하고 상온 건조하여 셀라 236

240 이트 0.5 g을 가한 후 130 에서 항량이 될 때까지 건조한 후 데시케이 터에 옮겨 보관한다 회화로 감압펌프(역류방지장치가 부착된 것) 교반기 감압건조기 또는 상압가열건조기 항온수조 데시케이터 ph 측정기 비커(200 ml) 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 일반시약 에탄올(Ethanol) 규조토(Celite 545 AW) 내열성 α-아밀라아제(α-amylase heat stable) 프로테아제(protease) 아밀로글루코시다아제(Amyloglucosidase) MES(2-(N-Morpholin)ethanesulfonic acid) TRIS(Tris(hydroxymethyl)aminomethane) 아세톤(Acetone) 4.2 시액의 조제 % 에탄올 용액 100%에탄올 850 ml에 증류수를 가하여 1,000 ml로 한다 % 에탄올 용액 100%에탄올 780 ml에 증류수를 가하여 1,000 ml로 한다 세척용액 액상계면활성제(International Products사의 MICRO제품 또는 이와 동등한 것)를 증류수에 희석하여 2%용액으로 함 MES/TRIS 완충액 MES g과 TRIS 12.2 g을 증류수 1.7 L에 녹이고 6 N 수산화나트륨용 액으로 ph가 8.2가 되도록 조절한 후 증류수를 가하여 2 L로 한다. 용액 의 온도가 20 이면, ph 8.1로, 용액의 온도가 28 이면 ph 8.3으로 조정 함 N 염산용액 6 N 염산 93.5 ml에 증류수를 가하여 1,000 ml로 함. 237

241 5. 시험과정 5.1 시험용액의 조제 시험은 두 개의 시료 및 공시험을 동시에 실시한다 고운분말로 한 시료 1) 약 1.0 g 2개(M1, M2)를 200 ml 비커에 취한다. 지 방이 10%이상인 경우 탈지하고, 당을 많이 함유한 경우 85%에탄올 용액 으로 시료 1 g 당 10 ml씩으로 세척한다 MES/TRIS용액 40 ml씩 가하고 마그네틱 교반하여 충분히 분산시킨다 내열성 α-아밀라아제 용액 50 μl를 가하고 서서히 저어 혼합한다 알루미늄박으로 뚜껑을 한 후 95~100 의 수욕에서 40분간 교반한다 반응이 끝난 후 60 로 식히고 비커 벽이나 바닥에 내용물이 부착되어 있으 면 시약스푼으로 긁어 분산시키고 증류수 10 ml로 스푼과 비이커 벽을 닦는다 각각의 비커에 프로테아제용액 100 μl씩 가하고 알루미늄박으로 뚜껑을 한 후 약 60 에서 30분간 교반하면서 항온 시킨다 뚜껑을 제거하고 N 염산용액 5 ml를 가하여 흔들어 혼합 후 60 에서 ph를 4.0~4.7로 조정한다 아밀로글루코시다아제용액 300 μl을 넣고 흔들어 섞은 후 알루미늄박으 로 뚜껑을 한 후 60 에서 30분간 교반을 유지하며 항온시켜 시험용액으 로 한다. 5.2 총 식이섬유 정량 상기(5.1) 시험용액 각각에 60 의 95% 에탄올 225 ml을 가한다. 에탄올과 시험용액의 용량비율은 4 : 1로 한다 실온에서 1시간 방치하여 침전시킨다 미리 셀라이트를 넣어 항량시킨 유리여과기에 78% 에탄올 15 ml을 가하여 분산시킨 후 흡인여과 하여 셀라이트층이 고르게 형성되도록 한다 위의 여과기에 시험용액을 넣어 여과하고 용기의 잔류물을 78% 에탄올로 씻어준다 잔사는 78%에탄올, 95%에탄올, 아세톤 순으로 각각 15 ml씩 2회 씻는다 아세톤이 잔류하지 않도록 충분히 흡인시킨 후 105 의 건조기에서 하룻 밤 건조시키고 데시케이터에서 1시간 방냉하여 항량으로 한 후 무게를 달 아 여과기와 셀라이트의 무게를 뺀다 하나의 여과기(M1) 잔사에 대하여 질소량을 측정하고 이에 6.25를 곱하여 단백질량으로 한다 또 다른 하나의 여과기(M2) 잔사를 525 에서 5시간 회화시킨 후 회분량 을 구한다 시료를 제외한 공시험을 하여 계산식에 따라 총 식이섬유의 함량을 구한 다. 238

242 5.3 물불용성 식이섬유의 정량 미리 셀라이트를 넣어 항량시킨 유리여과기에 물 3 ml을 가하여 분산시킨 후 흡인여과 하여 셀라이트층을 고르게 한다 [5.1]의 시험용액을 여과하고 잔류물은 70 의 물 10 ml로 2회 씻는다 여액 및 세척액은 합하여 600 ml 비커에 모아 [4.5] 수용성식이섬유 정량 용으로 한다 잔류물은 곧바로 78%에탄올, 95%에탄올 그리고 아세톤 순으로 각 15 ml 씩 2회 세척한다 여과기의 잔사를 105 의 건조기에서 하룻밤 건조시키고 데시케이터에서 1시간 방냉하여 항량으로 한 후 무게를 달아 여과기와 셀라이트의 무게를 뺀다 하나의 여과기(M1) 잔사에 대하여 질소량을 측정하고 이에 6.25를 곱하여 단백질량으로 한다 또 다른 하나의 여과기(M2) 잔사를 525 에서 5시간 회화시킨 후 회분양 을 구한다 시료를 제외한 공시험을 하여 계산식에 따라 총 식이섬유의 함량을 구한다. 5.4 수용성식이섬유 2) 의 정량 [5.3.3]에서 얻어진 여액 및 세척액에 60 의 95% 에탄올을 4배정도 가하 거나 여액을 물로 80 g으로 한다 의 95% 에탄올 320 ml을 가한다 한 시간 방치하여 침전물을 형성시킨다. 6. 계산 6.1 계산 공시험값 B(mg) = 공시험평균잔사무게(mg) - PB - AB PB : 공시험 단백질량(mg) AB : 공시험 회분량(mg) 식이섬유함량(%) = 시료의 평균잔사 무게(mg)-P-A-B / 시료의 평균 무게 (mg) 100 P : 단백질량(mg) A : 회분량(mg) B : 공시험값(mg) 7. 참고문헌 7.1 ALEXIS R. EBERENDU, GABRIELA LUTA, JOSHUA A. EDWARDS, BILL H.MCANALLEY, and BRICE DAVIS, SANTIAGO RODRIGUEZ, C. RAY HENRY : Quantitative Colorimetric Analysis of Aloe Polysaccharides as a 239

243 Measure of Aloe Vera Quality in Commercial Products, JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL VOL. 88, NO. 3, Emiko TAKEYAMA,1 Masako FUKUSHIMA1 and Akio TANIMURA : Effect of Heat-Treatment on the Content and Polysaccharide Composition of Dietary Fiber, Food Sci. Technol. Res, 8 (2), , 시험 주의사항 1) 10 메쉬의 체를 통과 할 정도로 균질하게 처리 하여야 하나 수분이 많은 경우 그대로 분쇄는 어려우므로 건조하여야 하는데 건조시의 성분 변화를 최소화 하기 위하여 동결건조 하는 것이 좋다. 지질이 많은 시료의 경우 아미라제와 프로테아제에의한 분해물에 의해 방해를 받게되므로 효소 처리 전 탈지하는 것이 좋다. 2) 이 방법에서는 저분자 수용성 난소화성 식이섬유(특히 올리고당 계통)이 효소 처리시 상등액에 포함되어 제거되기 때문에 이를 감안하여야 한다. 240

244 Ⅲ 식이섬유(제2법) 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 주로 저분자 수용성 섬유소(삼당류 이상)을 함유한 시료에 적용하는 방법으로, 가수분해 후 고속액체 크로마토그래피로 구하는 방법이다. 즉, 시료를 충 분히 탈지하고 α-아밀라아제, 프로테아제, 아밀로글루코시다아제를 이용하여 효소분 해한 후 당의 함량을 구한다. 실활 시켜 상기 칼럼에 통과시켜 칼럼용출액을 분취 시킨 용액을 감압 농축하여 DE52 type column을 통한 액체크로마토그래피/시차굴 절계를 이용하여 정량한다. 수욕 진탕 가열후 효소 실활 Filtration HPLC DE52 type column RI detector 2. 안전 주의 사항 시험 중 ph측정에 주로 사용되는 수산화나트륨은 부식성이 강하여 피부에 접촉되 어 화상, 눈 손상, 실명될 수 있고 섭취시 설사, 위통, 혼수 및 폐 손상을 야기 할 수 있으므로 피부에 접촉하지 않도록 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 용매용 일회용 실린지 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터 액체크로마토그래프용 유리병 부피플라스크(100 ml, 50 ml) 알루미늄 호일 비커(200 ml) 항온 수조 유리관(안지름 20 mm, 길이 300 mm) 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 시차굴절계(Refractive Index Detector) 칼럼오븐 Sugar-Pak(안지름 6.5 mm, 길이 300 mm, 충진재 8% cross-linked resin/calcium ionic form) 또는 이와 동등한 것 241

245 3.3 분석장비의 준비 이동상인 증류수를 분당 1 ml씩 흘려 기기와 칼럼을 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 Glucose 분자식 : C 6 H 12 O 6, 분자량 : , CAS No. : Sucrose 분자식 : C 12 H 22 O 11, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 내열성 α-아밀라아제(α-amylase, heat stable, 냉장보존) 프로테아제(protease) : 냉장 0~5 보존하며, 사용시에 MES/TRIS 완충액으로 50 mg/ml가 되게 조제 하여 사용한다 아밀로글루코시다아제 용액(Amyloglucosidase) : 냉장 0~5 보존하며, 사용시에 조제하여 사용한다 Amberlite IRA-96(OH형) Amberlite 200(H형) (N-Morpholino)ethanesulfonic acid(mes) Tris(hydroxymethyl)aminomethane(TRIS) 4.3 시액의 조제 MES/TRIS 완충액 MES g과 TRIS 12.2 g을 증류수 1.7 L에 녹이고 6 N 수산화나트륨 용액으로 ph가 8.2가 되도록 조절한 후 증류수를 가하여 2L로 한다. 용액 의 온도가 20 이면, ph 8.1로, 용액의 온도가 28 이면 ph 8.3으로 조정 242

246 함. 5. 시험과정 5.1 효소처리액의 조제 시료 약 1 g을 200 ml비커에 정밀히 칭량한다. 시료중의 지방질이 많은 경우 에테르 등을 이용하여 충분히 탈지한 후 사용한다 증류수 50 ml을 가하여 용해한 후, 0.1 N 염산용액 혹은 수산화나트륨용액 으로 ph 6.0으로 조정한다 여기에 내열성 α-아밀라아제 용액 0.1 ml을 가하고, 알루미늄박으로 뚜껑 을 하여 끓는 수욕에서 30분간 놓아둔다.(5분 간격으로 교반) 실온 냉각 후 0.1 N 수산화나트륨 용액으로 ph 7.5±0.1로 조정한다 프로테아제 0.1 ml을 가하고 알루미늄박으로 봉한 후 60 수용액에서 30분간 진탕한다 실온 냉각 후 0.1 N 염산용액으로 ph 4.5±0.2로 조정한다 아밀로글루코시다아제 0.1 ml을 가하고 알루미늄박으로 뚜껑을 하여 60 수욕에서 30분간 진탕 후 수욕 중에서 10분간 가열하여 효소를 실활 시킨 다 실온 냉각 후 100 ml 부피플라스크에 옮겨 증류수를 표선까지 채운 액을 효소처리액(A)라고 한다. 5.2 효소처리액(A) 중의 포도당 정량 포도당, 설탕의 표준품을 각각 100 ml 부피플라스크에 정밀히 취한 후 증류수로 가하여 표선까지 채운다. 단, 시험용액 중 분석하고자 하는 농 도가 검량선 내에 포함될 수 있도록 표준용액의 농도를 적절히 조절하여 사용한다 효소처리액(A) 및 표준용액을 시험용액과 표준용액으로 하여 당의 함량 1) 을 구한다. 5.3 탈염처리액(B) 효소처리액(A) 50 ml을 취하여 5. 분석 및 계산 5.1. 탈염 조건 에 맞는 이 온교환수지 칼럼에 초당 1~2방울의 속도 2) 로 통과시켜 탈염한 칼럼용출 액을 분취한다 상기 칼럼에 증류수 약 150 ml을 초당 1~2방울 속도로 통과시킨 칼럼용출 액을 분취한다 칼럼용출액 200 ml을 감압농축하여 20 ml 부피플라스크에 옮기고 증류 수를 표선까지 채운다 이 액을 0.20 μm의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다. 243

247 6. 분석 및 계산 6.1 탈염 조건 - 이온 교환 수지 Amberlite IRA-96(OH형), Amberlite-200(H형)을 1 : 1의 비율 로 혼합한 것 - 칼럼 크기 : 유리관(안지름 20 mm, 길이 300 mm) - 용리액 : 증류수 - 수지량 : 50 ml 이온교환수지 각각 OH형은 5% 수산화나트륨 용액으로, H형은 5% 염산용액 으로 하루정도 충분히 활성화 시킨 후 물로 수차례 세척하여 수산화나트륨용액 이나 염산용액이 잔존하지 않도록 하여 사용한다. 6.2 결과분석 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항목 조건 주입량 20 μl 칼럼온도 70 이동상 증류수 유량 0.4 ml/분 분석 크로마토그램 표준용액 크로마토그램 244

248 시료 크로마토그램 6.3 계산 포도당 중량(mg) = A x (B/C) / 1000 A : 시험용액 중 당질의 농도(μg/mL) B : 시험용액 전량(mL) C : 희석배수 난소화부 중량(mg) = A / B x C A : 난소화부의 피크 면적 B : 포도당의 피크면적 C : 포도당의 중량(mg) 7. 참고문헌 7.1 ALEXIS R. EBERENDU, GABRIELA LUTA, JOSHUA A. EDWARDS, BILL H.MCANALLEY, and BRICE DAVIS, SANTIAGO RODRIGUEZ, C. RAY HENRY : Quantitative Colorimetric Analysis of Aloe Polysaccharides as a Measure of Aloe Vera Quality in Commercial Products, JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL VOL. 88, NO. 3, Emiko TAKEYAMA,1 Masako FUKUSHIMA1 and Akio TANIMURA : Effect of Heat-Treatment on the Content and Polysaccharide Composition of Dietary Fiber, Food Sci. Technol. Res, 8(2), , 시험 주의사항 1) 포도당의 피크는 통상 단백질, 유기산, 무기염류 등 다른 물질 피크와 분리가 그다지 명확치 않은 경우가 많아서 이를 보정하기 위하여 글리세린 등을 내부 표준 물질로 사용하기도 하지만, 특이하게 글루코스로 분해되는 식이섬유의 경 우 분석에 어려움이 있을 수 있다. 2) 단백질, 유기산, 무기염류 등이 많은 시료의 경우 이들을 을 효과적으로 제거 하기 위하여 약 5초에 1 방울 정도의 속도가 적당하다. 245

249 Ⅲ 총 다당체 1. 시험방법의 원리 페놀-황산법은 총당 측정법으로 미량의 시료 분석에 적합하다. 특히 이 방법은 칼 럼크로마토그래피, 페이퍼크로마토그래피로 분획한 획분의 전당량 측정에 많이 사 용되고 있다. 환원당을 진한 황산으로 처리하면 탈수되어 푸르푸랄(furfurol) 또는 그 유도체가 된다. 형성된 푸르푸랄 및 이의 유도체는 페놀류와 축합 반응하여 비 색정량이 가능한 화합물을 만든다. 색조를 띠며 형성된 합성물의 결과물은 최대 490nm의 흡광도를 측정함으로써 비색정량이 가능할 수 있다. 본 시험법은 이러한 원리를 바탕으로 다당체를 시료로부터 추출하여 페놀과 황산 으로 발색시켜 분광광도계를 이용하여 정량하는 분석법이다. 이때, 만노오스를 표준 물질으로 하며 다당체, 페놀 및 황산의 상호작용으로 만들어진 화합물이 갖는 최대 흡수파장인 490 nm에서 정량 분석한다. 물 추출 원심분리 페놀/황산 발색 UV Spectrophotometer 24시간 투석 2. 안전 주의 사항 시험 중 페놀-황산법에 사용되는 진한 황산은 흡입 시 치명적이며, 점막에 심한 자 극을 야기할 수 있고, 눈과 피부에 화상을 야기할 수 있으므로 취급 후 철저히 씻 어야 하고, 적절한 환기 하에서 사용해야 한다. 또한 물과 위험한 반응을 일으킬 수 있으며, 연소물을 발화시킬 수 있으므로 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 부피플라스크(10 ml, 50 ml, 100 ml) 원심분리기 원심분리 튜브 투석용 튜브(분자량 3,500Da) 시험관 3.2 분석장비 분광광도계 3.3 분석장비의 준비 분광광도계는 측정 전에 켜서 충분히 안정화시킨다. 246

250 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 만노오스(D-(+)-mannose, D-Mannopyranose) 분자식 : C 6 H 12 O 6, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 황산(Sulfuric acid) 4.3 시액의 조제 % 페놀용액(Phenol) 페놀 5 g을 취하여 물을 가하여 100 ml로 한다. 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 만노오스 50 mg을 50 ml 부피플라스크에 넣는다(1 mg/ml) 표준원액을 증류수로 희석 1) 하여 농도별 표준용액을 만든다. 5.2 시료의 전처리 알로에겔 분말 시료가 0.1~0.5% 수용액이 되도록 시료를 취하여 2시간 이상 교반 하여 충분히 용해시킨다 위의 용액을 원심분리(8000 rpm, 30분)하여 상등액을 취하거나 감압필터 (20~25 μm)하여 불용성 물질을 제거한다 용해액을 투석용 튜브에 옮긴다 알로에겔 액상제품 시료(알로에겔분말로서) 약 100 mg이 되도록 취하여 증류수로 100 ml 가 되도록 취한 후 2시간 이상 교반하여 충분히 용해시킨다 위의 용액을 원심분리(8000 rpm, 30분)하여 상등액을 취하거나 감압필터 (20~25 μm)하여 불용성 물질을 제거한다 알로에겔 정제 시료(알로에겔분말로서) 약 100 mg이 되도록 취하여 증류수로 100 ml 가 되도록 취한 후 2시간 이상 교반하여 충분히 용해시킨다 위의 용액을 원심분리(8000 rpm, 30분)하여 상등액을 취하거나 감압필터 247

251 (20~25 μm)하여 불용성 물질을 제거한다 알로에겔 캡슐 시료가 7~8% 용액이 되도록 헥산에 용해시켜 지용성 성분을 용 해시킨다 사용된 헥산과 동일한 양의 증류수를 넣어 지용성 성분을 제거한다. 동량의 헥산을 2회 더 사용하여 지용성 성분을 충분히 제거한다 위의 용액을 원심분리(8000 rpm, 30분)하여 상등액을 취하거나 감압 필터(20~25 μm)하여 불용성 물질을 제거한다. 5.3 시험용액의 조제 전처리한 시료를 투석용 튜브에 넣고 튜브의 끝을 밀봉한다 튜브를 증류수에 담그고 24시간동안 투석 후 투석된 시료전체의 부피를 측정한다. 투석 시 증류수를 수시로 교환해 준다 위의 용액의 일부를 총다당체 함량 측정을 위한 시험용액으로 한다. 5.4 시험조작 표준용액 및 시험용액 200 μl를 각각 시험관에 넣는다 % 페놀용액 1 ml씩 넣어 혼합한다 혼합액(4.4.2)에 진한 황산 5 ml을 넣어 20분간 반응시킨 후 490 nm에서 흡광도를 측정한다 이때 대조액은 시험용액 대신 증류수를 사용하여 동일한 조작을 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 흡광도 측정 파장 490 nm에서 흡광도를 측정한다. 6.2 계산 총다당체 함량(mg/g) = C (a b)/s 1/1,000 C : 검량선으로부터 얻은 시료의 농도(μg/mL) a : 투석된 시험용액의 전량(mL) b : 희석배수 S : 시료 채취량(g) 1/1,000 : 단위 환산 계수 7. 시험 주의사항 1) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 248

252 Ⅲ 콘드로이친황산 Ⅲ 콘드로이친황산(제1법) 1. 시험방법의 원리 콘드로이친황산은 연골, 혈관 및 뼈를 비롯한 동물의 조직에 널리 분포하고 있는 점질성 다당류로서 황산기의 위치에 따라 크게 콘드로이친황산 A, 콘드로이친황산 B 및 콘드로이친황산 C의 세가지로 구분된다. 콘드로이친황산은 D-글루쿠론산과 N-아세틸-D-갈락토사민 β(1 3) 결합에 의해 이루어진 이당류를 단위로 하여 반복 되어지는 다당류이다. 이를 바탕으로 본 시험법은 콘드로이친황산의 기본 단위이자 hexuronic acid인 D- 글루쿠론산을 염료원료인 카바졸과 반응시켜 붉은색 화합물로 만든 후, 분광광도계 로 분석하는 방법이다. 이때 최대 흡수파장인 530nm에서 발색정도를 측정하여 정 량한다. 붉은 화합물로 합성 용해 Filtration 냉각 흡광도 측정 2. 안전 주의 사항 시험 중 붕산나트륨황산 시액의 조제 시 사용되는 붕산나트륨은 흡입시 타는 듯한 느낌, 기침, 인후염 등으로 숨쉬기가 곤란해질 수 있고, 신체접촉시 발진과 고통을 유발할 수 있으며 눈에 접촉시 발진, 고통, 화상 등을 일으킬 수 있으므로 취급 후 철저히 씻어야 하고, 적절한 환기 하에서 사용해야 합니다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 정량분석용여지(예, Advantec No. 5C) 비색관 부피플라스크(20mL 및 100mL) 항온수조 3.2 분석장비 분광광도계 3.3 분석장비의 준비 분광광도계는 측정 전에 켜서 충분히 안정화시킨다. 249

253 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 δ-글루쿠로노락톤(d-(+)-glucurono-6,3-lactone, Glucuronolactone) 분자식 : C 6 H 8 O 6, 분자량 : , CAS No. : 시액의 조제 카바졸시액 카바졸(Carbazol, C12H9N, 1급) g에 무수에탄올 100 ml를 가해 용해 한다(냉암소보관) 붕산나트륨황산시액 붕산나트륨(Sodium borate) 1 g에 정밀분석용 황산을 가해 200 ml로 한다. 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 δ-글루쿠로노락톤 0.04 g을 정밀히 취한다 위의 시료를 100 ml 부피플라스크에 넣고 증류수를 표선까지 채운다 이 액 1 ml를 정확히 취하여 20 ml 부피플라스크에 넣는다 증류수를 표선까지 채운다. 5.2 시험용액의 조제 시료 10 g을 수분이 흡수 1) 되지 않도록 빨리 분쇄 혼합한다 그 중 0.3 g을 정밀히 취하여 100 ml 부피플라스크에 넣는다 증류수를 표선까지 채운다 이 액 4 ml를 정확히 취하여 20 ml 부피플라스크에 넣는다 증류수를 표선까지 채우고, 정량분석용 여지로 여과한다 두개의 비색관에 붕산나트륨 5 ml씩 정밀히 달아 취한다 위의 비색관을 얼음물로 충분히 냉각시킨다 검액과 표준용액을 1 ml씩 취하여 시액(5.2.7) 위에 주의하여 가한다 주의하여 냉각하면서 혼합시킨다 약 100 의 수욕상에서 10분간 가열 후 즉시 얼음물로 냉각한다 각각에 카바졸시액 0.2 ml를 정확히 가하여 혼합한다. 250

254 수욕상에서 15분간 가열하고 얼음물로 실온까지 냉각한다 증류수 1 ml를 사용하여 동일하게 조작한 것을 대조액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 흡광도 측정 파장 530 nm에서 흡광도를 측정한다. 6.2 계산 콘드로이친황산 함량 = 글루쿠론산 글루쿠론산(mg/g) = 검액의 흡광도/표준물질의 흡광도 표준물질(mg)/시료 채취량(g) 1/ : 콘드로이친황산 분자량 / 글루쿠론산 분자량 : 글루쿠론산 분자량 / δ-글루쿠로노락톤의 분자량 7. 참고문헌 7.1 Yingxian Du, Atsushi Taga, Shigeo Suzuki, Wenying Liu and Susumu Honda : Effect of Structure Modification of Chondroitin sulfate C on its endantioselectivity to basic drugs in capillary electrophoresis, JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 947, Hitoshi Okamoto, Toshiaki Nakajima, Yuji Ito, Kenji Shimada and Susumu Yamato : Development of a Novel Analytical Method for Determination of Chondroitin sulfate Using an In-capillary Enzyme Reaction JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 1035, D. J. R. Laurence and J. M. Higginson : Detection and Estimation of Chondroitin Sulphate in Submicrogram Quantities as a Complex on Acrylamide Gel JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY 40, , Toyohide Takeuchi, Safni and Tomoo Miwa : Ion Chromatography of Anions on Stationary Phase Modified with Chondroitin sulfate JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 789, , Roger Carey Meyer and Lloyd T. Takahashi : Analysis of Cetylpyridinium chloride in the Polysaccharide, Chondroitin sulfate, wia High-Performance Liquid Chromatography, 280, , 시험 주의사항 1) 10 메쉬의 체를 통과 할 정도로 균질하게 처리 하여야 하나 수분이 많은 경우 그대로 분쇄는 어려우므로 건조하여야 하는데 건조시의 성분 변화를 최소화 하기 위하여 동결건조 하는 것이 좋다. 251

255 Ⅲ 콘드로이친황산(제2법) 1. 시험방법의 원리 콘드로이친황산은 연골, 혈관 및 뼈를 비롯한 동물의 조직에 널리 분포하고 있는 점질성 다당류로서 황산기의 위치에 따라 크게 콘드로이친황산 A, 콘드로이친황산 B 및 콘드로이친황산 C의 세가지로 구분된다. 콘드로이친황산은 D-글루쿠론산과 N-아세틸-D-갈락토사민 β(1 3) 결합에 의해 이루어진 이당류를 단위로 하여 반복 되어지는 다당류이다. 본 시험법의 표준물질인 콘드로이친황산 나트륨염은 백색 내지 유백색의 분말로 무미, 무취이며, 물에 잘 녹고, 에탄올에는 녹지 않는다. 황산기와 carboxyl기를 갖 는 강산성의 다당류로 이온교환성을 가져 여러 가지 금속과 염을 만들며, 5N HCl 용액으로 가수분해하면 황산을 잃고 콘드로이친이 된다. 본 시험법은 이러한 콘드로이친황산 나트륨염으로부터 콘드로이친을 추출한 후 size exclusion gel 칼럼을 통하여 분석하는 방법으로 최대 흡수파장인 210nm에서 검출하여 정량한다. 콘드로이친 추출 Filtration size exclusion gel 칼럼 액체크로마토그래피 2. 안전 주의 사항 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴(Acetonitrile)은 흡입이나 섭취시 구토, 구역질, 혈압변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의식불명 등의 증상 이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 부피플라스크(100 ml) 용매용 일회용 실린지 여과용 멤브레인 필터 액체크로마토그래프용 유리병 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 칼럼오븐 Size exclusion gel 칼럼안지름 8.0 mm, 길이 250 mm), Shodex KW801, 252

256 KW804 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상으로 아세토니트릴 : 10 mm 인산완충용액(pH 6.0) (2 : 98, v/v)을 한 후 용매를 분당 1.0 ml를 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 콘드로이친황산 나트륨염(chondroitin sulfate sodium salt) 분자식 : (C 14 H 21 NO 14 S)n, CAS No. : 일반시약 mm 인산완충액 (ph 6.0) 아세토니트릴(Acetonitrile) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 콘드로이친황산 나트륨 100 mg 정밀히 취하여 100 ml 부피플라스크에 넣는다 증류수를 표선까지 채운다(1.0 mg/ml) 이 용액을 증류수로 희석 1) 하여 각각의 농도로 만들어 0.45 μm 멤브레인 필 터로 여과한다. 5.2 시험용액의 조제 콘드로이친황산 100 mg에 해당하는 시료를 정밀히 취하여 100 ml 부피플라 스크에 넣는다 증류수를 표선까지 채운다 충분히 혼합하여 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예) 253

257 항목 조건 주입량 20 μl 칼럼 온도 30 이동상 아세토니트릴 : 10 mm 인산완충액(pH 6.0) (2 : 98, v/v) 검출기 파장 210 nm 유속 1.0 ml/분 6.2. 분석 크로마토그램 표준물질 크로마토그램 시료 크로마토그램 254

258 6.3 계산 콘드로이친황산 나트륨 함량(mg/g) = C (a b)/s 1/1,000 C : 시험용액 중 콘드로이친황산 나트륨 농도(μg/mL) a : 시험용액의 전량(mL) b : 희석배수 S : 시료 채취량(g) 1/1,000 : 단위 환산 계수 7. 참고문헌 7.1 Yingxian Du, Atsushi Taga, Shigeo Suzuki, Wenying Liu and Susumu Honda : Effect of Structure Modification of Chondroitin sulfate C on its endantioselectivity to basic drugs in capillary electrophoresis, JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 947, Hitoshi Okamoto, Toshiaki Nakajima, Yuji Ito, Kenji Shimada and Susumu Yamato : Development of a Novel Analytical Method for Determination of Chondroitin sulfate Using an In-capillary Enzyme Reaction JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 1035, D. J. R. Laurence and J. M. Higginson : Detection and Estimation of Chondroitin Sulphate in Submicrogram Quantities as a Complex on Acrylamide Gel JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY 40, , Toyohide Takeuchi, Safni and Tomoo Miwa : Ion Chromatography of Anions on Stationary Phase Modified with Chondroitin sulfate JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 789, , Roger Carey Meyer and Lloyd T. Takahashi : Analysis of Cetylpyridinium chloride in the Polysaccharide, Chondroitin sulfate, wia High-Performance Liquid Chromatography, 280, , 시험 주의사항 1) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 255

259 Ⅲ 콘드로이친황산(제3법) 1. 시험방법의 원리 콘드로이친황산은 연골, 혈관 및 뼈를 비롯한 동물의 조직에 널리 분포하고 있는 점질성 다당류로서 황산기의 위치에 따라 크게 콘드로이친황산 A, 콘드로이친황산 B 및 콘드로이친황산 C의 세가지로 구분된다. 콘드로이친황산은 D-글루쿠론산과 N-아세틸-D-갈락토사민 β(1 3) 결합에 의해 이루어진 이당류를 단위로 하여 반복 되어지는 다당류이다. 이러한 이당류 단위는 황산기가 존재하는 위치에 따라 Di-6S, Di-4S 및 Di-2,6diS 등으로 나눌 수 있으며 황산기가 없는 Di-0S도 있다. 일반적으로 육상동물 유래 콘드로이틴황산의 경우는 대부분 Di-0S, Di-6S 및 Di-4S로 이루어져 있으며, 어류의 연골에서 유래한 콘드로이친황산은 Di-2,6diS도 존재한다. 이러한 원리를 바탕으로, 본 시험법은 시료로부터 추출한 콘드로이친황산을 콘드 로이티나아제 ABC를 이용하여 특이적으로 분해시켜 얻은 3가지 이당류(Di-0S, Di-6S 와 Di-4S)를 액체크로마토그래프를 사용하여 분석하는 방법이다. 음이온을 가 진 이들 분해 산물을 음이온 교환수지 칼럼을 이용하여 232nm에서 정량한다. 콘드로이친황산 분해 가열 Filtration 초음파 추출 환류 냉각 음이온교환수지 칼럼 액체크로마토그래피 2. 안전 주의 사항 시험 중 사용되는 메탄올(Methanol)은 인체 내에 흡수 시, 간에서 포름알데하이드 라는 물질로 변환되어 인체에 치명적이고, 두통 현기증 구토 복통 설사 등의 증상이 나타나며 심할 때는 혼수상태가 되어 사망한다. 그러므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 환류냉각기 용매용 일회용 실린지 여과용 멤브레인 필터 부피플라스크(1 L) 액체크로마토그래프용 유리병 256

260 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 칼럼오븐 음이온교환수지칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 : 강염기성 암 모늄 음이온교환수지로 코팅된 실리카겔), Hypercil-SAX 칼럼 또는 이와 동 등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상인 증류수(pH 3.5)를 분당 1.0 ml로 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨 다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 콘드로이친황산 나트륨염(Chondroitin sulfate sodium salt) 분자식 : (C 14 H 21 NO 14 S)n, CAS No. : 일반시약 콘드로이티나아제 ABC(Chondroitinase ABC) 메탄올(Methanol) 트리스염(Tris base) 아세트산나트륨(Sodium acetate) 염화나트륨(Sodium chloride) 4.3 시액의 조제 mm Tris 완충용액 트리스염 6.06 g과 아세트산나트륨 4.92 g을 각각 취하여 900 ml 증류수에 녹인 후 ph 8.0으로 조절한 후 1 L로 한다. 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 콘드로이친황산 나트륨염을 0.5~1 mg/ml가 되도록 증류수로 희석한다 위의 용액 50 μl에 0.001unit/μL 콘드로이티나아제 ABC 50 μl와 50 mm Tris-buffer(pH 8.0) 400 μl를 넣는다 위의 용액을 37 에서 1시간 30분 1) 간 반응 시킨다. 257

261 5.1.4 위의 용액을 100 에서 5분간 가열한다 μm멤브레인 필터를 통과하여 표준용액으로 사용한다. 5.2 시험용액의 조제 콘드로이친황산 50 mg에 해당하는 시료를 정밀히 취한다 증류수 50 ml을 가하여 60 에서 1시간동안 초음파 추출한다 위의 용액을 100 에서 1시간 환류 냉각한다 위의 용액을 0.45 μm멤브레인 필터로 여과한다 위의 용액 50 μl를 취한 후, 표준용액의 [5.1.2]이하의 과정을 동일하게 행한 다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항목 주입량 조건 10 μl 칼럼 온도 30 이동상 검출기 파장 유속 A : 증류수(pH 3.5), B : 1 M 염화나트륨용액(pH 3.5) 232 nm 1.0 ml/분 표2. 이동상 조건(예) 시간(분) A (%) B(%)

262 6.2 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 콘드로이친황산 나트륨 함량(mg/g) = C (a b)/s 1/1,000 C : 시험용액 중 콘드로이친황산 나트륨 농도(μg/mL) a : 시험용액의 전량(mL) b : 희석배수 S : 시료 채취량(g) 1/1,000 : 단위 환산 계수 7. 참고문헌 7.1 Yingxian Du, Atsushi Taga, Shigeo Suzuki, Wenying Liu and Susumu Honda : Effect of Structure Modification of Chondroitin sulfate C on its endantioselectivity to basic drugs in capillary electrophoresis, JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 947, Hitoshi Okamoto, Toshiaki Nakajima, Yuji Ito, Kenji Shimada and Susumu Yamato : Development of a Novel Analytical Method for Determination of Chondroitin sulfate Using an In-capillary Enzyme Reaction JOURNAL OF 259

263 CHROMATOGRAPHY A, 1035, D. J. R. Laurence and J. M. Higginson : Detection and Estimation of Chondroitin Sulphate in Submicrogram Quantities as a Complex on Acrylamide Gel JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY 40, , Toyohide Takeuchi, Safni and Tomoo Miwa : Ion Chromatography of Anions on Stationary Phase Modified with Chondroitin sulfate JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 789, , Roger Carey Meyer and Lloyd T. Takahashi : Analysis of Cetylpyridinium chloride in the Polysaccharide, Chondroitin sulfate, wia High-Performance Liquid Chromatography, 280, , 시험 주의사항 1) 모든 가열 반응은 반응시키는 수욕조나 가열기를 목적하는 온도로 미리 맞추 어 두어 목적온도에서의 시간을 정확히 유지토록 한다. 260

264 Ⅲ 키토산(총글루코사민으로서) 1. 시험방법의 원리 키토산의 주요 용도는 주로 응집제, 중금속 흡착제, 염료폐수 정화제 등의 폐수처 리 분야와 토양개량제, 상충제, 식물항바이러스제, 농약 등의 농업분야에서 많이 이 용되어 왔으나, 키토산의 장점과 다양한 특성이 밝혀지면서 그 용도는 식품과 음료, 보건위생, 화장품, 섬유관련, 의약품 응용분야 등으로 더욱 확대되고 고급화되어 가 고 있다. 그리고 최근 노화나 과잉운동에 의해 연골관절액에 포함된 글루코사민이 결핍되어 일어나는 변형성 관절염의 근본적인 치료에 효과가 있다는 임상실험 결과 가 발표되어 주목받고 있는 것이 고분자 키토산을 구성하는 모노머인 D-글루코사민 이다. 글루코사민은 고분자의 불용성의 키토산을 적당한 농도의 염산으로 가수분해 하여 제조한다. 본 시험법은 키토산의 이러한 특성을 바탕으로, 키틴에 산을 첨가하여 키토산을 구성하는 단당류인 글루코사민으로 분해한 후 글루코사민과 발색제인 p-디메틸아미 노벤즈알데히드(p-dimethylaminobenzaldehyde)를 반응시켜 분광광도계를 이용하여 분석하는 방법으로, 530 nm에서 발색 정도를 측정하여 정량한다. 글루코사민 분해/반응 탈기 밀봉 감압 농축 냉각 분광광도계 2. 안전 주의 사항 시험 중 키토산을 가수분해 하는데 사용되는 염산(Hydrochloric acid)은 인체에 대 하여 유독성이 강하며, 눈에 묻으면 염증을 일으키고 많은 양을 흡입하면 폐수종을 일으켜 사망할 뿐만 아니라, 호흡을 하면 코나 목의 점막에 염증을 일으킨다. 희석 된 염산은 대개 해가 적다고 하지만 장기간, 염산의 증기 등에 접하면 치아가 부식 되고 위험성도 따를 수 있다. 따라서 염산용기는 기밀용기를 사용하여 야외에 두는 것이 좋으며, 직사광선, 발열원의 접근을 피하고 산화제 특히 질산, 염소산염, 식량, 가연물, 기타 시안화물, 황화물 등으로부터 거리를 멀리하여 저장함으로써 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 시험관 감압농축기 261

265 3.1.3 부피플라스크(10 ml 및 100 ml) 건조기(dry oven) ph 측정기 원심분리기 3.2 분석장비 분광광도계 3.3 분석장비의 준비 분광광도계는 사용 전 충분히 안정화시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 D-글루코사민 염산염(D-glucosamine hydrochloride) 분자식 : C 6 H 13 NO 5 HCl, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 염산(Hydrochloric acid) 에탄올(Ethanol) 아세틸아세톤(Acetyl acetone) p-디메틸아미노벤즈알데히드(p-dimethylaminobenzaldehyde) 4.3 시액의 조제 아세틸아세톤 시액 증류 정제한 무색 아세틸아세톤 1.5 ml에 1.2 N 탄산나트륨용액을 가하여 50 ml로 한다 p-디메틸아미노벤즈알데히드 시액 p-디메틸아미노벤즈알데히드 1.6 g에 염산 30 ml를 가하여 녹이고, 96%(v/v) 에탄올 30 ml를 가하여 혼합한다. 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 D-글루코사민염산염 50 mg을 정밀히 취하여 100 ml 부피플라스크에 넣는다 증류수를 표선까지 채운 다음 10 ml를 취한다(500 μg/ml) 이액에 염산 7 ml 및 증류수를 가하여 20 ml로 한다. 262

266 5.1.4 이액 5 ml를 시험관에 취한다 탈기 밀봉하여 105, 24시간 1) 분해한다(121 5시간, 130 3시간 또는 분으로 조절 가능) 뚜껑을 열어 감압 농축기를 이용하여 염산 및 증류수를 제거한다 잔류물에 증류수 5 ml를 가하여 녹인다. 단, 불용물이 있으면 여과한다 여액 1 ml를 마개 있는 시험관에 취하고 아세틸아세톤 시액 2 ml를 가하여 혼합한다 에서 1시간 가열한 후 흐르는 물에서 냉각시킨다 이에 96%(v/v) 에탄올 20 ml를 가하고 p-디메틸아미노벤즈알데히드 시 액 2 ml를 가하여 혼합하고 실온에서 2시간 방치한다. 5.2 시험용액의 조제 시료 0.04 g(글루코사민으로)을 정밀히 취하여 100 ml 부피플라스크에 넣 는다. 필요한 경우 탈지하고 산성에서 시료를 모두 녹인 후 증류수를 가하 여 100 ml로 하여 검액으로 한다. 단 원료를 이용하여 시험용액 조제 시 최대한 시료를 잘게 갈아서 사용한다 표준용액 [5.1.2]이하의 과정을 수행한다. 6. 분석 및 계산 6.1 흡광도 측정 공시험 용액을 대조액으로 하여 530nm에서 측정한다. 6.2 계산 총글루코사민(mg/g) = 표준용액의 농도(글루코사민으로서, μg/10 ml) Ca/Ct 10/S 1/1,000 Ca : 시료의 흡광도 Ct : 표준용액의 흡광도 S : 시료 채취량(g) 1/1,000 : 단위 환산 계수 7. 참고문헌 7.1 Yun Wang, Mingliang Guo and Yongming Jiang : Evaluation of n-valeraldehyde modified chitosan as a matrix for hydrophobic interaction chromatography JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 952, 79-83, Arnold C. M. WU and Wayne A. Bough : Determination of Molecular-Weight Distribution of Chitosan by High-Performance Liquid Chromatography JOURNAL of CHROMATOGRAPHY, 128, 87-99, L. Lepri, P.G. Desideri and G. Tanturli : Chromatographic Behaviour of Inorganic Ions on Chitosan Thin Layers and Columns JOURNAL OF 263

267 CHROMATOGRAPHY, 147, , 시험 주의사항 1) 모든 가열 반응은 반응시키는 수욕조나 가열기를 목적하는 온도로 미리 맞추 어 두어 목적온도에서의 시간을 정확히 유지토록 한다. 264

268 Ⅲ 키토올리고당 1. 시험방법의 원리 키토산은 갑각류(게, 새우 등)의 껍질, 연체류(오징어, 갑오징어 등)의 뼈를 분쇄, 탈단백, 탈염화한 키틴을 탈아세틸화하여 얻어지며, 이 키토산을 효소처리하여 당의 수가 2-10개인 것을 얻어낸 것이 키토올리고당이다. 건강기능식품 기능성원료로서의 키토산은 탈아세틸화도(당 사슬 중의 글루코사민 잔기비율)가 80% 이상, 즉 글루코사민을 80% 이상 함유하고 있어야 하며, 키토올리 고당을 20% 이상 함유하고 있어야 한다. 이러한 특징을 바탕으로, 본 시험법은 Ⅲ 분광광도계를 이용한 총글루코사민 정량법에 의해 총글루코사민 함량을 구한 후, Ⅲ.3.4.1에 따라 유리 D-글루코사민의 함량을 구하여 그 차로서 키토올리고당 함량을 정량한다. 2. 안전 주의 사항 시험법 Ⅲ.3.4.1의 D-글루코사민 함량 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴 (Acetonitrile)은 흡입이나 섭취시 구토, 구역질, 혈압변화, 불규칙적인 심장박동, 두 통, 호흡곤란, 경련, 의식불명 등의 증상이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시 설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 시험법 Ⅲ.3.4.7의 총글루코사민 정량 시험 중 키토산을 가수분해 하는데 사용되는 염산(Hydrochloric acid)은 인체에 대하여 유독성이 강하며, 눈에 묻으면 염증을 일 으키고 많은 양을 흡입하면 폐수종을 일으켜 사망할 뿐만 아니라, 호흡을 하면 코 나 목의 점막에 염증을 일으킨다. 희석된 염산은 대개 해가 적다고 하지만 장기간, 염산의 증기 등에 접하면 치아가 부식되고 위험성도 따를 수 있다. 따라서 염산용 기는 기밀용기를 사용하여 야외에 두는 것이 좋으며, 직사광선, 발열원의 접근을 피 하고 산화제 특히 질산, 염소산염, 식량, 가연물, 기타 시안화물, 황화물 등으로부터 거리를 멀리하여 저장함으로써 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 분석 및 계산 3.1 계산 키토올리고당 = 총글루코사민 함량-유리 D-글루코사민 함량 4. 참고문헌 4.1 J. Karkkainen, A. Lehtonen, T. Nikkari : Determination of glucosamine and galacosamine by gas chromatography, Journal of Chromatography 20, , Yun Wang, Mingliang Guo and Yongming Jiang : Evaluation of n-valeraldehyde modified chitosan as a matrix for hydrophobic interaction 265

269 chromatography JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 952, 79-83, Arnold C. M. WU and Wayne A. Bough : Determination of Molecular-Weight Distribution of Chitosan by High-Performance Liquid Chromatography JOURNAL of CHROMATOGRAPHY, 128, 87-99, L. Lepri, P.G. Desideri and G. Tanturli : Chromatographic Behaviour of Inorganic Ions on Chitosan Thin Layers and Columns JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY, 147, ,

270 Ⅲ 프락토올리고당 Ⅲ 프락토올리고당(제1법) 1. 시험방법의 원리 프락토올리고당(fructooligosaccharides)은 설탕의 과당 잔기에 과당 1-3분자가 β-(2 1)-glycoside 결합으로 결합되어 각각 1-ketose(GF 2 ), nystose(gf 3 ) 그리고 1 F -fructofuranosylnystose(gf 4 )로 명명된 올리고당으로 바나나, 벌꿀, 양파, 아스파라 거스, 우엉 등에 소량씩 함유되어 있는 천연의 당질이다. 프락토올리고당은 섭취 시 사람의 소화 효소로 분해되지 않는 비소화성 당류로 대 장에서 유익한 세균인 bifidobacteria를 선택적으로 증식시킬 수 있는 prebiotics의 한 종류로 식품 및 사료의 첨가물로 널리 사용되고 있다. 본 시험법은 증류수를 이용하여 시료로부터 프락토올리고당, 즉 1-ketose, nystose 및 1 F -fructofuranosylnystose를 추출하고 아민칼럼을 사용하여 프락토올리고당을 분리하는 방법으로 시차굴절계 검출기를 사용하여 고속 액체크로마토그래프를 이용하여 정량한 다. 프락토올리고당 추출 용해/추출 중화/가열/초음파처리 Filtration 아민칼럼 시차굴절계 고속 액체크로마토그라프 2. 안전 주의 사항 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴(Acetonitrile)은 흡입이나 섭취시 구토, 구역질, 혈압변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의식불명 등의 증상 이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 부피플라스크(100 ml, 20 ml 및 10 ml) 여과지(No.5B) 용매용 일회용 실린지 액체크로마토그래프용 유리병 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 267

271 3.2.2 시차굴절계 칼럼오븐 아민칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상은 70% 아세토니트릴을 이용하여 용매를 분당 1.0 ml를 충분한 시 간동안 흘려 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 케스토즈(1-kestose) 분자식 : C 18 H 32 O 16, 분자량 : , CAS No. : 니스토즈(nystose) 분자량 : C 24 H 42 O 21, 분자식 : , CAS No. : F-프락토퓨라노실니스토즈(1F-fructofuranosylnystose) 분자량 : C 30 H 52 O 26, 분자식 : , CAS No. : 일반시약 에탄올(Ethanol) 아세토니트릴(Acetonitrile) 4.3 시액의 조제 내부표준용액 글리세롤 혹은 아라비노즈를 5 g 달아 100 ml 용량플라스크에 넣고 에탄 올 50 ml를 넣어 용해시킨 후, 증류수를 표선까지 채운다. 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 케스토즈, 니스토즈, 1-F 프락토퓨라노실니스토즈를 0.4 g씩 달아 각각 20 ml의 부피플라스크에 넣는다 ml의 증류수를 넣고 완전히 용해시킨 후, 증류수를 넣어 표선까지 채운다 표준원액을 1, 2, 3, 4 및 5 ml를 정확히 취하여 각각 10 ml 부피플라스 크에 옮겨 넣는다 이에 내부표준용액 1) 1 ml를 넣은 뒤 증류수를 표선까지 채운다. 5.2 시험용액의 조제 프락토올리고당으로서 0.2~2 g이 함유되도록 시료를 정확히 달아 100 ml 부피플라스크에 넣는다 증류수 20 ml를 가하여 용해 또는 추출한다(산성인 채로 실험을 진행할 경 268

272 우 가수분해의 우려가 있으므로 필요하면 중화하고, 가열하며 혼합 또는 초음파 처리한다) 완전히 용해된 후 내부표준용액 20 ml를 넣고, 표선까지 증류수를 채운다 여과지 No.5B 또는 10,000 Da cut off 원심분리필터를 이용하여 여과한다 여과액과 동량의 에탄올을 첨가하여 희석한다. 단, 침전 또는 탁한 것이 생 겼을 경우 여과하고 여과액을 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항목 조건 주입량 20 μl 칼럼 온도 40 이동상 70% 아세토니트릴 유속 1.0 ml/분 6.2. 분석 크로마토그램 표준물질 크로마토그램 269

273 6.2.2 시료 크로마토그램 6.3 계산 개별 프락토올리고당(mg/g) = C (a b)/s C : 시험용액 중 개별 프락토올리고당의 농도(mg/mL) a : 시험용액의 전량(mL) b : 희석배수 S : 시료 채취량(g) 프락토올리고당 함량(mg/g) 프락토올리고당 함량(mg/g) = GF2(mg/g) + GF3(mg/g) + GF4(mg/g) 7. 참고문헌 7.1. Katarina Reiffova and Radomira Nemcova : Thin-layer chromatography analysis of fructooligosaccharides in biological samples JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 1110, , 시험 주의사항 1) 크로마토그램에서 내부표준물질 피크와 중첩되는 방해 피크가 존재 할 경우 내부표준물질을 가하지 않은 시험용액을 만들어서 적당한 피크를 기준으로 하 여 두 가지 시험용액을 비교하여 내부 표준물질 피크의 면적을 보정하여야 한 다. 270

274 Ⅲ 프락토올리고당(제2법) 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 증류수를 이용하여 시료로부터 프락토올리고당, 즉 1-ketose, nystose 및 1 F -fructofuranosylnystose를 추출한 후 액체크로마토그래피를 이용하여 분석하는 방 법으로 증기화광산란검출기를 이용하여 정량한다. 프락토올리고당 추출 증기화광산란검출 용해 / 추출 액체크로마토그래피 중화 / 가열 / 초음파처리 Filtration 2. 안전 주의 사항 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴(Acetonitrile)은 흡입이나 섭취시 구토, 구역질, 혈압변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의식불명 등의 증상 이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 용량플라스크(100 ml, 20 ml 및 10 ml) 여과지(No.5B) 용매용 일회용 실린지 액체크로마토그래프용 유리병 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 증기화광산란검출기(Evaporative Light Scattering Detectors, ELSD) 칼럼오븐 아민칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상은 70% 아세토니트릴을 이용하여 용매를 분당 1.0 ml를 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 케스토즈(1-kestose) 271

275 분자식 : C 18 H 32 O 16, 분자량 : , CAS No. : 니스토즈(nystose) 분자량 : C 24 H 42 O 21, 분자식 : , CAS No. : F-프락토퓨라노실니스토즈(1F-fructofuranosylnystose) 분자량 : C 30 H 52 O 26, 분자식 : , CAS No. : 일반시약 에탄올(Ethanol) 아세토니트릴(Acetonitrile) 4.3 시액의 조제 내부표준용액 글리세롤 혹은 아라비노즈를 5 g 달아 100 ml 용량플라스크에 넣고 에탄 올 50 ml를 넣어 용해시킨 후, 증류수를 표선까지 채운다. 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 케스토즈, 니스토즈, 1-F 프락토퓨라노실니스토즈를 0.4 g씩 달아 각각 20 ml의 용량플라스크에 넣는다 ml의 증류수를 넣고 완전히 용해시킨 후, 증류수를 표선까지 채운다 표준원액을 1, 2, 3, 4 및 5 ml를 정확히 취하여 각각 10 ml 용량플라스 크에 옮겨 넣는다 이에 내부표준용액 1) 1 ml를 넣은 뒤 증류수로 표선까지 채운다. 5.2 시험용액의 조제 프락토올리고당으로서 0.2~2 g이 함유되도록 검체를 정확히 달아 100 ml 용량플라스크에 넣는다 증류수 20 ml를 가하여 용해 또는 추출한다(산성인 채로 실험을 진행할 경우 가수분해의 우려가 있으므로 필요하면 중화하고, 가열하며 혼합 또 는 초음파 처리한다) 완전히 용해된 후 내부표준용액 20 ml를 넣고, 증류수를 표선까지 채운 다 여과지 No.5B 또는 10,000 Da cut off 원심분리필터를 이용하여 여과한다 여과액과 동량의 에탄올을 첨가하여 희석한다. 단, 침전 또는 탁한 것이 생 겼을 경우 여과하고 여과액을 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예) 272

276 항목 주입량 조건 10 μl 칼럼온도 40 Nebulization Temp. 70% Pressure (N 2 gas) 40psi Drift tube Temp. 85 이동상 유속 70% Acetonitrile 1.0 ml/min 6.2 계산 개별 프락토올리고당(mg/g) = C (a b)/s C : 시험용액 중 개별 프락토올리고당의 농도(mg/mL) a : 시험용액의 전량(mL) b : 희석배수 S : 검체량(g) 프락토올리고당 함량(mg/g) = GF2(mg/g) + GF3(mg/g) + GF4(mg/g) 7. 참고문헌 7.1 Katarina Reiffova and Radomira Nemcova : Thin-layer chromatography analysis of fructooligosaccharides in biological samples JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 1110, , 시험 주의사항 1) 크로마토그램에서 내부표준물질 피크와 중첩되는 방해 피크가 존재 할 경우 내부표준물질을 가하지 않은 시험용액을 만들어서 적당한 피크를 기준으로 하 여 두 가지 시험용액을 비교하여 내부 표준물질 피크의 면적을 보정하여야 한 다. 273

277 Ⅲ.3.5 지방산 및 지질류 Ⅲ 지방산 Ⅲ 지방산(제1법) 1. 시험방법의 원리 지방산은 그 자신으로는 분광적 흡수도 없을 뿐만 아니라, 적당한 정색 시약도 없 기 때문에 액체 크로마토그래피에는 적합하지 않다. 대신에 분자 중에 탄소원자가 많으므로 가스 크로마토그래피의 검출감도가 높다. 지방산은 그 자체로도 휘발성이 있으므로 그대로도 가스 크로마토그래피의 시료로 사용이 가능하지만, 일반적으로 휘발성이 보다 강한 유도체를 형성하기 위해 메틸에스테르화(methylester) 한다. 지방질을 구성하는 지방산 조성 및 지방산의 양을 정량하는 일반적인 방법은 식품 으로부터 전 지방질을 유기용매로 추출하여 그 지방질의 무게를 달아 내부 표준물 질을 첨가하고 검화 후, 지방산을 메틸 에스테르화 한 뒤, 기체 크로마토그래피로 분석한다. 이 때, 시료에서 지방을 추출하고 검화시켰을 때, 검화되지 않는 물질을 제거한 다음 유리 지방산으로 하고 메틸에스테르화시키는 경우와, 지질을 직접 메 틸에스테르화 하는 경우가 있다. 본 시험법에서는 검화과정에 0.5N 메탄올성수산화나타륨을 이용하여 지방산을 유 리시키는 조작을 하고, 14% 트리플루오르보란메탄올을 이용하여 ester교환반응에 의한 메틸에스테르화시켜 분석하는 방법으로 내부표준물질의 면적과 비교하여 정량 한다. 메틸에스테르화 환류냉각 / 가열 탈수 내부표준물질 면적비교 FID 검출기 가스크로마토그래피 2. 안전 주의 사항 시험 중 사용되는 수산화나트륨은 부식성이 강하여 피부에 접촉되어 화상, 눈 손 상, 실명될 수 있고 섭취 시 설사, 위통, 혼수 및 폐 손상을 야기 할 수 있으므로 피부에 접촉하지 않도록 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 균질기 환류냉각기 274

278 3.1.3 수욕조 환저플라스크(100 ml) 3.2 분석장비 가스크로마토그래프 불꽃이온화검출기(Flame Ionization Detector) 칼럼오븐 % dimethylpolysiloxane (길이 50 m, 안지름 0.32 mm, 필름두께 0.5 μ m) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 분 석 시 작 전 에 주 입 부 및 검 출 기 온 도, 유 량, 칼 럼 온 도 를 분 석 조 건 에 맞게 조작하고, 가스크로마토그래프를 충분히 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 각종 지방산 4.2 내부표준물질 C 11:0 triundecanoin 4.3 일반시약 트리플루오르보란(Boron trifluoride) 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 헵탄(Heptane, GC 급) 또는 이소옥탄(Isooctane, GC 급) 염화나트륨 포화용액 무수황산나트륨(Sodium sulfate anhydrous) 메탄올(Methanol) 4.4 시액의 조제 % 트리플루오르보란메탄올용액 : 125 g BF 3 를 1 L의 메탄올에 녹인다 N 메탄올성수산화나트륨용액(0.5N Sodium hydroxide/meoh) 수산화나트륨 2 g을 메탄올 100 ml에 녹인다 C 11:0 triundecanoin용액 1) 10 mg을 이소옥탄에 녹여 10 ml가 되게 한다(1 mg/ml) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 지방산 표준물질 약 100 mg을 100 ml 환저플라스크에 정밀히 취한다 N 메탄올성수산화나트륨용액 4 ml를 가한다 플라스크 위에 환류냉각기를 설치하고 5~10분간 수욕상에서 균질한 용 액이 얻어질 때까지 가열 2) 한다 그 후 14% BF 3 용액 5 ml를 환류냉각기를 통해 가하고 2분 동안 계속 가열 275

279 한다 마지막으로 헵탄 5 ml을 냉각기를 통해 가하고 1분간 더 가열한다 욕조와 냉각기를 제거하고 염화나트륨 포화용액을 가하여 플라스크를 휘 저은 후 염화나트륨 포화용액을 더 가하여 플라스크 목 부분까지 올라오게 한다 상층에서 약 1 ml의 헵탄을 취한 후 소량의 무수황산나트륨을 가하여 탈 수시킨 것을 표준용액으로 한다. 공액리놀레산의 경우 70~80 에서 가열한다 5.2 시험용액의 조제 지방 및 유지 시료를 환저플라스크에 정밀히 취하고 0.5 N 메탄올성 수산화나트 륨용액을 가한다 [5.1.3]이하의 과정을 동일하게 수행한다 지방산 시료를 환저플라스크에 정밀히 취한다 [5.1.4]이하의 과정을 동일하게 수행한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 3) 표 1. 가스크로마토그래프 조건(예) 항목 조건 주입부 온도 250 칼럼 온도 180 (1분)-10 /분-230 (1분) 검출기 온도 250 캐리어 가스 및 유량 질소, 3.0 ml/분 Split ratio 10 : 1 탄소수가 12이하인 경우에는 칼럼온도가 더 낮아야 하며, 탄소수가 20이상인 경우에는 주입부, 칼럼, 검출기의 온도가 높아야 한다. 다양한 탄소수의 지방산을 한번에 분석 할 경우에는 칼럼온도의 승온조건 조작이 필요하다. 6.2 계산 지방산 함량(mg/g) = STc (SAfa/STfa) (STis/SAis) (V/S) (1/1,000) STc : 표준물질용액의 농도(μg/mL) SAfa : 시험용액내 표준물질의 피크면적 STfa : 표준물질의 피크면적 STis : 표준물질용액내 내부표준물질 4) 피크면적 276

280 SAis : 시험용액내 내부표준물질 피크면적 V : 최종희석용액(mL) S : 시료 채취량(g) 1/1,000 : 단위 환산 계수 7. 참고문헌 7.1 R. Mateo Castro, M.T. Domenech Carbo, V. Peris Martinez, J.V. Gimeno Adelantado and F. Bosch Reig : Study of Binding Media in Works of Art by Gas Chromatographic Analysis of Amino Acids and Fatty Acids Derivatized with Ethyl Chloroformate. JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 778, , Svein A. Mjos : Identification of Fatty Acids in Gas Chromatography by Application of Different Temperature and Pressure Programs on a Single Capillary Column, JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 1015, , Sonnich Meier, Svein A. Mjos, Horaldur Joensen and Otto Grahl-Nielsen : Validation of A One-step Extraction/Methylation Method for Determination of Fatty Acids and Cholesterol in Marine Tissues. JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 1104, , V. Zuriguel, E. Causse, J.D. Bounery, G. Nouadje, N. Simeon, M. Nertz, R. Salvayre and F. Couderc : Short Chain Fatty Acids Anaylsis by Capillary Electrophoresis and Indirect UV detection or Laser-induced Fluorescence. JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 781, , 시험 주의사항 1) 내부 표준용액은 시료를 취하고 검화하기 전 일정량을 첨가한다. 2) 검화시 목적하는 온도가 되었을 때부터 정확히 시간을 지켜야 한다. 3) 케피너리 칼럼의 경우 칼럼 부하량이 작으므로 지방산 메틸에스테르의 농도가 1 4mg 정도로 작은량이 되도록 조절이 필요하다. 4) 크로마토그램에서 내부표준물질 피크와 중첩되는 방해 피크가 존재 할 경우 내부표준물질을 가하지 않은 시험용액을 만들어서 적당한 피크를 기준으로 하 여 두 가지 시험용액을 비교하여 내부 표준물질 피크의 면적을 보정하여야 한 다. 277

281 Ⅲ 지방산(제2법) 1. 시험방법의 원리 본 시험법에서는 검화과정에 0.5N 메탄올성수산화나타륨을 이용하여 지방산을 유 리시키는 조작을 하고, 14% 트리플루오르보란메탄올을 이용하여 ester교환반응에 의한 메틸에스테르화한 후 생성된 지방산에스테르를 헵탄 또는 이소옥탄 용액으로 추출하여 모세관 컬럼을 통하여 지방산을 분리하는 방법으로 불꽃이온화검출기를 이용하여 검출 정량한다. 메틸에스테르화 질소 충진 가온 / 가열 진탕 내부표준물질 반응면적비교 FID 검출기 가스크로마토그래피 2. 안전 주의 사항 실험 전처리에 사용되는 이소옥탄(Isooctane)은 흡입시 호흡곤란, 두통, 현기증 등 이 유발되고 장기간 흡입시에는 신경계통 이상이 올 수도 있다. 또한 섭취시에는 호흡곤란, 두통, 현기증, 폐 울혈 증상이 일어날 수 있으니 환기가 잘되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 유리튜브 균질기 질소 충진기 환류냉각기 가열기(heating block) 3.2 분석장비 가스크로마토그래프 불꽃이온화검출기(Flame Ionization Detector) 칼럼오븐 % dimethylpolysiloxane (길이 50 m, 안지름 0.32 mm, 필름두께 0.5 μ m) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 분석시작 전에 주입부 및 검출기 온도, 유량, 칼럼 온도를 분석조건에 맞게 조 작하고, 가스크로마토그래프를 충분히 안정화 시킨다. 278

282 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 : 각 지방산 methyl ester 표준품 4.2 내부표준물질 : C 11:0 Undecanoic acid methyl ester 4.3 시약 트리플루오르보란(Boron trifluoride) 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 헵탄(Heptane, GC 급) 또는 이소옥탄(Isooctane, GC 급) 염화나트륨 포화용액 무수황산나트륨(Sodium sulfate anhydrous) 메탄올(Methanol) 4.4 시액조제 % BF3 -MeOH 용액 : BF3 125g을 MeOH 1L에 녹인다 N Alcohollic sodium hydroxide : NaOH 2.0g을 Me-OH 100mL에 녹 인다 Internal standard 용액 : 1,000μg/mL이 되게 Undecanoic acid methyl ester 0.01g을 Isooctane 10mL 에 녹인다 포화 sodium chrolide 용액 ; NaCl 36g 을 물 100mL 에 녹인다. 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 지방산 표준물질을 헵탄에 녹여 1,000 μg/ml가 되게 한다 [4.4.4]용액과 1 : 1로 혼합하여 표준용액으로 사용한다(500 μg/ml). 5.2 시험용액의 조제 시료 25 mg을 유리튜브에 정밀히 취하고, 3.4.3용액을 1 ml 첨가한다 이어 0.5N 메탄올성 수산화나트륨 1.5 ml를 가하고 질소 충진하고 즉시 뚜껑을 덮고 혼합한다 이어 100 heating block에서 5분간 가온한다 이를 냉각한 후 14% 트리플루오르보란메탄올용액 2 ml을 가하고 다 질소 를 충진한 후 뚜껑을 덮고 혼합하고 100 에서 30분간 가열 1) 한다 이어 30~40 로 냉각하여 이소옥탄 1 ml을 가하여 질소 충진 후 30초간 격렬히 진탕한다 즉시 염화나트륨용액 5 ml을 가하고 질소 충진 후 뚜껑을 덮고 진탕한 다 상온으로 냉각한 후 수층으로부터 분리된 이소옥탄층을 새 유리튜브에 넣 고 질소를 불어넣은 후 즉시 뚜껑을 덮는다 수층에 이소옥탄 1 ml를 추가로 넣고 추출한 후 이소옥탄층을 [5.2.7] 과 합한다. 279

283 5.2.9 이 액을 무수황산나트륨으로 탈수하고 질소를 충진한 후 분 석전까지 밀봉 한다. 공액리놀레산의 경우 70~80 에서 가열한다 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 2) 표 1. 가스크로마토그래프 조건(예) 항목 조건 주입부 온도 250 칼럼 온도 180 (1분)-10 /분-230 (1분) 검출기 온도 250 캐리어 가스 및 유량 질소, 3.0 ml/분 Split ratio 10 : 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 지방산 함량(mg/g) = STc (SA fa /ST fa ) (ST is /SA is ) (V/S) f FAi (1/1,000) STc : 표준물질용액의 농도(μg/mL) SA fa ST fa : 시험용액내 표준물질의 피크면적 : 표준물질의 피크면적 ST is : 표준물질용액내 내부표준물질 3) 피크면적 SA is : 시험용액내 내부표준물질 피크면적 V : 최종희석용액(mL) S : 시료 채취량(g) : 내부표준물질(C 11:0 ) 글리세라이드로부터 지방산으로의 전환계수 4) (단 공액리놀레산 FFA의 경우 적용하지 않음) f FAi : 지방산 메틸에스테르로부터 지방산으로의 전환계수(표1) 1/1,000 : 단위 환산 계수 표 1. 지방산 메틸에스테르로부터 지방산으로의 전환계수 280

284 지방산명 f FAi 12: : : : : : : : : : : : : 참고문헌 7.1 R. Mateo Castro, M.T. Domenech Carbo, V. Peris Martinez, J.V. Gimeno Adelantado and F. Bosch Reig : Study of Binding Media in Works of Art by Gas Chromatographic Analysis of Amino Acids and Fatty Acids Derivatized with Ethyl Chloroformate. JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 778, , Svein A. Mjos : Identification of Fatty Acids in Gas Chromatography by Application of Different Temperature and Pressure Programs on a Single Capillary Column, JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 1015, , Sonnich Meier, Svein A. Mjos, Horaldur Joensen and Otto Grahl-Nielsen : Validation of A One-step Extraction/Methylation Method for Determination of Fatty Acids and Cholesterol in Marine Tissues. JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 1104, , V. Zuriguel, E. Causse, J.D. Bounery, G. Nouadje, N. Simeon, M. Nertz, R. Salvayre and F. Couderc : Short Chain Fatty Acids Anaylsis by Capillary Electrophoresis and Indirect UV detection or Laser-induced Fluorescence. JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 781, ,

285 8. 시험 주의사항 1) 검화시 목적하는 온도가 되었을 때부터 정확히 시간을 지켜야 한다. 2) 케피너리 칼럼의 경우 칼럼 부하량이 작으므로 지방산 메틸에스테르의 농도가 1 4mg 정도로 작은량이 되도록 조절이 필요하다. 3) 크로마토그램에서 내부표준물질 피크와 중첩되는 방해 피크가 존재 할 경우 내부표준물질을 가하지 않은 시험용액을 만들어서 적당한 피크를 기준으로 하 여 두 가지 시험용액을 비교하여 내부 표준물질 피크의 면적을 보정하여야 한 다. 4) 내부 표준용액을 표준용액과 시험용액 양쪽 모두 동일한 형태로 Undecanoic acid methyl ester를 사용하는 경우는 계산식 중 보정계수(1.0067)를 적용하지 않는다. 282

286 Ⅲ 인지질(아세톤불용물로서) 1. 시험방법의 원리 인지질은 글리세로인산(glycerophosphoric acid) 또는 스핑고신인산(sphingosine phosphate)의 유도체로서, 인을 포함하는 지질을 총칭하는데, 많은 종류의 성분으로 이루어져 있다. 대표적인 것은 레시틴(lecithin), 세팔린(cephalin), 스핑고마이엘린 (spingomyelin) 등이다. 인지질은 불포화지방산이 풍부하고, 동물 체내에서는 주로 생체막의 구성성분으로 서 중요하며, 지방의 소화흡수를 돕는 작용도 있다. 자연계에 널리 분포하며 장기, 뇌 신경계, 난황, 대두 등에 많이 포함되어 있다. 여러 가지 목적으로 의약이나 식 품가공의 분야에서 널리 이용되고 있다. 인지질은 메탄올 에탄올 벤젠 아세트산 석유아세트산 에테르 클로로포름 등 에는 녹지만 아세톤 아세트산에틸 등에는 녹지 않는다. 이러한 특성을 이용하여, 본 시험법은 시료 중 지질을 충분히 추출하여 지질의 양을 측정하고 이들 지질 중 인지질을 아세톤 불용물로서 분리하여 무게를 측정하여 인지질 함량을 계산하는 방 법이다. 지질 추출 용해 / Filtration 원심분리 증류 인지질 분리 무게측정 건조 2. 안전 주의 사항 시험 중 인지질 추출에 사용되는 아세톤은 가연성이 매우 높은 액체 또는 증기로 서, 증기는 증발연소를 야기할 수 있다. 흡입 시 호흡기를 자극하고, 피부자극, 눈 자극, 중추신경계통을 억제할 수 있으며, 피부 접촉 시 얼얼한 느낌을 받게 되므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 피부에 접촉하지 않도록 취급에 주의를 기울여야 한다. 283

287 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 환저플라스크 원심분리관(50 ml) 감압농축기 건조기(Dry oven) 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 일반시약 석유에틸에테르 아세톤(Acetone, 0~5 로 냉각) 5. 시험과정 5.1 시료(W 1, 수분을 함유한 경우 미리 80 전후로 가온하여 감압하에 탈수 건조 한다)를 석유에테르, 헥산 등으로 용해한 후 여과한다. 5.2 지질 이외의 성분이 제거된 여액은 환저플라스크에 넣어 잔존하는 용제를 감 압하에 제거한 후 시험용 시료(W 2 )로 한다. 지질이외의 성분 제거 조작 시 아래의 방법을 사용할 수 있다. 1 대두레시틴 이외의 원료 성분을 제거하기 위하여 클로로포름/메탄올 혼 합액, 클로로포름/헥산 혼합액 등의 용제 사용이 좋은 경우 또는 환류 를 행한 경우가 좋은 경우가 있다. 2 캡슐제품의 경우 중앙을 절단한 후 삼각플라스크에 넣고 에틸에테르 약 40 ml를 넣어 10분간 진탕시켜 내용물을 완전히 용해 추출시킨다. 추 출액을 모아 다시 에틸에테르 40 ml를 넣어 5분간 진탕 1) 시킨 후, 캡슐 기제를 제거하고 추출액을 앞의 추출액에 합하여 수욕 중에서 감압하여 용제를 완전히 날려 보낸 것을 분석 시료(W 1 )로 한다. 5.3 시험용 시료(W 2 ) 2 g을 50 ml 눈금의 원심분리관에 넣어 석유에틸에테르 3 ml에 녹여 아세톤 15 ml를 가해 잘 혼합하고 얼음물 중에 15분간 방치한다. 5.4 이에 미리 0~5 로 냉각한 아세톤을 가해 50 ml로 하여 다시 얼음물 중에 15분간 방치한 다음 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 미리 항량한 플라스크에 취한다. 5.5 공전원심관의 침전물에 0~5 의 아세톤을 가해 50 ml로 하고, 얼음 중에서 냉각시키면서 잘 혼합한 후 5.4와 동일하게 원심분리하여 상층액을 5.4의 플 라스크에 합하여 수욕 상에서 증류한다. 5.6 잔류물은 105 에서 한 시간 건조 후 항량을 구한다(W 3 ) 284

288 6. 분석 및 계산 인지질 함량(mg/g) = (W 2 -W 3 )/W 1 W 1 W 2 W 3 : 시료 채취량(g) : 시험용 시료 채취량(mg) : 아세톤 가용물 중량(mg) 7. 시험 주의사항 1) 에테르 처리 시 에멀젼을 방지하기 위하여 최초 2회 정도는 가볍게 흔들어 준 다. 285

289 Ⅲ 인지질 중 포스파티딜콜린의 함량 Ⅲ 인지질 중 포스파티딜콜린의 함량(제1법) 1. 시험방법의 원리 포스파티딜콜린(Phosphatidylcholine, PC)이란 동물식물 효모 곰팡이류에 널리 존재 하는 인지질( 燐 脂 質 ). 레시틴이라고도 하며 1,2-디아실-L-3-글리세릴포스포릴콜린에 해당한다. 포유동물의 막구성 인지질로서 주로 뇌수 신경 혈구 난황 등에 들어 있다. 식물에서는 대두 해바라기씨, 밀배아 등에 함유되어 있으며 박테리아에서는 거의 찾아볼 수 없다. 한 쪽에는 친유성이 강한 지방산기를 가지고 있고 한 쪽에는 친수 성이 강한 인산, 콜린 부분을 가지고 있어, 물과 유지의 혼합물을 안정화시켜주는 유화제로서 널리 사용된다. 건강기능식품으로 이용되는 레시틴은 대두유를 여과하고 수소화하여 얻은 레시틴 검화물에서 유지를 추출하거나, 난황을 물이나 주정으로 추출하고 용매를 제거한 것을 말한다. 대두를 원재료로 하여 만든 레시틴은 인지질(아세톤불용물로서)이 36% 이상, 그 중 포스파티딜콜린이 60% 이상 함유되어 있어야한다. 실제 원료를 제 조하였을 때 인지질은 36~98% 정도 함유되어 있으며, 대두레시틴 인지질 중 포스 파티딜콜린은 10~45%, 난황레시틴 인지질 중 포스파티딜콜린은 60~75% 정도 함유 되어 있는 것으로 보고되고 있다. 포스파티딜콜린은 주로 소장, 십이지장과 공장 상부의 점막 세포에서 흡수된다. 췌 장 효소인 phospholipase에 의해 소화되고 lysophosphatidylcholine(lysolecithin)을 생성한다. Lysolecithin은 장 점막세포에서 reacylation에 의하여 포스파티딜콜린을 재형성한 후, 혈액에서 VLDL과 LDL을 포함한 다양한 지단백질 성분으로 전환되어 인체의 여러 조직에서 이용된다. 이는 혈중 콜레스테롤을 개선시키는 것으로 보고 되고 있다. 기능성이 확인된 인체적용시험에서의 섭취량을 고려하여 레시틴으로서 1.2~ 1.8 g으로 일일섭취량을 설정하였다. 본 시험법은 인지질 중 포스파티딜콜린을 박층크로마토그래프판을 이용해 분리한 후 습식 분해하여 인을 추출 정량하는 방법으로, 발색시약을 사용하여 640 nm에서 흡 광도를 측정함으로써 정량한다. 인 추출 박충크로마토그래피 습식 분해 중화 / 진탕혼합 흡광도 측정 발색 286

290 2. 안전주의사항 시료를 녹일 때 사용되는 헥산은 상기도를 약간 자극하고 중추신경계를 억제한다. 만성폭로하면 말초신경장해를 초래한다. 2,000ppm 농도에 10분 폭로될 때에는 아무 런 작용이 없으나 5,000ppm 에서는 현기증이 생긴다. 구역, 두통, 눈과 목의 자극증 상이 1,400~1,500ppm 농도에서 생기며 탈지작용이 있으므로 오래 동안 폭로되면 피 부를 자극하게 된다. 피부에 닿으면 바로 물로 씻어내고 사용할 때에는 충분히 환 기를 해야 한다. 전개용매로 사용되는 클로로포름은 신경을 마비시키는 작용을 하므로 마취제로서 사용되지만 과량복용이나 주사 시 심장을 멈춰 죽음에 이르게 하며, 장기간 복용이 나 노출은 간, 폐, 신장에 해를 주므로 환기가 잘되는 시설과 안전장비를 갖추고 취 급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 박층크로마토그래프판(Thin layer chromatography plate) 원추형 플라스크(100 ml) 시계접시 비이커 분액여두(100 ml) 진탕기 3.2 분석장비 분광광도계 3.3 분석장비의 준비 분석 전 분광광도계를 충분히 안정화시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 일반시약 헥산(n-Hexane) 클로로포름(Chloroform) 메탄올(Methanol) 암모니아수(Ammonia solution) 과염소산(Perchloric acid) 질산(Nitric acid) 수산화나트륨(Sodium hydroxide) p-니트로페놀 용액 (ρ-nitrophenol) 몰리브덴산(6-)암모늄염4수화물(Ammonium molybdate tetrahydrate) 주석산 칼륨(Potassium tartrate) 287

291 황산(Sulfuric acid) 아마이드 황산암모늄(ammonium sulfamate) 인산2수소칼륨(Potassium dihydrogen phosphate) 아스코르빈산 (Ascorbic acid) 디이소부틸케톤 (Diisobutyl ketone, 2,6-Dimethyl-4-heptanone) 4.2 시액의 조제 몰리브덴산 암모늄 용액 7몰리브덴산(6-)암모늄염4수화물 6 g과 주석산 칼륨 0.24 g을 증류수 300 ml에 녹이고, 이에 황산(2+1)120 ml를 가한 후 아마이드 황산암모늄 5 g 을 녹인 후 증류수를 가해 500 ml로 한다 % 수산화나트륨 % p-니트로페놀 용액 클로로포름 : 메탄올 : 7 N 암모니아수(130 : 60 : 8, v/v/v)의 혼합액 % 아스코르빈산 용액 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 g의 인산2수소칼륨(KH2PO4)을 증류수에 용해하여 250 ml로 하고 이 용액 5.0 ml를 1000 ml로 희석하고, 검량선 작성용 표준인산용액 1) 으로 한다(인으로서 5.0 μg/ml). 5.2 시험용액의 조제 시료 0.2~0.5 g을 정확히 달아 헥산에 녹여 50 ml로 한다. 5.3 시험조작 이 중 100 μl를 취하여 박층판의 우하단 및 우변에서 2 cm 위치에 점적하여 클로로포름 : 메탄올 : 7 N암모니아수(130 : 60 : 8, v/v/v)의 혼합액을 전 개용매로 하여 2차 전개 2) 시킨다 전개 후 박층판을 풍건하고 요오드 증기를 사용하여 인지질의 반점을 발 색시켜 포스파티딜콜린의 반점을 확인한다 반점을 긁어 100 ml의 원추형 플라스크에 취하고, 과염소산 2 ml 및 질산 2~ 3방울 가하고 시계접시를 덮개로 하여 가열 분해한다 식힌 후 비이커 및 시계접시를 증류수로 씻어 여과한다 여액 및 세액을 합하여 증류수로 50 ml가 되게 한다 인으로서 1~10 μg을 함유하는 일정량을 100 ml 분액 여두에 정확히 취 한 후, 4% 수산화나트륨 용액으로 중화한다(지시약 : 0.1% p-니트로페놀 용액) 증류수로 전량을 약 40 ml가 되게 하고 몰리브덴산 암모늄용액 5 ml를 가해 진탕혼합하고, 이어 1% 아스코르빈산 용액 1 ml를 넣어 흔들어 혼화 288

292 한 후 15분간 진탕 혼합하여 15분간 방치한다 디이소부틸케톤 5 ml를 가해 5분간 진탕 3) 혼합한다 정치 후 용매층을 취한다. 5.4 인지질 중 인의 정량 시험용액에서 100 μl를 원추형비이커에 취하고 헥산을 제거한다 포스파티딜콜린 중 인의 정량과 동일한 조작으로 인지질의 인 함량을 구 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 640 nm에서 흡광도를 측정한다. 단, 표준인산용액(인으로서 5.0 μg/ml)을 이용하여 검량선을 작성하여 정량한다. 6.2 파장 흡광도 그래프 : phosphatidylcholine, : phosphatidylethanolamine, : sphingomyelin 6.3 계산 포스파티딜콜린 조성비(%) = A/B 100 A : 포스파티딜콜린 중 인 함량(mg/g) B : 인지질 중 인 함량(mg/g) 289

293 7.참고문헌 7.1 R. K. Raheja, Charanjit Kaur, Ajit Singh, I. S. Bhatia : New colorimetric method for the quantitative estimation of phospholipids without acid digestion, Journal of Lipid Research, 14, , 시험 주의사항 1) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조 시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 2) 전개액이 박층 높이의 80%를 넘지 않도록 전개시간에 주의를 기울여야 하며 통상 65 75% 정도의 높이까지 전개하는 것이 분리 효율이 좋다. 3) 분액여두 내에서 반응용매 진탕시 용매 증기가 모두 빠질 때 까지 초기 3 4회는 가볍 게 흔들고, 여두의 코크를 열어 주어야 한다. 290

294 Ⅲ 인지질 중 포스파티딜콜린의 함량(제2법) 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 인지질 중 포스파티딜콜린을 박층크로마토그래프판를 이용해 분리한 후 습식 분해하여 인을 추출하는 방법으로 유도결합플라즈마분광광도계를 사용하여 인을 정량한다. 인 추출 전개용매로 전개 발색 / 가열 유도결합플라즈마분광광도 2. 안전주의사항 시료를 녹일 때 사용되는 헥산(hexane)은 상기도를 약간 자극하고 중추신경계를 억제한다. 만성노출되면 말초신경장해를 초래한다. 2,000ppm 농도에 10분 폭로될 때에는 아무런 작용이 없으나 5,000ppm 에서는 현기증이 생긴다. 구역, 두통, 눈과 목의 자극증상이 1,400~1,500ppm 농도에서 생기며 탈지작용이 있으므로 오래 동안 폭로되면 피부를 자극하게 된다. 피부에 닿으면 바로 물로 씻어내고 사용할 때에는 충분히 환기를 해야 한다. 포스파티딜콜린 중 인의 정량에 시액으로 사용되는 클로로포름은 신경을 마비시키 는 작용을 하므로 마취제로서 사용되지만 과량복용이나 주사 시 심장을 멈춰 죽음 에 이르게 하며, 장기간 복용이나 노출은 간, 폐, 신장에 해를 주므로 환기가 잘되 는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 박층크로마토그래프판(Thin layer chromatography plate) 원추형 플라스크(100 ml) 시계접시 비이커 원추형 비이커 3.2 분석장비 유도결합플라즈마분광광도계(Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectrometer, ICP) 3.3 분석장비의 준비 분석 전 ICP를 충분히 안정화 시킨다. 291

295 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 일반시약 헥산(n-Hexane) 클로로포름(Chloroform) 메탄올(Methanol) 암모니아수(Ammonia solution) 과염소산(Perchloric acid) 질산(Nitric acid) 4.2 시액의 조제 % 수산화나트륨 % p-니트로페놀 용액 클로로포름 : 메탄올 : 7 N 암모니아수(130 : 60 : 8, v/v/v)의 혼합액 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 ICP용 인 표준용액(1000 ppm)을 질산으로 희석 1) 하여 0.5, 1, 5 ppm 용액을 한다. 5.2 시험용액의 조제 시료 0.2~0.5 g을 정확히 달아 헥산에 녹여 50 ml로 한다. 5.3 포스파티딜콜린 중 인의 정량 이 중 100 μl를 취하여 박층판의 우하단 및 우변에서 2 cm 위치에 점적하여 클로로포름 : 메탄올 : 7 N 암모니아수(130 : 60 : 8, v/v/v)의 혼합액을 전개용매로 하여 2차 전개 2) 시킨다 전개 후 박층판을 풍건하고 요오드 증기를 사용하여 인지질의 반점을 발 색시켜 포스파티딜콜린의 반점을 확인한다 반점을 긁어 100 ml의 원추형 플라스크에 취하고, 과염소산 2 ml 및 질산 2~3방울 가하고 시계접시를 덮개로 하여 2~3시간동안 가열하여 분해한 다 식힌 후 비이커 및 시계접시를 증류수로 씻어 여과한다 여액 및 세액을 합하여 증류수로 50 ml가 되게 한다 인으로서 1~10 μg을 함유하는 일정량을 2% 질산용액으로 20 ml로 하여 시 험용액으로 한다. 5.4 인지질 중 인의 정량 시험용액에서 100 μl를 원추형 비이커에 취하고 헥산을 제거한다 [5.3] 포스파티딜콜린 중 인의 정량과 동일한 조작을 행한다. 292

296 6. 분석 및 계산 6.1 ICP 기기분석 조건 항목 조건 RF power(kw) 1.25 Carrier gas flow 0.7 ml/분 Coolant gas flow 15.0 ml/분 Plasma gas flow 1.0 ml/분 Wavelength nm 6.2 계산 포스파티딜콜린 조성비(%) = A/B 100 A : 포스파티딜콜린 중 인 함량(mg/g) B : 인지질 중 인 함량(mg/g) 7. 참고문헌 7.1 Heidi De Brabandere, Niklas Forsgard, Lena Israelsson, Jean Petterson, Emil Rydin, Monica Waldeback, Per J. R. Sjoberg : Screening for Organic Phosphorus Compounds in Aquatic Sediments by Liquid Chromatography Coupled to ICP-AES and ESI-MS/MS, Analytical Chemistry, 80, , 시험 주의사항 1) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 2) 전개액이 박층 높이의 80%를 넘지 않도록 전개시간에 주의를 기울여야 하며 통상 65 75% 정도의 높이까지 전개하는 것이 분리 효율이 좋다. 293

297 Ⅲ 인지질 중 포스파티딜콜린의 함량(제3법) 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 시료로부터 포스파티딜콜린을 추출한 후 액체크로마토그래프를 이용하여 분석하는 방법으로 증기화광산랑검출기를 이용하여 정량한다. 포스파티딜콜린 추출 메탄올 용해 액체크로마토그래피 증기화광산랑검출기 2. 안전주의사항 이동상으로 사용되는 헥산(hexane)은 상기도를 약간 자극하고 중추신경계를 억제 한다. 만성폭로하면 말초신경장해를 초래한다. 2,000ppm 농도에 10분 폭로될 때에 는 아무런 작용이 없으나 5,000ppm 에서는 현기증이 생긴다. 구역, 두통, 눈과 목의 자극증상이 1,400~1,500ppm 농도에서 생기며 탈지작용이 있으므로 오래 동안 폭로 되면 피부를 자극하게 된다. 피부에 닿으면 바로 물로 씻어내고 사용할 때에는 충 분히 환기를 해야 한다. 이동상으로 사용되는 메탄올의 경우 포름알데하이드 제조나 부동액으로 사용되는 독성을 갖는 무색의 가연성 알코올로서, 생체 내에서알코올탈수소효소에 의해 포름 알데하이드나 포름산이 되기 때문에 독성이 강하다. 30mL 이하를 섭취하더라도 사 망에 이르며, 만성독성으로는 실명을 초래하는 것으로 알려져 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 부피플라스크(50 ml) 여과용 멤브레인 필터 용매용 일회용 실린지 액체크로마토그래프용 유리병 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 증기화광산란검출기(Evaporative Light Scattering Detectors, ELSD) 칼럼오븐 Novapak C8 칼럼(안지름 3.9 mm, 길이 150 mm, 충진입자크기 4 μm) 또 는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상인 헥산 : 이소프로판올 : 증류수(30 : 60 : 8)를 분당 1.0 ml로 흘려 칼럼 294

298 과 검출기를 충분히 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 포스파티딜콜린(L-α-Phosphatidylcholine, L-α-Lecithin) 분자식 : C 42 H 82 NO 8 P, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 헥산(n-Hexane) 이소프로판올(Isopropanol) 메탄올(Methanol) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 포스파티딜콜린을 125, 250, 500, 1000 및 2000 ppm이 되도록 메탄올에 녹인다 1). 5.2 시험용액의 조제 시료 0.2~0.5 g을 정확히 달아 메탄올에 녹여 50 ml로 하여 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건 항목 주입량 조건 40 μl 칼럼 온도 30 Nebulization Temp. 60% Pressure(N 2 gas) 13.1psi Drift tube Temp. 70 이동상 헥산 : 이소프로판올 : 증류수(30 : 60 : 8) 유속 1.98 ml/분 295

299 6.2. 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 포스파티딜콜린 함량(%) = C (a b)/s 100/1,000,000 C : 시험용액 중 포스파티딜콜린 함량(μg/mL) S : 시료 채취량(g) a : 시험용액의 전량(mL) b : 희석배수 100/1,000,000 : 단위 환산 계수 7. 참고문헌 7.1 A.M. Descalzo, E.M. Insani, and N.A. Pensel : Light-Scattering Detection of 296

300 Phospholipids Resolved by HPLC, Journal of Lipid Research, 38(9), , Jos F. H. M. Brouwers, Barend M. Gadella, Lambert M. G. van Golde, Aloysius G. M. Tielens : Quantitative analysis of phosphatidylcholine molecular species using HPLC and light scattering detection, Journal of Lipid Research, 39, , 시험 주의사항 1) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 297

301 Ⅲ 콜레스테롤 1. 시험방법의 원리 콜레스테롤(cholesterol)은 동물성 스테롤류의 대표적인 것으로서 비비누화 물질이 고 방향족 알코올에 속한다. 고등동물의 모든 세포, 뇌조직, 신경조직, 담즙에 존재 하고 혈액과 지방조직 중에는 유리 콜레스테롤 및 고급지방산과 에스터 형태인 cholesterylester 형태로 존재한다. 특히 혈액 중의 콜레스테롤은 lipoprotein 중에 존 재하며 약 1/3은 유리 형태로, 2/3는 에스터 형태로 존재한다. 인체 내의 콜레스테롤 중 일부는 인체에서 생합성이 되고 일부는 동물성 식품으로 부터 섭취된다. 인체 내에서 콜레스테롤 평형에 이상이 생겨 과도하게 많을 때는 혈관벽에 축적되기 때문에 동맥경화증, 심장병을 비롯한 순환기 계통의 장해가 유 발되므로 식품으로부터의 콜레스테롤 섭취를 조절하여야 된다. 콜레스테롤은 동물 체 내에 필요한 여러 가지 steroid와 steroid hormone류, 비타민 D의 전구체가 된 다. 콜레스테롤 기준치는 정상 성인의 경우 200 mg/dl이며, 240 mg/dl 이상이면 위험하다. 검체를 클로로포름:메탄올(2:1, v/v) 혼합용액으로 진탕, 혼합 추출하고, 0.5% 수 산화나트륨용액으로 세척하고 무수황산나트륨으로 탈수한 후 여과하여 40 이하에 서 클로로포름층을 감압 농축한다. 잔류물에 2N 수산화칼륨 에탄올 용액을 가하여 환류냉각기를 붙여 85 에서 1시간 비누화한 후 냉각하여 에테르로 추출한다. 에테 르층을 무수황산나트륨으로 탈수한 후 여과하여 감압 농축하고, 잔류물을 헥산에 녹여 기체크로마토그래피로 측정하고 내부표준물질의 면적비를 이용하여 정량한다. 검화 콜레스테롤 추출 균질화 / 진탕혼합 Filtration / 감압 농축 면적비로 정량 가스크로마토그래피 2. 안전주의사항 표준용액의 조제 시 사용되는 헥산은 상기도를 약간 자극하고 중추신경계를 억제 한다. 만성노출되면 말초신경장해를 초래한다. 2,000ppm 농도에 10분 노출될 때에 는 아무런 작용이 없으나 5,000ppm 에서는 현기증이 생긴다. 구역, 두통, 눈과 목의 자극증상이 1,400~1,500ppm 농도에서 생기며 탈지작용이 있으므로 오래 동안 폭로 되면 피부를 자극하게 된다. 피부에 닿으면 바로 물로 씻어내고 사용할 때에는 충 분히 환기를 해야 한다. 298

302 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 분액여두 환저플라스크 감압농축기 환류냉각기 3.2 분석장비 가스크로마토그래프 수소염이온화 검출기 칼럼오븐 % dimethylpolysiloxane (안지름 0.32 mm, 길이 50 m, 필름두께 0.5 μ m thickness) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 분석시작 전에 주입부 및 검출기 온도, 유량, 칼럼 온도를 분석조건에 맞게 조작 하고, 가스크로마토그래프를 충분히 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 콜레스테롤(Cholesterol) 분자식 : C 27 H 46 O, 분자량 : , CAS No. : 내부표준물질 α-콜레스탄(5α-Cholestane) 혹은 스쿠알렌(squalene) 4.3 일반시약 클로로포름(Chloroform) 메탄올(Methanol) 에틸에테르(Ethylether) 헥산(n-Hexane) 4.4 시액의 조제 α-콜레스탄 내부표준물질용액 5α-콜레스탄 20 mg을 헥산에 10 ml로 한다 N 수산화칼륨 에탄올용액 299

303 수산화칼륨 13.2 g을 소량의 물로 녹이고 에탄올을 가하여 100 ml로 한다. 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 표준물질 콜레스테롤 20 mg을 정밀하게 달아 헥산 10 ml에 녹여 표준용액 으로 한다 표준물질 콜레스테롤 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8 및 1.0 ml를 각각의 시험관에 취하여 내부 표준물질 용액 0.5 ml씩 가하여 헥산으로 정확히 2 ml가 되 게 한다. 5.2 시험용액의 조제 시료를 약 1~10 g(콜레스테롤 함량 20~1,000 mg/100 g)에 물 약 8 ml 과 5α-콜레스탄 0.5 ml를 가하여 혼화 균질화한다 이를 분액여두에 옮겨 클로로포름 : 메탄올(2 : 1) 200 ml를 가하여 약 5분간 진탕혼합 추출하여 방치한 후 클로로포름층을 취한다 검액 잔류물에 다시 클로로포름 : 메탄올(2 : 1) 100 ml씩을 가하여 2회 추출 한다 추출한 클로로포름층을 합하여 0.5% 수산화나트륨용액 100 ml로 세척하고 무수황산나트륨으로 탈수한 후, 여과하여 40 이하에서 감압 농축한다 감압 농축한 잔류물에 2 N 수산화칼륨 에탄올용액 20 ml를 가하여 환류냉각 기를 붙여 85 에서 1시간 비누화 1) 한 후 냉각하고 물 20 ml 를 가하여 분액여 두로 옮긴다 에틸에테르 20 ml씩 3회 추출하고, 추출액을 모두 합하여 물 20 ml 씩으 로 세척 2) 한다(약 5회 정도, 페놀프탈레인 지시약으로 홍색이 나타나지 않 을 때까지 세척한다) 에틸에테르층을 무수황산나트륨으로 탈수한 후 여과하여 감압 농축한다 잔류물을 헥산 2 ml에 녹여 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 가스크로마토그래프 조건 항목 조건 주입부 온도 290 칼럼 온도 245 (0.5분)-2 /분 /분 -290 (21분) 검출기 온도 300 캐리어 가스 및 유량 질소, 3.0 ml/분 Split ratio 12.5 : 1 Injection volume 1μL 300

304 6.2. 시료분석 크로마토그램 6.3 계산 [내부표준물질을 사용하지 않는 경우] 콜레스테롤 함량(mg/100 g) = C (V/S) (100/1,000) C : 시험용액 중의 콜레스테롤 농도(μg/mL) V : 최종희석액(mL) S : 시료 채취량(g) 100/1,000 : 단위 환산 계수 [내부표준물질 3] 을 사용한 경우] 콜레스테롤 함량(mg/100 g) = (2 K P1)/(S P2) 100 K : 환산계수 (피크면적비 또는 높이비가 1.0인 내부표준물질에 대한 표준 물질의 중량비) P1 : 콜레스테롤 피크면적 P2 : 5α-콜레스탄의 피크면적 S : 시료 채취량(g) 100 : 단위 환산 계수 301

305 7. 참고문헌 7.1 G. Brufau, R. Codony, M. A. Canela, M. Rafecas : Rapid and Quantitative Determination of Total Sterols of Plant and Animal Origin in Liver Samples by Gas Chromatography, CHROMATOGRAPHIA, 64, , 윤석권, 훈일, 이형주, 문태화, 노봉수, 김석중 : 식품화학, 수학사, , 시험 주의사항 1) 분석대상이 동물성식품이 많을 경우 주성분인 단백질과 지질을 가용성으로 만 들기 위하여 알카리로 검화 처리를 한다. 목적하는 온도가 되었을 때부터 정확 히 시간을 지켜야 한다. 당질이 많은 시료의 경우 처리 중 굳어지는 것을 방지 하기 위하여 유리봉 등으로 저어 주는 것도 좋다. 불검화물이 많은 시료의 경 우 알카리성에서 석유에테르로 추출하여 제거 하여야 한다. 2) 수세가 충분히 이루어지지 않으면 용매가 남게 되므로 반드시 회수를 지켜야 한다. 3) 크로마토그램에서 내부표준물질 피크와 중첩되는 방해 피크가 존재 할 경우 내부표준물질을 가하지 않은 시험용액을 만들어서 적당한 피크를 기준으로 하여 두 가지 시험용액을 비교하여 내부 표준물질 피크의 면적을 보정하여야 한다. 302

306 Ⅲ 구연산 1. 시험방법의 원리 구연산(citric acid)은 트리카르본산의 일종이며 시트르산회로를 형성하는 한 성 분으로, 호기적 대사에서 중요한 역할을 수행하며 생물계에 널리 분포해 있다. 또 한 세균, 사상균의 발효시 다량으로 생성된다. Ca2+의 포착제이며, 그 나트륨염인 시트르산나트륨은 혈액응고저지제로 사용된다. 레몬이나 귤과 같이 신맛이 나는 과일에 유리 형태로 존재한다. 구연산은 이펙터(effector)의 기능이 있어서 과당 -6-인산인산화효소에 대해서는 저해적으로 작용하고, 아세틸CoA카르복시화효소에 대해서는 촉진적으로 작용한다. 구연산은 또한 결정물(일수염)과 무수물이 있고, 각각을 결정구연산과 무수구연 산이라고 한다. 결정구연산은 청량음료수, 혼성주, 캔디, 젤리, 잼, 빙과, 통조림 등의 산성조미료 및 식용유의 산패방지제(synergist)로서 사용하며, 무수구연산은 분말주스, 가루발포쥬스, 분말샤벳, 분말 케찹, 츄잉껌 등 수분을 싫어하는 식품이 나 가루식품의 산미료로 사용한다. 본 시험법은 물로 시료를 추출하고 C 18 카트리지로 불순물을 제거하여 옥타데실 릴화한 칼럼을 통하여 구연산을 분리하는 방법으로 액체크로마토그래프/자외부흡광 광도검출기를 사용하여 구연산의 최대흡수 파장인 214 nm에서 검출하여 정량한다. 증류수로 용해 옥타데실실릴화 칼럼 C 18 카트리지 유출 액체크로마토그래피 Filtration 자외부흡광광도검출 2. 안전주의사항 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴(Acetonitrile)과 제일인산칼륨 (Monopotassium phosphate)은 흡입이나 섭취 시 구토, 구역, 혈압변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의식불명 등의 증상이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 부피플라스크(100 ml, 50 ml) 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 303

307 3.2.3 칼럼오븐 옥타데실실릴화한한 칼럼 (안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상은 제일인산칼륨(KH 2 PO 4 )27.2 g을 증류수 950 ml에 용해시킨 후 인산 으로 ph 2.4로 조절하여 용매를 분당 0.5 ml를 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 구연산(Citric acid, 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid) 분자식 : C 6 H 8 O 7, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 아세토니트릴(Acetonitrile) 제일인산칼륨(Monopotassium phosphate) 4.3 시액의 조제 M 인산완충액(pH 2.4) 제일인산칼륨(KH 2 PO 4 ) 27.2 g을 증류수 950 ml에 용해시킨 후 인산으로 ph 2.4가 되도록 조절한다. 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 표준물질 구연산 200 mg을 정밀하게 달아 증류수 100 ml에 녹여 표준용액 1) 으로 한다. 5.2 시험용액의 조제 시료 약 1~10 g(구연산으로서 약 100 mg이 되도록)을 정밀하게 취하여 증 류수로 50 ml로 한다 C 18 카트리지에 아세토니트릴/증류수(1 : 1) 용액 10 ml를 유출시켜 활성 화 시킨다 카트리지 내 용액을 제거한다 이어서 [5.2.1]의 시료 중 10 ml을 가하여 초기 용출액 4~5 ml을 제거한 후 나머지 용출액을 분취한다. 304

308 5.2.5 멤브레인 필터(0.45 μm)로 여과후 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표1. 고속액체크로마토그래프 조건 항목 조건 주입량 10 μl 칼럼 온도 40 이동상 0.2M인산완충액(pH 2.4 검출기파장 214 nm 유속 0.5 ml/분 6.2. 시료분석 크로마토그램 6.3 계산 구연산 함량(mg/g) = C (a b)/s C : 시험용액 중의 구연산 농도(mg/mL) a : 시험용액의 전량(mL) b : 희석배수 S : 시료 채취량(g) 7. 참고문헌 7.1 AOAC Official Methods of Analysis Quinic, Mallic, and Citric Acids in Cranberry Juice Cocktail and Apple Juice, Liquid Chromatographic Method #

309 7.2 K. Sturm, D. Koron, F. Stampar : The composition of fruit of different strawberry varieties depending on maturity stage, Food Chemistry, 83, , 시험 주의사항 1) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 306

310 Ⅲ 스쿠알렌 1. 시험방법의 원리 스쿠알렌(Squalene)은 탄소 30개, 수소 50개가 여섯 개의 이중 결합 결합으로 연결 된 triterpenoid계의 불포화 탄화수소로 인체와 동식물성 유지에 함유되어 있다. 심 해상어 간유( 肝 油 )에 특히 많이 함유되어 있으며 올리브오일, 야자유, 밀배아유 등에 도 함유되어 있고, 인체 내에서는 아세틸 보조효소 A로부터 메발론산을 거쳐 합성 되며, 콜레스테롤, 생식 호르몬, 비타민D, 담즙산 생산 등에 사용되는 것으로 알려 져 있다. 건강기능식품으로의 스쿠알렌은 상어 간에서 추출한 유지에 증류와 검화 과정을 반복한 후, 불검화물을 물이나 주정으로 세척하여 만든 것을 말하며, 순도가 98% 이상이어야 한다. 본 시험법은 헥산을 이용하여 스쿠알렌을 시료로부터 추출하여 가스크로마토그래 프로 분석하는 방법으로, 내부표준물질과 표준물질의 면적비를 이용하여 정량한다. 스쿠알렌 추출 핵산으로 용출 가스크로마토그래피 Filtration 2. 안전주의사항 표준용액 제조 시 사용되는 헥산(hexane)은 호흡기도 자극, 피부 자극, 눈 자극, 흡 인 위험, 중추 신경 계통 억제, 신경 이상의 건강 위험성이 있다. 물리적인 위험으 로는 가연성이 매우 높은 액체 또는 증기이므로 증발 연소를 야기할 수도 있으므로 환기장치를 설치하고 보안경으로 눈 보호, 실험복 착용 및 안전장갑 등의 안전장비 를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 부피플라스크(50 ml) 시험관 원심분리기 3.2 분석장비 가스크로마토그래프 불꽃이온화검출기(Flame Ionization Detector) 칼럼오븐 % dimethylpolysiloxane (길이 50 m, 안지름 0.32 mm, 필름두께 0.5 μ m) 또는 이와 동등한 것 307

311 3.3 분석장비의 준비 분석시작 전에 주입부 및 검출기 온도, 유량, 칼럼 온도를 분석조건에 맞게 조 작하고, 가스크로마토그래프를 충분히 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 스쿠알렌(squalene, 2,6,10,15,19,23-hexamethyl- tetracosahex-2,6,10,14,18,22-ene) 분자식 : C 30 H 50, 분자량 : , CAS No. : 내부표준물질 콜레스테롤(Cholesterol) 4.3 시액의 조제 내부표준용액 : 콜레스테롤 200 mg을 정밀히 달아 클로로포름으로 200 ml가 되도록 한 다. 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 스쿠알렌 표준물질 100 mg을 정밀히 달아 소량의 헥산으로 녹인 다음 헥산 을 가하여 100 ml로 한 것을 표준원액(1000 μg/ml)으로 한다 표준원액 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 및 1.5 ml를 각각의 시험관에 취하여 콜레 스테롤 내부 표준물질 용액 0.5 ml씩 가하여 헥산으로 정확히 2 ml 1) 가 되게 한다. 5.2 시험용액의 조제 시료 약 50 mg을 정밀히 달아 내부표준용액 12.5 ml와 헥산을 넣어 녹 이고 정확히 50 ml가 되게 하여 시험용액으로 한다. 필요한 경우 원심분 리 또는 여과 2) 하여 사용한다. 308

312 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 가스크로마토그래프 조건 항목 조건 주입부 온도 350 칼럼 온도 200 (1분)-5 /분 to 280 (15분)- 20 /분 to 360 (5분) 검출기온도 360 캐리어 가스 및 유량 질소, 3.24 ml/분 Split ratio 20 : 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 3) 스쿠알렌 함량(mg/g) = C (a b)/s C : 시험용액중의 스쿠알렌의 농도(mg/mL) a : 시험용액의 전량(mL) b : 희석배수 S : 시료 채취량(g) 7. 참고문헌 7.1 Zdenka Kopicova and Slavomira Vavreinova : Occurrence of Squalene and Cholesterol in Various Species of Czech Freshwater Fish, Czech J. Food Sci., 309

313 Vol. 25, No. 4: , George C K et al : Measurement of cholesterol synthesis in man by isotope kinetic squalene. Proc Nat Acad Sci 72: , 시험 주의사항 1) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 2) 스쿠알렌 원액 등 스쿠알렌 농도가 높은 제품의 경우 원심분리나 여과 조작을 간단히 하여도 무방하지만 다른 식품과 혼합된 시료의 경우 이 조작을 더욱 정확히 행하여야 하며 필요시 불순물 제거를 위한 검화 등의 조작이 필요 할 수도 있다. 3) 크로마토그램에서 내부표준물질 피크와 중첩되는 방해 피크가 존재 할 경우 내부표준물질을 가하지 않은 시험용액을 만들어서 적당한 피크를 기준으로 하여 두 가지 시험용액을 비교하여 내부 표준물질 피크의 면적을 보정하여야 한다. 310

314 Ⅲ 식물스테롤 1. 시험방법의 원리 식물스테롤(phytosterol, PS) 및 식물스테롤에스테르(phytosterol ester, PSE)는 식 물성 기름, 곡류, 과일, 채소류 등에 널리 존재하고 있는 천연 물질이며, 식생활을 통하여 아주 오랫동안 섭취되어 온 물질 중 하나이다. 식물스테롤/식물스테롤에스테르는 대두유, 옥수수유, 채종유 등 유지 제품을 생산 하는 공정 중의 탈취 공정 중에 생긴 증류물인 베타-시토스테롤(β-sitosterol), 브라 시카스테롤(brassicasterol), 스티그마스테롤(stigmasterol), 캄페스테롤(campesterol) 의 혼합물을 추출 및 정제하여 식용에 적합하도록 제조 가공하거나, 이러한 추출 및 정제물을 식용유지 유래 지방산으로 에스테르화하여 식용에 적합하도록 한 것 을 말한다. 식물스테롤 원료는 위 4가지 식물스테롤이 모두 검출되고 이의 합이 90% 이상이어야 하며, 에스테르화한 원료는 식물스테롤에스테르와 유리식물스테롤 의 합이 80% 이상, 유리식물스테롤이 10% 이하이어야 한다. 식물스테롤은 콜레스테롤과 구조적으로 유사하므로 담즙산과 경쟁적으로 결합한 다. 또한 콜레스테롤보다 소수적인 성질이 강하여 답즙산 미셀(micelle)에 더 잘 녹 아 콜레스테롤이 미셀에 결합하는 것을 방해하고 미셀의 용해도를 감소시켜 콜레 스테롤의 운반체인 mixed micelle에 경쟁적으로 작용할 수 있는 결정 형태를 형성 하게 한다. 따라서, 장간계순환(enterohepatic circulation) 내인성 콜레스테롤의 재 흡수가 억제되고 변으로의 배설이 증가되어 혈중 콜레스테롤이 감소하게 된다. 즉, 식물스테롤은 음식으로 섭취되는 콜레스테롤이 소장 내에서 흡수되는 것을 방해하 여 결과적으로 혈중 콜레스테롤의 감소를 유도한다고 할 수 있다. 정제되지 않은 식물성 유지 내에는 다량의 식물스테롤(100~500 mg PS/100 g iol) 이 함유되어 있으며, 일상식이로부터 서양인은 평균 180~250mg/day, 일본인은 400 mg/day을 섭취하고 있다. 국내에서는 식품 원료로 허용되지 않아 식품에 사 용되지 않고 있으나 외국에서는 식이보충제나 마가린 제품 등에 널리 이용되고 있 다. 본 시험법은 시료를 검화시킨 후 식물스테롤 성분을 추출하여 가스크로마토그래 프로 분석하는 방법으로 내부표준물질과 표준물질의 면적비를 이용하여 정량한다. 식물스테롤 추출 검화 / 냉각 감압 농축 가스크로마토그래피 2. 안전주의사항 표준용액의 조제 시 사용되는 헥산은 상기도를 약간 자극하고 중추신경계를 억제 311

315 한다. 만성 노출되면 말초신경장해를 초래한다. 2,000ppm 농도에 10분 노출될 때에 는 아무런 작용이 없으나 5,000ppm 에서는 현기증이 생긴다. 구역, 두통, 눈과 목의 자극증상이 1,400~1,500ppm 농도에서 생기며 탈지작용이 있으므로 오래 동안 폭로 되면 피부를 자극하게 된다. 피부에 닿으면 바로 물로 씻어내고 사용할 때에는 충 분히 환기를 해야 한다. 내부표준물질인 디히드로콜레스테롤을 녹일 때 사용되는 클로로포름은 신경을 마비 시키는 작용을 하므로 마취제로서 사용되지만 과량복용이나 주사 시 심장을 멈춰 죽음에 이르게 하며, 장기간 복용이나 노출은 간, 폐, 신장에 해를 주므로 환기가 잘되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 환저플라스크 분액여두 감압농축기 3.2 분석장비 가스크로마토그래프 불꽃이온화검출기(Flame Ionization Detector) 칼럼오븐 % dimethylpolysiloxane (안지름 0.32 mm, 길이 50 m, 필름두께 0.5 μ m thickness) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 분석시작 전에 주입부 및 검출기 온도, 유량, 칼럼 온도를 분석조건에 맞게 조작 하고, 가스크로마토그래프를 충분히 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 베타시토스테롤(β-sitosterol) 분자식 : C 29 H 50 O, 분자량 : , CAS No. : 캄페스테롤(campesterol) 분자식 : C 28 H 48 O, 분자량 : , CAS No. :

316 4.1.3 브라시카스테롤(brassicasterol) 분자식 : C 28 H 46 O, 분자량 : , CAS No. : 스티그마스테롤(stigmasterol) 분자식 : C 29 H 48 O, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 에탄올(Ethanol) 수산화칼륨(Potassium hydroxide) 헥산(n-Hexane) 염화나트륨(Sodium chloride) 4.3 내부표준물질 디히드로콜레스테롤(Dihydrocholesterol) 분자식 : C 27 H 48 O, 분자량 : , CAS No.: 시액의 조제 N 에탄올성수산화칼륨 수산화칼륨 5.61 g을 소량의 증류수에 녹인 후 에탄올을 가하여 1 L로 한 313

317 다 내부표준용액 디히드로콜레스테롤을 클로로포름에 녹여 5 mg/ml이 되도록 한다. 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 종의 표준물질을 각각 25 mg씩 정밀하게 달아 내부표준용액 25 ml에 녹여 만든다(1 mg/ml). 5.2 시험용액의 조제 베타-시토스테롤, 브라시카스테롤, 스티그마스테롤, 캄페스테롤의 합계량으 로서 25 mg~100 mg이 함유되도록 적당량의 시료를 환저플라스크에 정 밀하게 단다 에탄올 40 ml와 0.1 N 에탄올성수산화칼륨 용액 10 ml를 넣고 95 에서 1시간 동안 검화 1) 시킨다 검화 후 냉각하고 염화나트륨 포화용액 50 ml를 넣어 잘 혼합한 후 분액여 두로 옮겨 헥산 100 ml씩으로 4회 추출한다 이 헥산층을 감압 농축하여 내부표준용액 2) 을 25 ml를 넣은 후 여과한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 가스크로마토그래프 조건 항목 주입부 온도 칼럼 온도 조건 cold on column 105 (3분)-20 /분-275 (15분) 검출기 온도 300 캐리어 가스 및 유량 수소, 20 ml/분 Split ratio 10 : 1 314

318 6.2. 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 6.3.1개별식물스테롤 함량(mg/g) = STc (SA fa /ST fa ) (ST is /SA is ) V/S STc : 표준물질용액의 농도(mg/mL) SA fa ST fa ST is SA is : 시험용액내 표준물질의 피크면적 : 표준물질의 피크면적 : 표준물질용액 내 내부표준물질 피크면적 : 시험용액 내 내부표준물질 피크면적 V : 시험용액의 전량(mL) S : 시료 채취량(g) 식물스테롤 함량(mg/g)의 정량 식물스테롤 함량(mg/g) = 베타-시토스테롤 + 브라시카스테롤 + 스티그마 스테롤 + 캄페스테롤 7. 참고문헌 7.1 A. A. Jekel, H. A.M. G. Vaessen, R. C. Schothorst : Capillary gas-chromatographic method for determining non-derivatized sterols - some results for duplicate 24h diet samples collection in 1994, Jornal of Analytical Chemistry, Volume 360, number 5, , Matvienko O A et al., A single daily dose of soybean phytosterols in ground beef decreases serum total cholesterol and LDL cholesterol in young, mildly hypercholesterolemicmen. Am J Clin Nutr 76(1):57-64, 시험 주의사항 1) 분석대상이 동물성식품이 많을 경우 주 성분인 단백질과 지질을 가용성으로 315

319 만들기 위하여 알카리로 검화 처리를 한다. 목적하는 온도가 되었을 때부터 정 확히 시간을 지켜야 한다. 당질이 많은 시료의 경우 처리 중 굳어지는 것을 방 지하기 위하여 유리봉 등으로 저어 주는 것도 좋다. 불검화물이 많은 시료의 경우 알카리성에서 석유에테르로 추출하여 제거 하여야 한다. 2) 크로마토그램에서 내부표준물질 피크와 중첩되는 방해 피크가 존재 할 경우 내부표준물질을 가하지 않은 시험용액을 만들어서 적당한 피크를 기준으로 하 여 두 가지 시험용액을 비교하여 내부 표준물질 피크의 면적을 보정하여야 한 다. 316

320 Ⅲ 유리식물스테롤 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 유리형태의 스테롤을 추출하기 때문에 시료를 헥산과 잘 혼합한 후 추출 농축하여 시료 중에 유리 된 식물스테롤을 내부표준용액을 넣고 여과하여, 이를 가스크로마토그래프로 분석하여 내부표준물질과 표준물질의 면적비를 이용하 여 정량한다. 유리식물스테롤 헥산 추출 / 농축 가스크로마토그래피 2. 안전주의사항 표준용액의 조제 시 사용되는 헥산은 상기도를 약간 자극하고 중추신경계를 억제 한다. 만성폭로하면 말초신경장해를 초래한다. 2,000ppm 농도에 10분 폭로될 때에 는 아무런 작용이 없으나 5,000ppm 에서는 현기증이 생긴다. 구역, 두통, 눈과 목의 자극증상이 1,400~1,500ppm 농도에서 생기며 탈지작용이 있으므로 오래 동안 폭로 되면 피부를 자극하게 된다. 피부에 닿으면 바로 물로 씻어내고 사용할 때에는 충 분히 환기를 해야 한다. 내부표준물질인 디히드로콜레스테롤을 녹일 때 사용되는 클로로포름은 신경을 마비 시키는 작용을 하므로 마취제로서 사용되지만 과량복용이나 주사 시 심장을 멈춰 죽음에 이르게 하며, 장기간 복용이나 노출은 간, 폐, 신장에 해를 주므로 환기가 잘되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 환저플라스크 감압농축기 3.2 분석장비 가스크로마토그래프 불꽃이온화검출기(Flame Ionization Detector) 칼럼오븐 % dimethylpolysiloxane (길이 50 m, 안지름 0.32 mm, 필름두께 0.5 μ m) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 분석시작 전에 주입부 및 검출기 온도, 유량, 칼럼 온도를 분석조건에 맞게 조작 하고, 가스크로마토그래프를 충분히 안정화 시킨다. 317

321 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 베타시토스테롤(β-sitosterol) 분자식 : C 29 H 50 O, 분자량 : , CAS No. : 캄페스테롤(campesterol) 분자식 : C 28 H 48 O, 분자량 : , CAS No. : 브라시카스테롤(brassicasterol) 분자식 : C 28 H 46 O, 분자량 : , CAS No. : 스티그마스테롤(stigmasterol) 분자식 : C 29 H 48 O, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 에탄올(Ethanol) 헥산(n-Hexane) 318

322 4.2.3 염화나트륨(Sodium chloride) 4.3 내부표준물질 디히드로콜레스테롤(Dihydrocholesterol) 분자식 : C 27 H 48 O, 분자량 : , CAS No.: 시액의 조제 내부표준용액 1) 디히드로콜레스테롤을 클로로포름에 녹여 5 mg/ml이 되도록 한다. 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 종의 표준물질을 각각 25 mg씩 정밀하게 달아 내부표준용액 25 ml에 녹여 만든다(1 mg/ml). 5.2 시험용액의 조제 베타-시토스테롤, 브라시카스테롤, 스티그마스테롤, 캄페스테롤의 계량으로 서 25 mg~100 mg이 함유되도록 적당량의 시료를 환저플라스크에 정밀 하게 단다 ml 헥산과 잘 혼합한다 이 헥산층을 감압 농축한다 내부표준용액을 25 ml를 넣은 후 여과한다. 319

323 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 가스크로마토그래프 조건 항목 주입부 온도 칼럼 온도 조건 cold on column 105 (3분)-20 /분-275 (15분) 검출기 온도 300 캐리어 가스 및 유량 수소, 20 ml/분 Split ratio 10 : 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 개별식물스테롤 함량(mg/g) = STc (SA fa /ST fa ) (ST is /SA is ) V/S STc : 표준물질용액의 농도(mg/mL) SA fa ST fa ST is SA is : 시험용액 내 표준물질의 피크면적 : 표준물질의 피크면적 : 표준물질용액 내 내부표준물질 피크면적 : 시험용액 내 내부표준물질 피크면적 V : 시험용액의 전량(mL) S : 시료 채취량(g) 320

324 6.3.2 식물스테롤 함량(mg/g)의 정량 식물스테롤 함량(mg/g) = 베타-시토스테롤 + 브라시카스테롤 + 스티그마 스테롤 + 캄페스테롤 7. 참고문헌 7.1 A. A. Jekel, H. A.M. G. Vaessen, R. C. Schothorst : Capillary gas-chromatographic method for determining non-derivatized sterols - some results for duplicate 24h diet samples collection in 1994, Jornal of Analytical Chemistry, Volume 360, number 5, , Matvienko O A et al., A single daily dose of soybean phytosterols in ground beef decreases serum total cholesterol and LDL cholesterol in young, mildly hypercholesterolemicmen. Am J Clin Nutr 76(1):57-64, 시험 주의사항 1) 크로마토그램에서 내부표준물질 피크와 중첩되는 방해 피크가 존재 할 경우 내부표준물질을 가하지 않은 시험용액을 만들어서 적당한 피크를 기준으로 하여 두 가지 시험용액을 비교하여 내부 표준물질 피크의 면적을 보정하여야 한다. 321

325 Ⅲ 알콕시글리세롤 1. 시험방법의 원리 알콕시글리세롤은 분자구조 중 독특한 위치에 산소원자 1개가 추가 결합되어있어 보통 지질과는 다른 생물학적 작용을 나타낸다. Triglyceride 유도체로서 그 분자구 조는 CH2OH- CHOH-H2O-R로, 지질의 분자구조에 산소원자 하나가 독특하게 결 합되어 있다. 알킬글리세롤이라고도 부르며, 그 구조식은 체내 중성지방인 triglycerol과 유사하나 글리세라이드 분자의 1번 탄소에 지방산이 에테르 결합을 이루고 있어 체내에서 지방 분해효소에 의하여 분해되지 않고, 2,3번 탄소에 지방이 에스테르 결합을 이루고 있는 화합물의 통칭이다. 상어간유에서 분리한 알콕시글리세롤은 키밀알콜, 바틸알콜, 세라킬알코올 등을 포함한다. 보통 알콕시글리세롤은 키밀알콜이 18%, 바틸알콜이 4%, 세라킬알콜이 50%를 차지하고 있다. 시료를 검화하여 불검화물을 추출하고, 그 양을 측정한 다음 불검화물 중 스쿠알 렌의 양을 감해줌으로서 정량할 수 있다. 불검화물 추출 환류냉각 / 검화 탈수 / 증발 건조 가스크로마토그래피 스쿠알렌양 제외 2. 안전주의사항 무수황산나트륨(Sodium sulfate decahydrate)은 적절한 환기 하에서 취급이 이루어 져야 하고 눈, 피부, 의복에 접촉시키지 않아야 하며 용기는 완전히 밀폐 시켜두어 야 하고, 취급 후에는 철저히 씻어야 한다. 수산화나트륨(Sodium hydroxide)은 삼키면 유해하며 호흡기도, 피부, 눈, 점막에 화 상을 입힐 수 있고 물과 접촉 시 반응 할 수 있어 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 환류냉각기 분액여두 3.2 분석장비 가스크로마토그래프 불꽃이온화검출기(Flame Ionization Detector) 칼럼오븐 % dimethylpolysiloxane (안지름 0.32 mm, 길이 50 m, 필름두께 0.5 μ 322

326 m thickness) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 분석시작 전에 주입부 및 검출기 온도, 유량, 칼럼 온도를 분석조건에 맞게 조작 하고, 가스크로마토그래프를 충분히 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 스쿠알렌(squalene, 2,6,10,15,19,23-hexamethyl- tetracosahex-2,6,10,14,18,22-ene) 분자식 : C 30 H 50, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 에틸에테르(Ethyl ether) 무수황산나트륨(Sodium sulfate anhydrous) 에탄올(Ethanol) 4.3 시액의 조제 N 에탄올성 수산화나트륨 수산화칼륨 4 g을 소량의 증류수에 녹인 후 에탄올을 가하여 100 ml로 한다 내부표준물질 콜레스테롤 200 mg을 정밀히 달아 클로로포름으로 녹여 정확히 200 ml 가 되게 한다. 5. 시험과정 5.1 비비누화량 시료 약 5 g을 정밀히 취하여 환저플라스크에 넣는다 N 에탄올성 수산화나트륨 50 ml를 가한다 환류냉각기를 이용하여 100 에서 1시간 30분 동안 검화 1) 한 후 에탄올을 증발시킨다 열수를 가한 다음 분액여두로 옮긴다 이 용액에 에틸에테르를 첨가 2) 하고 혼합한 후 정치하여 에틸에테르층을 취한다. 323

327 5.1.6 물층은 다시 에틸에테르를 가해 세척하여 이전의 에틸에테르층에 합한다(3 회 반복) 에틸에테르층에 증류수 30 ml를 가해 교반한 후 증류수층을 제거한다(페놀 프탈레인 시액으로 붉은색이 나타나지 않을 때 까지 반복 3) 한다) 에틸에테르층을 무수황산나트륨으로 탈수시켜 증발 건조한 후 중량을 칭 량하여 비비누화량(불검화물량)으로 한다. 5.2 스쿠알렌량 표준용액의 조제 스쿠알렌 표준물질 50 mg을 정밀히 달아 50 ml 부피플라스크에 넣 는다 소량의 헥산으로 녹인 다음 표선까지 헥산을 채운다. (1,000 mg/l) 검량선 작성을 위하여 내부표준용액 4) 을 넣어 최소 3개 이상의 농도로 표준용액을 조제 5) 한다. 이 경우 내부표준물질은 1,000 mg/l 콜레스 테롤을 이용한다 시험용액의 조제 [5.1.8] 과정에서 만들어진 최종시험용액 50 mg을 정밀히 달아 내부 표준용액과 헥산을 넣어 정확히 50 ml가 되도록 하여 분석용액을 만든다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 가스크로마토그래프 조건 항목 조건 주입부 온도 350 칼럼 온도 200 (1분)-5 /분 to 280 (15분)- 20 /분 to 360 (5분) 검출기 온도 360 캐리어 가스 및 유량 질소, 3.24 ml/분 Split ratio 20 : 1 324

328 6.2. 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 알콕시글리세롤의 함량(%) = (불검화물의 양(g) - 스쿠알렌의 양(g))/시료 채취량(g) 100 단, 토코페롤 첨가제품은 토코페롤 양을 추가로 빼준다. 7. 참고문헌 7.1 Zdenka Kopicova and Slavomira Vavreinova : Occurrence of Squalene and Cholesterol in Various Species of Czech Freshwater Fish, Czech J. Food Sci., 25(4), , Hai-Tao Lua, Yue Jianga, Feng Chen : P reparative separation and purification of squalene from the microalga Thraustochytrium ATCC by high-speed counter-current chromatography, Journal of Chromatography A, 994, 37-3, 시험 주의사항 1) 목적하는 온도가 되었을 때부터 정확히 시간을 지켜야 한다. 2) 에테르 처리시 에멀젼을 방지하기 위하여 최초 2회 정도는 가볍게 흔들어 주 고, 분액여두 내에서 반응용매 진탕시 용매 증기가 모두 빠질 때 까지 초기 3 4회는 가볍게 흔들고, 여두의 코크를 열어 주어야 한다, 3) 수세가 충분히 이루어지지 않으면 수용성 물질이 남게 되므로 충분히 수세하 여야 한다. 4) 크로마토그램에서 내부표준물질 피크와 중첩되는 방해 피크가 존재 할 경우 내부표준물질을 가하지 않은 시험용액을 만들어서 적당한 피크를 기준으로 하 여 두 가지 시험용액을 비교하여 내부 표준물질 피크의 면적을 보정하여야 한 325

329 다. 5) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 326

330 Ⅲ 바틸알콜 확인 1. 시험방법의 원리 바틸알콜(Batyl alchol)은 본래 상어간유에서 분리한 알콕시글리세롤에 함유되어 있 는 것인데, 이 물질에는 키밀알콜, 바틸알콜, 세라킬알코올 등을 포함한다. 보통 알 콕시글리세롤은 키밀알콜이 18%, 바틸알콜이 4%, 세라킬알콜이 50%를 차지하고 있 다. 1922년 일본의 쓰지모토와 토야마에 의하여 발견되었고, 1926년 바이데만이 구 조에 대하여 보고한 바 있으며, 고텐부르크 연구소에서는 최초로 바틸알콜, 키밀알 콜, 세라킬알콜 등을 합성한 바 있다. 여기서 알콕시글리세롤을 함유한 상어간유는 상어 간에서 추출한 유지로부터 스쿠 알렌과 검화물을 제거한 후, 불검화물을 물로 세척하고 탈취, 가열, 여과하여 식용 에 적합하도록 한 것을 말하며, 알콕시글리세롤이 18% 이상 함유되어 있어야 하고 바틸알콜이 확인되어야 한다. 알콕시글리세롤의 함량은 상어 간의 지용성성분 중 불검화물에서 스쿠알렌을 제외한 것의 양으로 설정하고 있는데 그러므로 알콕시글 리세롤 여부를 확인하기 위해서 바틸알콜이 확인되어야 하므로 바틸알콜의 유무가 중요하다. 본 시험법은 시료를 검화시켜 불검화물을 추출한 후 박층크로마토그래피(TLC)에 전 개시켜 표준품과의 반점위치를 비교하여 정성하는 방법이다. 불검화물 추출 증발 탈수 / 건조 박층크로마토그래피 2. 안전주의사항 표준용액 제조 시 사용되는 헥산(hexane)은 호흡기도 자극, 피부 자극, 눈 자극, 흡 인 위험, 중추 신경 계통 억제, 신경 이상의 건강 위험성이 있다. 물리적인 위험으 로는 가연성이 매우 높은 액체 또는 증기이므로 증발 연소를 야기할 수도 있으므로 환기장치를 설치하고 보안경으로 눈 보호, 실험복 착용 및 안전장갑 등의 안전장비 를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 시험 중 수산화나트륨(Sodium hydroxide)은 삼키면 유해하며 호흡기도, 피부, 눈, 점막에 화상을 입힐 수 있고 물과 접촉 시 반응 할 수 있어 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 환류냉각기 분액여두 327

331 3.1.3 박층크로마토그래프판(Thin layer chromatograph plate) 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 바틸알콜(DL-Batyl alcohol) 분자식 : C 21 H 44 O 3, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 에틸에테르(Ethyl ether) 무수황산나트륨(Sodium sulfate anhydrous) 헥산(n-Hexane) 초산에틸(Ethyl acetate) 에탄올(Ethanol) 4.3 시액의 조제 N 에탄올성 수산화나트륨 수산화칼륨 4 g을 소량의 증류수에 녹인 후 에탄올을 가하여 100 ml로 한다. 5. 시험과정 5.1 비비누화물 추출 시료 약 5 g을 정밀히 취하여 환저플라스크에 넣는다 N 에탄올성 수산화나트륨 50 ml를 가한다 환류냉각기를 이용하여 100 에서 1시간 30분 동안 혼화 1) 한 후 에탄올을 증발시킨다 열수를 가한 다음 분액여두로 옮긴다 이 용액에 에틸에테르를 첨가 2) 하고 혼합한 후 정치하여 에틸에테르층을 취한다 물층은 다시 에틸에테르를 가해 세척하여 이전의 에틸에테르층에 합한다(3 회 반복) 에틸에테르층에 증류수 30 ml를 가해 교반한 후 증류수층을 제거한다. (페놀프탈레인 시액으로 붉은색이 나타나지 않을 때 까지 반복 3) 한다) 에틸에테르층을 무수황산나트륨으로 탈수시켜 증발 건조한 후 비비누화물 로 한다. 5.2 표준용액 DL-바틸알콜 표준물질 50 mg을 취하여 에테르에 녹여 10 ml로 한다. 328

332 5.3 시험용액 비비누화물을 에테르 10 ml에 녹여 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 박층크로마토그래피 조건 항목 조건 흡착제 실리카겔 60F 254 전개용매 헥산 초산에틸 에탄올(10 : 8 : 1) 점적량 발색제 5 μl 0.1% 로다민B 에탄올 용액 7. 참고문헌 7.1 D. Cagnianta, I. Nosyrevb, V. Cebollac, J.Velac, L. Membradoc, R. Grubera : Structural modifications of petroleum asphaltenes by reductive alkylation investigated by TLC-FID, Fuel 80, , Chung-May Wu : Seperation of the four butyl alcohol isomers on a cation-exchange resin column, J, Chromatogr.,57, , 시험 주의사항 1) 목적하는 온도가 되었을 때부터 정확히 시간을 지켜야 한다. 2) 에테르 처리시 에멀젼을 방지하기 위하여 최초 2회 정도는 가볍게 흔들어 주 고, 분액여두 내에서 반응용매 진탕시 용매 증기가 모두 빠질 때 까지 초기 3 4회는 가볍게 흔들고, 여두의 코크를 열어 주어야 한다, 3) 수세가 충분히 이루어지지 않으면 수용성 물질이 남게 되므로 충분히 수세하 여야 한다. 329

333 Ⅲ 옥타코사놀 1. 시험방법의 원리 옥사코사놀은 불용성의 고체 밀납 물질이며, 지방족 알코올에 속한다. 옥사코사놀의 공급은 단조롭고 반복된 운동으로 지친 훈련된 랫트의 생화학적 수치와 지구력을 늘려주는 것으로 나타났으며, 내구력이나 체력 및 활력을 증진하 는 기능이 있어 캅셀이나 과립 형태의 건강식품으로 상품화되어 있다. 옥사코사놀 의 흡수율은 개체에 따라 차이가 많으며 사람과 랫트는 11%, 토끼는 28%범위에서 흡수 및 소화가 된다. 지방 함량이 높은 식품은 옥사코사놀의 흡수를 높여주며 소장으로부터 림프 안으로 흡수된다. 시료를 검화시킨 후 옥타코사놀을 추출하여 FID 검출기를 부착한 가스크로마토그 래프로 분석하고 면적비를 통하여 정량한다. 검화/옥타코사놀 추출 진탕 가스크로마토그래피 2. 안전주의사항 에틸에테르(Ethyl ether)와 수산화나트륨(Sodium hydroxide)호흡기도 자극, 피부 자극, 눈 자극, 중추 신경 계통 억제의 건강 위험성이 있고 물리적 위험으로는 가연 성이 매우 높은 액체 또는 증기이므로 증발 연소를 야기할 수도 있고 물질의 흐름 또는 혼합에 의하여 정전기가 발생할 수도 있어 환기가 잘 되는 곳에서 실험복 착 용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 비누화용 플라스크 분액여두 증류플라스크 3.2 분석장비 가스크로마토그래프 불꽃이온화검출기(Flame Ionization Detector) 칼럼오븐 % dimethylpolysiloxane (안지름 0.32 mm, 길이 50 m, 필름두께 0.5 μ m thickness) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 분석시작 전에 주입부 및 검출기 온도, 유량, 칼럼 온도를 분석조건에 맞게 조 330

334 작하고, 가스크로마토그래프를 충분히 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 옥타코사놀(1-octacosanol) 분자식 : C 28 H 58 O, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 에틸에테르(Ethyl ether) 아세톤(Acetone) 무수황산나트륨(Sodium sulfate anhydrous) 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 4.3 시액의 조제 N 에탄올성 수산화칼륨 수산화칼륨 5.61 g을 소량의 증류수에 녹인 후 에탄올을 가하여 100 ml 로 한다. 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 옥타코사놀 표준물질 25 mg을 정확히 취하여 에틸에테르에 녹여 50 ml로 한다. 5.2 시험용액의 조제 시료 약 5 g을 비누화용 플라스크에 정확히 취한다 N 에탄올성 수산화칼륨액 50 ml를 넣고 냉각기를 부착하여 수욕상 또 는 열판에서 자주 흔들어주면서 천천히 가열하여 1시간 동안 비등 비누화 1) 시킨다 비누화 반응 종료 후, 소량의 온수로 냉각기를 씻어 내리고 냉각기를 떼어 낸 후 온수 100 ml로 비누화용 플라스크를 씻으면서 비누화액을 분액여두 에 옮긴다 증류수 50 ml를 가하여 혼합한 후 상온으로 식힌다 에틸에테르 100 ml로 비누화용 플라스크를 씻어서 분액여두에 넣고 마개 를 한 후 1분간 격렬히 진탕 2) 한 후, 두 층으로 확실히 분리될 때까지 방 치한다 분리된 하층은 다른 분액여두에 옮겨 에틸에테르 50 ml를 넣고 [5.2.4]의 과정을 수행한다(총 3회 추출). 331

335 5.2.7 추출된 에틸에테르층을 하나의 분액여두에 합하고, 각 분액여두는 에틸에테 르를 이용하여 여러 번 씻는다 이에 증류수 30 ml씩을 가하여 흔든 후 충분히 방치하여 씻은 액이 페놀 프탈레인 시액으로 착색되지 않을 때까지 씻어준다 에틸에테르층은 무수황산나트륨으로 탈수한 후 500 ml 증류 플라스크에 옮기고, 수기들은 에틸에테르로 씻어 합한다 에틸에테르의 대부분을 증류시킨 후 아세톤으로 증류플라스크의 내면을 충분히 씻어 50 ml로 하여 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 가스크로마토그래프 조건 항목 조건 주입부 온도 250 칼럼 온도 50 (2분)-5 /분-310 (15분) 검출기 온도 325 캐리어 가스 및 유량 헬륨, 1.0 ml/분 Split ratio 10 : 시료분석 크로마토그램 332

336 6.3 계산 옥타코사놀 함량(mg/g) = C (a b)/s C : 시험용액 중의 옥타코사놀의 농도(mg/mL) a : 시험용액의 전량(mL) b : 희석배수 S : 시료 채취량(g) 7. 참고문헌 7.1 J.J. Jimenez, J.L. Bernal, Ma.J. del Nozal, Ma.T. Martın, J. Bernal : Sample preparation methods for beeswax characterization by gas chromatography with flame ionization detection, Journal of Chromatography A, 1129, , Alberto dos Santos Pereira, Silvia Albero Carbonell, Francisco Radler de Aquino Neto, Ana Claudia Fernandes do Amaral, Roderick A. Barnes : High-temperature gas chromatography ass spectrometry with glass capillary columns for the screening of natural products, Journal of Chromatography A, 947, , 시험 주의사항 1) 분석대상이 동물성식품이 많을 경우 주 성분인 단백질과 지질을 가용성으로 만들기 위하여 알카리로 검화 처리를 한다. 목적하는 온도가 되었을 때부터 정 확히 시간을 지켜야 한다. 당질이 많은 시료의 경우 처리 중 굳어지는 것을 방 지하기 위하여 유리봉 등으로 저어 주는 것도 좋다. 불검화물이 많은 시료의 경우 알카리성에서 석유에테르로 추출하여 제거 하여야 한다. 2) 에테르 처리 시 에멀젼을 방지하기 위하여 최초 2회 정도는 가볍게 흔들어 준다. 333

337 Ⅲ 히드록시-2-데센산(10-HDA) 1. 시험방법의 원리 10-히드록시-2-데센산(10-HDA)은 로얄젤리에 다량 함유되어 있는 성분으로 로얄젤 리의 등급도 10-HDA의 함량에 결정될 정도로 큰 작용을 한다. 또한 인체의 항산화 기능을 도와 노화를 방지하고 각종 필수 영양분이 다량 포함되어 피로 회복과 영양 섭취에 효과적이다. 10-히드록시-2-데센산은 일종의 천연 불포화 지방산으로써 강력한 항산화 작용을 하며 특히 유방암에 큰 작용을 한다. 최근 연구에서 10-HDA는 면역 조정과 항산화 력에 뛰어난 효과가 있는 것으로 밝혀져 의학계에서 아주 중요한 부분으로 각인되 고 있다. 본 시험법은 시료로부터 10-히드록시-2-데센산을 증류수를 이용하여 추출한 후 역 상칼럼을 통하여 분석하는 방법으로 최대 흡수파장인 210 nm에서 검출하여 정량한다. 증류수 추출 Filtration 가온 / 진탕 초음파 진탕 역상칼럼 분석 214nm에서 검출 액체크로마토그래피 2. 안전주의사항 시약으로 사용되는 인산 제2암모니아(Ammonium phosphate dibasic)는 단기노출 시 호흡곤란, 폐출혈 등을 야기하며 피부 자극 및 섭취 시 화상, 구토 그리고 소화 불량을 야기하므로 환기가 잘 되도록 국소배기를 설치하고 안전장비를 갖추고 취급 에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 부피플라스크(500 ml) 용매용 일회용 실린지 여과용 멤브레인 필터(0.45 μm) 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 칼럼오븐 옥타데실실릴화한한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 150 mm, 충진재octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 334

338 3.3 분석장비의 준비 이동상으로 0.02 M (NH 4 ) 2 HPO 4 : 메탄올(7 : 3) 혼합액(pH 7.0)을 한 후 용매를 분당 0.8 ml를 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 히드록시-2-데센산(10-Hydroxy-2-Decenoic Acid) 분자식 : C 10 H 18 O 3, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 인산 제2암모니아(Ammonium phosphate dibasic) 메탄올(Methanol) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 HDA 표준물질을 황산데시케이터에 건조시킨 후, 약 10 mg을 100 ml 부피플라스크에 정밀히 취한다 메탄올을 표선까지 채운다 이 용액을 희석 1) 하여 각 농도로 만든 후 여과한다. 5.2 시험용액의 조제 HDA로서 48 mg에 해당하는 양의 시료를 취하여 500 ml 부피플라스 크에 넣는다. 단, 연질캡슐제품은 내용물과 피막을 함께 취한다. 캡슐제품 의 경우 20캡슐이상을 취하여, 캡슐을 절개하고 개개의 내용물의 무게를 정밀하게 달아 평균무게를 구하여 1캡슐의 평균무게로 한다 증류수 약 50 ml를 넣고 50 에서 가온 2) 진탕 혼합한다 메탄올 350 ml를 넣은 후 30분간 초음파 진탕 추출한다 메탄올을 표선까지 채운 다음 여과하여 검액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표1. 고속액체크로마토그래프 조건 335

339 항목 조건 주입량 5 μl 칼럼 온도 30 이동상 0.02 M (NH 4 ) 2 HPO 4 : 메탄올 (7 : 3, v/v) (ph 7.0, 인산으로 조정) 검출기 파장 210 nm 유속 0.8 ml/분 6.2. 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 3) 10-HDA 함량 (%) =A s /A t S t /S S 100 A s A t S t S S : 검액 중의 10-HDA의 피크면적 : 표준용액 중의 10-HDA의 피크면적 : 표준물질 취한 량(mg) : 시료 채취량(mg) 100 : 단위 환산 계수 7. 참고문헌 7.1 JINHUIZHOU, XIAOFENG XUE, YI LI, JINZHEN ZHANG, and JINGZHAO : Optimized Determination Method for iraws-10-hydroxy-2-decenoic Acid Content in Royal Jelly by High-Performance Liquid Chromatography with an Internal Standard, JOURNALOF AOAC INTERNATIONAL VOL. 90, , No, I Luis Henrique GARCIA-AMOEDO, Ligia Bicudo de ALMEIDA-MURADIAN : Determination of trans-10-hydroxy-2-decenoic acid (10-HDA) in royal jelly 336

340 from sao paulo state, brazil, Cienc. Tecnol. Aliment., Campinas, 23, 62-65, Mahmut Genc, Abdurrahman Aslan : Determination of trans-10-hydroxy-2-decenoicacid content in pure royal jelly and royal jelly products by column liquid chromatography, Journal of Chromatography A, 839, , Tetsuya KODAI, Kazue UMEBAYASHI, Takafumi NAKATANI, Kaori ISHIYAMA, Naoki NODA : Compositions of Royal Jelly II. Organic Acid Glycosides and Sterols of the Royal Jelly of Honeybees (Apis mellifera), Chem. Pharm. Bull. 55(10), , 시험 주의사항 1) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 2) 가열 반응은 반응시키는 수욕조나 가열기를 목적하는 온도로 미리 맞추어 두 어 목적온도에서의 시간을 정확히 유지토록 한다. 3) 정화한 결과값 계산을 위하여 내부 표준물질을 사용할 수도 있다. 337

341 Ⅲ 총(-)-Hydroxycitric acid 1. 시험방법의 원리 Hydroxycitric acid는 가르시니아 캄보지아 추출물로부터 유래되었다. 이것은 Guttiferae과의 식물로서 인도 남서부에서 자생하는 열대 식물인 가르시니아 캄보 지아 열매의 껍질 부위를 사용하며, 껍질에는 기능성분인 hydroxycitric acid(이하 HCA)가 약 10~30% 함유되어 있다. 동남아시아에서는 카레 등의 향신료로 사용되고, 남부 인디아 해안지역에서는 수 세기동안 돼지고기 및 생선의 산미제로서 사용되어 왔다. 가르시니아 캄보지아 추 출물은 1969년 Brandeis University의 연구자들이 HCA의Krebs/citric acid cycle 억 제제로서의 역할을 제시하여 신체 내에서 탄수화물로부터지방합성을 감소시킨다는 사실이 연구되기 시작하였다. (-)-HCA는 free form과 lactone form이 있으며, free form은 제조과정 중 농축과 증발과정에서 lactone form으로 고리화(lactonization)가 쉽게 일어난다. 따라서 (-)-HCA를 안정화하기 위해 칼슘, 나트륨, 칼륨 등의 염의 형태로 제조하는 것이 보편적인 것으로 알려져 있다. 본 시험법은 10 mm황산용액을 이용하여 시료 중 Hydroxycitric acid를 충분히 추 출하여 액체크로마토그래프를 통해 분석하는 방법으로 자외부흡광광도검출기를 이 용하여 정성 및 정량분석을 한다. Hydroxycitric acid 추출 자외부흡광광도검출 Filtration 액체크로마토그래피 2. 안전주의사항 황산(Sulfuric acid)은 적절한 환기 하에서 취급이 이루어져야 하고 눈, 피부, 의복 에 접촉시키지 않아야 하며 용기는 완전히 밀폐 시켜두어야 한다. 보안경으로 눈 보호, 실험복 착용 및 안전장갑 등의 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울이고 취급 후에는 철저히 씻어야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 부피플라스크(100 ml) 여과용 멤브레인 필터 액체크로마토그래프용 유리병 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 338

342 3.2.2 자외부흡광광도검출기 칼럼오븐 옥타데실실릴화한한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상인 10 mm 황산용액을 이용하여 용매를 분당 0.7 ml로 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 (-)-thero-hydroxycitric acid calcium 분자식 : C 12 H 10 Ca 3 O 16, 분자량 : (-)-Hydroxycitric acid lactone 분자식 : C 6 H 6 O 7, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 황산(Sulfuric acid) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 각각의 표준물질 일정량(2mg/mL)을 정밀하게 달아 부피플라스크에 넣는 다 증류수를 표선까지 채워 완전히 용해한다 이를 증류수로 희석 1) 하여 표준용액 2) 으로 한다(냉장보관) 5.2 시험용액의 조제 시료 0.5~1 g을 정밀하게 달아 100 ml부피플라스크에 넣는다 증류수를 표선까지 채워 용해한다 위 용액을 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다 339

343 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건 항목 주입량 검출기 파장 이동상 3) 유속 조건 20 μl 214 nm 10 mm 황산용액 (증류수를 사용하여 ph를 2.4로 조절) 0.7 ml/분 6.2. 시료분석 크로마토그램 6.3 계산 (-)-Hydroxycitric acid free 함량(mg/g) = A (B/S) P (1/1,000) A : 시험용액 중 (-)-Hydroxycitric acid calcium의 농도(μg/mL) B : 시험용액의 전량(mL) S : 시료 채취량(g) P : 표준품의 (-)-Hydroxycitric acid로의 순도 (-)-Hydroxycitric acid lactone 함량(mg/g) = A (B/S) P (1/1,000) A : 시험용액 중 (-)-Hydroxycitric acid lactone의 농도(μg/mL) B : 시험용액의 전량(mL) S : 시료 채취량(g) P : 표준품의 순도 총(-)-Hydroxycitric acid 함량(mg/g) = (-)-Hydroxycitric acid free 함량 + 340

344 (-)-Hydroxycitric acid lactone 함량 7. 참고문헌 7.1 G.K. Jayaprakasha, K.K. Sakariah: Determination of organic acids in Garcinia cambogia (Desr.) by high-performance liquid chromatography, Journal of Chromatography A, 806, , PAUL KUCERA. STEPHEN A. MOROS and ARTHUR R. MLODOZENIEC : DIFFERENTIAL FRONTAL ANALYSIS OF CARBOXYLIC ACIDS, Journaul of chromatography, 210, , 시험 주의사항 1) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조 시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 2) (-)-Hydroxycitric acid calcium표준용액은 분석시 제조하여 사용하도록 한다. 3) 제품 분석의 경우 일부 수용성 비타민(비타민C, 나이아신 등)에 의해 간섭현상이 있 을 수 있으며, 이동상의 ph를 조절하여 분리 정량하도록 한다. 341

345 Ⅲ 루테인 1. 시험방법의 원리 루테인의 원료인 마리골드 꽃 추출물에는 루테인의 4% 정도가 제아크산틴이며 야 채와 과일에서도 발견된다. 루테인은 카로틴과 함께 널리 분포하는 천연색소의 하 나로써 식물의 녹색부에 다량 함유되어 있다. 꽃잎이나 과실에도 유리 또는 에스테 르 형태로 널리 분포된다. 식물의 녹색잎의 건조분말을 에테르로 추출해 비누화를 거쳐 정제해서 얻는다. 식물의 엽록체 속에 많이 함유되어 있고 동물계에서도 자주 볼 수 있으며 난소의 황체 세포 안에 있는 황색 색소의 호르몬이기도 하다. 루테인의 자주색 주상결정은 메탄올에서 재결정하고, 1분자의 결정메탄올을 함유 한다. 녹는점 193 로서 벤젠 에탄올 등 유기용매에 녹고 석유벤진에는 거의 녹지 않고 물에는 녹지 않는다. 본 시험법은 용매혼합용액으로 추출하고 에탄올로 희석한 용액을 자외분광광도계 446 nm에서 총 카로티노이드 함량을 구하고 고속액체크로마토그래프/자외부흡광광도 검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대흡수파장인 446 nm에서 검출하여 정량 분 석한다. 카로티노이드 함량 자외분광광도 고속액체크로마토그래피 자외부흡광광도검출 2. 안전주의사항 표준용액 제조 시 사용되는 헥산(hexane)은 호흡기도 자극, 피부 자극, 눈 자극, 흡 인 위험, 중추 신경 계통 억제, 신경 이상의 건강 위험성이 있다. 물리적인 위험으 로는 가연성이 매우 높은 액체 또는 증기이므로 증발 연소를 야기할 수도 있으므로 환기장치를 설치하고 보안경으로 눈 보호, 실험복 착용 및 안전장갑 등의 안전장비 를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 톨루엔(Tolune)은 섭취 시 기도에 치명적일 수 있으며 호흡기계에 자극을 일으키고 장기간 또는 반복노출 시 장기에 손상을 일으킨다. 또한 태아 혹은 생식능력에 손 상을 일으킬 수도 있으므로 환기장치를 설치하고 보안경으로 눈 보호, 실험복 착용 및 안전장갑 등의 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 용매용 일회용 실린지 여과용 멤브레인필터 및 디스크형 멤브레인필터 액체크로마토그래프용 유리병 342

346 3.1.4 부피플라스크(100 ml) 질소농축기 질소가스 3.2 분석장비 자외분광광도계(UV/Visible Spectrophotometer) 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 silica 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 silica gel) 또는 이와 동 등한 것 컬럼오븐 3.3 분석장비의 준비 이동상은 헥산과 에틸아세테이트를 70:30으로 혼합한 용액을 분당 0.8mL씩 충분한 시간동안 흘려서 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 루테인(Lutein) Lutein (3R,3"R,6"R-β,ε-carotene-3,3'-diol, l-trans-lutein, 5'didehydro-5'6'dihydro-beta, beta-caroene-3,3'diol) 분자식 : C 40 H 56 O 2 분자량 : , CAS No. : OH HO 4.2 일반시약 에탄올(Ethanol) 헥산(Hexane) 아세톤(Acetone) 톨루엔(Toluene) 에틸아세테이트(Ethyl Acetate) 5. 시험과정 5.1 용매혼합용액 제조 헥산 1000 ml, 에탄올 600 ml, 아세톤 700 ml, 톨루엔 700 ml을 2000 ml 부피플라스크에 담아 흔들어 1) 섞는다. 5.2 시험용액 제조 시료(루테인으로서) 80~120 mg을 100 ml 부피플라스크에 담는다. 343

347 5.2.2 용매혼합용액(헥산:에탄올: 아세톤:톨루엔 10:6:7:7)을 넣어 표선까지 맞춘 다 위 시료혼합액 중 1 ml을 취하여 100 ml 부피플라스크에 담고 에탄올을 넣어 표선 까지 맞춘다. 5.3 정량시험 에탄올을 대조액으로 하여 용액을 자외분광광도계 446 nm에서 흡광도를 측정한다 용액 1 ml을 취한 후 질소가스를 이용하여 완전히 건조시킨 후 이동상 2 ml을 넣어 충분히 용해시킨 것을 액체크로마토그래피로 측정한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건 항목 조건 주입량 10 μl 칼럼온도 30 이동상 A: 85% MeOH/water, Buffered with 0.5M am hexane : ethly acetate(70 : 30) 검출기 파장 446 nm 유량 0.8mL/분 분석시간 25분 표 2. 이동상 조건 시간 A용액 (%) B용액 (%) C용액 (%)

348 6.2. 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 총카로티노이드 함량(%)=(A 10,000) /(B 2,550) A : 446 nm에서 측정된 흡광도시료의 농도(μg/mL) B : 시료의 채취량(g) 2,550 : 에탄올 분산 제형에서 루테인의 계수(1%, 1cm) 10,000 : 희석배수 루테인 함량(%) = 총 카로티노이드 함량(%) (루테인 peak 면적(%)/100) 7. 참고문헌 7.1. Michael W. Schaffer, Somdutta Sinha Roy, Shyamali Mukherjee, Salil K. Das : Identification of lutein, a dietary antioxidant carotenoid in guinea pig tissues, Biochemical and Biophysical Research Communications 374, , M.A. van Leeuwe, L.A. Villerius, J. Roggeveld, R.J.W. Visser, J. Stefels : An optimized method for automated analysis of algal pigments by HPLC, Marine Chemistry 102, , Dietmar E. Breithaupt Jrg Schlatterer : Lutein and zeaxanthin in new dietary supplements analysis and quantification, Eur Food Res Technol 220: , 시험 주의사항 1) 반응용매 진탕시 용매 증기가 모두 빠질 때 까지 초기 3 4회는 가볍게 흔들 고, 용기의 코크를 열어 증기를 빼주어야 한다. 345

349 Ⅲ 아스타잔틴 1. 시험방법의 원리 아스타잔틴은 산화물인 독성산소에 의한 유전자, 효소, 세포막등의 파손 등을 막아 주는 강력한 항산화제로서 널리 알려진 항산화제인 beta-carotene (베타-카로틴)과 비슷한 화학적인 구조를 가지고 있다. 그러나 작은 구조적 차이가 큰 화학적, 생물 학적 차이를 보이며 대표적인 항산화제인 비타민E 보다 550~1000배정도의 항산화 력을 가지고 있다. 상업적으로 생산되는 천연 아스타잔틴은 성장이 빠르며 아스타 잔틴의 함량이 높은 해조류인 Haematococcus pluvialis가 생산하는 것이 대표적이 며 이밖에 Phaffia rhodozyma 또는 Antarctic krill의 추출물이 있으나 함량이 낮다. 아스타잔틴은 화학적으로 합성할 수 있으나 합성 아스타잔틴은 관상용 어류의 색상 보조제로 사용되지만 천연 아스타잔틴과 구조이성질체가 달라 식용으로 사용할 수 없다. 본 시험법은 시료를 아세톤으로 녹여 추출하고 cholesterol esterase를 넣어 아스타 잔틴에 붙어있는 ester기를 분리시킨 후 정제하여 아세톤으로 녹인 용액을 액체크로마 토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대흡수파장인 474nm에서 검출하여 정량 분석한다. 아세톤첨가 용해 / 추출 액체크로마토그래피 방냉 / 원심분리 자외부흡광광도검출 ester기 분리 / 정제 Filtration 2. 안전주의사항 표준용액 제조 시 사용되는 헥산(hexane)은 호흡기도 자극, 피부 자극, 눈 자극, 흡 인 위험, 중추 신경 계통 억제, 신경 이상의 건강 위험성이 있다. 물리적인 위험으 로는 가연성이 매우 높은 액체 또는 증기이므로 증발 연소를 야기할 수도 있으므로 환기장치를 설치하고 보안경으로 눈 보호, 실험복 착용 및 안전장갑 등의 안전장비 를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 석유 에테르(petroleum ether)는 호흡기도 자극, 피부 자극, 눈 자극, 중추 신경 계 통 억제의 건강 위험성이 있고 물리적 위험으로는 가연성이 매우 높은 액체 또는 증기이므로 증발 연소를 야기할 수도 있고 물질의 흐름 또는 혼합에 의하여 정전기 가 발생할 수도 있어 환기가 잘 되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안 전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 황산나트륨(Sodium sulfate decahydrate)은 적절한 환기 하에서 취급이 이루어져야 하고 눈, 피부, 의복에 접촉시키지 않아야 하며 용기는 완전히 밀폐 시켜두어야 하 고, 취급 후에는 철저히 씻어야 한다. 346

350 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 부피플라스크(200 ml, 100 ml) 액체크로마토그래프용 유리병 용매용 일회용 실린지 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터 원심분리기 ml 원심분리관 초음파진탕기 항온수조 감압농축기 3.2 분석장비 자외분광광도계(UV/Visible Spectrophotometer) 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 YMC Carotenoid 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250mm) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상인 메탄올, MTBE, 1% 인산용액(81:15:4)을 분당 1.0 ml씩 충분한 시 간동안 흘려 기기를 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 아스타잔틴(Astaxanthin) Astaxanthin(3,3'-Dihydroxy-β,β-carotene-4,4'-dione) 분자식 : C 40 H 52 O 4, 분자량 : , CAS No. : O OH HO O 4.2 일반시약 헥산(Hexane) 아세톤(Acetone) 석유 에테르(petroleum ether) 메탄올(Methanol) MTBE(t-buthylmethylether) mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0) 347

351 4.2.7 황산나트륨(Sodium sulfate decahydrate) Cholesterolesterase(22unit/mg) 인산용액(Phosphoric acid) 무수황산나트륨(Sodium sulfate Anhydrous) 5. 시험과정 5.1 Cholesterol esterase 용액의 조제(사용직전에 조제) Cholesterol esterase가 4 unit/ml이 되도록 50 mm Tris-HCL 완충액 (ph7.0)에 용해 시킨다. 5.2 내부표준용액 1) 의 조제 내부표준용액(trans-β-apo-8'-Carotenal) 1 mg/ml 농도의 용액 7.5 ml을 200 ml 부피플라스크에 정밀히 취한다 아세톤 100 ml을 첨가하여 완전히 용해시킨 후 방냉한다 아세톤을 넣어 표선까지 맞춘다. 5.3 표준원액의 조제 아스타잔틴 표준품 5 mg을 200 ml 부피플라스크에 정밀히 취한다 ml의 아세톤을 넣고 10분간 초음파 처리하여 용해 후 방냉한다 아세톤을 넣어 표선까지 맞춘다. 5.4 표준용액 농도산출을 위한 시험 ml 부피플라스크에 표준 원액 1.5 ml 3.0 ml, 3.6 ml을 정밀히 취한다 아세톤을 넣어 표선까지 맞춘다 용액을 아세톤을 대조액으로 하여 474nm에서 흡광도를 측정한다. 5.5 HPLC 측정을 위한 표준용액 조제 ml 부피플라스크에 표준 원액 1.5 ml 3.0 ml, 3.6 ml을 정밀히 취한다 내부표준용액 10 ml을 넣는다 아세톤을 넣어 표선까지 맞춘다. 5.6 시험용액의 조제 시료를 60~70 수욕 상에서 가온하여 시료를 용해시킨다. (시료가 응고되어 있거나 침전물 발생시) 용해된 시료 약 50 mg(아스타잔틴으로서)을 100 ml 부피플라스크에 정밀 히 취한다 아세톤 50 ml을 넣어 완전히 용해시킨 후 표선까지 맞춘다 용액을 아세톤으로 10배 희석한 것을 시험용액으로 한다 ml 원심분리관에 시험용액 3 ml 내부표준용액 1 ml, Cholesterol esterase 용액 3 ml을 넣는다 수욕상에서 5~15분마다 흔들어주면서 45분간 반응시킨다 효소 분해 후 황산나트륨 1 g과 석유 에테르 2 ml을 첨가한다. 348

352 5.6.8 위 용액을 30초간 혼합 후 2,000 G로 3분간 원심 분리한다 석유에테르층을 취한 것에 황산나트륨 1 g을 넣어 탈수한다 탈수된 석유 에테르층을 감압 농축하여 건조 후 아세톤 3 ml을 넣어 초 음파 처리하여 용해시킨다 위 용액을 0.45μm 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건 항목 주입량 조건 20 μl 칼럼온도 25 이동상 유속 검출기 파장 A : 메탄올, B : MTBE, C : 1%인산용액 1.0 ml/분 474 nm 표 2. 이동상 조건 시간 A용액 (%) B용액 (%) C용액 (%)

353 6.2. 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 아스타잔틴의 농도(μg/mL) = (474nm흡광도 10,000)/2,100 2,100 : 474nm에서 1cm cuvette의 1% 아스타잔틴의 기준 흡광도값 내부표준물질 대비 아스타잔틴 이성질체 RT (이성질체의 상대머무름시간 = 각 아스타잔틴 이성체의 머무름시간/내부표준물 질 머무름시간) 아스타잔틴의 이성질체명 상대머무름시간 13-cis 아스타잔틴 trans 아스타잔틴 cis 아스타잔틴 면적비=(P trans +(1.3 P 13-cis ) (1.1 P 9-cis ))/P i.s P trans P 13-cis P 9-cis A : trans 아스타잔틴의 피크면적 A : 13-cis 아스타잔틴의 피크면적 A : 9-cis 아스타잔틴의 피크면적 1.3 : 13-cis를 trans 아스타잔틴으로 전환계수 350

354 1.1 : 9-cis를 trans 아스타잔틴으로 전환계수 아스타잔틴의 함량(%)=A (1000 * /B) 1/ A : 시험용액 중 아스타잔틴의 농도 (μg/ml) B : 시료 채취량(mg) 1000 * : 시험용액의 전량(mL) 7. 참고문헌 7.1 Schuep W. and J. Schierle : Astaxanthin Determination of stabilized, added astaxanthin in fish feeds and pre-mixes.in: Carotenoids Isolation and Analysis Volume 1A, pp , Vecchi M., V. Muduna, and E. Glinz :HPLC separation and determination of astacene, semiastacene, and other keto-carotenoids. J. High Res. Chrom, Chrom. Commun. 10: , Hua-Bin Li, Feng Chen : Preparative isolation and purification of astaxanthin from the microalga Chlorococcum sp. by high-speed counter-current chromatography. Journal of Chromatography A, 925, , 시험 주의사항 1) 크로마토그램에서 내부표준물질 피크와 중첩되는 방해 피크가 존재 할 경우 내부표준물질을 가하지 않은 시험용액을 만들어서 적당한 피크를 기준으로 하 여 두 가지 시험용액을 비교하여 내부 표준물질 피크의 면적을 보정하여야 한 다. 351

355 Ⅲ.3.6 페놀류 Ⅲ 카테킨 1. 시험방법의 원리 카테킨은 플라보노이드 그룹의 flavan-3-ols에 속하며, 폴리페놀 일종으로 녹차의 떫은 맛 성분이다. 차류(Camellia sinensis)에서 파생되었으며, 백차, 녹차, 홍차, 우 롱차에 포함되어 있다. 그러나 홍차나 우롱차의 경우 발효과정에서 반 이상의 카테 킨이 줄어든다. 찻잎 중의 폴리페놀은 온화한 쓴맛을 내는 유리형 카테킨과 쓰고 떫은맛을 내는 에스터형 카테킨, 강한 쓴맛과 약한 떫은맛을 내는 결합형 카테킨이 있어 감의 타 닌과는 달리 단백질과 분리되어 입안이 텁텁하지 않다. 주요한 카테킨으로는 에피 갈로카테킨갈레이트(EGCG: epigallocatechingallate), 에피갈로카테킨(EGC: epigallocatechin), 에피카테킨갈레이트(ECG: epicatechingallate), 에피카테킨(EC: epicatechin)이 있다. 건강기능식품의 기준 및 규격 에서 제시한 녹차추출물의 섭취량은 카테킨으로 서 300~1,000 mg에 해당되며 이 때의 EGCG 함량은 일반적으로 전체 카테킨의 40% 정도에 해당한다. 주로 EC, EGC, ECG, EGCG와 이들의 광학이성질체 등이 존 재한다. 일반적으로 이 네 가지가 차 카테킨류로 불리워지며, 이 중 EGCG가 가장 많은 양을 차지하며, 생리활성 또한 가장 높은 것으로 알려져 있다. 카테킨의 항산화 작용과 자유라디컬 제거기능은 비타민C와 비타민E에 비해 강력 한 활성산소 제거효과를 가지고 있으며, 항산화작용으로 인하여 저밀도지단백(low density lipoprotein) 산화와 같은 심혈관계 보호효과가 보고되었다. 카테킨은 바람 직하지 않은 세포군집의 생산과 개시를 멈추거나 느리게 하며, DNA 손상을 경험적 으로 야기하는 것들을 저지하는 것으로 나타났다. 본 시험법은 시료 중 존재하는 카테킨을 80% Methanol, 100% Methanol로 추출하 여 Nova-pak C18 column을 통해 자외부흡광광도검출기(DAD)를 이용하여 280 nm 에서 검출하여 정량한다. 용매처리 HPLC Sonication 옥타데실실릴화한 칼럼 Filtration DAD detector 2. 안전 주의 사항 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴(Acetonitrile)은 흡입이나 섭취 시 구 토, 구역, 혈압변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의식불명 등의 증 352

356 상이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1. 실험실 장비 및 소모품 용매용 일회용 실린지 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터 HPLC용 유리병 Volumetric flask (10 ml) 초음파 진탕기(Sonication) 3.2. 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도계 칼럼오븐 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3. 분석장비의 준비 이동상은 0.1% 초산용액과 아세토니트릴 용액을 85 : 15의 비율로 분당 1.0 ml씩 충분한 시간 동안 흘려서 기기를 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1. 표준물질 에피갈로카테킨((-)-epigallocatechin, EGC) 분자식 : C 15 H 14 O 7, 분자량 : , CAS No. : 에피갈로카테킨갈레이트((-)-epigallocatechin-gallate, EGCG) 분자식 : C 22 H 18 O 11, 분자량 : , CAS No. :

357 4.1.3 에피카테킨 분자식 ((-)-epicatechin, EC) 분자량 : C15H14O6, 에피카테킨갈레이트 분자량 분자식 일반시약 아세토니트릴 메탄올 초산용액 증류수 ((-)-epicallocatechin-gallate, : C22H18O10, 4.2. : , CAS No. : : , CAS No. ECG) : (Acetonitrile) (Methanol, HPLC grade) (Acetic acid) (Distilled water) 시험과정 표준용액 제조 가지 표준물질 을 각각 부피플라스크에 넣는다 메탄올을 표선까지 채운다 적당량 희석 하여 검량선 작성에 사용 한다 시험용액 제조 시료 μ 를 에 넣는다 mg ) ml. 2) ) L 10 ml volumetric flask 354..

358 % 메탄올과 100% 메탄올을 각각 넣고 조심스럽게 흔든 뒤, 표선까지 맞춘다 약 10분 가량 초음파진탕기로 용해시킨다 메탄올을 이용하여 10배 희석 후, 0.45 µm 멤브레인 필터로 여과한 용 액을 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1. 기기분석 조건 다음 표 1, 2의 조건으로 사용하되 적용되는 기기에 따라 수정이 필요할 수 있다. 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건 항목 주입량 검출기 파장 조건 20 μl 280 nm 칼럼 온도 40 이동상 유속 A : 0.1% 초산용액, B : 100% 아세토니트릴 1.0 ml/분 표 2. 이동상 조건 시간(분) A용액(%) B용액(%) 표준물질 크로마토그램 355

359 6.3. 계산 개별카테킨(mg/g) = C (a b)/s 1/1,000 C : 시험용액 중 개별카테킨의 농도(μg/mL) a : 시험용액의 전량(mL) b : 희석배수 S : 시료 채취량(g) 1/1,000 : 단위 환산 계수 카테킨 함량(mg/g) = EGC(mg/g)+EGCG(mg/g)+EC(mg/g)+ECG(mg/g) 7. 참고문헌 7.1 박경련, 이상길, 남태규, 김영준, 김영록, 김대옥 : 보성산 유기농 녹차의 품질 에 따른 카테킨 함량과 항산화능 비교 분석, KOREAN J. FOOD SCI. TECHNOL., 41(1), 82-86, 이민준, 권대중, 박옥진 : 국내 시판되는 녹차, 우롱차 및 홍차의 카테킨 함량 과 항산화능 비교, KOREAN J. FOOD CULTURE, 22(4), , 강지훈, 박영광, 정성택, 노경호 : 녹차로부터 EGCG(Epigallocatechin Gallate)의 추출 및 정제, Korean J. Biotechnol Bioen., 14(5), , 시험 주의사항 1) EC, ECG, EGC, EGCG 4가지 카테킨 표준물질을 각각 1,000 μg/ml의 농도가 되게 메탄올로 표준원액을 조제한다. 2) 일례로 표준원액을 사용하여 4가지 카테킨 표준물질을 섞어 다음과 같은 농도 가 되게 메탄올로 희석하여 제조한다. - catechin 1 : EC 5 μg/ml, ECG 5 μg/ml, EGC 5 μg/ml, EGCG 25 μg/ml - catechin 2 : EC 10 μg/ml, ECG 10 μg/ml, EGC 10 μg/ml, EGCG 50 μ g/ml - catechin 3 : EC 2 5μg/mL, ECG 25 μg/ml, EGC 25 μg/ml, EGCG 125 μ g/ml - catechin 4 : EC 50 μg/ml, ECG 50 μg/ml, EGC 50 μg/ml, EGCG 250 μ g/ml 3) 사용칼럼에 따라 표준물질의 용출 순서가 바뀔 수 있으므로, 분석 전에 각각의 표 준물질의 머무름시간을 확인한 후 표준물질 혼합액을 만드는 것이 바람직하다. 356

360 Ⅲ 안트라퀴논계화합물(무수바바로인으로서) Ⅲ 안트라퀴논계화합물(무수바바로인으로서)(제1법) 1. 시험방법의 원리 알로에는 백합목 백합과의 한 속으로 세계 여러 지역에서 오랫동안 사용되어 온 식물이며, 전 세계적으로 약 600 여종이 분포되어 있다. 현재 건강기능식품에서는 이 중 알로에 베라 (Aloe vera), 아보레센스(Aloe arborescence키타치), 사포나리아 (Aloe saponaria)의 잎만을 허용하여, 건강기능식품에서의 알로에 전잎 은 알로에 베라, 아보레센스, 사포나리아의 잎 중 비가식 부분을 제거한 후 건조하거나 분쇄 농축하여 식용에 적합하도록 한 것을 말한다. 또한, 안트라퀴논계 화합물의 함량은 0.2~5%이어야 한다. 보통 알로에 아보레센스 잎 분말 100%에서의 함량은 0.4~0.7% 라고 보고되어 있기도 하다. 알로에는 식품원료로 오랫동안 섭취하여 왔으나, The German Commission E Monographs(1998)에 의해 과량 섭취하는 경우 위 장관 경련, 전해질 불균형, 장점 막 색소침착, 장운동 둔화 등의 부작용이 보고된 바 있다. 알로에 전잎에 포함되어 있는 기능성분으로는 acemannan과 같은 polysaccharides와 glycoprotein, aloin 등 을 들 수 있다. 본 시험법은 메탄올 및 증류수를 이용하여 안트라퀴논계물질을 추출한 후, hydroxyanthracene 유도체성분으로 분광광도계를 이용하여 분석하는 방법이다. 유도 체의 최대 흡수파장인 512 nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량한다. 메탄올 혼합 / 진탕 여과 / 진탕 환류냉각 증발건조 흡광도 측정 2. 안전주의사항 표준용액 제조 시 사용되는 디클로로메탄(Dichloromethane)은 흡입시 유해, 호흡기 도 화상, 피부 화상, 눈 화상의 건강 위험성이 있고 용기가 열에 노출되면 파열되거 나 폭발할 수도 있으며 물 또는 습기가 많은 공기와 접촉하면 인화성 또는 유독성 가스가 발생할 수도 있으므로 환기가 잘 되는 곳에서 적절한 내화학성 보호의 및 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 357

361 3.1.1 부피플라스크(200 ml) 환류냉각기 분액여두 3.2 분석장비 분광광도계 3.3 분석장비의 준비 분광광도계는 분석 전에 충분히 안정화시켜둔다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 무수바바로인(Aloin A) 분자식 : C 21 H 22 O 9, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 메탄올(Methanol) 디클로로메탄(Dichloromethane) 염산(Hydrochloric acid) 4.3 시액의 조제 % 염화제2철용액 (Ferric chloride) N 수산화나트륨(Sodium hydroxide) % 메탄올초산마그네슘용액(Magnesium acetate) 5. 시험과정 5.1 시험용액의 조제 알로에건조분말 1 g을 취하여 메탄올 10 ml를 첨가한 후 60 의 증류수 10 ml를 가하여 혼합한다. 단, 검체에 기름이 다량 함유된 경우 용매를 사용 하여 기름을 제거하여야 한다. 또한, 혼합된 다른 성분이 결과에 영향을 미 치는 경우 이를 보정하여 시험한다 이후 60 증류수 75 ml를 가하여 30분간 진탕한다 냉각, 여과한 후 여액을 200 ml가 되도록 증류수로 채운다 여액 10 ml를 취하여 60% 염화 제2철용액 1 ml와 진한 염산 6 ml가 들어 있는 용기에 가한 후 환류냉각기를 설치하여 끓는 수욕조에서 4시간 358

362 동안 환류 1) 시킨다 이를 식힌 후 분액여두에 옮기고 냉각기 및 수기를 증류수 5 ml로 세척하고 분액여두에 합한다 이에 1 N 수산화나트륨 4 ml, 디클로로메탄 20 ml를 가해 추출하여 디 클로로메탄층을 다른 분액여두에 모은다(충분히 진탕하여 3회 반복) 분취한 디클로로메탄층을 증류수 10 ml로 세척한 다음 디클로로메탄을 이 용하여 100 ml로 한다 이 액 20 ml를 수욕 상에서 증발건조한 후 그 잔류물에 0.5% 메탄올초산 마그네슘용액 10 ml를 가하여 용해한 것을 시험용액으로 한다. 5.2 시험조작 메탄올을 대조액으로 하여 512 nm의 파장에서 흡광도를 측정한다. 6. 분석 및 계산 6.1 흡광도 측정 파장 512 nm에서 흡광도를 측정한다. 6.2 계산 안트라퀴논계물질(무수바바로인으로) 함량(mg/g) = A/ /20 200/10 1/S 10 A : 시험용액의 흡광도 S : 시료 채취량(g) 7. 참고문헌 7.1 Yuegang Zuoa, Chengjun Wang, Yuejuan Lin, Jinwen Guo, Yiwei Deng : by capillary gas chromatography coupled with flame ionization and massspectrometric detection, Journal of Chromatography A, 1200, 43-48, Eva Stodu lkova, Petr Man, Miroslav Kolarik, Miroslav Flieger : High-performance liquid chromatography ff line mass spectrometry analysis of anthraquinones produced by Geosmithia lavendula, Journal of Chromatography A, 1217, , 시험 주의사항 1) 가열 반응은 반응시키는 수욕조나 가열기를 목적하는 온도로 미리 맞추어 두 어 목적온도에서의 시간을 정확히 유지토록 한다. 359

363 Ⅲ 총 플라보노이드 1. 시험방법의 원리 플라보노이드는 C 6 -C 3 -C 6 를 기본골격으로 담황색 내지는 노란색을 띠고 있는 페놀 계 화합물의 총칭으로, 자연계에 널리 분포하고 있다. 그리고 채소류 이상의 고등식 물과 일부 녹조류만이 합성하고 동물은 합성능력이 없어 식물에만 존재하며, 채소 류와 유관속 식물의 잎, 꽃, 과실, 줄기, 뿌리 등 거의 모든 부위에 존재하고 있는 것으로 알려져 있다. 플라보노이드는 flavonol계의 quercetin, kaempferol, myricetin이 있으며, flavone계 의 apigenin, luteolin 그리고 limonin, momilin 등이 알려져 있다. 그리고 플라보노 이드 중에서 quercetin 등은 in vitro에서 low-density lipoprotein(ldl)의 산화와 cytotoxicity를 억제할 수 있다고 보고된 바 있다. 본 시험법은 에탄올을 이용하여 시료로부터 플라보노이드계물질을 추출하여 분광광도계를 이용하여 플라보노이드 의 최대 흡수파장인 415 nm에서 표준물질인 퀘세틴의 흡광도 검량선을 작성하여 시료의 흡광도를 측정한 후 대입하여 정량하는 방법이다. 에탄올 추출 원심분리 UV Spectrophotometer 2. 안전주의사항 흡광도 측정에 사용되는 질산알루미늄은 인체에 침입 시 산염에 의한 중독을 일으 키며 다량을 복용하면 사망에 이르기까지 한다. 질산알루미늄 사용 시 누설될 경우 충분한 물로 씻어내고 소다회를 첨가하고, 보호구 및 보호장비를 갖추고 취급에 주 의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 부피플라스크(50 ml, 100 ml) 분액여두 원심분리기 시험관 3.2 분석장비 분광광도계 3.3 분석장비의 준비 분광광도계는 분석 전에 충분히 안정화시켜둔다. 360

364 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 쿼세친(Quercetin) 분자식 : C 15 H 10 O 7 2H 2 O, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 에탄올(Ethanol) 4.3 일반시액 % 질산알루미늄용액(Aluminum nitrate) 질산알루미늄{Al(NO 3 ) 3 9H 2 O} 17.6 g을 정확히 달아 증류수로 용해하여 100 ml로 한다 M 초산칼륨액(Potassium acetate, CH 3 COOK) 초산칼륨 g을 정확히 달아 증류수로 용해하여 100 ml로 한다 % 에탄올 % 에탄올 5. 시험과정 5.1 시험용액의 조제 프로폴리스추출물 시료 60~100 mg을 칭량하고 90% 에탄올 20 ml를 가하여 용해한다. 과립상, 정제상의 제품은 시료를 충분히 파쇄 하여 사용한다. 또한 젤라틴 등을 포함한 제품은 내용물을 꺼내어 사용한다 원심분리(3,000 rpm, 10분)를 하여 상층액을 취한다 잔류물에 80% 에탄올 8 ml로 3회 추출한다 전 추출액을 합하여 80% 에탄올을 사용하여 전량을 50 ml로 한다 프로폴리스추출물이 기능성 원료인 최종제품 시료를 프로폴리스 추출물로 60~100 mg이 되도록 취한다 % 에탄올 20 ml를 가하여 용해시킨다 원심분리(3,000 rpm, 10분) 행하여 상등액을 취한다. 단, 당을 함유한 시료인 경우 시료를 정평하고 증류수 10 ml에 용해하고 에탄올 10 ml을 가하여 원심분리(3,000 rpm, 10분)를 행한다. 361

365 잔류물에 80% 에탄올 8 ml을 가하여 3회 추출한다 전 추출액을 합하여 80% 에탄올을 사용하여 전량을 50 ml로 한다. 5.2 표준용액의 조제 쿼세틴을 무수물로 혼합하여 50 mg을 정확히 달아 50 ml 부피플라스크 에 넣는다 에탄올을 표선까지 채운다 에탄올을 가하여 100, 20, 10배로 희석 1) 한다(예, 0.01, 0.05, 0.1 mg/ml). 5.3 시험조작 표준용액 및 시험용액을 각각 0.5 ml씩 대조액과 시험액용으로 두개의 시험관에 취한다 에탄올 1.5 ml, 10% 질산알루미늄용액 0.1 ml, 1 M 초산칼륨용액 0.1 ml, 증류수 2.8 ml를 가하여 충분히 교반한다. 각 농도별 표준물질 및 시료 의 공시험은 10% 질산알루미늄 대신 증류수 0.1 ml를 가한다 실온에서 40분간 정치 후 액층을 10 mm 셀(cell)을 사용하여 물을 대조액으 로 하여 415 nm에서 흡광도를 측정 2) 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 결과 분석 표준물질의 농도별 흡광도와 각 농도별 공시험의 흡광도의 차를 이용하여 표준물질의 검량선을 작성한다 시료의 흡광도와 시료의 공시험 흡광도의 차를 검량선에 적용시킨다. 6.2 계산 총 플라보노이드 함량(mg/g) = C (a b)/s C : 시험용액중의 총 플라보노이드 함량(mg/mL) S : 시료 채취량(g 또는 ml) a : 시험용액의 전량(mL) b : 희석배수 7. 참고문헌 7.1 김은정, 이화정, 김혜정, 남혜선, 이미경, 김해영, 이진하, 강윤숙, 이종옥, 김희연 : 프로폴리스추출물제품의 플라보노이드 함량분석을 위한 비색법의 비교, KOREAN J.FOOD SCI. TECHNOL., 7(6), , 김종태, 김철진, 조용진, 최애진, 신원선 : 에틸알코올로 추출한 프로폴리스 이 화학적 특성, KOREAN J. FOOD SCI. TECHNOL., 34(6), , 부희옥, 이현화, 이장원, 황성진, 박상언, 여주 품종별 폴리페놀 : 플라보노이 드 함량과 라디칼 소거활성 및 아질산염 소거능, Korean J. Medicinal Crop Sci., 17(1), 15-20,

366 7.4 이종미, 손은심, 오상석, 한대석 : 식물성 식품중 총플라보노이드 함량과 생리 활성 탐색, KOREAN J. DIETARY CULTURE, 16(5), , 시험 주의사항 1) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 2) 시료의 흡광도로부터 별도로 상기 조작 중 질산알루미늄용액 대신 물 0.1 ml 를 가한 것의 흡광도를 뺀 흡광도 차를 이용하여 정량한다. 363

367 Ⅲ 파라(ρ)-쿠마르산(Coumaric acid), 계피산(Cinamic acid) 확인 1. 시험방법의 원리 계피산(Cinamic acid)은 대표적인 방향족 불포화 카복실산의 하나로, 페닐기와 카 복시기가 이중결합에 대하여 반대쪽에 있는 트랜스형과 같은 쪽에 있는 시스형의 이성질체가 있다. 화학식은 C9H8O2이며 약한 방향( 芳 香 )을 가진 무색의 바늘 모양 결정으로, 에탄올 에테르 등 유기용매에 녹는다. 육계유 페루발삼 소합향유 등에 유리상태로 또는 에스터의 형태로 존재한다. 페닐기 와 카복시기가 이중결합에 대하여 반대쪽에 있는 트랜스형과, 같은 쪽에 있는 시스 형의 두 이성질체를 생각할 수 있으나, 천연으로는 안정한 트랜스형이 존재한다. 벤 즈알데하이드와 아세트산무수물을 아세트산칼륨의 존재하에 축합시키면 얻을 수 있 다. 본 시험법은 에탄올을 이용하여 시료 중 파라-쿠마르산 및 계피산을 충분히 추 출한 후 액체크로마토그래프/자외분광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 각 각 최대 흡수파장인 310 nm와 280 nm에서 정성 분석한다. 용매처리 HPLC Filtration DAD detector 옥타데실실릴화한한 칼럼 2. 안전 주의사항 이동상으로 사용되는 메탄올의 경우 포름알데하이드 제조나 부동액으로 사용되는 독성을 갖는 무색의 가연성 알코올로서, 생체 내에서 알코올탈수소효소에 의해 포 름알데하이드나 포름산이 되기 때문에 독성이 강하다. 30mL 이하를 섭취하더라도 사망에 이르며, 만성독성으로는 실명을 초래하는 것으로 알려져 있으므로 환기가 잘되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 부피플라스크(20 ml) 용매용 일회용 실린지 여과용 멤브레인 필터(0.45 μm) 액체크로마토그래프용 유리병 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 칼럼오븐 364

368 3.2.4 옥타데실실릴화한한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상인 0.5% 초산용액과 메탄올을 이용하여 분당 1.0 ml로 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 파라-쿠마르산(ρ-coumaric acid, trans-4-hydroxycinnamic acid) 분자식 : C 9 H 8 O 3, 분자량 : , CAS No. : 계피산(Cinnamic acid, trans-3-phenylacrylic acid) 분자식 :C 9 H 8 O 4, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 에탄올(Ethanol) 메탄올(Methanol) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 파라-쿠마르산용액 파라-쿠마르산 100 mg을 정확히 달아 80% 에탄올로 용해 1) 하여 100 ml로 한다 계피산용액 계피산 100 mg을 정확히 달아 80% 에탄올로 용해 1) 하고 100 ml로 한다. 365

369 5.2 시험용액의 조제 프로폴리스추출물 또는 프로폴리스추출물을 기능성 원료로 한 최종제품 2 g(ml)을 정확히 달아 2) 80% 에탄올로 희석하고 용해하여 20 ml로 한다 μm 멤브레인 필터로 여과한다. (단, 필요하면 소량의 물로 용해한 후 99.5% 에탄올을 가하여 전체용량을 20 ml로 한다.) 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항목 주입량 검출기 파장 조건 10 μl 310 nm(파라-쿠마르산), 280 nm(계피산) 칼럼 온도 40 이동상 유속 A : 0.5% 초산용액, B : 메탄올 1.0 ml/분 표 2. 이동상 조건(예) 시간(분) A용액(%) B용액(%)

370 6.2 표준물질 크로마토그램 6.3 정성시험 시험한 크로마토그램에서 표준 쿠마르산 또는 계피산과의 동일한 머무름시 간의 피크를 확인한다. 7. 참고문헌 7.1 Franciane D. Marquele, Anderson R.M. Oliveira, Pierina S. Bonato, Marilisa G. Lara, Maria Jos e V. Fonseca : Propolis extract release evaluation from topical formulations by chemiluminescence and HPLC, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,

371 7.2 KENNETH R. MARKHAM, KEVIN A. MITCHELL, ALISTAIR L. WILKINS, JULIA A. DALDY and YINRONG LU : HPLC AND GC-MS IDENTIFICATION OF THE MAJOR ORGANIC CONSTITUENTS IN NEW ZEALAND PROPOLIS, Phytochernistty, 42, , Ranjith Arimboor, K. Sarin Kumar, C. Arumughan : Simultaneous estimation of phenolic acids in sea buckthorn (Hippopha e rhamnoides) using RP-HPLC with DAD, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 47, 31-38, 시험 주의사항 1) 표준품을 에탄올에 용해 시 발열반응이 일어날 수 있으며, 부피프라스크에 정 용 시 열에 의한 부피 편차를 일으킬 수 있으므로 충분히 방치하여 실온에 도 달토록 한다. 2) 정성시험 시에는 소수점 이하 4자리까지 정밀히 계량 할 필요는 없다. 368

372 Ⅲ 다이드제인 및 제니스테인 확인 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 메탄올로 시료를 추출하고, 옥타데실실릴화한 칼럼을 이용하여 자외부흡 광광도검출기 부착 고속액체크로마토그래프로 다이드제인과 제니스테인을 분석하는 방법으로, 다이드제인과 제니스테인의 흡수파장인 260 nm에서 정량한다. 추출 방법으 로는 일반적인 용매추출법으로 물, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴을 주로 사용한다. 또한, 최근 급속도로 빠른 새로운 추출공정 중 하나인 초임계 유체 추출법은 온도, 압력, 보조용매의 변화 및 초음파 시스템의 다양한 주파수의 에너지 변화에 따라 일반적인 용매추출보다 빠르고, 환경에 안전하여 많은 관심을 받고 있다. 메탄올 추출 / 냉각 옥타데실실릴화 칼럼 회전 교반 filtration 2. 안전주의사항 표준물질인 다이드제인의 경우 피부에 자극을 일으키며, 눈에 심한 자극을 일으킬 수도 있으므로 보안경 및 안면보호구를 착용하고 피부에 묻으면 다량의 비누와 물로 씻고 눈에 묻으면 몇 분간 물로 조심해서 씻어야 하며 가능하면 콘택트렌즈를 제거하여야 한다. 제니스테인은 흡입한 경우 공기가 있는 곳으로 옮기며 피부에 접촉한 경우 즉시 피부를 물로 씻는다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 삼각플라스크(250 ml) 항온수조 원심분리기 용매용 일회용 실린지 여과용 멤브레인 필터(0.45 μm) 액체크로마토그래프용 유리병 부피플라스크(50 ml) 와동(Vortex) 믹서 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 칼럼오븐 369

373 3.2.4 옥타데실실릴화한한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상은 2% 초산용액과 2% 초산을 함유한 메탄올을 이용하여 용매를 분당 1.0 ml를 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 다이드제인(Daidzein) 분자식 : C 15 H 10 O 4, 분자량 : , CAS No. : Genistein(Genistein) 분자식 : C 15 H 10 O 5, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 메탄올(Methanol) 초산(Acetic acid) 증류수(Distilled water) 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 표준물질 각 20 mg을 정밀하게 취한다 위의 표준물질을 50 ml 부피플라스크에 넣는다 메탄올을 표선까지 맞춘다(20 mg/50 ml 400 ppm). 5.2 시험용액의 조제 시료 10 g을 정밀히 취한다 위의 시료를 250 ml 삼각플라스크에 넣는다. 370

374 5.2.3 여기에 80% 메탄올 40 ml를 넣은 후 호일을 씌운다 항온수조에서 2시간 추출 1) 한다 냉각시킨 후 2 M 수산화나트륨용액 3 ml를 넣는다 이를 상온에서 10분간 회전 교반한 후 빙초산 1 ml를 넣는다 % 메탄올을 사용하여 50 ml로 하여 하고 혼합한다 여액 5 ml에 증류수 4 ml를 넣고 메탄올을 사용하여 10 ml로 한다 원심분리(5,000 rpm, 5분)한 상징액을 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건 항목 주입량 검출기 파장 조건 10 μl 260 nm 칼럼 온도 40 이동상 유속 표 2. 이동상 조건 A : 2% 초산용액 B : 2% 초산을 함유한 메탄올 1.0 ml/분 시간(분) A용액(%) B용액(%) 표준물질 크로마토그램 371

375 6.3 다이드제인 및 제니스테인 확인 대두단백 확인 표준용액 중 제니스테인, 다이드제인과 머무름시간이 일치하는 피크가 시 험용액 중에서 확인되어야 한다. 7. 참고문헌 7.1 Rostagno, M. A., Palma, M. and Barroso, C. G., Ultrasound-ssisted Extraction of Soy Isoflavones, J. Chromatogr. A, 1012(2), , Han, S. K, Lee, K. J., Kim, J. D., Lee, Y. W. and Row, K. H., Extraction of Isoflavones from Korean Soybean by Sub/super- Critical Water, Korean hem. Eng. Res., 42(6), , Li, H. Z, Pordesimo, L. and Weiss, J., High Intensity Ultrasound-assisted Extration of Oil from Soybeans, Food Research International, 37(7), , Nicola Volpi, Gianluca Bergonzini: Analysis of flavonoids from propolis by on-line HPLC -electrospray mass spectrometry, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 42, , 시험 주의사항 1) 가열 반응은 반응시키는 수욕조나 가열기를 목적하는 온도로 미리 맞추어 두 어 목적온도에서의 시간을 정확히 유지토록 한다. 372

376 Ⅲ 총 모나콜린 K 1. 시험방법의 원리 모나콜린-K는 홍국균(Monascus pilo년, Monascus purpureus, Monascus anka, Monascus ruber 등의 미생물)이 만들어내는 2차 대사산물이다. 홍국에 함유되어있는 모나콜린-K(Monacholine-K)는 전체 모나콜린계의 80%를 차 지하며 내인성 콜레스테롤 생합성의 경로의 속도 결정 단계인 HMG-CoA 환원효소 를 특이적으로 억제함으로써 저밀도지단백질(LDL)과 결합된 콜레스테롤 농도를 저 하시켜 혈중 콜레스테롤량을 감소하게 만드는 것으로 밝혀져 있다. 이러한 유사체 의 구조식은 β-hydroxy-delta-lactone 구조를 가지고 있으며, 가수분해에 의해 고리 가 깨져서 이룬 부분 형태가 HMG-CoA 환원효소의 HMG 부분과 유사한 구조를 띠고 있어 길항저해작용을 통해서 세포내 콜레스테롤을 저하시킨다. 간장 세포내 콜레스테롤이 감소하게 되면 콜레스테롤을 보충하기 위해 간장세포표면의 LDL 수 용체가 증가하여 조직내로 콜레스테롤의 이행이 증가하기 때문에 혈액중의 LDL-콜 레스테롤 수치가 감소하게 된다. 본 시험법은 10배량의 75% 에탄올을 가하여 초음파 처리를 하여 시료 중 모나콜린 K 를 충분히 추출한 후 액체 크로마토그래프/자외부 흡광광도 검출기(HPLC/DAD)를 이 용하여 분석하는 방법으로 최대 흡수파장인 237nm에서 정량분석을 한다. 시료분쇄 HPLC분석 원심분리 Filtration 2. 안전 주의 사항 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴(Acetonitrile)은 흡입이나 섭취시 구토, 구역질, 혈압변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의식불명 등의 증상 이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 메스플라스크(50mL) mL 바이알 원심분리기 용매용 일회용 실린지 μm 여과용 멤브레인 필터(Hydrophilic) 373

377 3.1.6 액체크로마토그래프용 유리병 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부 흡광 광도검출기(DAD : Diode Array Detector) 칼럼오븐(온도 조절 가능) 옥타데실실릴화한한 칼럼(안지름 4.6mm, 길이 250mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상은 아세토니트릴과 0.2% 인산을 이용하여 용매를 분당 1.0mL를 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 비활성형 모나콜린 K(mevinolin) 분자식 : C 24 H 36 O 5, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 에탄올(Ethanol) 아세토니트릴(Acetonitrile) 인산(Phosphoric acid) 4.3. 시액 % 에탄올 N 수산화나트륨 용액 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 비활성형 모나콜린 K 표준용액 표준물질 10mg을 정밀하게 달아 75% 에탄올 50mL에 녹인다(200μg/mL) 활성형 모나콜린 K 표준용액 374

378 표준물질 10mg을 정밀하게 달아 75% 에탄올 50mL에 녹인다 위의 용액 2mL를 4mL 바이알에 취하여 0.5mL 0.05N 수산화나트륨용액 1) 과 혼합한다 실온에서 최소 30분 방치하여 표준용액으로 사용한다(167μg/mL). 5.2 시험용액의 조제 총 모나콜린 K로서 1~4mg이 함유되도록 적당량의 시료를 달아 10mL 원 심분리관에 넣고 75% 에탄올 10mL를 넣은 후 1시간 초음파 처리를 한다 실온으로 냉각한 후 원심분리(3,000ppm, 10분)를 행하여 0.45μm 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건 항목 조건 사용 컬럼 C 18(Waters, 5 μm 4.6mm 250mm) 오븐 온도 40 o C 검출기(검출파장) DAD(Diode Array Detector) (237 nm) 이동상 A액 : Acetonitril B액 : 0.2% H 2 PO 4 유속 시료 주입량 시간(분) A B Post run : 3 min 1.0 ml/min 10 μl 375

379 6.2 표준물질 크로마토그램 Standard Chromatogram of Monacolin K 200 ppm Standard Chromatogram of Active Monacolin K 167ppm 6.3 계산 (비)활성형 모나콜린 K (mg/g) = C (a b)/s C : 시험용액 중 (비)활성형 모나콜린 K의 농도(mg/mL) a : 시험용액의 전량(mL) b : 희석배수 S : 시료 채취량(g) 총 모나콜린 K(mg/g) = 활성형 모나콜린 K + 비활성형 모나콜린 K 7. 참고문헌 7.1 비지 홍국의 색소 및 Monacolin K 함량, 윤은경 등, Korean J. of Food Preservation, 10(3), , Identification and chemical profiling of moancolin in red yeast rice using HPLC with PAD and mass spectrometry, Yong-guo et al., J.of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 35, , Monitoring of selected metabolites and biotransformation products from fermentation broths by HPLC, Gyorgy Morovjan et al., J.of Chromatography A, 763, ,

380 8. 시험 주의사항 1) 정밀하게 용액을 취하기 위해서는 반드시 정해진 용량의 홀 피펫을 사용하여 야 한다. 377

381 Ⅲ 코엔자임Q10 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 시료 중 코엔자임Q10을 에탄올 용액으로 추출하여 액체크로마로그래 프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대흡수파장인 275nm에 서 정량 분석한다. 에탄올 추출 초음파진탕 filtration 액체크로마토그래피 자외부흡광광도검출 2. 안전주의사항 이동상으로 사용되는 메탄올의 경우 포름알데하이드 제조나 부동액으로 사용되는 독성을 갖는 무색의 가연성 알코올로서, 생체 내에서 알코올탈수소효소에 의해 포 름알데하이드나 포름산이 되기 때문에 독성이 강하다. 30mL 이하를 섭취하더라도 사망에 이르며, 만성독성으로는 실명을 초래하는 것으로 알려져 있으므로 환기가 잘되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 용매용 일회용 실린지 여과용 멤브레인필터 및 디스크형 멤브레인필터 액체크로마토그래프용 유리병 부피플라스크(50 ml) 초음파진탕기 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6mm, 길이 250mm, 충진재 Octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상은 메탄올과 에탄올 13:7로 혼합한 용액을 이용하여 분당 1.0 ml를 충분 한 시간동안 흘려 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 378

382 4.1.1 코엔자임Q10(Coenzyme Q10, Ubiquinone, Ubidecarenone) 분자식 : C 59 H 90 O 5, 분자량 : , CAS No. : H 3 C H 3 C O O O O CH 3 CH 3 H 일반시약 에탄올(Ethanol) 메탄올(Methanol) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 코엔자임Q10 표준물질 50 mg을 정밀히 측정한다 정밀히 측정한 표준물질을 50 ml 부피플라스크에 넣는다 에탄올을 넣어 표선까지 맞춘다 에탄올로 적당히 희석 1) 하여 표준용액으로 한다 5.2 시험용액 제조 시료(코엔자임Q10으로서) 약 50 mg을 정밀히 측정한다 정밀히 측정한 시료를 50 ml 부피플라스크에 넣는다 여기에 에탄올을 20 ml를 넣고 조심스럽게 흔든다 시료가 전부 용해될 때까지 초음파진탕기로 용해시킨다 에탄올을 넣어 표선까지 맞춘다 μm 멤브레인 필터로 여과한 용액을 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건 항목 조건 주입량 20 μl 칼럼온도 25 이동상 메탄올:에탄올(13:7) 검출기 파장 275 nm 유속 1.0 ml/분 379

383 6.2. 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 코엔자임Q10(mg/g)= A (B/S) P (1/1,000) A : 시료의 농도(μg/mL) B : 시험용액의 전량(mL) S : 시료채취량(g) P : 표준품의 순도 7. 참고문헌 7.1 J. Ruiz-Jim enez, F. Priego-Capote, J.M. Mata-Granados, J.M. Quesada, M.D. Luque de Castro : Determination of the ubiquinol-10 and ubiquinone-10(coenzyme Q10) in human serum by liquid chromatography tandem mass spextrometry to evaluate the oxidative stress, JOURNAL OF CHROMATOGRAPHIA, 1175, , 정자영, 노기미, 임동길, 김미경, 박경식, 윤태영, 홍진, 박선영 : HPLC를 이용 한 건강기능식품 중 코엔자임 Q10 성분 분석, 한국식품위생안전성학회지, 26(1), 시험 주의사항 1) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 380

384 Ⅲ 대두이소플라본(제1법) 1. 시험방법의 원리 대두이소플라본은 구조적으로 flavonoids에 속하며 주로 콩류(legume)에 존재하는 물질이다. flavonoid 화합물의 기본적인 구조적 특징은 2개의 benzene ring이 hetero환상으로 연결되어 있는 구조인 flavonoid핵이 있는 형태이다. Isoflavone의 이성체는 12개가 알려져 있는데 주로 배당체의 형태로 존재한다. 콩 과, 장미과, 붓꽃과 등의 식물에 널리 분포되어 있고 그 대부분은 배당체로 존재한 다. 콩에 함유된 isoflavone은 주로 genistein(4`,5,7-trihydroxyisoflavone)과 daidzein (4,7-dihydroxy-isoflavone) genistein, daidzein의 배당체인 genistin, daidzin으로구성 되어있으며,소량의glycitein(7, 4`-dihydroxy-6-methoxy-isoflavone)과 그것의 배당체, glycitin이 있다. 본 시험법은 목적하는 플라보노이드 추출과정을 처리가 복잡하고 시간이 소요되는 알카리-가열분해 과정대신 초음파 처리를 이용하여 메탄올로 시료 중 이소플라본을 추출하여 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대 흡수파장인 260 nm에서 정량 분석한다. 메탄올 용해 초음파 처리 filtration 액체크로마토그래피 자외부흡광광도검출 2. 안전주의사항 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴(Acetonitrile)은 흡입이나 섭취 시 구 토, 구역, 혈압변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의식불명 등의 증상이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide)는 흡입이나 섭취 시 자극, 구역, 구토, 설사, 현기증, 위통, 졸음 등의 증상이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 곳과 실험복 및 고글 등의 안전장비를 갖추고 취급하여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 부피플라스크(100 ml) 여과용 멤브레인 필터 액체크로마토그래프용 유리병 3.2 분석장비 381

385 3.2.1 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 칼럼오븐 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6mm, 길이 250mm, 충진재 Octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상을 이용하여 용매를 분당 0.3 ml로 충분한 시간동안 흘려 안정화 시 킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 이소플라본류 다이드진(Daidzin) 분자식 : C 21 H 20 O 9, 분자량 : , CAS No. : OH O O O HO OH O OH HO 글리시틴(Glycitin) 분자식 : C 22 H 22 O 10, 분자량 : , CAS No. : OH O O O HO OH O HO OH HO 제니스틴(Genistin) 분자식 : C 21 H 20 O 10, 분자량 : , CAS No. : OH O O O HO OH O OH OH HO 다이드제인(Daidzein) 분자식 : C 15 H 10 O 4, 분자량 : , CAS No. : 제니스테인(Genistein) 분자식 : C 15 H 10 O 5, 분자량 : , CAS No. :

386 글리시테인(Glycitein) 분자식 : C 16 H 12 O 5, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 메탄올(Methanol) 아세토니트릴(Acetonitril) 초산(Acetic acid) 디메틸설폭시드(Dimethylsulfoxide) 5. 시험과정 5.1 표준용액 제조 각각의 이소플라본(Daidzin, Genistin, Glycitin, Daidzein, Genistein, Glycitein) 표준물질 50 mg을 정밀히 측정한다 정밀히 측정한 표준물질을 50 ml 부피플라스크에 넣는다 배당체(Daidzin, Genistin, Glycitin) 표준품은 메탄올을 가하여 완전히 녹 인 후 이를 표준원액으로 한다 비배당체(Daidzein, Genistein, Glycitein) 표준품은 Dimethylsulfoxide를 가하여 완전히 녹인 후 이를 표준원액으로 한다 위의 용액을 메탄올로 적절히 희석 1) 하여 표준용액으로 한다. 5.2 시험용액의 조제 시료 약 0.5 g을 50 ml 부피플라스크에 정밀히 취하여 메탄올로 정용한 다 분간 초음파 처리한다 μm의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다. 383

387 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건 항목 조건 주입량 10 μl 칼럼온도 40 이동상 A : acidified water (0.1% acetic acid) B: acetonitrile (0.1% acetic acid) 검출기 파장 260nm 유량 0.3ml/분 표 2. 이동상 조건 시간 A용액 B용액 (%) (%) 표준물질 크로마토그램 384

388 6.3 계산 각 이소플라본(비배당체) 함량(mg/g)= A (B/S) P (1/1,000) A : 시료의 농도(μg/mL) B : 시험용액의 전량(mL) S : 시료채취량(g) P : 표준품의 순도 이소플라본 배당체일 경우 1/1.6(0.625) 전환계수 적용함 7. 참고문헌 7.1 Mauricio A. Rostagno, Miguel Palma, Carmelo G. Barroso: Solid-phase extraction of soy isoflavones, Journal of Chromatography A, 1076, , Mauricio A. Rostagno, Miguel Palma, Carmelo G. Barroso: Ultrasound-assisted extraction of soy isoflavones, Journal of Chromatography A, 1012, , Radka Mikelova, Petr Hodek, Pavel Hanustiak,c,d Vojtech Adam, Sona Krizkova, Ladislav Havel, Marie Stiborova, Ales Horna, Miroslava Beklova, Libuse Trnkova, Rene Kizek: Determination of Isoflavones Using Liquid Chromatography with Electrochemical Detection, Acta Chim. Slov. 54, 92-97, 시험 주의사항 1) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 385

389 Ⅲ 대두이소플라본(제2법) 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 목적하는 플라보노이드 검출을 위하여 중합되어 있는 배당체 구조를 파괴하기 위하여 알카리-가열 처리한 다음 중화하여 메탄올을 이용하여 시료 중 이 소플라본을 추출하여 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하 는 방법으로 최대 흡수파장인 260 nm에서 정량 분석한다. 메탄올 용해 항온수조 추출 / 냉각 회전교반 filtration 액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출 2. 안전주의사항 시험 중 수산화나트륨(Sodium hydroxide)은 삼키면 유해하며 호흡기도, 피부, 눈, 점막에 화상을 입힐 수 있고 물과 접촉 시 반응 할 수 있어 주의를 기울여야 한다. 또한 초산(Acetic acid)은 초산 냄새가 강하며 흡입 시 자극, 재채기, 콧물과 섭취 시 출혈, 구토, 설사를 유발하고 눈에 화상과 호흡기도 및 피부 자극에 위험성이 있 어 환기가 잘되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 삼각플라스크(250 ml) 항온수조 원심분리기 용매용 일회용 실린지 여과용 멤브레인 필터 액체크로마토그래프용 유리병 부피플라스크(50 ml) 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 칼럼오븐 옥타데실실릴화한한 칼럼(안지름 4.6mm, 길이 250mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 386

390 이동상을 이용하여 용매를 분당 0.8 ml로 충분한 시간동안 흘려 안정화 시 킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 이소플라본류 다이드진(Daidzin) 분자식 : C 21 H 20 O 9, 분자량 : , CAS No. : OH O O O HO OH O OH HO 글리시틴(Glycitin) 분자식 : C 22 H 22 O 10, 분자량 : , CAS No. : OH O O O HO OH O HO OH HO 제니스틴(Genistin) 분자식 : C 21 H 20 O 10, 분자량 : , CAS No. : OH O O O HO OH O OH OH HO 다이드제인(Daidzein) 분자식 : C 15 H 10 O 4, 분자량 : , CAS No. : 제니스테인(Genistein) 분자식 : C 15 H 10 O 5, 분자량 : , CAS No. : 글리시테인(Glycitein) 분자식 : C 16 H 12 O 5, 분자량 : , CAS No. :

391 4.2 일반시약 메탄올(Methanol) 초산(Acetic acid) 증류수(Distilled water) 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 각 이소플라본(Daidzin, Genistin, Glycitin, Daidzein, Genistein, Glycitein) 표준물질 50mg을 정밀히 측정한다 정밀히 측정한 표준물질을 50mL 부피플라스크에 넣는다 배당체(Daidzin, Genistin, Glycitin) 표준품은 메탄올을 가하여 완전히 녹 인 후 이를 표준원액으로 한다 비배당체(Daidzein, Genistein, Glycitein) 표준품은 Dimethyl sulfoxide를 가하여 완전히 녹 인 후 이를 표준원액으로 한다 위의 용액을 메탄올로 적절히 희석 1) 하여 표준용액으로 한다 5.2 시험용액의 조제 시료 1~10g을 정밀히 취한다 위의 시료를 250mL 삼각플라스크에 넣는다 여기에 80% 메탄올 40mL를 넣은 후 호일을 씌운다 항온수조에서 2시간 추출 2) 한다 냉각시킨 후 2M 수산화나트륨용액 3mL를 넣는다 이를 상온에서 10분간 회전 교반한 후 초산 1mL를 넣는다 % 메탄올을 사용하여 50mL로 하여 하고 혼합한다 여액 5mL에 증류수 4mL를 넣고 메탄올을 사용하여 10mL로 한다 원심분리(5,000rpm, 5분)한 상등액을 0.45μm 멤브레인 필터로 여과한다. 388

392 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건 항목 조건 주입량 10 μl 칼럼온도 40 이동상 A : 물/메탄올/초산(88:10:2) B: 메탄올/초산(98:2) 검출기 파장 260nm 유량 0.8ml/분 표 2. 이동상 조건 시간 A용액 B용액 (%) (%) 표준물질 크로마토 그램 389

393 6.3 계산 각 이소플라본(비배당체) 함량(mg/g)= A (B/S) P (1/1,000) A : 시료의 농도(μg/mL) B : 시험용액의 전량(mL) S : 시료채취량(g) P : 표준품의 순도 이소플라본 배당체일 경우 1/1.6(0.625) 전환계수 적용함 7. 참고문헌 7.1 Mauricio A. Rostagno, Miguel Palma, Carmelo G. Barroso: Solid-phase extraction of soy isoflavones, Journal of Chromatography A, 1076, , Qizhen Du, Zhonghua Li, Yoichiro Ito : Preparative separation of isoflavone components in soybeans using high-speed counter-current chromatography, Journal of Chromatography A, 923, , 시험 주의사항 1) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 2) 가열 반응은 반응시키는 수욕조나 가열기를 목적하는 온도로 미리 맞추어 두 어 목적온도에서의 시간을 정확히 유지토록 한다. 390

394 Ⅲ.3.7 터핀류 Ⅲ 진세노사이드 Rb1과 Rg1 1. 시험방법의 원리 인삼의 학명은 Panax ginseng C. A. Myere 이고, 인삼 사포닌은 인삼속 식물에만 존재하는 특유의 것으로서 다른 식물의 사포닌과는 다른 특이한 구조를 가지고 있 다. 인삼(Ginseng)의 배당체(Glycoside)라는 의미로 진세노사이드(Ginsenoside)라고 불리며, 비당부분의 구조에 따라 담마란계와 올레아닌계 2종류로 구별된다. 이중 담 마란계 사포닌은 다시 비당부분에 붙어있는 수산기(OH)의 수가 2개인 protopanaxadiol계 사포닌(PPD)과 3개인 protopanaxatriol계 사포닌(PPT)으로 나뉘 는데 PPD계 사포닌 중 주요 사포닌인 진세노사이드 Rb1과 PPT계 주요 사포닌인 진세노사이드 Rg1을 인삼의 지표성분으로 하여 품질관리가 이루어 지고 있다. 본 시험법은 증류수 및 유기용매를 이용하여 시료로부터 충분히 진세노사이드 성분을 추출하여 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대 흡수파장인 203 nm에서 정량분석을 한다. 메탄올 용해 환류 냉각 감압농축 filtration 액체크로마토그래피 자외부흡광광도검출 2. 안전주의사항 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴(Acetonitrile)은 흡입이나 섭취시 구토, 구역질, 혈압변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의식불명 등의 증상 이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 환류용 플라스크 수욕조 환저플라스크 감압농축기 부피플라스크(10 ml 및 50 ml) 용매용 일회용 실린지 391

395 3.1.7 여과용 멤브레인 필터 액체크로마토그래프용 유리병 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 칼럼오븐 옥타데실실릴화한한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상은 아세토니트릴과 0.2% 인산을 이용하여 용매를 분당 1.0 ml를 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 진세노사이드 Rb1(ginsenoside Rb1) 분자식 :C 54 H 92 O 23, 분자량 : 1,109.29, CAS No. : 진세노사이드 Rg1(ginsenoside Rg1) 분자식 :C 42 H 72 O 14, 분자량 : , CAS No. :

396 4.2 일반시약 메탄올(Methanol) 아세토니트릴(Acetonitrile) 헥산(n-Hexane) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 진세노사이드 Rb1 및 Rg1을 각각 10 mg씩 10 ml 부피플라스크에 넣는 다 메탄올을 이용하여 완전히 녹인 다음 메탄올을 표선까지 채운다(1 mg/ml) 적당히 희석하 1) 여 표준용액으로 만든다. 5.2 시험용액의 조제 분말시료 시료 약 1 g을 정밀히 달아 250 ml 환류용 플라스크에 취한다 % 메탄올 용액 50 ml를 가하여 70~80 수욕에서 1시간 환류 2) 냉 각한다 식히고, 원심분리한 다음 상징액을 환저플라스크에 취한다 잔류물에 대해서 1회 더 반복한다 환저플라스크에 옮긴 상징액을 수욕 중에서 60 이하에서 감압농축 한다 농축물을 증류수 : 아세토니트릴 혼합액(80 : 20) 2 ml에 용해한다 멤브레인 필터(0.45 μm)로 여과하여 시험용액으로 한다 농축액 및 농축액 분말의 시료 시료 약 2 g을 정밀히 달아 50 ml 부피 플라스크에 취한다 완전히 용해시킨 후 증류수를 표선까지 채운다. 393

397 멤브레인 필터(0.45 μm)로 여과하여 시험용액으로 한다 인삼성분함유제품 시료 3~4 g을 정밀히 달아 증류수 50 ml에 완전히 용해시킨다 여과(0.45 μm)하여 시험용액으로 한다. 시료에 지용성물질이 포함된 경우 시료 3~4 g을 분액여두에 취하고 n-hexane 100 ml 및 70% 메탄올 100 ml를 가하여 3시간동안 진탕 추출한다. 층이 완전히 분리될 때까지 정 치한 다음 하층을 환저플라스크에 취하여 수욕 중에서 감압농축하고 농 축물을 증류수 10 ml에 용해한 후 여과(0.45 μm)하여 시험용액으로 한 다. 시료에 부재료나 부형제가 많이 포함된 경우 시료를 물로 희석 또는 추출하고 원심분리 한 후 상징액을 C18 카르리 지로 처리하고 여과(0.45 μm)하여 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 3), 4), 5) 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항목 주입량 검출기 파장 조건 20 μl 203 nm 칼럼 온도 30 이동상 유속 A : 증류수, B : 아세토니트릴 1.0 ml/분 표 2. 이동상 조건(예) 시간(분) A용액(%) B용액(%)

398 6.2. 분석 크로마토그램 표준물질 크로마토그램(진세노사이드 다중 표준품) 시료 크로마토그램 홍삼분말 홍삼정 395

399 6.3 계산 진세노사이드 Rb1(또는 Rg1) 함량(mg/g)=C (a b)/s 1/1,000 C : 시험용액 중 개별 진세노사이드 농도(μg/mL) a : 시험용액의 전량(mL) b : 희석배수 S : 시료 채취량(g) 1/1,000 : 단위 환산 계수 7. 참고문헌 7.1 J.B. Wan, C.M. Lai, S.P. Li, M.Y. Lee, L.Y. Kong, Y.T. Wang : Simultaneous determination of nine saponins from Panax notoginseng using HPLC and pressurized liquid extraction, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41, , Yutang Wang, Jingyan You, Yong Yu, Chenling Qu, Huarong Zhang, Lan Ding, Hanqi Zhang, Xuwen Li : Analysis of ginsenosides in Panax ginseng in high pressure microwave-assisted extraction, Food Chemistry, 110, , 시험 주의사항 1) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 2) 가열 반응은 반응시키는 수욕조나 가열기를 목적하는 온도로 미리 맞추어 두어 목적온도에서의 시간을 정확히 유지토록 한다. 3) 이 기기분석 조건에서는 시료분석 시 진세노사이드 Rb1 과 Rg1의 피크가 중 되어 판별이 곤란 할 경우가 있으므로 시료에 따라 아래의 조건으로 변경하여 분석 할 필요도 있다. - 고속액체크로마토그래프 조건의 다른 예 항목 조건 주입량 20 μl 검출기 파장 203 nm 칼럼 온도 30 이동상 A : 증류수, B : 아세토니트릴 396

400 - 이동상 조건의 다른 예 시간(분) 유속 A용액(%) B용액(%) 제시된 조건에서의 표준물질 크로마토그램 - 제시된 조건에서의 홍삼분말 크로마토그램 397

401 - 제시된 조건에서의 홍삼정 크로마토그램 4) 시간단축 및 분리능 개선. 용매절감 등 효율성 및 경제성을 위하여 Rb1, Rg1 분석 시 Gradient 조건을 재설정 할 수도 있다. 5) 크리닝을 하지않을 시는 다음분석에 영향을 미칠 수 있으므로 비극성용매를 사용한 크리닝시간을 Gradient 조건설정에 포함 하는 것이 효율성이 좋다. 398

402 Ⅲ 총 엽록소 Ⅲ 총 엽록소(제1법) 1. 시험방법의 원리 엽록소는 대부분의 식물, 조류(algae), 남조류(cyanobacteria)에서 발견되는 녹색색 소이다. 엽록소에는 a, b, c1, c2, d 등이 있는데 분자구조의 차이에 의하여 분류, 명 명된 것이며, 공통적으로 마그네슘을 분자 속에 가지고 있다. 엽록소 중에서 가장 보편적으로 볼 수 있는 것은 a와 b이다. 대개의 식물에서는 a와 b가 약 3:1의 비율 로 존재하고 있으며, 다른 엽록소들은 극소량 함유되어 있거나 특정 식물에만 존재 하고 있다. 이들은 물에 녹지 않고 에테르, 벤젠, 클로로포름 등의 유기용매에 녹으 며, 자외선을 받으면 암적색의 형광을 방출한다. 건강기능식품의 엽록소 함유 식물 원료로는 맥류약엽(보리, 밀, 귀리의 어린 싹) 또 는 어린 이삭 형성 전의 잎의 전분 또는 일부와, 알팔파의 성숙한 잎, 잎꼭지, 줄기 의 전부 또는 일부, 엽록소를 함유한 식용해조류의 전부 또는 일부, 맥류약엽, 알팔 파, 해조류 이외의 식용식물류로서 단일 식물 전부 또는 일부가 있다. 이들 원재료 는 그대로 사용하거나 착즙, 건조하여 식용에 적합하도록 만든 것이다. 기능성이 확 인된 인체적용시험에서 섭취량을 고려하여, 총 엽록소의 일일 섭취량은 mg 이다. 본 시험법은 시료 중 존재하는 엽록소를 Alkari 성 Pyridine 용액으로 가온 처리하 여 충분히 추출하여 UV Spectrophotometer로 최대 흡광파장인 419nm와 454nm에 서 흡광도를 측정하여 정량한다. 물 추출 용매추출 원심분리 UV Spectrophotometer 2. 안전 주의 사항 시험 중 엽록소 추출에 주로 사용되는 Pyridine은 휘발성이 강하여 흡입이나 피부를 통해 흡수되어 현기증, 두통, 구역질, 식욕 부진, 복부 고통 및 폐 손상을 야기 할 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한 다. 3. 장비와 재료 3.1실험실 장비 및 소모품 공전 시험관 399

403 3.1.2 원심분리관 원심분리기 갈색 부피 플라스크(10mL) 갈색 홀 피펫(2mL) 3.2 분석 장비 UV Spectrophotomete 3.3 분석장비의 준비 분석 전 UV Spectrophotomete를 충분히 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반 시약 4.1 일반 시약 Pyridine Sodium Hydroxide D. Water 4.2 Alkali 성 pyridine 용액 제조 Sodium Hydroxide 1.4g을 증류수 50ml에 용해하고 pyridine 16.6g을 가하여 잘 교반 한후 증류수 세척병을 이용하여 m-flask에 옮겨 100mL로 한다. 5. 시험과정 5.1 시험 용액의 조제 시료 약 100g을 homogenize 하여 (5,000 rpm, 2분) 이중 클로렐라 건조물 로서 5 10mg에 해당하는 시료 1) 를 차광한 공전 시험관에 취한다 증류수를 사용하여 10mL 짜리 갈색 메스 플라스크로 옮겨 10mL로 정용 한 다음 잘 혼합하고 수욕조를 미리 60 o C에 맞춰 방치한다 mL 홀 피펫을 사용하여 현탁액 2mL를 취하여 차광한 원심분리관에 넣고 Alkali성 pyridine 용액 5mL를 가한후 60 o C 수욕상에서 15분간 방치한다 분간 3000rpm 으로 원심분리를 한 후 상층액을 10mL 갈색 메스플라스크에 옮긴다 남아있는 잔사는 Alkali 성 pyridine 용액 3mL를 가하여 와 과정을 2 3회 반복하여 상층액을 합쳐서 최종 10mL가 되도록 한다. 5.2 시험 조작 위 시험조작을 통하여 얻어진 시험용액을 Alkali 성 pyridine 용액을 대조액 으로 하여 액층 1cm, 파장 419nm와 454nm에서 흡광도를 측정한다 이때 Alkali 성 pyridine 용액을 가한 후 1시간 이내에 모든 조작을 마쳐야 한다. 400

404 6.분석 및 계산 6.1 계산 측정된 흡광도를 이용하여 다음식에 따라 총 엽록소의 양을 계산한다 총 엽록소(mg/100g) = C / S 100 C : 엽록소(mg/L) = (7.19 E 419nm E 454nm ) S : 용액 2 ml에 함유된 시료의 양(mg) E 419nm : 419nm의 흡광도 E 454nm : 454nm 의 흡광도 7.참고 문헌 7.1. Lee, Young Ja, Kim, So Hee, Kim, Jin-Sook, Han, Jeong A, Seo, Hae Jeom, Lim, Hyo Jeong and Choi, Soo Young. Studies on simultaneous determination of chlorophyll a and b, pheophorbide a, and β-carotene in chlorella and spirulina products. J. FdHys. Safety., 20(3), , Chlorophyll in Plants: Photoelectric colorimetric method for total chlorophyll only. A.O.A.C. Official Method , Identification of Chlorophyll and Carotenoids in Mazor Teas by HPLC with PAD, Yasuyo Suzuki and Yuzo Shioi, J. Agric. Food Chemistry, 51, p , Stimultaneous determination of chlorophyll a and chlorophyll b by derivative spectrophotometry, Emel Ergun et.al., anal Bioanal Chemistry, 379, p , 시험 주의사항 1) 흡광도 수치가 0.6일 때가 가장 정확한 값을 나타내므로 여러 번의 예비 시험을 통하 여 최적의 시료량을 취하도록 한다. 401

405 Ⅲ 총 엽록소(제2법) 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 시료로부터 85% 아세톤을 이용하여 엽록소를 충분히 추출하여 비색법 으로 분석하는 방법으로, 최대 흡광파장인 660 nm와 nm에서 총 엽록소를 정량한 다. 냉암소 방치 filtration / 진탕 탈수 비색법 분석 2. 안전주의사항 시험 중 엽록소 추출에 주로 사용되는 에틸에테르와 아세톤은 휘발성이 강하여 흡 입이나 피부를 통해 흡수되어 호흡기도 자극 및 피부 자극, 눈 자극, 중추신경계통 억제, 구역, 구토, 두통, 졸음 등을 야기 할 수 있으므로 환기가 잘되는 시설과 안전 장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 갈색플라스크(125 ml 또는 250 ml) G-2 유리여과기 유리봉 갈색분액여두 여과지 3.2 분석장비 분광광도계 3.3 분석장비의 준비 분석 전 분광광도계를 충분히 안정화시킨다. 4. 일반시약 및 시액 4.1 일반시약 아세톤(Acetone) 에틸에테르(Ethyl ether) 황산나트륨(Sodium sulfate) 4.2 시액의 조제 % 아세톤 402

406 아세톤 85 ml에 증류수를 가하여 100 ml로 한다 % 황산나트륨 황산나트륨 5 g에 증류수를 가하여 100 ml로 한다. 5. 시험과정 5.1 시험용액의 조제 총엽록소 약 7 mg에 상당하는 시료를 갈색플라스크에 정밀히 달아 넣는 다 % 아세톤 50 ml를 가하고 해사 일정량을 추가하여 분쇄한 후 냉암소 에서 하룻밤 방치한다 추출액은 3G-2 유리여과기를 사용하여 여과한다 잔류물은 85% 아세톤 25 ml를 가하여 10분간 유리봉으로 저어 다시 여 과한다 아세톤액이 착색되지 않을 때까지 반복 조작하여 액을 합하고, 아세톤을 가하여 최종 여액이 200 ml가 되도록 한다 이 액 20 ml를 갈색분액여두에 취하여 에틸에테르 50 ml 및 5% 황산나 트륨 50 ml를 가해 완만히 진탕 1) 한 후 에틸에테르가스를 방출한 후 1분간 더 진탕한다 정치 후 물층(하층)을 분리하여 여기에 에틸에테르 10 ml를 가하여 추 출한다(2회 반복) 에틸에테르 층을 합하여 5% 황산나트륨용액 50 ml로 3회 세척한다 세척된 에틸에테르층은 무수황산나트륨을 통과 탈수시켜 여과한다 분액여두 및 여과지를 에틸에테르로 씻어 먼저 액에 합한다 이에 에틸에테르를 가해 100 ml로 한 것을 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 흡광도 측정 에틸에테르를 대조액으로 액층 1 cm, 파장 nm와 660 nm에서 흡광도를 측정한다. 6.2 계산 총엽록소 함량(mg/g) = C 1/1, /S 100/20 C : 총엽록소(μg/mL) = 7.12E 660nm S : 시료 채취량(g) E 642.5nm 7. 참고문헌 7.1 Lee, Young Ja, Kim, So Hee, Kim, Jin-Sook, Han, Jeong A, Seo, Hae Jeom, Lim, Hyo Jeong and Choi, Soo Young. Studies on simultaneous determination of 403

407 chlorophyll a and b, pheophorbide a, and β-carotene in chlorella and spirulina products. J. FdHys. Safety., 20(3), , Chlorophyll in Plants: Photoelectric colorimetric method for total chlorophyll only. A.O.A.C. Official Method , Identification of Chlorophyll and Carotenoids in Mazor Teas by HPLC with PAD, Yasuyo Suzuki and Yuzo Shioi, J. Agric. Food Chemistry, 51, p , Stimultaneous determination of chlorophyll a and chlorophyll b by derivative spectrophotometry, Emel Ergun et.al., anal Bioanal Chemistry, 379, p , 시험 주의사항 1) 에테르 처리 시 에멀젼을 방지하기 위하여 최초 2회 정도는 가볍게 흔들어 준 다. 404

408 Ⅲ 총 페오포르바이드 Ⅲ 총 페오포르바이드(제1법) 1. 시험방법의 원리 페오포르바이드(pheophorbide)는 엽록소가 분해되어 형성되는 부산물로서 해당 성 분으로 인하여 인체 내 광과민증을 유발할 수 있으며, 엽록소가 다량 함유된 제품 의 위생지표로 많이 사용되고 있다. 엽록소는 대부분의 식물, 조류(algae), 남조류 (cyanobacteria)에서 발견되는 녹색색소이다. 녹색식물은 광합성, 즉 태양의 빛을 이 용하여 이산화탄소와 물로부터 유기물을 합성하는데, 엽록소는 이 과정에서 태양의 빛에너지를 흡수하여 화학에너지의 형태로 바꾸는 중요한 역할을 한다. 클로렐라 원료는 각 속의 조류를 인공적으로 배양하고 건조하여 식용에 적합하도 록 한 것을 말한다. 맥류약엽을 원재료로 하여 제조하였을 경우에는 총엽록소가 0.24%, 알팔파로 제조하였을 경우에는 0.06%, 해조류 및 기타식물류로 제조하였을 경우에는 0.12%, 클로렐라로 제조하였을 경우에는 1% 이상 함유되어 있는 것으로 기준규격을 정하였다. 위와 같은 원재료들을 이용하여 기능성 원료를 제조하였을 때 엽록소 함량은 보통 0.6~25.0 mg/g 정도이다. 원료에 따라 기능성분인 총 엽록 소의 함량 기준은 다를 수 있으나, 공통적으로 엽록소의 분해산물인 총 페오포르바 이드는 0.1% 이하로 관리하여야 한다. 본 시험법은 시료로부터 인산완충용액 및 아세톤 등을 이용하여 충분히 페오포르 바이드를 추출하여 비색법으로 분석하는 방법으로, 최대 흡수파장인 667 nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량한다. 시료 마쇄 원심분리 탈수 비색법 분석 2. 안전주의사항 염산(Hydrochloric acid)은 자극적인 냄새를 가지고 있고 피부 화상, 점막 화상, 호 흡 자극, 눈 자극 등의 건강 위험성이 있다. 물리적 위험으로는 용기가 열에 노출되 면 파열되거나 폭발할 수도 있고 물과 접촉 시 반응할 수 있다. 또한 흡입 시 자극 이 심한 경우도 있을 수 있으며 두통, 폐 울혈과 폐 이상이 생길 수 있다. 또한 피 부에 접촉 시 자극 및 동상과 눈 접촉 시에는 실명 및 동상 마지막으로 섭취 시에 는 화상, 구역, 구토 및 설사를 유발시킬 수 있으므로 환기가 잘 되는 곳에서 실험 복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 황산나트륨(Sodium sulfate)은 적절한 환기 하에서 취급이 이루어져야 하고 눈, 피 405

409 부, 의복에 접촉시키지 않아야 하며 용기는 완전히 밀폐 시켜두어야 하고, 취급 후 에는 철저히 씻어야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 분액여두 원심분리관 원심분리기 항온수조 마쇄기(homogenizer) 3.2 분석장비 분광광도계 3.3 분석장비의 준비 분석 전 분광광도계를 충분히 안정화시킨다. 4. 일반시약 및 일반시액 4.1 일반시약 아세톤(Acetone) 에틸에테르(Ethyl ether) 염산(Hydrochloric acid) 황산나트륨(Sodium sulfate) 4.2 시액의 조제 /15 M 인산완충용액 1/15 M potassium diphosphate(kh 2 PO 4, M.W )를 1/15 M dipotassium phosphate(k 2 HPO 4, M.W )에 넣어 ph 7.5로 맞춘다. 5. 시험과정 5.1 시험용액의 조제 시료 100 mg(클로렐라 건조물로서)을 정밀히 달아 차가운 1/15 M 인산 완 충용액(pH 8.0) : 아세톤 혼합(7 : 3) 10 ml를 가하고 37 에서 3시간 항온 1) 시킨다 % 염산으로 약산성화하고 유발에 넣어 약 0.5 g 해사 및 85%(v/v) 아 세톤 20 ml를 가하여 마쇄한다 상등액을 원심분리관으로 옮기고, 잔사에 아세톤 10 ml를 첨가하여 위의 과정을 2회 반복한다 상등액을 모두 합하여 원심분리(3000 rpm, 5분)한 후, 에틸에테르 30 ml를 넣은 분액여두로 옮긴다 에틸에테르와 아세톤 혼합액에 5% 황산나트륨용액 50 ml를 가하여 약하 406

410 게 2) 흔든 후, 황산나트륨층을 버린다(3회 반복) 무수황산나트륨을 가하여 탈수한 후 에틸에테르층을 취한 다음, 에틸에테 르를 가해 전량을 50 ml로 하여 이를 색소원액으로 한다 색소원액 중 20 ml를 취하여 17% 염산 20 ml를 넣고 흔들어 추출한 후 염산층을 취한다 이후 17% 염산 10 ml를 넣고 한 번 더 흔들어 추출한 후 염산층을 모은 다 모은 염산층에 포화황산나트륨 용액 150 ml와 에틸에테르 20 ml를 넣고 흔 들어 추출한다 에틸에테르층을 분취하고 전량을 20 ml로 한 것을 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 흡광도 측정 에틸에테르를 사용하여 시험용액을 필요한 농도로 정확하게 희석하여 667 nm의 파장에서 흡광도를 측정 3) 한다. 6.2 계산 총페오포르바이드(mg/kg) = A/ /S 50/20 D A : 흡광도 70.2 : 페오포르바이드의 667 nm 비흡광계수(0.1% 용액 1cm) S : 시료 채취량(g) D : 희석배수 7. 참고문헌 7.1 이영자 김소희 김진숙 외 4명 : 클로렐라 및 스피루리나제품에 함유된 엽록소 a, b, 페오포르바이드 a 및 β-카로틴의 동시분석법에 관한 연구, J. Fd Hyg. Safety, 20(3), , 시험 주의사항 1) 가열 반응은 반응시키는 수욕조나 가열기를 목적하는 온도로 미리 맞추어 두 어 목적온도에서의 시간을 정확히 유지토록 한다. 2) 에테르 처리시 에멀젼을 방지하기 위하여 최초 2회 정도는 가볍게 흔들어 준 다. 3) 흡광도 측정시 대조액으로 에틸에테르를 사용한다. 407

411 Ⅲ 총 페오포르바이드(제2법) 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 아세톤을 이용하여 시료로부터 페오포르바이드를 추출한 후 액체크로 마토그래프를 이용하여 분석하는 방법으로 흡수파장인 440 nm에서 정량한다. 아세톤 용해 초음파 추출 질소 농축 filtration 액체크로마토그래피 2. 안전주의사항 이동상인 헥산(hexane)은 호흡기도 자극, 피부 자극, 눈 자극, 흡인 위험, 중추 신 경 계통 억제, 신경 이상의 건강 위험성이 있다. 물리적인 위험으로는 가연성이 매 우 높은 액체 또는 증기이므로 증발 연소를 야기할 수도 있으므로 환기장치를 설치 하고 보안경으로 눈 보호, 실험복 착용 및 안전장갑 등의 안전장비를 갖추고 취급 에 주의를 기울여야 한다. 암모늄아세테이트(Ammonium acetate)는 적절한 환기 하에서 취급이 이루어져야 하고 눈, 피부, 의복에 접촉시키지 않아야 하며 용기는 완전히 밀폐 시켜두어야 하 고, 취급 후에는 철저히 씻어야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 부피플라스크(50 ml) 여과용 멤브레인 필터(0.2 μm Nylon filter) 초음파추출기 원심분리기 질소농축기 액체크로마토그래프용 유리병 원심분리용 튜브(50 ml) 3.2. 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 칼럼오븐 옥타데실실릴화한한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 408

412 이동상인 헥산 : 이소프로판올 : 증류수 = 30 : 60 : 8를 분당 1.0 ml로 흘려 칼럼 과 검출기를 충분히 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 페오포르바이드 a(pheophorbide a) 분자식 : C 35 H 36 N 4 O 5, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 탄산마그네슘(Magnesium carbonate) 아세톤(Acetone) 메탄올(Methanol) 암모늄아세테이트(Ammonium acetate) 해사(Sea sand) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 표준물질의 농도가 1.0~100 mg/l이 되도록 아세톤에 녹인다 1). 5.2 시험용액의 조제 시료 100 mg을 정밀히 달아 소량의 해사와 50 mg의 탄산마그네슘을 가 한다 위의 시료를 분쇄한 다음 10 ml 아세톤을 첨가한다 분간 초음파 추출 한 후, 4 에서 하룻밤 방치한다 추출한 검액을 원심분리(3,000 rpm, 5분, 4 )한다 상층액을 취하여 2) 질소 농축한다 건고시킨 추출물에 1 ml의 아세톤을 가한다 μm 나일론필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건 409

413 항목 주입량 검출기 파장 이동상 유속 조건 20 μl 440 nm A : 메탄올 : 0.5 M 초산암모늄용액(80 : 20) B : 메탄올 : 아세톤(70 : 30) 0.8 ml/분 표 2. 이동상조건 시간(분) A용액(%) B용액(%) 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 페오포르바이드 a(%) = A/B x C/D x E A : 표준물질 채취량(mg) B : 시료 채취량(mg) C : 검액 피크 면적 D : 표준액 피크 면적 E : 표준물질 순도(%) 410

414 7. 참고문헌 7.1 이영자 김소희 김진숙 외 4명 : 클로렐라 및 스피루리나제품에 함유된 엽록소 a, b, 페오포르바이드 a 및 β-카로틴의 동시분석법에 관한 연구, J. Fd Hyg. Safety 20(3), YOSI118ICY1O SHITAKE, K1kUICOK AKIUCHI, K1yOtOSI11M ORISHIGE 외 3명 : Determination of Pheophorbide a and Methyipheophorbide by Fluorescence High Performance Liquid Chromatography Availability of Narrow Baseline Method, ANALYTICAL SCIENCES FEBRUARY, 2, 66-69, 시험 주의사항 1) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 2) 상층액을 완전히 취하기 위하여 층분리가 충분히 이루어 졌나 확인 하여야하 며, 분리조작 시 충분한 훈련을 통하여 층간 혼합이 이루어지지 않게 주의를 기울여야 한다. 411

415 Ⅲ.3.8 발효미생물류 Ⅲ 유산간균 및 구균 1. 시험방법의 원리 유산균은 글루코오스 등 당류를 분해하여 젖산을 생성하는 세균을 말한다. 이는 그람양성균이며, 통성혐기성 또는 혐기성이고, 운동성은 없고 대부분이 카탈라아제 음성이고, 생육에는 각종 비타민, 아미노산, 펩타이드 등을 요구한다. 미생물 분류학 상으로는 유박테리알레스목(Eubacteriales)에 포함된다. 이 과는 락토바실레아에 (Lactobacilleae)와 스트렙토코카세아에(Streptococcaceae)으로 구분되는데, 전자에서는 락토 바실루스속(Lactobacillus)이, 후자에서는 스트렙토코쿠스속(Streptococcus), 페디오코쿠스속 (Pediococcus), 류코노스톡속(Leuconostoc)이 중요하다. 형태학상으로는 젖산 간균( 桿 菌 : 락토바실루스속)과 젖산 구균( 球 菌 :스트렙토코쿠스속 페디오코쿠스속 류코노스톡속) 으로 대별되고, 생리학적으로는 당을 혐기적으로 분해하여 주로 젖산만을 생성하는 호모발효균과, 젖산 외에 부산물(알코올 이산화탄소 등)을 생성하는 헤테로발효균 으로 분류된다. 본 시험법은 시료에 함유된 유산균을 BCP 첨가 평판배지를 이용하 여 35~37 에서 72±3시간 배양한 후 발생한 황색의 집락을 집락계산기로 정량한다. 시료 진탕 저온 균질화 희석 무균적 분주 냉각 응고 / 배양 집락계산 2. 안전 주의사항 실험에 사용되는 고압멸균기의 취급에 주의를 기울여 폭발 등의 사고를 방지하여 야 하며, 모든 실험 조작 전후에 소독과 세척을 철저히 하는 등 개인위생에 만전을 기하여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 고압멸균기(Autoclave) 고압멸균가능 병 무균대(Clean bench) 도말봉(Spreader, 스프레더) 마개 있는 시험관 412

416 소독용 알콜 램프 항온배양기(Incubator) 4. 일반시약 및 일반시액 4.1 일반시약 에탄올(Ethanol) 4.2 시액 및 배지의 조제 BCP첨가 평판측정용 한천배지(Plate Count Agar with Brom Cresol Purple) Yeast Extract 2.5 g, Peptone 5.0 g, Dextrose 1.0 g, Tween g L-Cysteine 0.1 g, Agar 15.0 g(다만, 종균에 따라 적정 peptone을 사 용하여야 함)을 증류수 1,000 ml에 녹여 ph 6.8~7.0으로 조정한 후 BCP(Brom cresol purple)을 0.004~0.006%가 되도록 가한다. 시판되 는 BCP 첨가 평판측정용 한천배지를 사용해도 무관하다 에서 15분간 멸균한다. 5. 시험과정 5.1 시험용액의 조제 액상시료 채취된 시료를 강하게 진탕하여 혼합한 것을 시험용액으로 한다 반유동상시료 채취된 시료를 멸균유리봉과 멸균스파테르 등으로 잘 혼합한다 그 일정량(10~25 ml)을 멸균용기에 취해 9배 양의 멸균생리식염수 와 혼합한 것을 시험용액으로 한다 고체시료 채취된 시료의 일정량(10~25 g)을 멸균된 가위와 칼 등으로 잘게 자 른다 멸균생리식염수를 가해 균질기를 이용해서 가능한 한 저온으로 균질 화한다 여기에 멸균생리식염수를 가해서 일정량(100~250 ml)으로 한 것을 시험용액으로 한다 분말상시료 시료를 멸균유리봉과 멸균스파테르 등으로 잘 혼합한다 그 일정량(10 g)을 멸균용기에 취해 9배 양의 멸균생리식염수와 혼합한 것을 시험용액으로 한다 캡슐제품류 캡슐을 포함하여 시료의 일정량(10~25 g)을 취한다. 413

417 배 양의 멸균생리식염수를 가해 균질기와 스토마커 등을 이용하여 균질화한 것을 시험용액으로 한다 시험용액조제 시 주의사항 위와 같이 조제된 시험원액에 대해서는 멸균생리식염수 9 ml에 시험원액 1 ml를 취하여 10배 희석액으로 만든다 필요에 따라 10 2 배, 10 3 배, 10 4 배 희석액을 만들어 사용한다 시험용액의 조제 시 시료를 용기 포장한 대로 채취할 때에는 그 외 부를 물로 씻고 자연 건조시킨 다음 마개 및 그 하부 5~10 cm의 부근까지 70% 알콜 탈지면으로 닦고, 화염멸균한 후 냉각하고 멸균 한 기구로 개봉, 또는 Tween 80과 같은 세균에 독성이 없는 계면활 성제를 첨가하는 것이 좋다. 개관하여 2차 오염을 방지하여야 한다. 지방분이 많은 시료의 경우는 Tween 80과 같은 세균에 독성이 없 는 계면활성제를 첨가하는 것이 좋다 냉동제품 냉동상태의 시료를 포장된 상태 그대로 40 이하에서 될 수 있는 대 로 단시간에 녹여 용기, 포장의 표면을 70% 알코올 솜으로 잘 닦은 후 상기 5.1.1~5.1.5의 방법으로 시험용액을 조제한다. 5.2 시험의 조작 각 단계별 희석액 1 ml를 멸균 페트리접시 2매 이상씩에 무균적으로 취한 다 약 43~45 로 유지한 BCP첨가 평판측정용배지 약 15 ml를 무균적으로 5.2.1에 분주한다 페트리접시 뚜껑에 부착하지 않도록 주의하면서 조용히 회전하여 좌우로 기울이면서 시료와 배지를 잘 섞고 냉각 응고시킨다. 단, 시료를 취하여 배지를 가할 때까지의 시간은 20분 이상 경과하여서는 안 된다 냉각 응고시킨 페트리접시는 거꾸로 하여 35~37 에서 72±3시간 배양한 다 발생한 황색의 집락을 유산균의 집락으로 계측한다. 6. 분석 및 계산 6.1 계산 배양 후 즉시 집락 계산기를 사용하여 생성된 집락수를 계산한다. 단, 부득 이할 경우에는 5 에 보존시켜 24시간 이내에 산정한다 집락수의 계산은 확산집락이 없고(전면의 1/2이하 일 때에는 지장이 없 음) 1평판 당 30~300개의 집락을 생성한 평판을 택하여 집락수를 계산하는 것을 원칙으로 한다. 전 평판에 300개 이상 집락이 발생한 경우 300에 가까 운 평판에 대하여 밀집평판 측정법에 따라 안지름 9 cm의 페트리접시인 경 414

418 우에는 1 cm 2 내의 평균집락수에 65를 곱하여 그 평판의 집락수로 계산한 다. 전 평판에 30개 이하의 집락만을 얻었을 경우에는 가장 희석배수가 얕은 것을 측정한다. 6.2 유산균수의 기재보고 시료 1 ml 중의 유산균수를 기재 또는 보고할 경우에 그것이 어떤 제한된 것 에서 발육한 집락을 측정한 수치인 것을 명확히 하기 위하여 1평판에 있어서의 집락수는 상당 희석배수로 곱하고 1 ml 중(1 g 중)의 유산균수 몇 개라고 기재 보고하며 동시에 배양온도를 기록한다. 숫자는 높은 단위로부터 3단계를 4사 5입하여 유효숫자를 2단계로 끊어 이하를 0으로 한다. 6.3 균수 계산 유산균수 (개/g) = A 희석배수 A : plate 당 집락 수(개) < 그림 > 유산간균 (Lactobacillus bulgaricus) 415

419 Enterococcus faecalis colonies on Columbia blood agar < 그림 > 유산구균 (Enterococcus fecalis, 쌍구균) 7. 참고문헌 7.1 K. Kailasapathy, I. Harmstorf, M. Phillips : Survival of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium animalis ssp. lactis in stirred fruit yogurts, LWT 41, , Lee M. K., Park W. S., and Kang K. H. : Selective Media for Isolation and Enumeration of Lactic Acid Bacteria from Kimchi, J Korean Soc. Food Sci. Nutr, 25, , 시험 주의사항 1) 이중코팅 유산균제품의 경우 인산완충액이나 생리식염수에서는 코팅을 완벽하게 제거 416

420 하지 못하여 유산균수가 정확히 나오지 않는 경우가 있으므로 이러한 경우Na 2HPO 4 0.6%, KH 2 PO %, L-cystein HCL 0.05%, Tween %, 증류수 98.85%를 코팅 제거 용액으로 이용하여 코팅을 제거한 후 시험하여야 한다. 417

421 Ⅲ 비피더스균(Bifidobacterium) 1. 시험방법의 원리 비피더스균은 1899년 Pasteur 연구소의 Tissier에 의하여 건강한 모유영양아의 분 변에서 처음으로 발견되었다. 그 형상이 나무의 가지와 같이 분기(bifid)하고 있으므 로 비피더스균(Bacillus bifidus)로 명명되었다. 분 균은 Gram 양성 다형성 간균으로 Y자상, V자상 만곡상, 스파텔상, 곤봉상을 나타내고 편성혐기성으로 포도당을 발효 하여 초산과 유산을 생성하고 탄산가스, propionic acid 등은 생성하지 않는다. 본 시험법은 시료에 함유된 유산균을 BL 배지를 이용하여 배양하는 방법으로 배양 후 집락계산기로 정량한다. 시료진탕 저온균질화 희석 / 도말 집락계산 생균수 산출 2. 안전주의사항 실험에 사용되는 고압멸균기의 취급에 주의를 기울여 폭발 등의 사고를 방지하여 야 하며, 모든 실험 조작 전후에 소독과 세척을 철저히 하는 등 개인위생에 만전을 기하여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 고압멸균기(Autoclave) 고압멸균가능병 무균대(Clean bench) 도말봉(Spreader, 스프레더) 마개 있는 시험관 소독용 알콜 램프 항온배양기(Incubator) 4. 일반시약 및 일반시액 4.1 일반시약 에탄올(Ethanol) 4.2 시액 및 배지의 조제 펩톤식염완충액(Buffered Peptone Water) Peptone 10 g, Sodium Chloride 5 g, Disodium Phosphate 3.5 g, 418

422 Mono-potassium Phosphate 1.5 g을 1 L 부피플라스크에 넣는다 증류수에 가하여 1,000 ml로 하고 ph 7.2±0.2로 조정한다 에서15분간 고압 멸균한다 BL 한천배지(BL Agar) Beef Extract 3 g, Liver Extract 5 g, Yeast Extract 5 g, Proteose Peptone 10 g, Tryptone 5 g, Soypeptone 3 g, Soluble Starch 0.5 g, Glucose 10 g, Dipotassium Phosphate 1 g, Monopotassium Phosphate 1g, Magnesium Sulfate 0.2g, Sodium Chloride 0.01g, Manganese Sulfate g, L-Cysteine HCl H 2 O 0.5 g, Ferrous Sulfate 0.01 g, Polysorbate 80(Tween 80) 1 g, Agar 15 g을 1 L 부피플라스크에 넣는다. 시판용 BL 한천배지 사용도 무관하다 증류수를 이용하여 1,000 ml로 하고, ph 7.2로 조정한다 에서 15분간 멸균하여, 50 로 냉각시킨다 소, 말, 양 또는 사람의 탈섬유소 혈액을 5% 되도록 첨가한다 BS한천배지(유산균과 비피더스균의 혼합제품에 적용) BL agar 1 L에 Sodium Propionate 15 g, Praomomycin Sulfate 50 mg, Neomycin 100 mg, Lithium Chloride 3 g을 첨가하여 조제한다 에서 15분간 멸균한다. 5. 시험과정 5.1 시험용액의 조제 액상시료 채취된 시료를 강하게 진탕하여 혼합한 것을 시험용액으로 한다 반유동상시료 채취된 시료를 멸균유리봉과 멸균스파테르 등으로 잘 혼합한다 그 일정량(10~25 ml)을 멸균용기에 취해 9배 양의 멸균생리식염수 와 혼합한 것을 시험용액으로 한다 고체시료 채취된 시료의 일정량(10~25 g)을 멸균된 가위와 칼 등으로 잘게 자 른다 멸균생리식염수를 가해 균질기를 이용해서 가능한 한 저온으로 균질화한다 여기에 멸균생리식염수를 가해서 일정량(100~250 ml)으로 한 것을 시험용액으로 한다 분말상시료 시료를 멸균유리봉과 멸균스파테르 등으로 잘 혼합한다 그 일정량(10 g)을 멸균용기에 취해 9배 양의 멸균생리식염수와 혼 419

423 합한 것을 시험용액으로 한다 캡슐제품류 캡슐을 포함하여 시료의 일정량(10~25 g)을 취한다 배 양의 멸균생리식염수를 가해 균질기와 스토마커 등을 이용하여 균질화한 것을 시험용액으로 한다 시험용액 조제 시 주의사항 위와 같이 조제된 시험원액에 대해서는 멸균생리식염수 9 ml에 시험원액 1 ml를 취하여 10배 희석액으로 만든다 필요에 따라 10 2 배, 10 3 배, 10 4 배 희석액을 만들어 사용한다 시험용액의 조제 시 시료를 용기 포장한 대로 채취할 때에는 그 외 부를 물로 씻고 자연건조시킨 다음 마개 및 그 하부 5~10 cm의 부근까지 70% 알콜탈지면으로 닦고, 화염멸균한 후 냉각하고 멸균 한 기구로 개봉, 또는 개관하여 2차 오염을 방지하여야 한다. 지방 분이 많은 시료의 경우는 Tween 80과 같은 세균에 독성이 없는 계면 활성제를 첨가하는 것이 좋다 냉동제품 냉동상태의 시료를 포장된 상태 그대로 40 이하에서 될 수 있는 대로 단시간에 녹여 용기, 포장의 표면을 70% 알코올 솜으로 잘 닦 은 후 상기 5.1.1~5.1.5의 방법으로 시험용액을 조제한다. 5.2 시험의 조작 시험용액 1 ml에 펩톤식염완충용액을 가하여 10 ml가 되게 한 다음 잘 혼합한다 위의 검액(10-1 용액) 1 ml에 희석액을 가하여 10 ml가 되게하고 10-2 검액 을 만든 후, 동일하게 조작하여 10-3, 10-4~ 10-7 검액을 조제한다 각 희석검액 0.1 ml씩을 각각 BL배지 (혹은 BS배지) 상에 접종하여 멸균 초자봉으로 도말(포)한다 이때 대조시험으로 검액을 가하지 아니한 동일 희석액 0.1 ml을 배지에 가한 것을 대조로하여 페트리접시, 희석용액, 배지 및 조작이 무균적이었 는지 여부를 확인한다 배지를 혐기성 상자에 넣고 37, 48~72시간 배양한다. 배양 후 집락을 계수하고 희석배수( 10)을 곱하여 시료 ml당 생균수를 산출한다. 6. 분석 및 계산 6.1 배양 후 BL 한천평판상의 균의 성장 Bifidobacterium longum 유갈색~황갈색의 반구상으로 융기된 중심부가 적갈색인 직경 약 1.0~2.0 mm의 집락을 형성한다. 420

424 6.1.2 Bifidobacterium bifidum 유갈색~회색으로 융기된 중심부가 적갈색인 직경 0.5~1.5 mm정도의 원 형집락을 형성한다 Bifidobacterium breve 유백색~유갈색의 반구형으로 중심부가 융기된 직경 1.0~2.0 mm의 원형 집 락을 형성한다. 6.2 계산 배양 후 즉시 집락 계산기를 사용하여 생성된 집락수를 계산한다. 단, 부득 이할 경우에는 5 에 보존시켜 24시간 이내에 산정한다 집락수의 계산은 확산집락이 없고(전면의 1/2이하 일 때에는 지장이 없 음) 1평판 당 30~300개의 집락을 생성한 평판을 택하여 집락수를 계산하 는 것을 원칙으로 한다. 전 평판에 300개 이상 집락이 발생한 경우 300에 가까운 평판에 대하여 밀집평판 측정법에 따라 안지름 9 cm의 페트리접시인 경우에는 1 cm 2 내의 평균 집락수에 65를 곱하여 그 평판의 집락수로 계 산한다. 전 평판에 30개 이하의 집락만을 얻었을 경우에는 가장 희석배수 가 얕은 것을 측정한다. 6.3 비피더스균수의 기재보고 시료 1 ml 중의 비피더스균수를 기재 또는 보고할 경우에 그것이 어떤 제한된 것에서 발육한 집락을 측정한 수치인 것을 명확히 하기 위하여 1평판에 있어서의 집락수는 상당 희석배수로 곱하고 1 ml 중(1 g 중)의 비피더스균수 몇 개라고 기재보고하며 동시에 배양온도를 기록한다. 숫자는 높은 단위로부터 3단계를 4 사5입하여 유효숫자를 2단계로 끊어 이하를 0으로 한다. 6.4 계산 비피더스 (개/g) = A 희석배수 A : plate 당 집락 수(개) 421

425 < 그림 > Bifidobacterium 사진 (Bifidobacterium breve in MRS) 7. 참고문헌 7.1 Clelia Altieri, Antonio Bevilacqua, Daniela D Amato, Matteo Alessandro Del Nobile, Milena Sinigaglia : Modelling the survival of starter lactic acid bacteria and Bifidobacterium bifidum in single and simultaneous cultures, Food Microbiology 25, , K. Kailasapathy, I. Harmstorf, M. Phillips : Survival of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium animalis sp. Lactis in stirred fruit yogurts, LWT 41, , R. Tabasco, T. Paarup, C. Janer, C. Pela"L ez, T. Requena : Selective enumeration and identification of mixed cultures of Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus, L. paracasei subsp. paracasei and Bifidobacterium lactis in fermented milk, International Dairy Journal, 17, , 지근억, 이세경, 김인희 : 개량된 Bifidobacterium의 선택배지 개발. 한국식품과 학회지, 26(5), , 시험 주의사항 1) 이중코팅 유산균제품의 경우 인산완충액이나 생리식염수에서는 코팅을 완벽하게 제거 하지 못하여 유산균수가 정확히 나오지 않는 경우가 있으므로 이러한 경우Na 2HPO 4 0.6%, KH 2PO %, L-cystein HCL 0.05%, Tween %, 증류수 98.85%를 코팅 제거 용액으로 이용하여 코팅을 제거한 후 시험하여야 한다. 2) 유산균과 비피더스균의 혼합제품에 사용하는 BS(Bifidobgacterium selective) agar 배지 는 지근억 등(1994)의 결과에 따라 상당수의 Bifidobacterium이 사멸되므로 TP(Transgalactooligosaccharide-Propionate)배지를 대체하여 사용하는 것을 제안하고 있다. 422

426 Ⅲ 자실체 또는 균사체의 함량 및 확인 Ⅲ 영지버섯제품 1. 시험방법의 원리 영지버섯은 담자균류 민주름목에 속하는 구멍장이버섯과의 버섯이다. 활엽수 뿌리 에서 발생하여 땅위로 돋는 1년생 버섯으로 예로부터 불로초라고도 불렸으며, 일본 에서는 만년버섯, 중국에서는 영지라고 하여 장식용이나 약재로 많이 사용되어져 왔다. 버섯갓은 지름 5~15cm, 두께 1~1.5cm로 반원 모양, 신장 모양, 부채 모양이며 편평 하고 동심형의 고리 모양 홈이 있다. 버섯갓 표면은 처음에 누런빛을 띠는 흰색이다가 누런 갈색 또는 붉은 갈색으로 변하고 늙으면 밤갈색으로 변한다. 본 시험법은 시료 중 존재하는 자실체를 산성클로로포름으로 추출 시킨 후 내부표 준물질을 가해 옥타데실실릴화한된 칼럼을 연결하여 분리하는 방법으로 자외부흡광 광도검출기를 이용하여 최대 흡수 파장인 254 nm에서 검출하여 정량한다. 산성클로로포름 추출 filtration / 진탕 감압 농축 자외부흡광광도검출 2. 안전주의사항 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴(Acetonitrile)은 흡입이나 섭취 시 구토, 구역, 혈압변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의식불명 등의 증상 이 나타날 수 있으므로 환기가 잘되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의 를 기울여야 한다. 농축물 추출에 사용되는 클로로포름은 신경을 마비시키는 작용을 하므로 마취제로 서 사용되지만 과량복용이나 주사 시 심장을 멈춰 죽음에 이르게 하며, 장기간 복 용이나 노출은 간, 폐, 신장에 해를 주므로 환기가 잘되는 시설과 안전장비를 갖추 고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 용매용 일회용 실린지 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터 감압농축기 가지달린 삼각플라스크(Filter Flask) 여지(filter paper) 423

427 3.1.6 액체크로마토그래프용 유리병 부피플라스크(50 ml, 10 ml) 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 내경 4 mm, 길이 25~30 cm의 스테인레스관에 5~10 μm의 옥타데실실 릴화한 실리카겔(μ-Bondapak C 18 상당품)을 충전한 것 3.3 분석장비의 준비 자실체가공제품실험 2% 초산수용액 아세토니트릴(2 : 1)을 분당 1 ml씩 충분한 시간동안 흘려 기기와 칼럼을 안정화 시킨다 배양물가공제품실험 (ph 6.5 인산이수소칼륨, 인산수소이나트륨완충액) 에탄올의 혼액(9 : 20) 을 분당 1 ml씩 충분한 시간동안 흘려 기기와 칼럼을 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 Thymol(2-Isopropyl-5-methylphenol,5-Methyl-2-isopropylphenol) 분자식 : 2-[(CH 3 ) 2 CH]C 6 H 3-5-(CH 3 )OH, 분자량 : , CAS No. : Pyrene(Benzo[def]phenanthrene) 분자식 : C 16 H 10, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 염산(Hydrochloric acid) 클로로포름(Chloroform) 증류수(Distilled water) 에탄올(Ethanol,) 아세토니트릴(Acetonitrile) 초산(Acetic acid) 424

428 4.2.7 인산이수소칼륨(Potassiom dihydrogenphosphate) 인산수소이나트륨(Disodium hydrogenphosphate) 5. 시험과정 5.1 시험용액의 조제 제품 약 10 g(추출물은 자실체로 환산하여)을 정밀히 달아 삼각플라스크에 취하고 물 100 ml를 가해 냉각관을 부착한 고무마개를 하여 90~100 에서 4시간 환류하여 추출 1) 한 후 추출물은 가온하여 녹인다 에탄올 100 ml를 가해 잘 흔들어 섞은 후 여과한다 잔류물을 물 : 에탄올(1 : 1) 200 ml로 30분간 진탕하여 추출한다 여액을 합하여 감압 농축하여 전량을 10 ml 이하로 한다 농축물을 물 200 ml에 분산하여 2 N 염산으로 ph 3으로 한 후 클로로 포름 50 ml씩으로 3회 추출한다 클로로포름층을 합하여 5% 탄산수소나트륨용액 50 ml씩으로 3회 추출한 다 물층을 합하여 2 N 염산으로 ph 3으로 조정하여 클로로포름 50 ml씩으 로 3회 추출한다 클로로포름층을 합하여 미리 무게를 구해놓은 플라스크에 옮기고, 클로로포 름을 감압 하에 날려보내고, 잔류물을 데시케이타(실리카겔) 중에서 24시 간 건조한 후 그 무게를 구하고 조제시료로 한다. 5.2 표준용액의 조제 해당제품의 원료 자실체 건조물을 분쇄 또는 가늘게 썰거나 배양물의 건 조물 약 10 g을 정밀히 달다 삼각플라스크에 취하고 물 100 ml를 가하여 냉각관을 부착한 고무마개를 하여 90~100 에서 4시간 환류하여 추출하고(추출물은 가온하여 녹인다) 에탄올 100 ml를 가해 잘 흔들어 섞은 후 여과한다 잔류물은 물 : 에탄올(1 : 1) 200 ml로 30분간 진탕하여 추출한다 여액을 합하여 감압 하에 농축하여 전량을 10 ml 이하로 한다 농축물을 물 200 ml에 분산하여 2 N 염산으로 ph 3으로 한 후 클로로 포름 50 ml씩으로 3회 추출한다 클로로포름층을 합하여 5% 탄산수소나트륨수용액 50 ml씩으로 3회 추출 한다 물층을 합하여 2 N 염산으로 ph 3으로 조정하여 클로로포름 50 ml씩으 로 3회 추출한다 클로로포름층을 합하여 미리 무게를 구해놓은 플라스크에 옮기고, 클로로포 름을 감압 하에 날려보내고 잔류물을 데시케이타(실리카겔) 중에서 24시간 건 조한 후 그 무게를 구한다. 425

429 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 제품의 산성클로로포름 추출에 의해 얻은 시료 3~10 mg을 정확히 달아 내부 표준용액 2) 1 ml를 정확히 가해 검액으로 한다 별도로 원료 영지건조물에서 산성클로로포름 추출에 의해 얻은 표준물질 3~10 mg을 정확히 달아 내부표준용액 1 ml를 정확히 가해 표준용액으로 한다 검액 및 표준용액 10 μl씩을 예시된 표의 조건 하에서 고속액체크로마토 그래프하여 얻은 검액의 크로마토그램 및 표준용액의 크로마토그램은 동일 한 특유의 양상(패턴)이 확인되어야 한다. 표 1. 자실체 가공제품 고속액체크로마토그래프 조건 항목 주입량 조건 10 μl 칼럼온도 40 칼럼의 선택 산성클로로포름 가용물, 내부표준물질의 순으로 용출되고 내부표준물질에 대한 분리계수가 약 2.7이 되는 피크의 물 질<가노데린산 A(Ganoderic acid A)>과 내부표준물질의 분리도가 2.0 이상의 것을 사용한다. 이동상 2% 초산수용액 아세토니트릴(2 : 1) 검출기 파장 유량 254 nm 티몰의 머무름 시간이 약 40분이 되도록 조정 표 2. 배양물 가공제품 고속액체크로마토그래프 조건 항목 주입량 칼럼온도 칼럼의 선택 조건 10 μl 실온 산성클로로포름 가용물, 내부표준물질의 순으로 용출되고 내부표준물질에 대한 분리계수가 약 1.7이 되는 피크의 물질<가노데린산 S(Ganoderic acid S)>과 내부표준물질의 분리도가 6.0 이상의 것을 사용한다. 이동상 검출기 파장 유량 (ph 6.5 인산이수소칼륨, 인산수소이나트륨완충액) 에탄올의 혼액(9 : 20) 210 nm 파이렌의 머무름 시간이 약 30분이 되도록 조정 426

430 6.2. 표준물질 크로마토그램 6.3 정량시험 자실체 또는 배양물을 가공한 제품의 경우 시료 및 표준물질의 조제에서 얻어진 산성클로로포름 가용분의 중량을 사용하여 다음 식에 의거하여 구한다. 시료의 산성클로로포름 가용분(mg) 시료채취량(g) 영지함유율(건조물환산율 %)= 100 표준물질의 산성클로로포름 가용분(mg) 표준자실체 또는 표준배양물의 건조물량(g) 자실체와 배양물을 혼합하여 가공한 제품의 경우 확인시험에 의해 얻은 시료 및 표준물질의 액체크로마토그램의 내부 표준물질이 피크 면적에 대한 지표물질(자실체에 있어서는 가노데린산 A 배양물에 있어서는 가노데린산 S)의 피크 면적비와 Q t A, Q s A 및 Q t S, Q s S를 구하여 다음 식에 의거 계산한다. 영지의 함유율(건조물 환산율)(%) = <영지자실체 함유율(M)>+<영지배양물함유율(N)> M= Q t A(조제검체)/(검체채취량(g) Q s A(표준물질)/표준자실체건조물량(g)

431 N= Q t S(조제검체)/(검체채취량( g) Q s S(표준물질)/표준배양물의 건조물량( g) 100(%) 7. 참고문헌 7.1 Hiroshi Kohda, Wakako Tokumoto, Kiyoe Sakamoto, Michiko Fujii, Yuko Hirai, Kazuo Yamasaki, yasuo Komoda, Hideo Nakamura, Shigenasa Ishihara, Masaru Uchida : The biologically active constituents of Ganoderma lucidum(fr.) karst. Histamine release-inhibitory triterpenes, Chemical and Pharmaceutical bulletin, 33, , 시험 주의사항 1) 가열 반응은 반응시키는 수욕조나 가열기를 목적하는 온도로 미리 맞추어 두어 목적온도에서의 시간을 정확히 유지토록 한다. 2) 내부 표준 물질로는 thimol을 사용하며, 크로마토그램에서 내부표준물질 피크와 중첩되는 방해 피크가 존재 할 경우 내부표준물질을 가하지 않은 시험용액을 만들어서 적당한 피크를 기준으로 하여 두 가지 시험용액을 비교하여 내부 표 준물질 피크의 면적을 보정하여야 한다. 428

432 Ⅲ 운지버섯제품 <산성클로로포름 가용분에 의한 확인 및 정량> 1. 시험방법의 원리 운지버섯은 민주름버섯목 구멍장이버섯과의 버섯이다. 마치 구름처럼 뭉쳐서 난다 고 하여 한자로 구름운, 버섯지 즉 운지( 雲 芝 )라고 부른다. 색깔은 흑색에서 남흑색 이고 구름무늬는 회색, 황갈색, 암갈색, 흑갈색, 흑색 등이 있다. 봄부터 가을에 걸 쳐 침엽수, 활엽수의 고목 또는 그루터기등에 수십 내지 수백 개가 무리지어 자란 다. 한국, 일본, 중국 등 전세계에 골고루 분포되어 있다. 운지의 다당체인 PSK가 대식세포활성화 등의 작용을 통해 인체면역력을 증가시킨다. 본 시험법은 시료 중 존재하는 자실체를 산성클로로포름으로 추출 시킨 후 내부표준 물질을 가해 옥타데실실릴화한된 칼럼을 연결하여 분리하는 방법으로 자외부흡광광 도검출기를 이용하여 최대 흡수 파장인 254 nm에서 검출하여 정량한다. 산성클로로포름 추출 filtration / 진탕 감압 농축 자외부흡광광도검출 2. 안전주의사항 염산(Hydrochloric acid)은 자극적인 냄새를 가지고 있고 피부 화상, 점막 화상, 호 흡 자극, 눈 자극 등의 건강 위험성이 있다. 물리적 위험으로는 용기가 열에 노출되 면 파열되거나 폭발할 수도 있고 물과 접촉 시 반응할 수 있다. 또한 흡입 시 자극 이 심한 경우도 있을 수 있으며 두통, 폐 울혈과 폐 이상이 생길 수 있다. 또한 피 부에 접촉 시 자극 및 동상과 눈 접촉 시에는 실명 및 동상 마지막으로 섭취 시에 는 화상, 구역, 구토 및 설사를 유발시킬 수 있으므로 환기가 잘 되는 곳에서 실험 복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 아세토니트릴(Acetonitrile)은 흡입이나 섭취 시 구 토, 구역, 혈압변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의식불명 등의 증상이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 용매용 일회용 실린지 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터 감압농축기 가지달린 삼각플라스크(Filter Flask) 429

433 3.1.5 여지(filter paper) 액체크로마토그래프용 유리병 부피플라스크(50 ml, 10 ml) 3.2 분석장비 고속액체크로마토그래프 자외부흡광광도검출기 내경 4 mm, 길이 25~30 cm의 스테인레스관에 5~10 μm의 옥타데실실 릴화한 실리카겔(μ-Bondapak C 18 상당품)을 충전한 것 3.3 분석장비의 준비 % 초산수용액 아세토니트릴(2 : 1)을 분당 1 ml씩 충분한 시간동안 흘려 기기와 칼럼을 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 Thymol(2-Isopropyl-5-methylphenol,5-Methyl-2-isopropylphenol) 분자식 : 2-[(CH 3 ) 2 CH]C 6 H 3-5-(CH 3 )OH, 분자량 : , CAS No. : 일반시약 염산(Hydro chloride) 클로로포름(Chloroform) 증류수(Distilled water) 에탄올(Ethanol) 아세토니트릴(Acetonitrile) 초산(Acetic acid) 5. 시험과정 5.1 시험용액의 조제 제품 약 10 g(추출물은 자실체로 환산하여)을 정밀히 달아 삼각플라스크에 취하고 물 100 ml를 가해 냉각관을 부착한 고무마개를 하여 90~100 에서 4시간 환류하여 추출 1) 한 후 추출물은 가온하여 녹인다 에탄올 100 ml를 가해 잘 흔들어 섞은 후 여과한다 잔류물을 물 : 에탄올(1 : 1) 200 ml로 30분간 진탕하여 추출한다 여액을 합하여 감압 농축하여 전량을 10 ml 이하로 한다. 430

434 5.1.5 농축물을 물 200 ml에 분산하여 2 N 염산으로 ph 3으로 한 후 클로로 포름 50 ml씩으로 3회 추출한다 클로로포름층을 합하여 5% 탄산수소나트륨용액 50 ml씩으로 3회 추출한 다 물층을 합하여 2 N 염산으로 ph 3으로 조정하여 클로로포름 50 ml씩으 로 3회 추출한다 클로로포름층을 합하여 미리 무게를 구해놓은 플라스크에 옮기고, 클로로포 름을 감압 하에 날려보내고, 잔류물을 데시케이타(실리카겔) 중에서 24시간 건 조한 후 그 무게를 구하고 조제시료로 한다. 5.2 표준용액의 조제 해당제품의 원료 자실체 건조물을 분쇄 또는 가늘게 썰거나 배양물의 건 조물 약 10 g을 정밀히 달다 삼각플라스크에 취하고 물 100 ml를 가하여 냉각관을 부착한 고무마개를 하여 90~100 에서 4시간 환류하여 추출하고(추출물은 가온하여 녹인다) 에탄올 100 ml를 가해 잘 흔들어 섞은 후 여과한다 잔류물은 물 : 에탄올(1 : 1) 200 ml로 30분간 진탕하여 추출한다 여액을 합하여 감압 하에 농축하여 전량을 10 ml 이하로 한다 농축물을 물 200 ml에 분산하여 2 N 염산으로 ph 3으로 한 후 클로로 포름 50 ml씩으로 3회 추출한다 클로로포름층을 합하여 5% 탄산수소나트륨수용액 50 ml씩으로 3회 추출 한다 물층을 합하여 2 N 염산으로 ph 3으로 조정하여 클로로포름 50 ml씩으 로 3회 추출한다 클로로포름층을 합하여 미리 무게를 구해놓은 플라스크에 옮기고, 클로로포 름을 감압 하에 날려보내고 잔류물을 데시케이타(실리카겔) 중에서 24시간 건 조한 후 그 무게를 구한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 제품의 산성클로로포름 추출에 의해 얻은 시료 3~10 mg을 정확히 달 아 내부 표준용액 2) 1 ml를 정확히 가해 검액으로 한다 별도로 원료 영지건조물에서 산성클로로포름 추출에 의해 얻은 표준물질 3~10 mg을 정확히 달아 내부표준용액 1 ml를 정확히 가해 표준용액으로 한다 검액 및 표준용액 10 μl씩을 예시된 표의 조건 하에서 고속액체크로마토 그래프하여 얻은 검액의 크로마토그램 및 표준용액의 크로마토그램은 동일 한 특유의 양상(패턴)이 확인되어야 한다. 431

435 표 1. 자실체 가공제품 고속액체크로마토그래프 조건 항목 주입량 조건 10 μl 칼럼온도 40 이동상 2% 초산수용액 아세토니트릴(2 : 1) 검출기 파장 유량 274 nm 1ml/min 6.2. 표준물질 크로마토그램 6.3 정량시험 시료 및 표준물질의 조제에서 얻어진 산성클로로포름 가용분의 중량을 사 용하여 다음 식에 의거 함량을 구한다. 운지자실체 또는 균사체(건조물환산율)(%) 시료의 산성클로로포름 가용분(mg) 시료의 채취량(g) = 100 표준물질의 산성클로로포름 가용분(mg) 표준자실체 또는 표준 배양추출물의 건조물량(g) 7. 참고문헌 7.1 Anne-Claire Martel, Sarah Zeggane : Determination of acaricides in honey by high-performance liquid chromatography with photodiode array 432

436 detection, Journal of Chromatography A, 954, , H. Hajimehdipoor, M. Shekarchi, M. Khanavi, N. Adib, and M. Amri : A validated high performance liquid chromatography method for the analysis of thymol and carvacrol in Thymus vulgaris L. volatile oil, Pharmacogn Mag. Jul-Sep; 6(23): , 시험 주의사항 1) 가열 반응은 반응시키는 수욕조나 가열기를 목적하는 온도로 미리 맞추어 두어 목적온도에서의 시간을 정확히 유지토록 한다. 2) 내부 표준 물질로는 thimol을 사용하며, 크로마토그램에서 내부표준물질 피크와 중첩 되는 방해 피크가 존재 할 경우 내부표준물질을 가하지 않은 시험용액을 만들 어서 적당한 피크를 기준으로 하여 두 가지 시험용액을 비교하여 내부 표준물 질 피크의 면적을 보정하여야 한다. 433

437 Ⅲ 표고버섯제품 1. 시험방법의 원리 표고버섯은 일명 참나무버섯으로 봄과 가을 2회에 걸쳐 참나무류 밤나무 서어나무 등 활엽수의 마른 나무에 발생한다. 갓 표면은 다갈색이고 흑갈색의 가는 솜털처럼 생긴 비늘조각으로 덮여 있으며 때로는 터져서 흰 살이 보이기도 한다. 갓 가장자 리는 어렸을 때 안쪽으로 감기고 흰색 또는 연한 갈색의 피막으로 덮여 있다가 터 지면 갓 가장자리와 버섯대에 떨어져 붙는다. 버섯대에 붙은 것은 불완전한 버섯대 고리가 되고, 주름살은 흰색이며 촘촘하다. 버섯대는 3 6cm 1cm이고 나무에 붙어 있는 상태에 따라 한쪽으로 기울어진다. 버섯대 표면은 위쪽이 흰색, 아래쪽이 갈색이고 섬유처럼 질긴 편이다. 홀씨는 한쪽 이 뾰족한 타원 모양이고 색이 없으며 홀씨 무늬는 흰색이다. 원목에 의한 인공재 배가 이루어지며 한국 일본 중국에서는 생표고 또는 건표고를 버섯 중에서 으뜸가 는 상품의 식품으로 이용한다. 한국 일본 중국 타이완 등지에 분포한다. 본 시험법은 시료 중 존재하는 자실체를 추출 시킨 후 실리카겔박층판에 전개하여 발 색부에서 자외선(365 nm)를 조사하여 형광의 반점을 비교 확인하여 정량한다. 감압농축 원심분리 진탕 / 흡착 / 용출 환류추출 자외선 조사 형광반점 비교확인 2. 안전주의사항 닌히드린(Ninhydrin)은 결정체 혹은 분말 상태로 호흡기도 자극, 피부 자극, 눈 자 극의 주요한 건강위험성이 있고 물리적 위험으로는 분진/공기 혼합물은 발화하거나 폭발할 수 있어 환기가 잘 되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치 를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 초산(Acetic acid)은 초산 냄새가 강하며 흡입 시 자극, 재채기, 콧물과 섭취시 출 혈, 구토, 설사를 유발하고 눈에 화상과 호흡기도 및 피부 자극에 위험성이 있어 환 기가 잘되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 분액여두 삼각플라스크 부피플라스크(50 ml, 10 ml) 434

438 3.1.4 감압농축기 3.2 분석장비 전개조 : 200 mm 200 mm 유리판의 사용이 가능한 유리재질로 기밀한 것 실리카겔박층판 자외선등(365 nm) : 탁상형 또는 휴대형 3.3 분석장비의 준비 박층크로마토그래피용 실리카겔 30 g에 물 50 ml를 가하여 섞은 후 유리 판(200 mm 200 mm)에 0.3~0.5 mm의 두께로 도포한다. 풍건 후 105~ 110 에서 3시간 건조하고 데시케이타 중에서 방냉하여 보존한다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 일반시약 에테르(Diethyl Ether) 증류수(Distilled water) 무수에탄올(Ethanol) Amberlite IR-120B(H형), Amberlite IRA-45(OH형) 암모니아수(Ammonia water) 초산(Acetic acid) n-부탄올(n-butanol) 닌히드린(Ninhydrin) 4.2 시액의 조제 N 암모니아용액 암모니아수(28%) 67 ml를 취하여 물을 가해 1 L로 한다 N 초산용액 초산(특급) 29 ml를 취해 물을 가해 1 L로 한다 전개용매 n-부탄올(특급), 초산(특급), 증류수를 4 : 1 : 2(용량비)로 혼합한다 닌히드린용액 물로 포화시킨 n-부탄올에 닌히드린(특급)을 용해하여 0.2%로 한 용액 5. 시험과정 5.1 표준물질의 조제 원료인 건조표고버섯 및 관리 배양한 표고균사 10 g을 정확히 달아 삼각 플라스크에 취하고 10배량의 물을 가한다 냉각관을 부착한 고무마개를 하여 90~100 에서 4시간 환류하여 추출 1) 하 고 추출액을 모아 감압 농축하여 액량을 20 ml로 한다. 435

439 5.2 표준용액의 조제 표준물질에 4배량의 무수에탄올을 가해 80% 에탄올용액으로 하고 생성한 침전을 원심분리하여 제거한다 상등액을 감압 농축하여 에탄올을 제거하고, 분액여두에 옮겨 동량의 에 테르로 2회 추출 2) 하고 그 에테르층을 제거한다 에테르를 완전히 제거한 후 물층에 10 g의 Amberlite IR-120B(H형)을 가 해 30분간 진탕하여 흡착시킨다 흡착된 수지를 물로 세척한 후 1 N 수산화암모늄을 20 ml 가하여 30분 간 진탕하여 용출시킨다 용출 후 10 g의 Amberlite IRA-45(OH형)을 가하고 30분간 진탕하여 흡착 시킨다 흡착시킨 수지를 물로 씻어낸 후 0.5 N 초산 20 ml로 30분간 흔들어서 용출시킨 후 이것을 2~3회 반복하여 용출액을 모아 감압 농축하여 전량 을 1 ml로 하여 표준용액으로 한다. 5.3 시험용액의 조제 원료표고버섯 자실체 또는 인공적으로 관리 배양한 균사의 가공분말 또는 이들을 가공한 제품의 경우에는 원료의 10 g에 해당하는 제품을 정확히 달아 삼각플라스크에 취하고 10배량의 물을 가한다 냉각관이 부착된 고무마개를 하여 90~100 에서 4시간 환류하여 추출한다 추출액은 합하여 감압 농축하여 액량을 20 ml로 한다. 단, 원료가 표고버섯 의 자실체 및 인공적으로 관리 배양한 균사의 추출물인 경우에는 원료 10 g 상당의 제품에 20 ml의 물을 가해 용해 또는 현탁한다 앞의 4.2 표준용액과 동일한 방법으로 실험하여 시험용액을 준비한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 표준용액 및 시험용액을 실리카겔박층판(200 mm 200 mm)에 각각 20 μl 씩 직경 3~5 mm로 점적한 후 전개조에서 전개 3) 시킨다 전개된 실리카겔박층판은 풍건한 후 닌히드린용액을 분무하여 90~100 에서 수 분간 가열하여 발색한 후 발색부에 자외선(365 nm)를 조사하여 형광의 반점(Elidadenin)을 비교 확인한다 별도로 조작하여 얻은 박층판의 동일 반점부위를 긁어모아 에탄올 일정량을 가하여 추출하고 원심분리하여 액층 1 cm, 파장 nm에서 흡광도를 측정 하여 함량을 구한다. 436

440 6.2. 파장 그래프 7. 참고문헌 7.1 Val eria Gergely, Kevin M. Kubachka, Sandra Mounicouc, P eter Fodor, Joseph A.Caruso: Selenium speciation in Agaricus bisporus and Lentinula edodes mushroom proteins using multi-dimensional chromatography coupled to inductively coupled plasma mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 1101, , KAZUNORI TAKAMURA, HlROKO HOSHINO, TATSUYUKI SUGAHARA : Determination of vitamin D, in shiitake mushroom (Lentinusedodes) by high-performance liquid chromatogiaphy, Journal of Chromatography, 545, , 시험 주의사항 1) 가열 반응은 반응시키는 수욕조나 가열기를 목적하는 온도로 미리 맞추어 두 어 목적온도에서의 시간을 정확히 유지토록 한다. 2) 에테르 처리시 에멀젼을 방지하기 위하여 최초 2회 정도는 가볍게 흔들어 준 다. 3) 전개액이 박층 높이의 80%를 넘지 않도록 전개시간에 주의를 기울여야 하며 통상 65 75% 정도의 높이까지 전개하는 것이 분리 효율이 좋다. 437

441 Ⅲ 효모수 1. 시험방법의 원리 효모란 진핵세포 구조를 가진 고등미생물로 생활의 대부분을 구형, 난형 등의 단 세포로 행하고 주로 출아에 의하여 증식하는 진균류의 총칭이나 곰팡이, 버섯류 등 의 이름과 같이 분류학상의 엄밀한 명칭은 아니다. 그러나 같은 진균류에 속하는 곰팡이나 버섯과는 그 성상이 아주 다르므로 보통 이들 균류와 구별하여 취급한다. 효모 중에도 출아에 의한 증식 외에 분열법으로 증식하는 것도 있고 균사나 가균사 를 가진 것도 있다. 즉 효모는 자낭포자(ascospore)를 형성하는 Endomycetaceae, 사 출포자(ballistospore)를 형성하는 Sporebolomycetaceae, 포자를 형성하지 않는 Cryptococcaceae 등이 있다. 전형적인 효모는 출아에 의해 증식하는 크기 8 μm의 타원형 구형인 세포이다. 곰팡이 및 효모 등 진균이 성장하는데 고포도당 및 starch가 필수적이며. 세균 등 다른 미생물의 성장을 저해하기 위해 tataric acid로 배지 ph를 3.5±0.1로 낮춰 이 배지에서 자라는 집락을 진균수로 규정하고 이를 계 수한다. 본 시험법은 멸균생리식염수로 최소 구획 중의 세포수가 5개 전 후가 되도 록 희석하여 혈구계산판(Bürkei-Türk형)에 주입 후 검경하여 일정 구간 내에 효모수 를 측정하는 방법이다. 시료 희석 혈구계산판에 주입 검경 후 효모수 측정 2. 안전 주의사항 실험에 사용되는 고압멸균기의 취급에 주의를 기울여 폭발 등의 사고를 방지하여 야 하며, 모든 실험 조작 전후에 소독과 세척을 철저히 하는 등 개인위생에 만전을 기하여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 혈구계산판(Bürkei-Türk형) 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 일반시약 멸균생리식염수 5. 시험과정 5.1 시험용액의 조제 438

442 5.1.1 시료 일정량을 취한다 멸균생리식염수를 이용하여 최소 구획 중의 세포 수가 5개 전 후가 되도 록 희석한다 혈구계산판(Bürkei-Türk형)에 일정량을 주입한다 혈구계산판을 검경 후 일정 구간 내의 진균수를 측정한다 이 값에서 시료 1 ml 중의 진균수를 산출한다. < 그림 > 혈구계산판 사진 < 그림 > 효모 사진 6. 분석 및 계산 7. 참고문헌 7.1 Microbiological Applications 6th Ed (Wm. C. Brown Publishers, 1994) 7.2. Laboratory Manual of Experimental Microbiology (Mosby-Year Book, 1995) 7.3 Microbiology Laboratory Guidebook 3th Ed (USDA, 1999) 7.4 Bacteriological Analytical Manual 8th Ed (FDA, 2001) 439

443 8. 시험 주의사항 1) 진균시험법 중 멸균, 사용기구, 시료의 채취방법 등은 거의 세균시험법과 공통되나, 진 균의 배양, 동정 등의 방법에는 진균특유의 성질, 특히 균사체를 갖고, 구조가 입체적 이고 복잡한, 또한 다수의 포자를 형성하고, 비산하기 쉬운 성질 등이 있으므로 진균만 을 취급하는 전용실험실, 배양실을 필요로 한다. 특히 접종실에는 무균설비 뿐 아니라 배기 중에 섞여 외부로 포자가 비산하지 않도록 생물학적 안전캐비넷을 설치한다. 2) 곰팡이균은 호기성의 진균이라 기존의 pouring 방법에 의하여 정확한 균수를 계수하 기어려워 곰팡이균수 만을 계수하고자 하는 경우는 시료를 희석하여 PDA agar에서 도말 희석평판법으로 측정하여야 한다. 440

444 Ⅲ.3.9 효소활성 Ⅲ α-아밀라아제 1. 시험방법의 원리 α-아밀라아제는 글루코오스의 α-1,4-결합에만 작용한다. 아밀로오스는 α-1,4-결합 밖 에 없으므로, α-아밀라아제에 의하여 완전히 분해된다. 그러나 아밀로펙틴이나 글리 코겐에는 α-1,6-결합도 함유되어 있으므로, α-아밀라아제에 의하여 분해되지 않는 부분이 남는다. 이것을 한계( 限 界 )덱스트린이라고 한다. 침이나 이자액의 아밀라아제 는 전형적인 α-아밀라아제다. 또한, α-아밀라아제는 맥아 곰팡이 세균 등에도 존재한다. 녹말이나 글리코겐 등의 글루코오스 사슬을 안쪽에서부터 규칙성 없이 절단하면 반응의 초기부터 다당류는 급속히 저분자화 하여 요오드 녹말반응을 나타내지 않게 된다. 반응이 진행함에 따라 글루코오스 사슬은 차례로 짧아져 반응의 종기에는 말 토오스가 주성분이 된다. 본 시험법은 시료 중 α-아밀라아제의 효소활성을 나타내는 방법으로 시험용액 중의 효소활성을 있는 검액과 효소활성을 잃은 검액을 분광광도계를 이용하여 파장 660 nm에서 흡광도의 차이를 이용한다. filtration 가온 / 방치 분광광도 2. 안전주의사항 염산(Hydrochloric acid)은 자극적인 냄새를 가지고 있고 피부 화상, 점막 화상, 호 흡 자극, 눈 자극 등의 건강 위험성이 있다. 물리적 위험으로는 용기가 열에 노출되 면 파열되거나 폭발할 수도 있고 물과 접촉 시 반응할 수 있다. 또한 흡입 시 자극 이 심한 경우도 있을 수 있으며 두통, 폐 울혈과 폐 이상이 생길 수 있다. 또한 피 부에 접촉 시 자극 및 동상과 눈 접촉 시에는 실명 및 동상 마지막으로 섭취 시에 는 화상, 구역, 구토 및 설사를 유발시킬 수 있으므로 환기가 잘 되는 곳에서 실험 복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 시험관 항온수조 부피플라스크(100 ml) 441

445 3.1.4 시험관(20 ml) 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 일반시약 증류수(Distilled water) 제1인산나트륨(Monosodium phosphate) 구연산(Citric acid) 염화칼슘(Calcium chloride) 요오드(Iodine) 요오드칼륨(Potassium iodide) 염산(Hydrochloric acid) 4.2 시액의 조제 % 가용성전분용액 가용성전분 1 g을 물에 녹이고 호화하여 100 ml로 한다 맥바인(Mcllvaine) 완충액(pH 6.0 또는 7.0) 0.1 N 인산일수소나트륨액 일정량에 0.1 N 구연산액을 넣어 ph 6.0 및 7.0으로 각각 만든다 % 염화칼슘용액 염화칼슘 1 g을 물에 녹여 1 L로 한다 요오드시액 요오드 0.2 g과 요오드칼륨 2 g을 물에 녹여 100 ml로 하고 그 1 ml에 1 N 염산 1 ml를 넣고 물로 100 ml로 한다. 5. 시험과정 5.1 시험용액의 조제 시료 약 5 g을 정밀히 달아 100 ml 부피플라스크에 취한다 물 또는 완충액을 표선까지 채운 다음 여과한 것을 검액으로 한다 T1(시험용)시험관에 1%가용성전분용액 5 ml, 맥바인완충용액 13 ml, 0.1% 염화칼슘용액 1 ml을 넣고 37 로 가온한다 검액 1 ml을 넣고 T1(시험용)시험관은 37 에서 30분간 방치 1) 한다 T2(공시험용)시험관의 검액은 100 에서 30분간 가열하여 활성을 잃게 한 다 활성을 잃은 검액 1 ml을 T2(공시험용)시험관에 넣고 5.1.3~5.1.4와 같이 조작한다 T1(시험용), T2(공시험용) 반응액 0.2 ml에 요오드시액 10 ml을 넣은 것 을 시험용액으로 한다. 442

446 6. 분석 및 계산 6.1 분석 물을 대조액으로 하여 파장 660 nm에서 흡광도를 측정한다. 이 때 시험용액 의 흡광도는 공시험의 흡광도보다 이상 작아야 한다 발색의 정도가 지나쳐 측정이 곤란한 경우에는 검액을 희석하여 시험하고 희석배수를 적용한다. 7. 참고문헌 7.1 ROBERT J. HENRY : Rapid separation of ol-amyiases from barley by ion-exchange high-performanceliquid chromatography on non-porous columns, Journnl of Chromatography, 481, , T. DOBRANSKY, POLiVKA and I, HAAS, 0. SOVA and E. PETRVALSKL : Purification of x-amylase by industrial autofocusing, Journnl of Chromatography, 41I, , CYNTHIA A. HENSON, JULIE M. STONE : RAPID HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHIC SEPARATION OF BARLEY MALT α -AMYLASE ON CYCLOBOND COLUMNS, Journal of Chromatography, 469,36 I-367, 시험 주의사항 1) 모든 가열 반응은 반응시키는 수욕조나 가열기를 목적하는 온도로 미리 맞추 어 두어 목적온도에서의 시간을 정확히 유지토록 한다. 443

447 Ⅲ 프로테아제 1. 시험방법의 원리 프로테아제는 단백질 가수분해효소를 말하며 단백질의 펩티드 결합을 가수분해하 는 효소의 총칭이기도 하다. 대부분의 단백질은 분자량 수 만인 단순단백질인데, 당 이나 금속이온을 수반하는 복합단백질인 경우도 있다. 분류방법에는 작용양식에 의 하여 폴리펩티드 사슬을 말단에서 절단하는 엑소펩티다아제(exopeptidase)와 엔도펩 티다아제(endopeptidase)로 나눈다. 엑소펩티다아제는 펩티드사슬의 말단에만 작용 하여 아미노산을 차례로 유리시킨다. 로이신아미노펩티다아제나 카복시펩티다아제 가 대표적이다. 엔도펩티다아제는 말단보다는 오히려 내부에 작용하여 여러 가지 크기의 펩티드를 유리시킨다. 식품공업에서 프로테아제는 중요한 역할을 하며, 보기 로 치즈의 제조에서는 송아지 장의 산성 프로테아제인 레닌(rennin)이 필요하고 된 장, 간장 등의 양조에 있어서도 발효 중에 누룩곰팡이의 미생물 프로테아제가 중요 한 역할을 다하여 영양가나 정미를 지배하고 있다. 또한 파파인은 고기의 연화에 쓰이고 있다. 본 시험법은 시료 중 프로테아제의 효소활성을 나타내는 방법으로 시험용액 중의 효소활성이 있는 검액과 효소활성을 잃은 검액을 분광광도계를 이용하여 파장 660 nm에서 흡광도의 차이를 이용한다. filtration 가온 / 방치 분광광도 2. 안전 주의사항 수산화나트륨(Sodium hydroxide)은 호흡기도 자극, 피부 자극, 눈 자극, 중추 신경 계통 억제의 건강 위험성이 있고 물리적 위험으로는 가연성이 매우 높은 액체 또는 증기이므로 증발 연소를 야기할 수도 있고 물질의 흐름 또는 혼합에 의하여 정전기 가 발생할 수도 있다. 탄산나트륨(Sodium carbonate)은 흡입 시 유해, 점막 화상, 호흡기도 자극, 피부 자극, 눈 자극 등을 야기시킬 수 있으며 물과 접촉 시 반응할 수 있어 환기가 잘 되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 시험관 444

448 3.1.2 항온수조 부피플라스크(100 ml) 시험관(20 ml) 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 일반시약 증류수(Distilled water) 카제인(Casein) 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 인산(Phosphoric acid) 삼염화초산(Trichloroacetic acid) 탄산나트륨(Sodium carbonate) 텅스텐나트륨(Sodium tungstate) 몰리브덴산나트륨(Sodium molybdate) 4.2 시액의 조제 % 카제인용액 카제인을 건조하여 0.6 g을 달아 0.1 N 수산화나트륨액 20 ml에 가열하여 녹여서 식힌 다음 0.1 M 인산을 넣어 ph 7.0으로 조정하고, ph 7.0 완충액 20 ml를 넣어 100 ml로 한다 M 삼염화초산액 삼염화초산(순품) 65.4 g을 물에 녹여 1 L로 한다 M 탄산나트륨액 탄산나트륨(순품) 42.5 g을 물에 녹여 1 L로 한다 포린시액 텅스텐나트륨 20 g 및 몰리브덴산나트륨 5 g에 물 약 140 ml을 가하고 이 에 희석한 85%인산 10 ml 및 염산 20 ml을 가하여 환류냉각기를 달고 10시간 조용히 끓인 다음 황산리티움 30 g 및 물 10 ml을 가하고 다시 브롬 소량을 가하여 진한 녹색을 황색으로 하여 냉각기를 달지 아니하고 15분간 끓여서 과잉의 브롬을 제거하고 식힌 다음 물을 가하여 200 ml 로 하고 유리여과기(1G4)로 여과하여 밀전하여 보존한다 완충액 0.1 M 인산염완충액(pH 6.0 또는 8.0) 또는 0.1 M 초산염 완충액(pH 6.0 또는 8.0) 5. 시험과정 5.1 시험용액의 조제 시료 약 5 g을 정밀히 달아 100 ml 부피플라스크에 취한다. 445

449 5.1.2 물 또는 완충액을 표선까지 채운 다음 여과한 것을 검액으로 한다 시험관에 0.6%카제인용액 1 ml을 넣고 37 항온 수욕중에서 가온 1) 한다 검액 1 ml을 넣고 T1(시험용)시험관은 37 에서 10분간 반응시킨다 M 삼염화초산액 2 ml을 넣고 37 에서 25분간 방치한 다음 이것을 여과한다 여액 1 ml을 다른 시험관에 정확히 취한다 M탄산나트륨용액 5 ml 및 포린시액(원액을 3배 희석한 액) 1 ml을 넣고 잘 흔들어 준다 에서 20분간 방치한 다음 발색된 액을 시험용액으로 한다 공시험용 검액을 만들기 위해 시험관에 검액 1 ml을 취하고 37 에서 10분 간 방치한다 M 삼염화초산액 2 ml을 넣어 혼화하고 0.6%카제인용액 1 ml을 넣어 37 에서 25분간 방치한다 다음 [5.1.6]~[5.1.8]와 동일한 조작한 것을 공시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 분석 물을 대조액으로 하여 파장 660 nm에서 흡광도를 측정한다. 물을 대조액으 로 하여 파장 660 nm에서 흡광도를 측정한다 발색의 정도가 지나쳐 측정이 곤란한 경우에는 검액을 희석하여 시험하고 희석배수를 적용한다. 7. 참고문헌 7.1 Anshu Gupta, Ipsita Roy, S.K. Khare, M.N. Gupta : Purification and characterization of a solvent stable protease from Pseudomonas aeruginosa PseA, Journal of Chromatography A, 1069, , Wolfgang Gutleben, Nguyen Duc Tuan, Heribert Stoiber, Manfred P. Dierich,Mario Sarclettic, Andreas Zemann : Capillary electrophoretic separation of protease inhibitors used in human immunodeficiency virus therapy, Journal of Chromatography A, 922, , 시험 주의사항 1) 모든 가열 반응은 반응시키는 수욕조나 가열기를 목적하는 온도로 미리 맞추 어 두어 목적온도에서의 시간을 정확히 유지토록 한다. 446