Nextera™ DNA Flex 라이브러리 준비 레퍼런스 안내서( )

Nextera DNA Flex 라이브러리준비 레퍼런스안내서 2017 년 9 월 ILLUMINA 소유

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목차 1장개요 1 소개 1 게놈 DNA 인풋권장사항 1 추가리소스 2 2장프로토콜 3 소개 3 Nextera DNA Flex 라이브러리준비작업흐름 4 팁과기술 5 Tagment 게놈 DNA 6 사후 Tagmentation 세척 7 Tagmented DNA 증폭 8 라이브러리세척 10 라이브러리풀링 12 3 장시퀀싱 15 부록 4 지원정보 16 소개 16 Nextera DNA Flex 에세이작동방법 17 약어 18 키트내용물 18 소모품및장비 21 혈액세포용해 ( 선택사항 ) 23 타액세포용해 ( 선택사항 ) 25 기술지원 27 iii

1 장개요 소개 1 게놈 DNA 인풋권장사항 1 추가리소스 2 소개 이프로토콜은 Illmina 시퀀싱시스템에서후속시퀀싱을위해게놈 DNA 로부터최대 96 개의인덱스페어드엔드라이브러리를준비하는방법을설명합니다. Nextera DNA Flex 라이브러리준비프로토콜 : Tagmentation 이라고하는효소반응을이용하여단 15 분만에 DNA 를분절하고어댑터시퀀스를추가할수있습니다. 100ng 을초과하는인풋에서샘플정규화를혁신합니다. 샘플풀링및시퀀싱을간소화합니다. 과도한피펫작업과전반적인조작시간을줄이면서, 마스터믹스시약으로소모품의사용을최적화합니다. 1ng 의적은인풋으로도라이브러리를생성합니다. 혈액또는타액샘플에서직접라이브러리를준비합니다. 게놈 DNA 인풋권장사항 Nextera DNA Flex 라이브러리준비프로토콜은 1~500 ng 범위의 DNA 인풋과호환됩니다. 인간 DNA 샘플및기타대형복합게놈에권장되는 DNA 인풋은 100~500ng 사이입니다. 소형게놈의경우 DNA 인풋양이최저 1 ng 까지축소될수있습니다 ( 상황에맞춰 PCR 주기조건수정 ). DNA 인풋이 100~500 ng 사이인경우초기 DNA 샘플은정확하게정량화할필요가없으며, 최종수율은정규화될것으로예상됩니다. DNA 인풋이 100 ng 미만인경우초기 DNA 샘플을정량화하여필수 PCR 주기수를확인할것을권장합니다 ( 표 1 참조 ). 이경우최종라이브러리수율이정규화되지않을것으로예상되므로시퀀싱을하기전에라이브러리를정량화및정규화할것을권장합니다. 표 1 DNA 인풋권장사항 총 DNA 인풋 (ng) 권장되는인풋 DNA 정량화권장되는 PCR 주기수정규화된라이브러리수율 1~9 12 10~24 8 예 25~49 6 아니요 50~99 5 100~500 아니요 5 예 혈액 / 타액아니요 5 예 혈액 / 타액전용프로토콜은이안내서의지원정보섹션에나와있습니다. 혈액프로토콜에는 Flex 세포용해시약키트가필요합니다. 이키트는 Nextera DNA Flex 라이브러리준비키트와함께제공되지않습니다. 이키트는별도로판매됩니다. Illmina 카탈로그번호 20015884 를참조하십시오. 1

인풋 DNA 정량화 (100ng 미만 ) 인풋이 100ng 미만인경우형광기반의방법을사용하여인풋 DNA 를정량화합니다. NanoDrop 이나다른 UV 흡수방법과같이총핵산을측정하는방법은피하십시오. Qbit dsdna BR 에세이키트및 / 또는 HS 키트를사용하는경우각 DNA 샘플을 2µl 씩 198µl 의 Qbit 표준용액과함께사용합니다. DNA 품질평가 UV 흡수는 DNA 샘플의품질을평가하는데사용되는일반적인방법입니다. 280nm 의흡수량대비 260nm 의흡수량비율은샘플순도를나타냅니다. 이프로토콜은흡수량비율값이 1.8~2.0( 순수 DNA 샘플을나타냄 ) 인 DNA 에최적화되어있습니다. 260/230 비율의목표값을 2.0~2.2 로삼으십시오. 이범위를벗어난값은오염물질이있음을나타냅니다. 오염물질이있으면미완료 Tagmentation 이발생하고최종라이브러리수율에부정적인영향을미칠수있습니다. 오염원, 회피할물질, 라이브러리에미치는효과와같은오염물질의전체목록은 Nextera XT 문제해결기술정보를참조하십시오. 시재료를뉴클레아제가없는물에희석합니다. 추가리소스 오염물질로인해 Tagmentation 이미완료되면그결과로라이브러리준비실패, 불량클러스터링또는예기치않게높은비계숫자가나타날수있습니다. 호환되는 Illmina 제품에대한설명서, 소프트웨어다운로드, 교육리소스및정보를이용하려면 Illmina 웹사이트의 Nextera DNA Flex 라이브러리준비지원페이지를방문하십시오. 다음설명서는 Illmina 웹사이트에서다운로드할수있습니다. 리소스 cstom 프로토콜선택기 Nextera DNA Flex 라이브러리준비풀링안내서 ( 문서번호 1000000031471) Nextera DNA Flex 라이브러리준비검사목록 ( 문서번호 1000000033561) Nextera DNA Flex 라이브러리준비소모품및장비목록 ( 문서번호 1000000033564) 설명 시퀀싱실행에사용되는라이브러리준비방법, 실행매개변수및분석방법에맞게사용자지정된통합설명서를생성하기위한마법사입니다. Nextera DNA Flex 라이브러리준비키트를사용하기위한풀링지침과듀얼인덱싱전략을제공합니다. 프로토콜단계의검사목록을제공합니다. 검사목록은숙련된사용자용입니다. 사용자제공소모품및장비의대화식검사목록을제공합니다. 2

2 장프로토콜 소개 3 Nextera DNA Flex 라이브러리준비작업흐름 4 팁과기술 5 Tagment 게놈 DNA 6 사후 Tagmentation 세척 7 Tagmented DNA 증폭 8 라이브러리세척 10 라이브러리풀링 12 소개 이장에서는 Nextera DNA Flex 라이브러리준비프로토콜을설명합니다. 진행하기전에모범사례를검토하십시오. Illmina 웹사이트에서 Nextera DNA Flex 라이브러리준비모범사례에액세스하는방법은 2 페이지의추가리소스를참조하십시오. 진행하기전에키트내용물을확인하고필요한장비와소모품을모두갖췄는지확인합니다. 16 페이지의지원정보를참조하십시오. 지정된용량및배양매개변수를사용하여표시된순서대로프로토콜을따릅니다. 풀링준비 라이브러리를풀링할계획이라면라이브러리준비를시작하기전에먼저샘플정보를기록합니다. 자세한내용은 Nextera DNA Flex 라이브러리준비지원페이지를참조하십시오. 3

Nextera DNA Flex 라이브러리준비작업흐름 그림 1 Nextera DNA Flex 라이브러리준비작업흐름 4

팁과기술 프로토콜에안전한중지시점이지정된경우를제외하고다음단계로즉시이동하십시오. 교차오염방지 샘플또는시약마스터믹스를추가하거나옮길때각샘플마다팁을바꿔줍니다. 인덱스어댑터를추가할때각행과각열마다팁을바꿔줍니다. 작업구역에서사용하지않은인덱스어댑터튜브를제거합니다. 캡을잘못끼우지않도록한번에하나의인덱스어댑터튜브만엽니다. 플레이트밀봉 프로토콜에서열주기단계에착수하기전에는항상 96 웰플레이트를밀봉합니다. 접착실을발라플레이트를덮고고무롤러로봉인하십시오. 마이크로실 'F' 알루미늄포장지는최저 -70 C 의온도에서도효과적이며, 최종라이브러리가들어있는 96 웰플레이트를장기보관하는데권장됩니다. 마이크로실 'B' 접착실은 -40 C~110 C 에서효과적이며, 스커트형또는반스커트형 PCR 플레이트에적합합니다. 마이크로실 'B' 실은열주기또는단기보관용입니다. 마이크로실 'A' 접착필름은열주기에효과적입니다. BLT( 비드연결트랜스포좀 ) 처리 BLT 를조제한용액튜브를냉장고에똑바로세워서보관하여비드가항상완충액에잠겨있게만듭니다. BLT 를조제한용액튜브를완전히교반하여분취량으로나눌때비드가현탁액에남아있게합니다. 피펫작업전에원심분리하는것은권장하지않습니다. 비드가 96 웰플레이트의측면또는상단에들러붙은경우에는원심분리가허용됩니다. 완전히혼합될때까지피펫작업을해서비드펠릿을완전하게재부유시킵니다. 세척단계를수행할때 : 플레이트에맞는적절한자석을사용합니다. 21페이지의소모품및장비를참조하십시오. 별도의지침이없는한플레이트를자석위에놓아둡니다. 플레이트가자석에있는동안에는플레이트를흔들거나비드펠릿이섞이지않게하십시오. 비드가실수로피펫팁에흡입되는경우액체를전부웰에다시공급하고비드가안정되어서투명해질때까지기다립니다. Tagment 세척액을바로비드에공급합니다. 액체가튜브나웰의측면또는상단에들러붙은경우짧게원심분리기에돌려서액체를용액에합칩니다. TWB(Tagment 세척액 ) 처리 Tagmentation 때굉장히세심한피펫기술로 TWB 폼이최대한일어나지않게합니다. 5

Tagment 게놈 DNA 이단계에서는 BLT( 비드연결트랜스포좀 ) 를사용하여 DNA 를 Tagment 합니다. 이프로세스는어댑터시퀀스를사용하여 DNA 를분절하고태깅합니다. 소모품 BLT( 비드연관트랜스포좀 ) TB1(Tagmentation 완충액 ) 준비 뉴클레아제가없는물 96 웰 PCR 플레이트 마이크로실 'B' 접착실 1.7ml 미량원심분리기튜브 다음소모품을준비합니다 : 품목보관조건지침 BLT 2 C~8 C : 비드를 2 C 미만으로보관하면 BLT 가사용할수없는상태가됩니다. 실온에둡니다. 교반하여섞습니다. TB1-25 C~-15 C 실온에둡니다. 교반하여섞습니다. 권장되는 DNA 인풋양과샘플유형은 1 페이지의 DNA 인풋권장사항을참조하십시오. 절차 1 2µl~30µl 사이의 DNA 를 96 웰 PCR 플레이트의웰에옮겨서, 총인풋양 (ng) 이적정범위에머물게합니다. 2 DNA 샘플에뉴클레아제가없는물을추가하여총용량을 30µl 로맞춥니다. 3 BLT 를 10 초동안힘차게교반한다음, 육안으로비드가완전하게재현탁되었는지확인합니다. 필요한만큼반복합니다. 4 Tagmentation 마스터믹스를준비합니다. 각반응에다음을사용합니다. 시약 BLT 10µl TB1 10µl 반응당용량 (µl) 5 Tagmentation 마스터믹스를완전히교반하여 BLT 비드가완충액에고르게재부유되었는지확인합니다. 마스터믹스가적절하게교반되었으며믹스를 96 웰플레이트에분취량으로나누는동안에비드가믹스에서고르게재부유되었는지확인합니다. 6 새로운팁을사용하여 Tagmentation 마스터믹스 20µl 를샘플이담긴각웰에옮깁니다. 7 피펫으로반응믹스 50µl 를혼합하여재부유시킵니다. 8 플레이트를밀봉합니다. 6

9 플레이트를 55 C 에서 15 분동안배양한뒤 10 C 를유지합니다. 100 C 로가열된뚜껑이있는유전자증폭기를사용합니다. 사후 Tagmentation 세척 이단계에서는 PCR 을증폭하기전에 BLT 에서어댑터가태깅된 DNA 를씻습니다. 소모품 TSB(Tagment 방지액 ) TWB(Tagment 세척액 ) 준비 96 웰플레이트자석 마이크로실 'B' 접착실 다음소모품을준비합니다 : 절차 품목보관조건지침 TSB 15 C~30 C 침전물이있는지확인합니다. 침전물이있으면있는경우완충액을 10분동안 37 C 로가열하고용해될때까지교반합니다. 실온에서사용합니다. TWB 15 C~30 C 실온에서사용합니다. 1 TSB 10µl 를 Tagmentation 반응에추가합니다. 2 피펫으로천천히전체용량을혼합하여비드를재부유시킵니다. 3 플레이트를밀봉합니다. 4 100 C 로가열된뚜껑이있는유전자증폭기에서 37 C 로 15 분동안유전자증폭기에배양한다음, 10 C 로유지합니다. 반응용량은 60µl 입니다. 5 3 분동안또는용액이투명해질때까지플레이트를자석에올려놓습니다. 6 다중채널피펫을사용하여상층액을제거하고폐기합니다. 흡수하는동안비드가섞이는경우용액을웰에다시넣습니다. 비드가안정될때까지플레이트를자석에둡니다. 7 자석에서플레이트를제거하고 TWB 100µl 를추가합니다. 비드가완전히재부유할때까지피펫으로조심스럽게혼합합니다. 8 3 분동안또는용액이투명해질때까지플레이트를자석에올려놓습니다. 9 다중채널피펫을상층액으로제거하고폐기합니다. 10 총 2 번세척하는동안 7 단계에서 9 단계까지를한번더반복합니다. 11 자석에서플레이트를제거하고 TWB 100μl 를추가합니다. 비드가완전히재부유할때까지피펫으로조심스럽게혼합합니다. 12 TWB 가있는플레이트를자석에올려놓고 Tagmented DNA 증폭절차까지배양되도록둡니다. 3 분동안또는투명해질때까지플레이트에서배양합니다. 7

비드가과건조되는일이없도록펠릿을 TWB 안에둡니다. 13 샘플이배양되는동안프로토콜을계속진행합니다. Tagmented DNA 증폭 이단계에서는주기가제한된 PCR 프로그램을사용하여 Tagmented DNA 를증폭합니다. PCR 단계는인덱스 1(i7) 어댑터, 인덱스 2(i5) 어댑터, 클러스터형성에필요한시퀀스를추가합니다. 소모품 EPM( 향상된 PCR 믹스 ) 준비 Nextera DNA Flex 인덱스어댑터 뉴클레아제가없는물 마이크로실 'A' 필름또는 'B' 접착실 1.7ml 미량원심분리기튜브 다중채널피펫 다음소모품을준비합니다 : 품목보관조건지침 EPM -25 C~-15 C 얼음위에서해동합니다. 뒤집어용액을혼합한다음짧게원심분리를실시합니다. Nextera DNA Flex 인덱스 -25 C~-15 C 실온에서해동합니다. 인덱스튜브의경우 : 교반하여섞은다음짧게원심분리를 실시합니다. 플레이트의경우 : 사용하기전에짧게회전시킵니다. 만족할만한라이브러리수율을얻으려면예상된초기 DNA 인풋양에따라다음과같은수의 PCR 주기를사용하십시오. 절차 DNA 인풋 (ng) 1~9 12 10~24 8 25~49 6 50~100 5 >100 5 혈액 / 타액 5 PCR 주기수 1 PCR 마스터믹스를준비합니다. 시약 반응당용량 EPM 20µl 뉴클레아제가없는물 20µl 2 PCR 마스터믹스를교반한다음원심분리합니다. 8

3 자석에붙은상태에서샘플의세번째 TWB 세척을제거합니다. 다중채널피펫및 P20 팁을사용하여플레이트에남은액체를제거합니다. 웰벽면에남은폼은라이브러리에부정적인영향을미치지않습니다. 4 자석에서플레이트를제거합니다. 비드의과다건조를방지하려면즉시다음단계로진행합니다. 5 각샘플웰에 PCR 마스터믹스를 40µl 씩추가합니다. 피펫으로조심스럽게혼합하는방법으로하여비드를완전히재부유시킵니다. 6 사용하는인덱스키트구성에따라각샘플에인덱스어댑터를추가합니다. 아래표의용량을확인합니다. 낮은 Plexity 조건에대해서는 Nextera DNA Flex 라이브러리준비풀링안내서 ( 문서번호 1000000031471) 를참조하십시오. 인덱스키트유형키트구성샘플당인덱스어댑터용량 24플렉스 ( 듀얼인덱스 ) 개별튜브 5µl i5 어댑터 5µl i7 어댑터 96 플렉스 ( 듀얼인덱스 ) 96 웰플레이트프라이머믹스 10µl 튜브의경우, 캡을잘못끼우지않도록한번에하나의인덱스어댑터튜브만여십시오. 아니면각튜브를열때마다새로운캡을사용하십시오. 플레이트의경우, 인덱스플레이트의각웰은일회용입니다. 7 40µl 로설정된피펫을사용하여 10 회이상혼합하여전체반응용량을혼합합니다. 8 플레이트를밀봉해서뚜껑이 100 C로가열된유전자증폭기에넣고다음프로그램을실행합니다 ( 반응용량은 50µl). 68 C, 3분 98 C, 3분 아래조건주기를 1페이지의 DNA 인풋권장사항에나열된총주기수만큼반복합니다. 98 C, 45초 62 C, 30초 68 C, 2분 68 C, 1분 10 C 유지 9 PCR 프로그램이완료되면유전자증폭기에서플레이트를제거합니다. 10 280 x g 으로 1 분동안원심분리시켜모든액체가웰의바닥에오게합니다. 안전한중지시점 중지할경우에는마이크로실 'B' 접착실로플레이트를밀봉하고최대 3 일간 2 C ~ 8 C 에보관합니다. 9

라이브러리세척 이단계의목적은양면비드정제절차를통해증폭된라이브러리를정제하는것입니다. 소모품 SPB( 샘플정제비드 ) 80% 에탄올 ( 사용당일에새로만듦 ) RSB( 재현탁완충액 ) MIDI 플레이트 (2) 준비 96 웰 PCR 플레이트 마이크로실 'B' 접착실 마이크로실 'F' 알루미늄포장지 1.7ml 미량원심분리기튜브 96 웰플레이트자석 뉴클레아제가없는물 1 다음소모품을준비합니다 : 절차 품목보관조건지침 SPB 2 C~8 C 30 분동안실온에둡니다. 교반하고뒤집어혼합합니다. RSB -25 C~-15 C 해동하여실온에둡니다. 교반하여섞습니다. 1 5 분동안또는상층액이투명해질때까지플레이트를자석에올려놓습니다. 2 새 MIDI 플레이트에 PCR 상층액 45µl 를옮깁니다. 3 SPB 를여러번교반하고뒤집어완전히재현탁된상태로만듭니다. 4 희석된 SPB 의마스터믹스를준비합니다. 시약 SPB 45µl 뉴클레아제가없는물 40µl 반응당용량 (µl) 5 희석된 SPB 마스터믹스를완전히교반하고각 PCR 제품에믹스 85µl 를추가합니다. 6 피펫으로 10 회이상또는완전히섞일때까지혼합합니다. 경고 라이브러리를적절한크기로분포하려면완전히혼합하는것이중요합니다. 7 실온에서 5 분동안배양합니다. 8 5 분동안또는상층액이투명해질때까지 MIDI 플레이트를자석에올려놓습니다. 9 배양하는동안 SPB( 희석되지않은상태의조제한용액튜브 ) 를완전히교반한다음, 15µl 를새 MIDI 플레이트의각웰에추가합니다. 10

10 첫번째 MIDI 플레이트의상층액 125µl를 SPB 15µl가든두번째 MIDI 플레이트에옮깁니다. 11 피펫으로 10번혼합합니다. 라이브러리를적절한크기로분포하려면혼합하는것이중요합니다. 12 실온에서 5분동안배양합니다. 13 5분동안또는투명해질때까지 MIDI 플레이트를자석에올려놓습니다. 14 비드가섞이지않게상층액을제거하고폐기합니다. 15 플레이트를자석에둔상태로 80% 에탄올 200µl를추가하고 30 초동안배양합니다. 16 피펫으로에탄올을제거합니다. 17 총 2번세척하는동안 15단계와16단계를반복합니다. 18 P20 피펫을사용하여 MIDI 플레이트에남은액체를제거합니다. 19 비드를 5분동안자석위에서공기로건조합니다. 20 자석에서 MIDI 플레이트를제거하고비드에 RSB 32µl를추가합니다. 21 피펫으로완전히재부유할때까지혼합합니다. 22 작업대에서실온으로 2분동안배양합니다. 23 2분동안또는투명해질때까지 MIDI 플레이트를자석에다시올려놓습니다. 24 상층액 30µl를새 96웰플레이트에옮깁니다. 안전한중지시점중지할경우에는마이크로실 'F' 알루미늄포장지로플레이트를밀봉하고최대 30일간 -25 C ~ -15 C에보관합니다. 11

라이브러리풀링 100~500ng 사이의 DNA 인풋을사용할때이라이브러리프로토콜의정규화기능은단일실험에서생성된라이브러리를정량화 / 정규화할필요가없음을의미합니다. 그러나여러번라이브러리를준비하다보면최종수율이조금씩변할수있습니다. 그러므로최적의클러스터밀도를얻으려면라이브러리를동일한용량으로풀링하고풀을정량화한후에시퀀싱할것을권장합니다. HiSeqX 및 HiSeq 3000/4000 사용자 이러한기기에서허용되는클러스터링농도범위가넓다는것은라이브러리풀의 Qbit/PicoGreen 정량화 ( 아래섹션에설명된대로 ) 가 9.5ng/µl~12.5ng/µl 인경우 1:11 의희석액 ( 풀링된라이브러리 10µl + RSB 100µl) 을만들어풀을시퀀싱에필요한농도 ( 즉, 2~3nM) 로맞출수있음을의미합니다. DNA 인풋 100~500ng 의경우 최대 96 개의라이브러리까지샘플당 5µl 를단일 1.5ml 미량원심분리기튜브속으로풀링합니다. 교반해서혼합한다음미량원심분리기에서원심분리합니다. Qbit, PicoGreen 등의 dsdna 용형광염료방법을사용하여하나의풀링된라이브러리를정량화합니다. DNA 인풋 100ng 미만의경우 Qbit 또는 PicoGreen 을사용하여각라이브러리를개별적으로정량화합니다. 혈액또는타액에서생성된라이브러리의경우 이프로토콜에서사용된혈액과타액의양은대다수샘플의정규화를제공하기위해마련되었습니다. 하지만혈액과타액은불균일샘플유형이란것을알아야합니다. 정규화된라이브러리를생성하는 Nextera DNA Flex 의기능은용해된샘플로부터얻은총 DNA 양에따라달라집니다. 이는키트성능과는무관하게다양한요인으로부터부정적인영향을받을수있습니다. 이러한요인은다음을포함하지만이에국한되지않습니다. 타액샘플의점도 혈액샘플의오래된정도 보관조건 백혈구수에영향을미치는기저질환 적절한양의 DNA 인풋 (100ng 초과 ) 으로시작했다고가정했을때 100~500ng gdna 인풋에서관찰된것과동일한라이브러리정규화를예상하십시오. 신뢰도를향상하려면풀링하기전에 Qbit 또는 PicoGreen 을사용하여각라이브러리를개별적으로정량화할수있습니다. 라이브러리품질확인 ( 선택사항 ) 풀링된라이브러리또는개별라이브러리 1µl 를고감도 DNA 키트를사용하는 Agilent Technology 2100 Bioanalyzer 또는 HS NGS 고감도 474 키트로 Advanced Analytical Fragment Analyzer 에서실행합니다. 아래에일반적인라이브러리크기프로필과약 600bp(150~1500bp 의크기범위를사용하여분석했을때 ) 일것으로예상되는평균분절크기가나와있습니다. 12

그림 2 Fragment Analyzer 에고감도 NGS 키트를사용하여최종라이브러리실행 그림 3 Bioanalyzer 에고감도 DNA 키트를사용하여최종라이브러리실행 몰농도계산 다음공식을사용하여개별라이브러리또는풀링된라이브러리의몰농도를계산합니다. 개별또는풀링된라이브러리를 Bioanalyzer 또는 Fragment Analyzer 에서실행한경우샘플에서구한평균크기를사용합니다. 아니면계산시 600bp 를평균분절길이로사용합니다. 13

몰농도계산후 : 정량화하기전에풀링된라이브러리의경우 RSB를사용하여표 2에서자신의시퀀서에해당하는농도로풀을희석합니다. 개별적으로정량화된라이브러리의경우 RSB를사용하여표 2의농도로개별샘플을희석한다음, 희석된각샘플 10µl를단일튜브에풀링합니다. 표 2 권장장착농도 시퀀서 희석농도 템플레이트장착농도 Denatration 지침문서번호 NovaSeq 문서번호 1000000019358 참조 문서번호 1000000019358 참조 1000000019358 HiSeqX 2~3nM 200~300pM 15006165 HiSeq 3000/4000 2~3nM 200~300pM 15006165 HiSeq 2000/2500 고출력모드 2nM 12pM 15006165 HiSeq 2500 Rapid 실행모드 2nM 8.5pM 15050107 NextSeq 2nM 1.2~1.3pM 15048776 MiSeq 4nM 12pM 15039740 MiniSeq 2nM 1.2~1.3pM 1000000002697 이러한권장장착농도는일반적인지침으로만하십시오. 본인의작업흐름과정량화방법에맞춰장착농도를최적화하십시오. 14

3 장시퀀싱 Nextera DNA Flex 는최대 2 x 151 주기의리드길이를지원합니다. 표 3 Illmina 시퀀서의권장리드길이 시퀀서 리드길이 NovaSeq, HiSeq X, HiSeq 3000/4000, NextSeq, MiSeq, MiniSeq 2 x 151 HiSeq 2000/2500 고출력 2 x 126 HiSeq Rapid 실행 2 x 101 15

부록 4 지원정보지원정보 소개 16 Nextera DNA Flex 에세이작동방법 17 약어 18 키트내용물 18 소모품및장비 21 혈액세포용해 ( 선택사항 ) 23 타액세포용해 ( 선택사항 ) 25 소개 이안내서에설명된프로토콜은사용자가이부록의내용을검토하고작업흐름내용을확인했으며필요한모든소모품과장비를확보했음을가정하고작성되었습니다. 16

Nextera DNA Flex 에세이작동방법 Nextera DNA Flex 라이브러리준비키트는혁신적인비드기반트랜스포좀복합체를사용하여단일반응단계에서분절후어댑터태그시퀀스를추가함으로써게놈 DNA 를 Tagment 합니다. 인풋 DNA 로포화상태가되면비드기반트랜스포좀복합체가정해진수의 DNA 분자를분절하여, 다양한 DNA 인풋범위, 고밀도분절크기의일관적인분포, 정규화된라이브러리를사용할수있는유연성을제공합니다. Tagmentation 단계다음에는주기가제한된 PCR 단계에서 Nextera Flex 용인덱스어댑터시퀀스를 DNA 분절끝에추가함으로써모든 Illmina 시퀀싱플랫폼에서사용가능하게합니다. 그런다음후속 SPB( 샘플정제비드 ) 세척단계에서라이브러리를정화하여 Illmina 시퀀서에서라이브러리를사용가능하게만듭니다. 그림 4 Nextera DNA Flex 작업흐름 17

약어 약어 정의 BLB 혈액세포용해완충액 BLT 비드연결트랜스포좀 EPM 향상된 PCR 믹스 EtOH 에탄올 PK1 단백분해효소 K RSB 재현탁완충액 SPB 샘플정제비드 TB1 Tagmentation 완충액 1 TSB Tagment 방지액 TWB Tagment 세척액 키트내용물 Nextera DNA Flex 라이브러리준비키트구성 키트의일부컴포넌트는배송온도와다른온도로보관됩니다. 키트컴포넌트를지정온도로보관합니다. Nextera DNA Flex 라이브러리준비 - 샘플 24개상자 1/3 수량 약어 설명 보관온도 1 SPB 샘플정제비드 2 C~8 C 1 TSB Tagment 방지액 실온 1 TWB Tagment 세척액 실온 상자 2/3 수량 약어 설명 보관온도 1 RSB 재현탁완충액 -25 C~-15 C 1 TB1 Tagmentation 완충액 1-25 C~-15 C 1 EPM 향상된 PCR 믹스 -25 C~-15 C 상자 3/3 수량약어설명보관온도 1 BLT 비드연결트랜스포좀 2 C~8 C 18

Nextera DNA Flex 라이브러리준비 - 샘플 96 개 상자 1/3 수량 약어 설명 보관온도 1 SPB 샘플정제비드 2 C~8 C 4 TSB Tagment 방지액 실온 1 TWB Tagment 세척액 실온 상자 2/3 수량 약어 설명 보관온도 1 RSB 재현탁완충액 -25 C~-15 C 4 TB1 Tagmentation 완충액 1-25 C~-15 C 4 EPM 향상된 PCR 믹스 -25 C~-15 C 상자 3/3 수량약어설명보관온도 4 BLT 비드연결트랜스포좀 2 C~8 C 인덱스키트내용물 라이브러리준비절차를진행하기전에이섹션에서언급한시약이모두있는지확인해야합니다. 키트는다음구성으로제공됩니다. 소모품 카탈로그번호 Nextera DNA CD 인덱스 ( 인덱스 24 개, 샘플 24 개 ) 20018707 Nextera DNA CD 인덱스 ( 인덱스 96 개, 샘플 96 개 ) 20018708 키트의일부컴포넌트는배송온도와다른온도로보관됩니다. 키트컴포넌트를이프로토콜에서지정한온도로보관합니다. 19

24 듀얼인덱스 ( 튜브형식 ) - 샘플 24 개 수량 인덱스이름 설명 보관온도 1 H503 DNA 어댑터 -25 C~-15 C 1 H505 DNA 어댑터 -25 C~-15 C 1 H506 DNA 어댑터 -25 C~-15 C 1 H517 DNA 어댑터 -25 C~-15 C 1 H710 DNA 어댑터 -25 C~-15 C 1 H705 DNA 어댑터 -25 C~-15 C 1 H706 DNA 어댑터 -25 C~-15 C 1 H707 DNA 어댑터 -25 C~-15 C 1 H711 DNA 어댑터 -25 C~-15 C 1 H714 DNA 어댑터 -25 C~-15 C 96 듀얼인덱스 ( 플레이트형식 ) - 샘플 96 개 수량 설명 보관온도 1 96 듀얼어댑터인덱스플레이트 -25 C~-15 C 혈액세포용해키트내용물 라이브러리준비절차를진행하기전에이섹션에서언급한시약이모두있는지확인하십시오. 소모품 카탈로그번호 Nextera DNA Flex 라이브러리준비 - Flex 세포용해시약키트 20018706 Flex 세포용해시약키트 수량약어설명보관온도 4 BLB 혈액세포용해완충액실온 4 PK1 단백분해효소 K -25 C~-15 C 이키트에는 SPB( 샘플정제비드 ) 가없습니다. 하지만혈액세포용해작업흐름을실행하는데충분한양의 SPB 가 24 플렉스및 96 플렉스라이브러리키트에들어있습니다. 20

소모품및장비 작업에필요한사용자공급소모품과장비가있고사용가능한상태인지확인한후에프로토콜을시작하십시오. 프로토콜이나열된항목을사용하여최적화되고검증되었습니다. 대체소모품및장비를사용하는경우에는유사한성능이보장되지않습니다. 소모품 소모품 공급업체 10µl 피펫팁일반실험용품공급업체 10µl 다중채널피펫일반실험용품공급업체 10µl 단일채널피펫일반실험용품공급업체 20µl 피펫팁일반실험용품공급업체 20µl 다중채널피펫일반실험용품공급업체 20µl 단일채널피펫일반실험용품공급업체 200µl 피펫팁일반실험용품공급업체 200µl 피펫팁일반실험용품공급업체 200µl 단일채널피펫일반실험용품공급업체 1000µl 피펫팁일반실험용품공급업체 1000µl 단일채널피펫일반실험용품공급업체 96 웰보관플레이트, 원형웰, 0.8ml(MIDI 플레이트 ) xs Fisher Scientific, 카탈로그번호 AB-0859 하드셸 96 웰 PCR 플레이트 마이크로실 'A' 필름 마이크로실 'B' 접착실 마이크로실 'F' 알루미늄포장지 Bio-Rad, 카탈로그번호 HSP-9601 Bio-Rad, 카탈로그번호 MSA-5001 Bio-Rad, 카탈로그번호 MSB-1001 Bio-Rad, 카탈로그번호 MSF-1001 RNase/DNase 없는다중채널시약저장소, 일회용 VWR, 카탈로그번호 89094-658 분자생물실험 (500ml) 용에탄올 200 프루프 ( 절대 ) 뉴클레아제가없는물 Sigma-Aldrich, 제품번호 E7023 일반실험용품공급업체 [ 선택사항 ] Agilent 고감도 DNA 키트 Agilent, 카탈로그번호 5067-4626 Qbit dsdna HS 에세이키트 Qant-iT PicoGreen dsdna 에세이키트 Thermo Fisher Scientific, 카탈로그번호 Q32851 또는 Q32854 Thermo Fisher Scientific, 카탈로그번호 P11496 [ 선택사항 ] 고감도 NGS 분절분석키트 Advanced Analytical, 카탈로그번호 DNF-474 Flex 세포용해시약키트 Illmina, 카탈로그번호 20015884 EDTA 혈액채취튜브 타액용 Oragene DNA 채취키트 Becton Dickinson DNA Genotek, 카탈로그번호 OGR-500 또는 OGD-510 21

장비 장비 공급업체 자석스탠드 -96 마이크로판원심분리기 미량원심분리기 Vortexer Thermo Fisher Scientific, 카탈로그번호 AM10027 일반실험용품공급업체 일반실험용품공급업체 일반실험용품공급업체 [ 선택사항 ] 2100 Bioanalyzer 시스템 Agilent, 카탈로그번호 G2940CA Qbit 형광계 3.0 [ 선택사항 ] Fragment Analyzer 분석 Advanced Analytical 유전자증폭기 Thermo Fisher Scientific, 카탈로그번호 Q33216, Q33217 또는 Q33218 나열되어있는선택된유전자증폭기모델에권장설정을사용합니다. 나열되지않은유전자증폭기를모두검증한후에라이브러리준비를수행합니다. 주의 열순환장치는심각한화상을유발할정도로열을발생시킵니다. 유전자증폭기온도모드뚜껑온도혈관유형 Bio-Rad C-1000 Toch 유전자증폭기계산됨가열됨플레이트 Bio-Rad DNA Engine Tetrad 2 계산됨 가열됨 폴리프로필렌플레 이트및튜브 MJ Research DNA Engine Tetrad 계산됨가열됨플레이트 Eppendorf Mastercycler Pro S 그라데이션 S, 시뮬레이션된튜브 가열됨 플레이트 22

혈액세포용해 ( 선택사항 ) 이프로토콜은 EDTA 채취용튜브로채취한신선한전혈을사용하여검증되었습니다. 채취후에는혈액을 4 C 로보관하고 3 일이내에처리하십시오. 소모품 냉동된혈액의사용은검증된, 따라서권장수없습니다. 되지않았으므로권장하지않습니다. 주의 혈액은전염병의잠재적오염원입니다. 혈액샘플을안전하게처리할수있도록현장별절차를따르십시오. 세포용해프로토콜때전체혈액샘플의세포가완전하게용해되었는지, 즉가열배양단계이후에색상이갈색으로변했는지확인한후에다음단계를진행해야합니다. EDTA 채취용튜브에채취한혈액샘플 SPB ( 샘플정제비드 ) BLB ( 혈액세포용해완충액 ) PK1( 단백분해효소 K) 뉴클레아제가없는물 80% 에탄올 ( 사용당일에새로만듦 ) 준비 96 웰 PCR 플레이트 96 웰플레이트자석 1 다음소모품을준비합니다 : 품목보관조건지침 BLB 15 C~30 C* 최적으로사용하려면 BLB가실온이어야합니다. 침전물이있는지확인합니다. 있 는경우 10분동안 37 C로가열하고재부유할때까지교반합니다. SPB 2 C~8 C** 실온상태가되도록 30분동안둡니다. 프로토콜의나중작업에사용할수있도록 실온에둡니다. PK1-25 C~-15 C 필요한만큼얼음위에둡니다. *BLB 는냉동상태로배송되지만실온에보관해야합니다. **SPB 는 Nextera DNA Flex 라이브러리준비키트에포함되어있습니다. 절차 1 각준비에대해다음과같은용량을포함하는세포용해마스터믹스를만듭니다. 시약 BLB 7µl PK1 2µl 뉴클레아제가없는물 31µl 반응당용량 (µl) 2 튜브를뒤집어 EDTA 혈액튜브가완전히섞였는지확인합니다. 3 혈액 10µl 를 96 웰 PCR 플레이트의웰에옮깁니다. 23

4 세포용해마스터믹스를교반한다음원심분리합니다. 5 마스터믹스 40µl 를각샘플에추가합니다. 6 SPB 를여러번교반하고뒤집어완전히재현탁된상태로만듭니다. 7 SPB 20µl 를샘플웰에추가합니다. 8 50µl 로지정된피펫으로조심스럽게 10 번섞어비드가샘플과완전히섞이게만들어야합니다. 9 플레이트를밀봉하고 100 C 로가열된뚜껑이있는유전자증폭기에서 56 C 로 10 분동안배양합니다. 10 플레이트를자석위에 5 분동안놓아둡니다. 현재이시점에서비드는보이지않습니다. 세포용해반응으로인해혈액색상이짙은갈색으로보이기때문입니다. 비드가모두자석으로이동하도록샘플을자석위에 5 분동안두어야합니다. 11 비드가섞이지않게조심스럽게상층액을피펫으로뽑아냅니다. 상층액을폐기하기전에샘플내에비드펠릿이있는지확인합니다. 잘못해서비드가흡입된경우샘플을다시웰에공급하고안정될때까지기다렸다가상층액을다시제거합니다. 12 80% 에탄올 (EtOH) 150µl 를추가하고자석위에서 30 초간배양합니다. 13 EtOH 를모두제거하고폐기합니다. 14 P20 피펫을사용하여잔여 EtOH 를모두제거합니다. 15 자석에서플레이트를제거합니다. 16 물 30µl 에비드를재부유하고재현탁될때까지피펫으로혼합합니다. 17 Tagmentation 마스터믹스를비드와물 30µl 가담긴샘플웰에바로추가합니다. 안전한중지시점 중지할경우에는마이크로실 'B' 접착실로플레이트를밀봉하고최대 3 일간 2 C ~ 8 C 에보관합니다. 24

타액세포용해 ( 선택사항 ) 이프로토콜은 Oragene DNA 타액채취튜브로채취한타액에대해서만검증되었습니다. 채취후에는타액을채취튜브에들어있는 Oragene DX 용액과혼합하여실온에서안정된상태로만듭니다. 타액세포를용해하기전에먼저샘플을담은 Oragene 튜브를 50 C 의물또는공기인큐베이터 (DNA Genotek 에서권장한대로 ) 에서최소 1 시간동안배양해서세포를용해해야합니다. 이배양단계는샘플채취후언제든지실시할수있습니다. 가열처리가끝나면샘플을실온에보관할수있습니다. 이프로토콜은타액세포용해단계가끝날때 100ng 이넘는 DNA 산출량을생성할것으로예상됩니다. 소모품 주의 타액은전염병의잠재적오염원입니다. 타액샘플을안전하게처리할수있도록현장별절차를따르십시오. 타액샘플 (Oragene DNA 채취튜브로채취후가열처리함 ) SPB( 샘플정제비드 ) 뉴클레아제가없는물 80% 에탄올 ( 사용당일에새로만듦 ) 준비 96 웰 PCR 플레이트 96 웰플레이트자석 1 다음소모품을준비합니다. 품목보관조건지침 SPB 2 C~8 C* 실온상태가되도록 30 분동안둡니다. 프로토콜의나중작업에사용할수있도록실온에둡니다. *SPB 는 Nextera DNA Flex 라이브러리준비키트에포함되어있습니다. 절차 1 물 20µl 를 96 웰 PCR 플레이트 ( 샘플당 1 웰 ) 에옮깁니다. 2 가열처리된 Oragene DNA 채취튜브를교반하여샘플이완전히혼합되었는지확인합니다. 3 샘플 30µl 를물이든 96 웰플레이트에옮기고피펫으로천천히혼합합니다. 일부타액샘플은점성이있을수있으므로대구경피펫팁을사용하면보다정확한피펫작업을수행할수있습니다. 4 SPB 를여러번교반하고뒤집어완전히재현탁된상태로만듭니다. 5 SPB 20µl 를샘플웰에추가합니다. 6 50µl 로지정된피펫으로조심스럽게 10 번섞어비드가샘플과완전히섞이게만듭니다. 7 5 분동안플레이트를실온에둡니다. 8 플레이트를자석위에 5 분동안놓아둡니다. 25

9 비드가섞이지않게조심스럽게상층액을피펫으로뽑아냅니다. 상층액을폐기하기전에샘플내에비드펠릿이있는지확인합니다. 잘못해서비드가흡입된경우샘플을다시웰에공급하고안정될때까지기다렸다가상층액을제거합니다. 10 80% 에탄올 (EtOH) 150µl 를 SPB 플레이트에추가하고자석위에 30 초간둡니다. 11 EtOH 를모두제거하고폐기합니다. 12 P20 피펫을사용하여잔여 EtOH 를모두제거합니다. 13 자석에서플레이트를제거합니다. 14 물 30µl 에비드를재부유하고완전히재현탁될때까지피펫으로혼합합니다. 15 Tagment 게놈 DNA 절차 3 단계를바로진행하여 Tagmentation 마스터믹스를비드와물 30µl 가담긴샘플웰에바로추가합니다. 안전한중지시점 중지할경우에는마이크로실 'B' 접착실로플레이트를밀봉하고최대 3 일간 2 C ~ 8 C 에보관합니다. 26

기술지원 기술지원을받으려면 Illmina 기술지원부서에문의하십시오. 웹사이트 : 이메일 : www.illmina.com techspport@illmina.com Illmina 고객지원센터전화번호 지역 무료통화 지역 북미 +1.800.809.4566 네덜란드 +31 8000222493 +31 207132960 노르웨이 +47 800 16836 +47 21939693 뉴질랜드 0800.451.650 대만 00806651752 덴마크 +45 80820183 +45 89871156 독일 +49 8001014940 +49 8938035677 벨기에 +32 80077160 +32 34002973 스웨덴 +46 850619671 +46 200883979 스위스 +41 565800000 +41 800200442 스페인 +34 911899417 +34 800300143 싱가포르 +1.800.579.2745 아일랜드 +353 1800936608 +353 016950506 영국 +44 8000126019 +44 2073057197 오스트리아 +43 800006249 +43 19286540 이탈리아 +39 800985513 +39 236003759 일본 0800.111.5011 중국 400.635.9898 프랑스 +33 805102193 +33 170770446 핀란드 +358 800918363 +358 974790110 호주 +1.800.775.688 홍콩 800960230 기타국가 +44.1799.534000 SDS( 안전보건자료 ) - Illmina 웹사이트 (spport.illmina.com/sds.html) 에서확인할수있습니다. 제품설명서 - Illmina 웹사이트에서 PDF 로다운로드할수있습니다. spport.illmina.com 에서제품을선택한다음, Docmentation & Literatre( 설명서및문헌 ) 를선택하십시오. 27