(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 10-2013-0087802 (43) 공개일자 2013년08월07일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) G01N 33/18 (2006.01) C12Q 1/02 (2006.01) (21) 출원번호 10-2012-0008969 (22) 출원일자 2012 년 01 월 30 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 10 항 2012 년 01 월 30 일 (71) 출원인 주식회사그린파이오니아 인천광역시연수구갯벌로 169, 201 호 ( 송도동, 인천대학교미래관 ) (72) 발명자 한태준 인천광역시연수구송도동 9-31 웰카운티 APT 10 2 동 1001 호 박아름 인천광역시서구가좌 2 동 30-2 진주아파트 1 동 615 호 윤정현 인천광역시서구가좌 2 동 30-2 진주아파트 1 동 615 호 (74) 대리인 임상엽, 고영갑 (54) 발명의명칭개구리밥과식물의뿌리생장을이용한수질독성평가방법 (57) 요약 본발명은 (a) 측정용용기에수체샘플을넣는단계 ; (b) 수체샘플을함유하는측정용용기에뿌리가절단된개구리밥과식물을투입하는단계 ; (c) 측정용용기에투입된개구리밥과식물을배양하는단계 ; 및 (d) 배양이완료된개구리밥과식물의뿌리생장길이또는뿌리길이생장률을측정하는단계 ; 를포함하는수질독성평가방법을제공한다. 본발명에따른수질독성평가방법은뿌리가절단된개구리밥과식물의뿌리생장특성을수질독성평가의지표로이용하기때문에수질독성판별시간이약 2 일정도소요되고, 종래의수질독성평가시간 ( 약 7 일 ) 보다 3 배이상단축된다. 또한, 본발명에따른수질독성평가방법은잎의수 (frond number), 잎의면적 (frond area), 습중량 (fresh weight), 건중량 (dry weight), 군체수 (population growth rate), 또는색소함량 (pigment contents) 의변화량을수질독성평가의지표로이용하는종래의수질독성평가방법에비해측정절차가보다간편하고, 아울러수질독성원에대한높은민감성을가진다. 대표도 - 도 3-1 -
특허청구의범위청구항 1 (a) 측정용용기에수체샘플을넣는단계 ; (b) 수체샘플을함유하는측정용용기에뿌리가절단된개구리밥과식물을투입하는단계 ; (c) 측정용용기에투입된개구리밥과식물을배양하는단계 ; 및 (d) 배양이완료된개구리밥과식물의뿌리생장길이또는뿌리길이생장률을측정하는단계 ; 를포함하는수질독성평가방법. 청구항 2 제 1항에있어서, 상기 (a) 단계의수체샘플은원수및희석배수가서로다른적어도 2개이상의희석원수로구성되고상기희석원수는원수를스테인버그 (Steinberg) 인공배지로희석하여제조된것을특징으로하는수질독성평가방법. 청구항 3 제 2 항에있어서, 상기희석원수는반수희석법에의해희석되는것을특징으로하는수질독성평가방법. 청구항 4 제 2 항에있어서, 상기수체샘플은원수의대조군으로개구리밥과식물의뿌리생장을저해하는독성물질을 포함하지않는배양액을더포함하는것을특징으로하는수질독성평가방법. 청구항 5 제 4항에있어서, 상기독성물질은은 (Ag; Silver), 알루미늄 (Al; Aluminum), 비소 (As; Arsenic), 카드뮴 (Cd; Cadmium), 코발트 (Co; Cobalt), 크롬 (Cr; Chromium), 구리 (Cu; Copper), 철 (Fe; Iron), 수은 (Hg; Mercury), 니켈 (Ni; Nickel), 납 (Pb; Lead), 및아연 (Zn; Zinc) 으로이루어진군으로부터선택되는하나이상의금속류인것을특징으로하는수질독성평가방법. 청구항 6 제 4 항에있어서, 상기대조군은스테인버그 (Steinberg) 인공배지인것을특징으로하는수질독성평가방법. 청구항 7 제 1 항에있어서, 상기 (a) 단계의수체샘플은 ph 가 4~10 으로조정되는것을특징으로하는수질독성평가방 법. 청구항 8-2 -
제 1 항에있어서, 상기 (a) 단계의수체샘플은염분농도가 4 이하로조정되는것을특징으로하는수질독 성평가방법. 청구항 9 제 1 항에있어서, 상기 (c) 단계의배양시광조사량은 50~200 μ mol photon/ m2 s 인것을특징으로하는수질 독성평가방법. 청구항 10 제 1 항에있어서, 상기 (c) 단계의배양시배양온도는 20~35 인것을특징으로하는수질독성평가방법. 명세서 [0001] 기술분야 본발명은수질독성평가방법에관한것으로서, 보다상세하게는개구리밥과식물의뿌리생장을이용한수질 독성평가방법에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] 배경기술인류의활동과산업의발달로새롭고잠재적인위해성을지닌화학물질이생산되고수서생태계로유입되고있다. 현대화학의발전은알려진유용한화학물의생산량을높이는데기여했을뿐만아니라매일 1200 여종가량의새로운물질도만들어내고있다. 물질의이동과변환이급속하게일어나는수서생태계의특성상, 이러한독성물질에대한위해성을평가하고법적인대처를취하는노력이이루어지지않는다면매년수천종의화학물질을함유한산업폐수와도시하수에의해서위기에처하게될위험성에노출되어있다. 하천및호소를오염시키는오염물질에는산업체에서유래하는중금속과 VOCs, 농업용제초제, 살충제그리고인구밀집도시에서방출되는방대한생활폐수에함유된질소와인화합물등이있는데이러한오염물질들에의한위해성을평가하기위해서전통적으로이화학적방법이사용되고있다. 이화학적방식이란수체내의용존산소량 (DO), 생물화학적산소요구량 (BOD), 화학적산소요구량 (COD), 탁도, 전기전도도및 ph등과부영양화를유발시키는질산염과인산염을정량적으로측정하거나중금속을분석하여수질오염정도의기준으로삼는방식을지칭한다. 그러나, 이러한방법은장시간, 고비용, 전문기술등을필요로한다는단점과함께생물학적이용성, 복합효과 ( 상승또는길항작용등 ) 와나아가생태학적의미에대한정보를제공해줄수없다. 이같은제약점을극복하기위해국제적으로수중미생물, 조류 (algae), 수중무척추동물및수생관속식물등지표생물을이용한오염진단방식에대한관심이고조되어최근국제사회에서제정한환경규약을보면환경독성을평가하는데있어서지표생물에의한독성평가자료를차용하고있음을알수있다. 이러한지표생물을이용한오염진단방식은종래에생물체내의오염물질의농도를직접측정하거나서식처의오염등급별서식종의존재여부로판정하는 Bioindicator식개념에서현재는생물개체또는그하위의생물학적조직단위의특성을이용하여오염물질을진단하는 Biomonitor식방법으로진화하고있다. 후자의방법은생물의다양한생리학적변화를통해환경에존재하는단독혹은혼합물질의위해성을정량화하거나그물질의잠재적인영향력을평가할수있으므로환경오염이광역화되기이전에그징후를사전에파악할수있고생태학적의미를찾을수있다는장점을내포하고있다. 과거국제적으로독성연구에사용되었던생물종은대부분의경우수서척추동물또는무척추동물이었지만최근들어수서생태계내의수생식물의역할이부각되어수생식물을이용한독성평가방법에대해관심이증가하고있다. 수생식물은수중생태계의 1차생산자로서동식물플랑크톤, 무척추동물및어류의서식처가되며, 많은유기물질을흡수정화하는능력을갖고있다. 특히수생식물중개구리밥은수서독성과광독성테스트모델로권장되고있다. 개구리밥과 (Lemnoideae) 에속하는식물은가장작은단자엽의일년생수생식물로논물, 호수, 연못등의정수나유속이느린물에살며물표면에떠서살기도하고, 물에잠겨서사는것도있다. 개구리밥과식물은개구리밥속 (Spirodela), 좀개구리밥속 (Lemna), 좀분개구리밥속 (Wolffia), Landoltia 및 Wolffiella 등과같은 5개의속으로나뉘고, 세계적으로 - 3 -
약 30 종이분포하고있는것으로알려져있다. [0007] 현재까지국제표준화기구 (ISO), 미국환경보호청 (EPA), 및경제협력개발기구 (OECD) 에등록된종래의개구리밥을이용한수질독성평가방법을살펴보면개구리밥을수체샘플에배양한후잎의수 (frond number), 잎의면적 (frond area), 군체수 (population growth rate), 습중량 (fresh weight), 건중량 (dry weight), 또는색소함량 (pigment contents) 의변화량을측정하는것으로구성된다. 그러나, 종래의개구리밥을이용한수질독성평가방법은유효한변화량을확보하기위하여배양시간이약 7일정도소요되고독성원에대한민감성이떨어지는등의문제가있으며, 이를개선시켜야할필요가있다. 발명의내용 [0008] 해결하려는과제본발명은종래의문제점을해결하기위하여도출된것으로서, 본발명은뿌리가절단된개구리밥과식물의뿌리생장특성, 예를들어뿌리생장길이또는이로부터파생된뿌리길이생장률을수질독성평가의지표로이용하여보다간편하고평가시소요되는시간이현저히단축되며동시에민감성이높은수질독성평가방법을제공하는데에그목적이있다. [0009] [0010] [0011] [0012] [0013] [0014] [0015] 과제의해결수단본발명의발명자들은개구리밥과식물의뿌리를절단하고이를배양한후뿌리생장길이또는뿌리길이생장률을통해수질독성을평가하는경우 ( 일명 "Root Cut method") 수질독성평가시간을획기적으로단축할수있고수질독성원에대해높은민감도를가진다는것을발견하고본발명을완성하였다. 본발명의상기목적을해결하기위하여, 본발명은 (a) 측정용용기에수체샘플을넣는단계 ; (b) 수체샘플을함유하는측정용용기에뿌리가절단된개구리밥과식물을투입하는단계 ; (c) 측정용용기에투입된개구리밥과식물을배양하는단계 ; 및 (d) 배양이완료된개구리밥과식물의뿌리생장길이또는뿌리길이생장률을측정하는단계 ; 를포함하는수질독성평가방법을제공한다. 이때, 상기 (a) 단계의수체샘플은바람직하게는원수및희석배수가서로다른적어도 2개이상의희석원수로구성되고상기희석원수는원수를스테인버그 (Steinberg) 인공배지로희석하여제조된다. 또한, 상기수체샘플은더바람직하게는원수의대조군으로개구리밥과식물의뿌리생장을저해하는독성물질을포함하지않는배양액을더포함한다. 또한, 상기 (a) 단계의수체샘플은바람직하게는 ph가 4~10으로조정된다. 또한, 상기 (a) 단계의수체샘플은바람직하게는염분농도가 4 이하로조정된다. 또한, 상기 (c) 단계의배양시광조사량은바람직하게는 50~200 μmol photon/ m2 s 이다. 또한, 상기 (c) 단계의배양시배양온도는바람직하게는 20~35 이다. [0016] 발명의효과본발명에따른수질독성평가방법은뿌리가절단된개구리밥과식물의뿌리생장특성을수질독성평가의지표로이용하기때문에수질독성판별시간이약 2일정도소요되고, 종래의수질독성평가시간 ( 약 7일 ) 보다 3배이상단축된다. 또한, 본발명에따른수질독성평가방법은잎의수 (frond number), 잎의면적 (frond area), 습중량 (fresh weight), 건중량 (dry weight), 군체수 (population growth rate), 또는색소함량 (pigment contents) 의변화량을수질독성평가의지표로이용하는종래의수질독성평가방법에비해측정절차가보다간편하고, 아울러수질독성원에대한높은민감성을가진다. [0017] 도면의간단한설명 도 1 은개구리밥과식물의뿌리를절단하기전과절단한후의모양을나타낸사진이다. 도 2 는뿌리가절단된개구리밥과식물을배양액에넣고 48 시간배양하였을때배양액의독성물질유무및독 성물질함량의고저에따른개구리밥과식물의뿌리생장상태를나타낸사진이다. 도 3 은본발명의수질독성평가방법의바람직한일예를단계별로나타낸사진이다. - 4 -
도 4는광조사량및배양온도조건별개구리밥과좀개구리밥속식물의뿌리생장길이를나타낸것이고 ( 도 4 에서배양액의 ph는 7이고염분농도는 0 이다 ), 도 5는배양액의 ph 조건별개구리밥과좀개구리밥속식물의뿌리생장길이를나타낸것이고 ( 도 5에서배양온도는 30 이고, 배양액의염분농도는 0 이며, 광조사량은 Lemna minor 및 Lemna gibba의경우 150μmol photon/ m2 s 이고, Lemna paucicostata의경우 50μmol photon/ m2 s 이다 ), 도 6은배양액의염분농도별개구리밥과좀개구리밥속식물의뿌리생장길이를나타낸것이다 ( 도 6에서배양온도는 30 이고, 배양액의 ph는 7이며, 광조사량은 Lemna minor 및 Lemna gibba의경우 150μmol photon/ m2 s 이고, Lemna paucicostata의경우 50μmol photon/ m2 s 이다 ). 도 7은단일독성물질로서은 (Ag) 을포함하는독성물질용액의은 (Ag) 농도에따른개구리밥과좀개구리밥속식물의뿌리생장길이를나타낸그래프이고, 도 8은단일독성물질로서카드뮴 (Cd) 을포함하는독성물질용액의카드뮴 (Cd) 농도에따른개구리밥과좀개구리밥속식물의뿌리생장길이를나타낸그래프이고, 도 9는단일독성물질로서 6가크롬 (Cr 6+ ) 을포함하는독성물질용액의 6가크롬 (Cr 6+ ) 농도에따른개구리밥과좀개구리밥속식물의뿌리생장길이를나타낸그래프이고, 도 10은단일독성물질로서구리 (Cu) 를포함하는독성물질용액의구리 (Cu) 농도에따른개구리밥과좀개구리밥속식물의뿌리생장길이를나타낸그래프이고, 도 11 은단일독성물질로서수은 (Hg) 을포함하는독성물질용액의수은 (Hg) 농도에따른개구리밥과좀개구리밥속식물의뿌리생장길이를나타낸그래프이다. [0018] 발명을실시하기위한구체적인내용본발명은수체샘플에대해간편하고, 판별시간이짧으며독성물질에의해발휘되는독성을정확하게평가할수있는수질독성평가방법에관한것으로서, 본발명에따른수질독성평가방법은측정용용기에수체샘플을넣는단계 ; 수체샘플을함유하는측정용용기에뿌리가절단된개구리밥과식물을투입하는단계 ; 측정용용기에투입된개구리밥과식물을배양하는단계 ; 및배양이완료된개구리밥과식물의뿌리생장길이또는뿌리길이생장률을측정하는단계 ; 를포함한다. 이하, 이하, 본발명에따른수질독성평가방법을구성요소별로나누어설명한다. [0019] [0020] [0021] [0022] [0023] 수체샘플수체 (water body) 샘플은물이주요부피를차지하는샘플을말하는것으로서, 본발명에따른수체샘플은해수, 하천, 호수, 폐수, 방류수, 오수, 슬러지용출수, 토양용출수, 퇴적토용출수등에서채취한샘플을포함한다. 최초의수체샘플 ( 이하, 원수 ) 은원수이외에원수를인공배지나물과같이독성물질을포함하지않는액체로희석하여적어도 2가지이상, 바람직하게는 4가지이상의농도로구배화시킨희석원수들로구성되는것이바람직하다. 이때, 사용되는희석방법은크게제한되지않으며, 일예로반수희석법 [100%( 원수자체 ), 50%( 원수의 1/2 농도로희석한것 ), 25%( 원수의 1/4 농도로희석한것 ), 12.5%( 원수의 1/8 농도로희석한것 ), 6.25%( 원수의 1/16 농도로희석한것 )] 이있다. 원수를희석하기위한액체는개구리밥과식물의뿌리생장을저해하는독성물질을포함하지않고개구리밥과식물의배양과양립할수있는것이라면그종류가크게제한되지않으며, 구체적으로물, 스테인버그 (Steinberg) 인공배지등이있으며, 이중개구리밥과식물의원활한배양을고려할때스테인버그 (Steinberg) 인공배지인것이바람직하다. 또한, 수체샘플은바람직하게는원수의대조군으로개구리밥과식물의뿌리생장을저해하는독성물질을포함하지않는배양액을더포함하는데, 대조군으로는공지의다양한인공배지가있으며, 이중개구리밥과식물의원활한배양을고려할때스테인버그 (Steinberg) 인공배지인것이바람직하다. 이때, 개구리밥과식물의뿌리생장을저해하는독성물질은예를들어은 (Ag; Silver), 알루미늄 (Al; Aluminum), 비소 (As; Arsenic), 카드뮴 (Cd; Cadmium), 코발트 (Co; Cobalt), 크롬 (Cr; Chromium), 구리 (Cu; Copper), 철 (Fe; Iron), 수은 (Hg; Mercury), 니켈 (Ni; Nickel), 납 (Pb; Lead), 및아연 (Zn; Zinc) 으로이루어진군으로부터선택되는하나이상의금속류로구성될수있다. 한편, 대조군, 원수및희석원수들로구성된수체샘플은측정용용기에넣어지기전에개구리밥과식물의원활한배양을위해 ph 및염분농도가조정되는것이바람직하다. 구체적으로수체샘플의 ph는 4~10으로조정되는것이바람직하고, 5~10로조정되는것이더바람직하며, 6~9로조정되는것이더바람직하다. 또한, 수체샘플의염분농도는 4 이하로조정되는것이바람직하고, 2 이하로조정되는것이더바람직하며, 1 이하로 - 5 -
조정되는것이더바람직하다. 다만, 수체샘플의최적 ph 및염분농도는사용되는개구리밥과식물의종류에 따라변경될수있다. [0024] 본발명에있어서, 염분농도및 ph가조정된수체샘플 ( 예를들어대조군, 원수, 4개이상의희석원수들 ) 을배양액으로하여뿌리가절단된개구리밥과식물을배양하는경우원수의희석농도에따른개구리밥과식물의뿌리생장길이또는뿌리길이생장률을구할수있고, 이를기초로수체샘플의수질독성을평가하는경우정확한반수유효농도 ( 독성물질을포함하지않는대조군에서의개구리밥과식물의뿌리생장길이또는뿌리길이생장률보다 50% 감소된뿌리생장길이또는뿌리길이생장률을보이는독성물질의농도로서단일독성물질의경우특정농도로표시되고미지의원수의경우희석률로표시됨 ; Half maximal effective concentration, EC 50 ) 내지무영향농도 ( 독성물질을포함하지않는대조군에서의개구리밥과식물의뿌리생장 길이또는뿌리길이생장률과유의적차이가없는수준으로유지시키는독성물질의농도로서단일독성물질 의경우특정농도로표시되고미지의원수의경우희석률로표시됨 ; No Observed Effect Concentration, NOEC) 를평가할수있다. [0025] [0026] 측정용용기측정용용기는수체샘플및뿌리가절단된개구리밥과식물을수용하고, 이후배양기에넣어져개구리밥과식물을배양하기것으로서, 그형태는크게제한되지않으며, 일예로웰플레이트 (Well plate) 가있다. 본발명에서웰플레이트는적어도 6개이상의웰 (Well) 을포함하는것이바람직한데, 1개의웰에는대조군으로서독성물질을포함하지않는인공배지를넣어개구리밥과식물을배양하고, 나머지 5개의웰에는원수와 4개의희석원수들을넣어개구리밥과식물을배양한다. 또한, 본발명에서웰플레이트는다양한원수들의수질독성을한번에평가할수있는측면을고려할때더바람직하게는 12개이상의웰, 가장바람직하게는 24개이상의웰을포함하는것이바람직하다. [0027] [0028] 개구리밥과식물개구리밥과식물은천남성과의하위아과식물로서, 세계에널리분포하며, 6속의약 30종가량이알려져있는데, 한국에는개구리밥 (Spirodela polyrhiza) 과좀개구리밥 (Lemna paucicostata) 2종이자란다. 또한, 좀개구리밥속에속하는종으로는 Lemna gibba, Lemna minor, Lemna minuta, Lemna trisulca, Lemna valdiviana 등이있다. 본발명에서는수질독성의평가를위한바이오마커로서수생식물에속하는개구리밥과식물, 바람직하게는좀개구리밥속에속하는 Lemna gibba, Lemna minor, Lemna paucicostata를이용한다. 또한, 본발명에서는개구리밥과식물을측정용용기에투입하여배양하기전에뿌리를절단하는단계를포함한다. 이때개구리밥과식물의뿌리는뿌리생장점을해치지않는범위내에서일정길이로절단된다. 도 1은개구리밥과식물의뿌리를절단하기전과절단한후의모양을나타낸사진이다. 또한, 본발명에서사용되는개구리밥과식물은전처리배양 (Preculture) 을통해본배양에최적화된것이바람직하다. [0029] [0030] 개구리밥과식물의배양뿌리가절단된개구리밥과식물및수체샘플을함유하는측정용용기는배양기에옮겨지고, 이후소정시간동안개구리밥과식물이배양된다. 이때, 배양시간은크게제한되지않으나수질독성평가의신뢰성을확보하는측면에서적어도 30시간이상인것이바람직하고, 40시간이상인것이더바람직하며, 48시간이상인것이가장바람직하다. 또한, 수생식물에속하는개구리밥과식물의뿌리생장을위한배양시광조사량은 50~200 μmol photon/ m2 s 인것이바람직하고, 50~150 μmol photon/ m2 s 인것이더바람직하며, 100~150 μmol photon/ m2 s 인것이가장바람직하다. 또한, 수생식물에속하는개구리밥과식물의뿌리생장을위한배양시배양온도는 20~35 인것이바람직하고, 25~35 인것이더바람직하며, 25~30 인것이가장바람직하다. 다만, 개구리밥과식물의뿌리생장을위한배양조건인배양시간, 광조사량, 및배양온도는개구리밥과식물의종류에따라변경될수있다. [0031] 개구리밥과식물이뿌리생장길이또는뿌리길이생장률의측정 - 6 -
[0032] [0033] 뿌리가절단된개구리밥과식물을수체샘플이담겨진측정용용기에넣고특정배양조건에서약 48시간동안배양하면개구리밥과식물의뿌리는수체샘플내독성물질의함량에따라생장길이가달라진다. 도 2는뿌리가절단된개구리밥과식물을배양액에넣고 48시간배양하였을때배양액의독성물질유무및독성물질함량의고저에따른개구리밥과식물의뿌리생장상태를나타낸사진이다. 도 2에서보이는바와같이수체샘플에독성물질이포함되지않은경우배양된개구리밥과식물의뿌리생장길이가가장크고, 수체샘플에독성물질함량이증가할수록배양된개구리밥과식물의뿌리생장길이가줄어든다. 배양이완료된후개구리밥과식물의뿌리생장길이는눈금자를이용하여육안으로측정할수도있고, 영상분석장치를이용하여측정할수도있다. 또한, 측정된뿌리생장길이로부터뿌리길이생장률은다음과같은수학식 1로계산될수있다. 수학식 1 [0034] [0035] 여기서 A 는대조군 ( 독성원이없는상태 ) 에서의개구리밥과식물의뿌리생장길이를나타내고, B 는실험군 ( 독성 원이내포된상태의수체샘플 ) 에서의개구리밥과식물의뿌리생장길이를나타낸다. [0036] [0037] [0038] 수질독성의평가수체샘플의수질독성은개구리밥과식물의뿌리생장길이자체를이용하여평가될수도있고, 뿌리길이생장률을이용하여평가될수도있다. 뿌리생장길이자체를이용하여평가하는방법은다음과같다. 수학식 2 [0039] [0040] [0041] 여기서 A는대조군 ( 독성원이없는상태 ) 에서의개구리밥과식물의뿌리생장길이를나타내고, B는실험군 ( 독성원이내포된상태의수체샘플 ) 에서의개구리밥과식물의뿌리생장길이를나타낸다. 또한, 수질독성은원수및희석원수들에서배양된개구리밥과식물의뿌리생장길이또는뿌리길이생장률을독성물질을포함하지않는대조군에서배양된개구리밥과식물의뿌리생장길이또는뿌리길이생장률과비교하여평가되며, 구체적으로반수유효농도 (Half maximal effective concentration, EC 50 ) 내지무영향농 도 (No Observed Effect Concentration, NOEC) 값으로표시된다. [0042] 반수유효농도 (Half maximal effective concentration, EC 50 ) 는뿌리생장길이또는뿌리길이생장률이독성 물질을포함하지않는대조군에서의뿌리생장길이또는뿌리길이생장률보다 50% 감소하는수체샘플의농도를의미하는것으로서, 단일독성물질을포함하는수체샘플의경우단일독성물질의특정농도로표시되고다수의독성물질을포함하는미지의원수의경우원수의희석률로표시된다. 무영향농도는뿌리생장길이또는뿌리길이생장률이독성물질을포함하지않는대조군에서의뿌리생장길이또는뿌리길이생장률과유의적차이가없는수준으로유지되는수체샘플의농도를의미하는것으로서, 반수유효농도와마찬가지로단일독성물질을포함하는수체샘플의경우특정농도로표시되고다수의독성물질을포함하는미지의원수의경우희석률로표시된다. 한편, 반수유효농도의크기와커질수록실제수체샘플의독성은상대적으로작다는것을의미하기때문에반수유효농도를실제수체샘플독성으로환산하기위해독성단위 (Toxic Unit, TU) 을다음과같이표시할수있다. - 7 -
[0043] TU = 100/ 반수유효농도 (%) [0044] [0045] [0046] 본발명에따른수질독성평가방법과다른수질독성평가방법과의비교현재수질독성평가에대한국제공인시험법으로는국제표준화기구 (ISO), 미국환경보호청 (EPA), 및경제협력개발기구 (OECD) 등에서제시한방법이있다. 일반적으로수질독성평가에대한국제공인시험법은개구리밥과식물을배양한후잎의수 (frond number), 잎의면적 (frond area), 군체수 (population growth rate), 습중량 (fresh weight), 건중량 (dry weight), 또는색소함량 (pigment contents) 의변화량을측정하고, 이를통해수질독성을평가하고있다. 반면, 본발명인 "Root cut method" 는개구리밥과식물의뿌리를일정하게절단하고배양한후뿌리생장길이를측정하고이를통해수질독성을평가한다. 도 3은본발명의수질독성평가방법의바람직한일예를단계별로나타낸사진이다. 도 3에서보이는바와같이본발명의바람직한일예에따른수질독성평가방법은개구리밥과식물의전배양단계 (Pre-culture) 원수및이를희석한희석원수와독성물질을함유하지않는대조군으로구성된수체샘플의준비단계 (Preparation) 전배양된개구리밥과식물의뿌리절단단계 (Cutting off the root) 수체샘플을함유하는측정용용기에뿌리가절단된개구리밥과식물을투입하는단계 ( Treating) 수체샘플에투입된개구리밥과식물의배양단계 (Incubating) 배양된개구리밥과식물의뿌리생장길이를측정및분석하는단계 (Measuring) 로구성된다. 하기표 1은본발명의바람직한일예에따른수질독성평가방법 (Root cut method) 과국제적으로공인된수질독성시험법의특징을정리한것이다. 표 1에서보이는바와같이본발명의바람직한일예에따른수질독성평가방법 (Root cut method) 은국제적으로공인된수질독성시험법에비해배양시간이매우짧고요구되는수체샘플용액의양이매우적다는장점을가진다. [0047] Method ISO method OECD method US EPA method Root cut method Test species L. minor, L. minor, L. minor, L. minor, L. gibba L. gibba 표 1 L. gibba L. gibba, L. paucicostata Test duration 7 days 7 days 7 days 2 days Temperature( ) 25±1 24±2 25±2 30±1 Salinity fresh water fresh water fresh water fresh water Light intensity 100±15 μmol 6500~10000 lux 4200~6700 lux 50~150 μmol photons/ m2 s photons/ m2 s Photoperiodism continuous light continuous light continuous light continuous light Test vessel type beaker flask, petri dish beaker 24-well plate Test solution 100ml (minumum) 150ml 150ml 3ml volume Test solution ph 5.5 6.5±0.2 7.5±0.1 7±0.2 Test organism size Endpoint frond number, total frond area, dry weight, fresh weight, pigment contents 10 fronds 9~12 fronds per test vessel total frond area, dry weight, fresh weight 3~5 fronds per test vessel frond number, population growth rate, dry weight, pigment contents one plant with 2 fronds per test vessel root length [0048] [0049] [0050] ISO method : ISO 20079(2005) Water quality-determination of the toxic effect of water constituents and waste water on duckweed(lemna minor)-duckweed growth inhibition test. OECD method : OECD(2002) guidelines for the testing of chemicals, revised proposal for a new guideline 221, Lemna sp. Growth Inhibition Test. US EPA method : US EPA(1996) Ecological Effects Test Guidelines, Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp.tiers Ⅰand Ⅱ. OPPTS 850.4400, EPA 712-C-96-156. - 8 -
[0051] [0052] [0053] 본발명에따른수질독성평가방법의용도본발명의수질독성평가방법으로진단가능한독성물질은은 (Ag; Silver), 알루미늄 (Al; Aluminum), 비소 (As; Arsenic), 카드뮴 (Cd; Cadmium), 코발트 (Co; Cobalt), 크롬 (Cr; Chromium), 구리 (Cu; Copper), 철 (Fe; Iron), 수은 (Hg; Mercury), 니켈 (Ni; Nickel), 납 (Pb; Lead), 및아연 (Zn; Zinc) 등과같은중금속류가있다. 본발명의수질독성평가방법은하수및폐수오니를투척하기전에생태계에부정적인영향을끼치지않도록하기위해서취해야할오니희석배수를신속하게결정하는데도유용하게사용될수있다. 본발명의방법은종래의화학적분석방식에의존한수질오염측정법에내재된문제점중미지의독성물질이수체내에투입되었을때그것을탐지해낼수없고, 더나아가화학적분석에의한결과수치만을가지고는실제생태계에끼칠수있는수질오염의영향에대해전혀예측할수가없다는단점을보완한실용적인기법이라고할수있다. [0054] 본발명의또다른측면은본발명에따른수질독성평가방법을구현할수있는수질독성평가키트에관한것으로서, 본발명에따른수질독성평가키트는뿌리가절단된개구리밥과식물 ; 수체샘플및뿌리가절단된개구리밥과식물을수용하고개구리밥과식물을배양하기위한측정용용기 ; 및수체샘플을희석하기희석수또는인공배지 ; 를포함한다. 또한, 본발명에따른수질독성평가키트는은 (Ag; Silver), 알루미늄 (Al; Aluminum), 비소 (As; Arsenic), 카드뮴 (Cd; Cadmium), 코발트 (Co; Cobalt), 크롬 (Cr; Chromium), 구리 (Cu; Copper), 철 (Fe; Iron), 수은 (Hg; Mercury), 니켈 (Ni; Nickel), 납 (Pb; Lead), 및아연 (Zn; Zinc) 으로이루어진군으로부터선택되는하나의금속류독성물질을희석수또는인공배지에용해시켜제조한표준독성물질용액을더포함할수있는데, 표준독성물질용액은수체샘플의수질독성을평가하기전에뿌리가절단된개구리밥과식물의상태, 즉독성물질에대한반응감응성여부를테스트하는데이용될수있다. 구체적으로본발명에따른표준독성물질용액이구리를독성물질로포함하는용액인경우, 다양한구리용액및대조군에서의뿌리가절단된개구리밥과식물의뿌리생장길이또는뿌리길이생장률에대한데이터를미리확보하여수질독성평가키트와함께제공할수있다. 사용자는구리용액에대한뿌리가절단된개구리밥의뿌리생장길이또는뿌리길이생장률을측정하고이를미리제공하는데이터와비교하여뿌리가절단된개구리밥이독성물질에대해정상적으로반응하는지여부를판단하고, 일정범위 ( 예를들어, 본래반응감응성의 80% 이상 ) 의반응감응성을보이는경우미지의수체샘플에대한수질독성평가를진행할수있다. [0055] 이하, 실시예를통하여본발명을보다구체적으로설명한다. 다만, 하기의실시예는본발명의내용을명확하 게예시하기위한것일뿐본발명의보호범위를제한하는것은아니다. [0056] [0057] [0058] [0059] 1. 개구리밥과식물의최적배양조건확립 (1) 개구리밥과식물의전처리배양개구리밥과식물중좀개구리밥속식물인 Lemna minor, Lemna gibba, Lemna paucicostata를각각 1.5L의스테인버그 (Steinberg) 인공배지를담은가로 25cm, 세로 10cm, 높이 15cm의수조에넣은뒤배양기로옮기고, 연속광조건하에 20-30 μmol photon/ m2 s의광조사량및 15~20 의온도에서정지배양하였다. 이때배양 ph는약 7로조정되었고 ( 스테인버그인공배지의 ph는 7±0.2이다 ), 인공배지는 7일간격으로전량교체해주었다. 표 2는본발명의실시예에서사용된인공배지인스테인버그 (Steinberg) 인공배지에포함되는성분과농도를나타낸것이다. 표 2에나타나는바와같이인공배지는총 5개의스톡용액 (Stock solution) 을포함하며, 각각의스톡용액은개구리밥과식물의배양에필요한무기성분내지유기성분을포함하는용액으로구성된다. - 9 -
[0060] 스톡용액구분스톡용액을구성하는 성분의종류 표 2 스톡용액내에서의구 성성분의농도 (g/l) 인공배지 1 리터당스 톡용액이차지하는 부피 ( ml /l) Ⅰ KNO 3 17.5 20 K 2 HPO 4 4.5 KH 2 PO 4 0.63 Ⅱ MgSO 4 7H 2 O 5 20 Ⅲ Ca(NO 3 ) 2 4H 2 O 14.75 20 Ⅳ H 3 BO₃ 0.12 1 ZnSO 4 7H 2 O 0.18 Na 2 MoO 4 2H 2 O 0.044 MnCl 2 4H 2 O 0.18 Ⅴ FeCl 3 6H 2 O 0.76 1 Na 2 -EDTA2H 2 O 1.5 [0061] [0062] [0063] (2) 개구리밥과식물의뿌리제거및배양전처리배양된개구리밥과좀개구리밥속식물의뿌리를미세가위를이용하여완전히잘라낸후, 24웰플레이트에넣고뚜껑을닫아배양기에옮겨넣은후, 다양한광조사량, 배양액의 ph, 배양액의염분농도및배양온도조건하에서배양하였다. 48시간배양이끝난후영상분석장치 (Moticam 2000, Motic Instruments Inc., BC, Canada) 를사용하여각웰내에서배양된개구리밥과좀개구리밥속식물의뿌리생장길이를측정하였다. 도 4 는광조사량및배양온도조건별개구리밥과좀개구리밥속식물의뿌리생장길이를나타낸것이고 ( 도 4에서배양액의 ph는 7이고염분농도는 0 이다 ), 도 5는배양액의 ph 조건별개구리밥과좀개구리밥속식물의뿌리생장길이를나타낸것이고 ( 도 5에서배양온도는 30 이고, 배양액의염분농도는 0 이며, 광조사량은 Lemna minor 및 Lemna gibba의경우 150μmol photon/ m2 s 이고, Lemna paucicostata의경우 50μmol photon/ m2 s 이다 ), 도 6은배양액의염분농도별개구리밥과좀개구리밥속식물의뿌리생장길이를나타낸것이다 ( 도 6에서배양온도는 30 이고, 배양액의 ph는 7이며, 광조사량은 Lemna minor 및 Lemna gibba의경우 150μmol photon/ m2 s 이고, Lemna paucicostata의경우 50μmol photon/ m2 s 이다.). 개구리밥과에속하는좀개구리밥속식물의최적배양조건을살펴보면, 도 4 내지도 6에서보이는바와같이광조사량은 50~200 μmol photon/ m2 s, 바람직하게는 50~150 μmol photon/ m2 s 이었고, 배양온도는 25~30, 바람직하게는 30 이었고, 배양액의염분농도는 0~2, 바람직하게는 0~1 이었고, 배양액의 ph는 5~10, 바람직하게는 6~7이었다. [0064] [0065] [0066] 2. 개구리밥과식물을이용한단일금속류독성물질용액의수질독성평가 (1) 단일금속류독성물질용액의준비단일금속류독성물질로각각은 (Ag), 카드뮴 (Cd), 6가크롬 (Cr 6+ ), 구리 (Cu), 및수은 (Hg) 을포함하는독성물질용액 (ph는 7±0.2로조정함 ) 및 Steinberg 인공배지를이용하여반수희석법으로희석하여초기농도의 50%, 25%, 12.5%, 6.25% 로희석된독성물질용액을제조하고이들독성물질용액의수질독성을평가하였다. 이때, 희석되기전단일금속류독성물질용액의농도는개구리밥과좀개구리밥속식물, 즉 Lemna minor, Lemna gibba, 및 Lemna paucicostata에맞추어각각선택하였다. 또한, 대조군용액으로는독성물질을포함하지않는 Steinberg 인공배지 ( 인공배지의 ph 는 7±0.2임 ) 를사용하였다. [0067] [0068] (2) 개구리밥과식물의뿌리제거및배양 미세가위를이용하여개구리밥과좀개구리밥속식물, 즉 Lemna minor, Lemna gibba, 및 Lemna paucicostata 의 - 10 -
뿌리를각각잘라내었다. 이후, 24웰플레이트의웰에대조군용액및독성물질용액을넣고, 여기에뿌리가절단된개구리밥과좀개구리밥속식물을넣은후 24웰플레이트를배양기에옮겨넣었다. 이후 30 의온도에서 48시간배양하였다. 이때, 사용된개구리밥과좀개구리밥속식물이 Lemna minor 및 Lemna gibba인경우 150 μ mol photon/ m2 s의광조사량상태를유지하였고, 사용된개구리밥과좀개구리밥속식물이 Lemna paucicostata 인경우 50 μmol photon/ m2 s의광조사량상태를유지하였다. [0069] [0070] [0071] (3) 개구리밥과식물의뿌리생장길이의측정영상분석장치 (Moticam 2000, Motic Instruments Inc., BC, Canada) 를사용하여 48시간배양후개구리밥과식물의뿌리생장길이를측정하였다. 도 7은단일독성물질로서은 (Ag) 을포함하는독성물질용액의은 (Ag) 농도에따른개구리밥과좀개구리밥속식물의뿌리생장길이를나타낸그래프이고, 도 8은단일독성물질로서카드뮴 (Cd) 을포함하는독성물질용액의카드뮴 (Cd) 농도에따른개구리밥과좀개구리밥속식물의뿌리생장길이를나타낸그래프이고, 도 9는단 일독성물질로서 6가크롬 (Cr 6+ ) 을포함하는독성물질용액의 6가크롬 (Cr 6+ ) 농도에따른개구리밥과좀개구리밥속식물의뿌리생장길이를나타낸그래프이고, 도 10은단일독성물질로서구리 (Cu) 를포함하는독성물질용액의구리 (Cu) 농도에따른개구리밥과좀개구리밥속식물의뿌리생장길이를나타낸그래프이고, 도 11 은단일독성물질로서수은 (Hg) 을포함하는독성물질용액의수은 (Hg) 농도에따른개구리밥과좀개구리밥속식물의뿌리생장길이를나타낸그래프이다. 도 7 내지도 11에서보이는바와같이개구리밥과좀개구리밥속식물의뿌리생장길이는일정범위에서금속류독성물질의농도와선형관계를나타내었다. 또한, 도 7 내지도 11에서는나타내지않았지만, 개구리밥과좀개구리밥속식물의뿌리생장길이는대조군배양에서의뿌리생장길이와독성물질을포함하는용액에서의뿌리생장길이의비, 즉개구리밥과좀개구리밥속식물의뿌리길이생장률로대체될수있다. [0072] [0073] (4) 개구리밥과식물의뿌리생장길이를이용한단일금속류독성물질의수질독성판단 도 7 내지도 11 에표시된개구리밥과좀개구리밥속식물의뿌리생장길이를기준으로단일금속류독성물질 의반수유효농도 (EC 50 ) 내지무영향농도 (NOEC) 를계산하였다. 이때 EC 50 값은점예측기법 (point estimation techniques) 을써서계산하였고, NOEC 값은 Dunnett 과정과같은가설검정방법을써서계산하였다. 표 3 은뿌 리가절단된개구리밥과좀개구리밥속식물의뿌리생장길이를수질독성평가기준으로하였을때의단일금 속류독성물질의반수유효농도 (EC 50 ) 내지무영향농도 (NOEC) 를나타낸것이다. [0074] 표 3 금속류독성 Lemna minor 뿌리생장길이 Lemna gibba 뿌리생장길 Lemna paucicostata 뿌리물질기준이기준생장길이기준 NOEC( mg /L) EC 50 ( mg /L) NOEC( mg /L) EC 50 ( mg /L) NOEC( mg /L) EC 50 ( mg /L) Ag < 0.0031 0.0053 < 0.025 0.0276 < 0.0625 0.2138 Cd 0.125 0.2264 0.125 0.3666 < 0.0781 0.1426 Cr 6+ 0.375 0.3418 0.75 0.9558 < 0.1562 0.6430 Cu 0.125 0.2210 0.25 0.3604 < 0.1562 0.3914 Hg 0.25 0.1971 < 0.0625 0.2854 < 0.078 0.1498 [0075] [0076] (5) 본발명의 "Root cut method" 와국제공인시험법의민감도비교 하기표 4 는본발명의 "Root cut method" 를이용하여수질독성을평가하였을때의반수유효농도 (EC 50 ; 단위 는mg /L) 값과, 국제공인시험법을이용하여수질독성을평가하였을때의반수유효농도 (EC 50 ) 값을나타낸것이다. 하기표 4에서보이는바와같이본발명의뿌리가절단된개구리밥과식물의뿌리생장길이를기준으로수질독성을평가하는 "Root cut method" 가개구리밥과식물의잎의수 (frond number; ISO method) 또는군체수 (population growth rate; US EPA ECOTOX Database) 를기준으로수질독성을평가하는국제공인시험법보 - 11 -
다현저히향상된민감도를보인다. [0077] 표 4 금속류독성물개구리밥과식물 : Lemna minor 질 Root cut method ISO method US EPA ECOTOX Database Ag 0.0053 0.081 - Cd 0.2264 0.323 0.74(4일배양기준 ) Cr 6+ 0.3418 2.3 8.5(7일배양기준 ) Cu 0.221 0.33 0.32(14일배양기준 ) Hg 0.1971 0.683 - [0078] * ISO Method 반수유효농도 (EC 50 ) 값출처 : B. Naumann et al., 2007, Growth rate based dose-response relationships and EC-values of ten heavy metals using the duckweed growth inhibition test (ISO 20079) with Leman minor L clone St, Journal of Plant Physiology 164 1656-1664 [0079] [0080] [0081] [0082] * US EPA ECOTOX Database 반수유효농도 (EC 50 ) 값출처 1) Cd : Chouikhi, A., 1979, Choice and Set Up of the Food Chains in Freshwater in Order to Show the Bioaccumulation Character of a Pollutant, OECD-IRCHA Universite Paris-Sud, Unite d'enseignement et de Recherche d'hygiene et Protection de l'homme et de son Environnement 2) Cr 6+ : Ince, N.H., N. Dirilgen, I.G. Apikyan, G. Tezcanli, and B. Ustun, 1999, Assessment of Toxic Interactions of Heavy Metals in Binary Mixtures: A Statistical Approach, Arch. Environ. Contam. Toxicol.36(4): 365-372 3) Cu : Jenner, H.A., and J.P.M. Janssen-Mommen, 1993, Duckweed Lemna minor as a Tool for Testing Toxicity of Coal Residues and Polluted Sediments, Arch. Environ. Contam. Toxicol.25(1): 3-11 [0083] 상기의실시예에서는비록성분과농도가특정된독성물질에의한수질독성을평가하였으나, 미지의독성물 질을포함하는수체샘플에변형되어실시될수있고, 그때의 EC 50 값이나, NOEC 값을통해미지의독성물질이 수질에미치는영향을파악할수있음은본발명의기술분야에서통상의지식을가진자에게는자명하다할것이다. 또한, 수질독성평가의기준으로개구리밥과식물의뿌리길이생장률을이용하는기술적사상은개구리밥과식물의뿌리생장길이를이용하는기술적사상의균등범위에속함은본발명이기술분야에서통상의지식을가진자에게자명하다할것이다. - 12 -
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