(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 2014년05월27일 (11) 등록번호 10-1399121 (24) 등록일자 2014년05월19일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A01K 67/027 (2006.01) C12N 5/10 (2006.01) C12N 15/52 (2006.01) G01N 33/15 (2006.01) (21) 출원번호 10-2011-0001850 (22) 출원일자 2011 년 01 월 07 일 심사청구일자 2013 년 02 월 26 일 (65) 공개번호 10-2012-0080407 (43) 공개일자 2012 년 07 월 17 일 (56) 선행기술조사문헌 KR1020030067204 A KR1020080098156 A JP2007075033 A 논문 1 - INTERNATIONAL IMMUNOLOGY (73) 특허권자 한국생명공학연구원 대전광역시유성구과학로 125 ( 어은동 ) 고려대학교산학협력단 서울특별시성북구안암로 145, 고려대학교 ( 안암동 5 가 ) 대한민국 ( 식품의약품안전처장 ) 충청북도청원군강외면오송생명 2 로 187 (72) 발명자 유대열 대전광역시유성구과학로 125 ( 어은동 ) 오칠환 서울특별시강남구광평로 19 길 15, 목련타운 103-1501 ( 일원동 ) ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 이원희전체청구항수 : 총 9 항심사관 : 박영관 (54) 발명의명칭산화스트레스를이용한아토피피부염모델마우스개발 (57) 요약 본발명은산화스트레스를이용한아토피피부염모델마우스개발에관한것으로서, 종래아토피피부염모델동물인 NC/Nga 마우스의피부염부위에서는정상부위에서보다항산화효소인퍼록시레독신 Ⅱ(peroxiredoxin Ⅱ, PrxⅡ) 의발현이현저하게감소되는것에착안하여, NC/Nga 마우스와퍼록시레독신 Ⅱ 녹아웃 (knockout) 마우스의 교배를통해자손 (NC/PrxⅡ -/- ) 을생산하였고, 상기 NC/PrxⅡ -/- 마우스는아토피증상을나타내는지표인혈중 IgE 함유량, 비장세포의 CD4/CD8 T 세포함량, IL-4, 활성산소및피부염증현상이 NC/Nga 마우스보다유의적으로증가하였으므로, 신규한아토피피부염모델마우스로유용하게이용할수있을뿐아니라, 아토피피부염모델마우스의제조, 및이를이용한아토피피부염치료제후보물질의스크리닝에유용하게이용할수있다. 대표도 - 도 6a - 1 -
(72) 발명자하혜린대전광역시유성구과학로 125 ( 어은동 ) 김진호서울특별시은평구통일로 194 조양하서울특별시은평구통일로 194 이인선서울특별시은평구통일로 194 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 1475004911(09162 독관리 548) 부처명 연구사업명 연구과제명 기여율 1.4/2 식품의약품안전청 안전성관리기반연구 아토피피부염유발평가연구 주관기관 한국생명공학연구원 연구기간 2009.03.01 ~ 2010.05.31 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 10574 부처명 연구사업명 연구과제명 서울특별시 기여율 0.6/2 서울시기술기반구축사업 분자영상기반난치병치료신기술개발 주관기관 고려대학교산학협력단 연구기간 2005.12.01 ~ 2010.11.30-2 -
특허청구의범위 청구항 1 퍼록시레독신 Ⅱ(peroxiredoxin Ⅱ, PrxⅡ) 유전자가녹아웃된 (PrxⅡ -/- ) NC/Nga 마우스로서, 아토피피부염이 유발된아토피피부염모델마우스. 청구항 2 제 1 항의아토피피부염모델마우스의수정란. 청구항 3 제 2 항에있어서, 상기수정란은수탁번호 KCTC 11764BP 로기탁된것을특징으로하는수정란. 청구항 4 1) NC/Nga 마우스와퍼록시레독신 Ⅱ(peroxiredoxin Ⅱ, PrxⅡ) 유전자녹아웃마우스를교배시켜 PrxⅡ 유전자 가녹아웃된 NC/Nga 마우스 (NC/ PrxⅡ -/- ) 를제조하는단계 ; 및 2) 상기단계 1) 에서얻은 NC/PrxⅡ -/- 마우스를유사유전자형 (congenic) 마우스로제조하는단계를포함하는, PrxⅡ 유전자가녹아웃된 NC/Nga 마우스의제조방법. 청구항 5 제 4 항에있어서, 단계 2) 의유사유전자형마우스는 NC/PrxⅡ -/- 마우스를 NC/Nga 마우스와역교배시켜제조하는 것을특징으로하는제조방법. 청구항 6 제 4 항에있어서, 상기유사유전자형마우스는 7 세대내지 13 세대인것을특징으로하는제조방법. 청구항 7 1) 제 1항의아토피피부염모델마우스에피검화합물또는조성물을투여하는단계 ; 2) 실험군으로서상기피검화합물또는조성물이처리된마우스, 및대조군으로서피검화합물또는조성물이처리되지않은마우스로부터각각아토피피부염의증상을측정하는단계 ; 및 3) 대조군에비하여실험군에서아토피피부염의증상이감소된피검화합물또는조성물을선별하는단계를포함하는, 아토피피부염치료제후보물질의스크리닝방법. 청구항 8 제 7 항에있어서, 상기단계 1) 의피검화합물또는조성물은천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아또는진균의대사산물및생활성분자로이루어진군으로부터선 - 3 -
택되는어느하나인것을특징으로하는스크리닝방법. 청구항 9 제 7항에있어서, 상기단계 2) 의아토피피부염증상의측정은혈중 IgE, CD8 T 세포, CD4 T 세포, IL-4, 활성산소및피부병변의정도로구성된군으로부터선택되는어느하나이상을측정하는것을특징으로하는스크리닝방법. 명세서 [0001] 기술분야 본발명은산화스트레스를이용한아토피피부염모델마우스개발에관한것이다. [0002] 배경기술아토피피부염 (atopic dermatitis) 은만성적인염증성피부질환으로서, 면역학적, 유전적, 약리및생리학적, 및환경적등다인자적요인에의해발명되며, 병인과발병기전은감염, 스트레스, 계절과기후변화, 자극및알러젠 (allergen) 등에의해호전및악화가반복적으로일어난다. 아토피피부염은영 유아부터성인에까지광범위하게유발되며, IgE 매개감작 (IgE-mediated sensitization) 에의한외인성형태 (extrinsic form, 70~80%) 와비 IgE 매개감작 (non-ige-mediated sensitization) 에의한내인성형태 (intrinsic form, 20~30%) 2 가지형태로분류되는것으로알려져있다 (Nova N, Bieber T. J Allergy Clin Immunol, 2003, 112(2): 252-262). 현재까지아토피피부염의확실한원인은밝혀지지않았으나, 유전적인소인과건조한피부, 정상인에비해서쉽게피부가려움증을느끼는특성, 비정상적인피부혈관반응, 비정상적인기능을가진백혈구, 환자가일상의생활에서접하는세균, 바이러스, 곰팡이등에의한감염, 히스타민등의염증매개물질, 정신적스트레스등여러가지원인이복합적으로작용하여일어나는것으로이해되고있다. 아토피피부염의증상으로는주로가려움증, 발진, 상처, 경피수분손실량의증가, 각질층의수분량감소와같은피부항상성에이상을초래하고, 면역병리학적특징을수반하는것으로알려져있으며, 피부가려움증, 두드러기, 기침, 재채기, 콧물, 코막힘, 눈의결막충혈, 눈물, 구토, 설사, 복통등의증상을잘나타낼수있으며심한경우호흡곤란이나쇼크를일으킬수도있다. [0003] 아토피피부염의치료는건조한피부의보습, 피부염치료를위한부신피질호르몬제, 면역조절제, 국소면역조절제, 또는가려움증을치료하기위한항히스타민제가주로사용된다. 그러나, 현재아토피피부염에쓰이는약물들은장기적으로쓰였을때불면증, 중독증세와같은심각한부작용을초래하는것으로알려져있다. 특히, 스테로이드제는피부위축이일어날수있고전신으로흡수될경우부신기능부전신증이생길수있는부작용이있으며, 면역억제제의경우에는고혈압또는신기능이상등의부작용을초래한다. 그러므로부작용이적고상대적으로효과는뛰어난치료제의개발이무엇보다시급한실정이다. 따라서, 아토피피부염치료제개발에활용할수있는모델동물의개발이필수적이다. 아토피피부염모델동물은생체에서약물의효능및동력학 (pharmacokinetics) 을이해하고연구하는데사용되고, 인체의아토피피부염병인, 병태및그기전을이해하는데활용될수있으며, 치료약물을개발하는데직접이용될수있을것이다. [0004] 이에, 본발명자들은아토피피부염에대한핵심적병인기전과약물의효능을대량으로검증할수있는새로운 아토피피부염모델동물의개발을위해연구한결과, 기존의아토피피부염모델마우스인 NC/Nga 마우스와퍼 록시레독신 Ⅱ(peroxiredoxin Ⅱ) 녹아웃 (knockout) 마우스의교배를통해태어난마우스 (NC/PrxⅡ -/- ) 는아토피증상을나타내는지표인혈중 IgE 함유량, CD4/CD8 T 세포의함량및피부염증현상이 NC/Nga 마우스보다유의적으로증가하는것을확인하였으므로, 상기 NC/PrxⅡ -/- 마우스는효과적인아토피피부염모델동물로서유용하게이용될수있음을밝힘으로써본발명을완성하였다. - 4 -
발명의내용 [0005] [0006] 해결하려는과제본발명의목적은아토피피부염모델마우스, 이의제조방법, 및이의용도를제공하는것이다. 본발명의또다른목적은상기아토피피부염모델마우스를이용하여아토피피부염치료제를스크리닝하는방법을제공하는것이다. 과제의해결수단 [0007] 상기목적을달성하기위하여, 본발명은퍼록시레독신 Ⅱ(peroxiredoxin Ⅱ, PrxⅡ) 유전자가녹아웃된 (PrxⅡ - /- ) NC/Nga 마우스로서, 아토피피부염이유발된아토피피부염모델마우스를제공한다. [0008] [0009] [0010] 또한, 본발명은상기아토피피부염모델마우스의수정란을제공한다. 또한, 본발명은상기아토피피부염모델마우스의제조방법을제공한다. 아울러, 본발명은상기아토피피부염모델마우스를사용한아토피피부염치료제후보물질의스크리닝방법을제공한다. [0011] 발명의효과본발명에따른퍼록시레독신 Ⅱ(peroxiredoxin Ⅱ, PrxⅡ) 유전자가녹아웃된 NC/Nga 마우스는기존에알려진아토피피부염모델동물인 NC/Nga 마우스에비해아토피피부염의표현형이우수하므로아토피피부염연구를위한획기적인모델마우스로서유용하게이용될수있다. [0012] 도면의간단한설명 도 1 은 NC/Nga 마우스에있어서아토피피부염과관련된항산화효소의발현을나타낸그림이다. 도 2는 NC/PrxⅡ -/- 마우스또는 NC/PrxⅡ+/+ 마우스에바셀린을처리한실험군, 및 AD 연고를처리한실험군의혈중 IgE값의변화를나타낸그래프이다. 도 3은 NC/PrxⅡ -/- 마우스또는 NC/PrxⅡ+/+ 마우스의비장세포에서의면역세포 { 세포독성 T 세포 (CD8+) 및헬퍼 T 세포 (CD4+)} 의분포를나타낸그래프이다. 도 4는 NC/PrxⅡ -/- 마우스또는 NC/PrxⅡ+/+ 마우스의아토피피부염조직에서의사이토카인유전자의발현을나타낸그래프이다. 도 5 는 NC/PrxⅡ -/- 타낸그림이다. 마우스또는 NC/PrxⅡ+/+ 마우스의혈중활성산소 (A) 및피부에서의활성산소 (B) 수준을나 도 6 은 NC/PrxⅡ -/- 마우스또는 NC/PrxⅡ+/+ 마우스의조직병리학적변화를나타낸그림이다 : 도 6a: 피부병변에대한육안적소견 ; 및 도 6b: H&E 염색 ( 상 ) 및프러시안블루염색 ( 하 ). [0013] 발명을실시하기위한구체적인내용 이하, 본발명을상세히설명한다. - 5 -
[0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] 본발명은퍼록시레독신 Ⅱ(peroxiredoxin Ⅱ, PrxⅡ) 유전자가녹아웃된 (PrxⅡ -/- ) NC/Nga 마우스로서, 아토피피부염이유발된아토피피부염모델마우스를제공한다. 또한, 본발명은상기아토피피부염모델마우스의수정란을제공한다. 상기아토피피부염모델마우스는 NC/Nga 마우스와 PrxⅡ 유전자녹아웃마우스의교배를통해제조되는것이바람직하고, NC/Nga 마우스와 PrxⅡ 유전자녹아웃마우스를역교배시켜제조한 NC/Nga 계통의마우스인것이더욱바람직하나이에한정되지않는다. 상기아토피피부염모델마우스는마우스를 NC/Nga 계통화하기위하여역교배를 7세대내지 13세대실시하여유사유전자형 (congenic) 마우스를제조하는것이바람직하나이에한정되지않는다. 상기수정란은 PrxⅡ 유전자가녹아웃된 NC/Nga 마우스로부터유래한것일수있고, 수탁번호 KCTC 11764BP로기탁된수정란인것이바람직하나이에한정되지않는다. 본발명의구체적인실시예에있어서, 기존에아토피피부염모델동물로서사용된 NC/Nga 마우스와, 아토피피부염조직에서발현이감소하는것으로확인된 PrxⅡ 유전자가결손된마우스를교배하여, PrxⅡ 유전자녹아웃 된 NC/Nga 마우스 (NC/PrxⅡ -/- ) 를제조하였다. 상기 NC/Nga 마우스는일본에서개발되어기존에아토피피부염 모델동물로서주로사용되고있는것으로, 아토피피부염유발정도가높지않고, IgE 의혈중농도가낮기때 문에실제사람에서나타나는아토피피부염과는상관관계가적다는단점이있었다. [0020] 본발명자들은상기제조된 NC/PrxⅡ -/- 마우스의아토피피부염모델동물로서효과를표현형분석을통해확인하였다. 구체적으로, ELISA 분석을실시하여혈중 IgE 함유량을측정한결과, NC/PrxⅡ -/- 마우스는아토피유발물질처리유무에상관없이 NC/PrxⅡ+/+ 마우스에비해혈중 IgE 값이증가하였고 ( 도 2 참조 ), 유세포분석을실시하여비장세포에서면역세포 { 세포독성 T 세포 (CD8+) 및헬퍼 T 세포 (CD4+)} 의함량을측정한결과, 면역세포비율이현저히증가하는것으로나타났다 ( 도 3 참조 ). 또한, 실시간 PCR을통해비장조직에서의사이토카인의발현량을측정한결과, NC/PrxⅡ -/- 마우스는 NC/PrxⅡ+/+ 마우스에비해 IL-4 mrna의발현량이유의적으로증가한것으로나타났고 ( 도 4 참조 ), NC/PrxⅡ -/- 마우스의혈중활성산소및피부조직에서의활성산소수준이증가된것을확인하였다 ( 도 5 참조 ). 이러한 NC/PrxⅡ -/- 마우스는아토피유발물질처리유무에상관없이아토피피부염증상이육안적으로관찰되었고, 아토피유발물질을처리한경우에는아토피피부염증상이더욱심화된것으로나타났으며 ( 도 6a 참조 ), 병리학적검사결과, 림프구, 비만세포및표피층의두께가모두증가한것으로확인되었다 ( 표 1 및도 6b 참조 ). 이에, 상기 NC/PrxⅡ -/- 마우스는아토피유발물질처리에상관없이아토피피부염이유발되고, PrxⅡ 유전자를발현하는정상 NC/Nga 마우스에비해효과적으로아토피피부염관련표현형이나타남을확인하였다. [0021] 이로써, 본발명의 NC/PrxⅡ -/- 마우스는아토피피부염모델동물로서사용할수있음을확인하였고, 상기 NC/PrxⅡ -/- 마우스의수정란을한국생명공학연구원유전자은행에 2010 년 09 월 13 일자로기탁하였다 [ 수탁번호 : KCTC 11764BP (NC/Nga/129-PrxⅡ ko(mouse embryo)]. [0022] [0023] [0024] 또한, 본발명은상기아토피피부염모델마우스의제조방법을제공한다. 상기제조방법은 1) NC/Nga 마우스와 PrxⅡ 유전자녹아웃마우스를교배시켜 PrxⅡ 유전자가녹아웃된 NC/Nga 마우스 (NC/ PrxⅡ -/- ) 를제조하는단계 ; 및 [0025] [0026] 2) 상기단계 1) 에서얻은 NC/PrxⅡ -/- 마우스를유사유전자형 (congenic) 마우스로제조하는단계를포함하는것 이바람직하나이에한정되지않는다. 상기방법에있어서, 상기단계 2) 에서제조한마우스중에서퍼록시레독신 Ⅱ(peroxiredoxin Ⅱ, PrxⅡ) 유전 자가녹아웃된마우스 (PrxⅡ -/- ) 를선별하는단계를포함하는것이바람직하나이에한정되지않고, 상기유사유 - 6 -
전자형마우스는추가적으로아토피피부염여부를판정하는단계를포함하는것이바람직하나이에한정되지 않는다. [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] 상기아토피피부염여부의판정은조직병리학적방법, ELISA, 유세포분석법또는중합효소연쇄반응방법을통하여아토피피부염유발여부를판정할수있고, 상기조직병리학적방법은피부병소의육안적검사, H&E 또는프러시안블루 (prussian blue) 염색된조직절편의현미경관찰로이루어질수있으나이에한정되지않는다. 상기방법에있어서, 단계 1) 의 NC/Nga 마우스는기존에아토피피부염모델동물로서사용되고있는마우스로서, 일본의 fancy 마우스 (Nishiki-Nezumi) 로부터유래되었고, 1955년에근교계 (inbred) 계통으로확립되었다. 일반적인사육환경에서 NC/Nga 마우스를사육하면피부상처가유발되어가려움증을나타내는피부질환으로발전되나, SPF(Specific Pathogen Free) 상태에서사육하면피부손상이전혀유발되지않는다는사실이보고되었다 (Matsuda H. et al., Int Immunol, 1997:9, 461-466; Suto H. et al., Int Arch Allergy Immunol, 1999:120, 70-75). 상기단계 1) 의 PrxⅡ 유전자가녹아웃된마우스는 PrxⅡ 유전자가결손된동형접합성 (PrxⅡ -/- ) 마우스로서, PrxⅡ 유전자결손벡터로배아줄기세포의 PrxⅡ 유전자를결손시키고, 이를발생중인배반포내에미세주입하여생산한키메라마우스를역교배함으로써생산할수있으며, 참고문헌 ( 대한민국공개특허 2003-0067204) 에기재된방법과같이, 유전자조작으로 PrxⅡ 유전자를녹아웃시켜제작하는것이바람직하나이에한정되지않는다. 상기단계 2) 의유사유전자형마우스는 NC/Nga 계통으로통일하기위하여, NC/PrxⅡ -/- 마우스를 NC/Nga 마우스와역교배시켜제조하는것이바람직하고, 역교배를 7세대내지 13세대실시한마우스인것이가장바람직하나이에한정되지않는다. 본발명의구체적인실시예에있어서, NC/Nga 마우스의아토피피부염병변에서는정상부위에서보다항산화효소인 PrxⅡ 유전자의발현이현저하게감소되는것에착안하여 ( 도 1 참조 ), 기존의아토피피부염모델동물로서사용되고있는 NC/Nga 마우스를 PrxⅡ 유전자가녹아웃 (knockout) 된마우스와교배시켜 1세대자손을생산하였 고, NC/Nga 마우스와 PrxⅡ -/- 마우스는마우스계통이상이하여 NC/PrxⅡ -/- 마우스의계통을전부 NC/Nga 계통화하기위하여 7대이상역교배하여 NC/Nga 계통의유사유전자형마우스 (congenic mouse) 를제작하였다. 이때, 대조군인 NC/Nga 마우스의유전적배경과동일한유전적배경을가진 NC/PrxⅡ -/- 마우스를제조하여정확한실험군을만들기위하여 7세대의역교배를실시하였고, NC/Nga 마우스와 100% 동일한유전자배경을갖는 NC/Prx Ⅱ -/- 마우스를제조하기위하여 13세대까지역교배를실시하는것이바람직하다. [0032] [0033] 본발명자들은상기와같이제조한 NC/PrxⅡ -/- 마우스의표현형분석을통하여, NC/PrxⅡ -/- 마우스는아토피피부염증상을나타내는지표물질인혈중 IgE 함유량, CD4/CD8 T 세포의함량, IL-4, 혈중또는피부조직의활성산소, 및피부염증현상이 NC/Nga 마우스에서보다유의적으로증가하는것을확인하였다 ( 도 2 내지도 6 참조 ). 따라서, 상기 NC/PrxⅡ -/- 마우스는기존의아토피피부염모델마우스보다효과가탁월하고, 아토피피부염과관련된표현형을효과적으로유발하는것을확인하였으므로, 상기방법은아토피피부염모델마우스의제조에유용하게사용될수있다. [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] 아울러, 본발명은상기제조한아토피피부염모델마우스를이용한아토피피부염치료제후보물질의스크리닝방법을제공한다. 상기스크리닝방법은 1) 상기아토피피부염모델마우스에피검화합물또는조성물을투여하는단계 ; 2) 실험군으로서상기피검화합물또는조성물이처리된마우스, 및대조군으로서피검화합물또는조성물이처리되지않은마우스로부터각각아토피피부염의증상을측정하는단계 ; 및 3) 대조군에비하여실험군에서아토피피부염의증상이감소된피검화합물또는조성물을선별하는단계를포함하는것이바람직하나이에한정되지않는다. - 7 -
[0039] [0040] [0041] [0042] [0043] 상기방법에있어서, 상기단계 1) 의피검화합물또는조성물은통상적인선정방식에따라아토피피부염의억제가능성을지닌것으로추정되거나또는무작위적으로선정된개별적인천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아또는진균의대사산물또는생활성분자일수있다. 상기단계 1) 의투여방법은경구투여또는비경구투여를통해수행될수있으며, 상기비경구투여시피내주사, 피하주사, 정맥주사, 복강주사, 근육주사로이루어지는군으로부터선택되는어느하나의주사투여 ; 직장투여 ; 국소도포 ; 첩포 ; 및이온토포레시스 (Iontophoresis) 로이루어지는군으로부터선택되는어느하나의방법으로수행될수있다. 상기단계 2) 의아토피피부염증상의측정은조직병리학적방법, ELISA, 유세포분석법또는중합효소연쇄반응방법을통하여아토피피부염증상을측정할수있고, 혈중 IgE, CD8 T 세포, CD4 T 세포, IL-4, 활성산소및피부병변의정도로를측정하는것이바람직하나, 아토피피부염증상을측정할수있는지표는무엇이든가능하다. 상기스크리닝방법을통해수득한, 아토피피부염억제활성을나타내는피검화합물또는조성물은아토피피부염치료제후보물질이될수있다. 이와같은후보물질은이후의아토피피부염치료제개발과정에서선도물질로서작용하게되며, 선도물질이아토피피부염억제효과를나타낼수있도록그구조를변형시키고최적화함으로써새로운아토피피부염치료제를개발할수있다. 본발명의 NC/PrxⅡ -/- 마우스는종래의 NC/Nga 마우스보다더욱뛰어난아토피피부염표현형을나타내므로 ( 도 2 내지도 6 참조 ), 아토피피부염치료제개발을위한모델마우스로서유용하게사용될수있다. [0044] [0045] 이하, 본발명을하기실시예에의하여상세히설명한다. 단, 하기실시예는본발명을구체적으로예시하는것이며, 본발명의내용이하기의실시예에의해한정되는 것은아니다. [0046] [0047] [0048] 실시예 1 아토피피부염과항산화효소와의관련성확인최근아토피피부염이환경인자와밀접한관계가있음이밝혀지면서, 이에착안하여아토피피부염과항산화효소와의관련성을확인하고자하였다. 아토피피부염유발후보물질인천연진드기유래성분 (Dermatophagoidesfarinae, AD) 을, 기존에아토피피부염모델동물로널리활용되고있는 Nc/Nga 마우스의피부조직에도포하였고, 이와함께천연진드기유래성분을도포하지않은 Nc/Nga 마우스의피부조직에대하여웨스턴블랏 (Western blot) 을실시하여활성산소 (Reactive Oxygen Species, ROS) 제거기능을지닌항산화효소인퍼록시레독신 Ⅰ(peroxiredoxin Ⅰ, PrxⅠ), 퍼록시레독신 Ⅱ(peroxiredoxin Ⅱ, PrxⅡ), 및 GpxI의발현을확인하였다. 그결과, 도 1에나타낸바와같이, 정상피부조직 (NC-N) 에서는 PrxⅠ 및 PrxⅡ가발현되는것으로나타났으나아토피피부염조직 (NC-AD) 에서는 PrxⅠ 및 PrxⅡ의발현이현저하게감소한것으로나타났으며, GpxI은정상피부조직에서는발현하지않았으나아토피피부염조직에서는발현되었다 ( 도 1). [0049] [0050] 실시예 2 아토피피부염모델마우스의제작 NC/Nga 마우스 (Japan SLC, Inc 로부터구입, International Immunology, Vol. 9, No. 3, pp. 461-466 참조 ) 와 PrxⅡ 녹아웃마우스 (PrxⅡ -/- )( 대한민국공개특허 2003-0067204 참조 ) 를교배하여자손 (NC/PrxⅡ -/- ) 마우스를생산하였다. NC/Nga 마우스와 PrxⅡ -/- 마우스는마우스계통이상이하여, NC/PrxⅡ -/- 마우스의계통을전부 NC/Nga 마우스의계통으로통일하기위하여역교배 (backcross) 시켜 7세대의유사유전자형마우스 (congenic mouse) 를제작하였다. 이와같이제작한상기 NC/PrxⅡ -/- 마우스의수정란을한국생명공학연구원유전자은행에 - 8 -
2010 년 09 월 13 일자로기탁하였다 [ 수탁번호 : KCTC 11764BP (NC/Nga/129-PrxⅡ ko(mouse embryo)]. [0051] [0052] [0053] [0054] 실시예 3 아토피피부염모델마우스의표현형분석 <3-1> 혈중 IgE 함유량분석상기 < 실시예 2> 에서제조한 NC/PrxⅡ -/- 마우스, 및 PrxⅡ가녹아웃되지않은 NC/PrxⅡ+/+ 마우스에아토피를유발하지않는바셀린 (Vaseline), 또는아토피를유발하는 AD 연고를각각처리한마우스실험군에대하여혈중 IgE 값변화를측정하였다. 그결과, 도 2에나타낸바와같이, 혈중 IgE 수준이아토피유발물질처리유무에상관없이 NC/PrxⅡ+/+ 마우 스보다 NC/PrxⅡ -/- 마우스에서증가하는것으로나타났다 ( 도 2). [0055] [0056] [0057] <3-2> 비장세포에서 CD4/8 T세포의함량분석바셀린 (Vaseline), 또는 AD 연고가각각도포된, NC/PrxⅡ -/- 마우스및 NC/PrxⅡ+/+ 마우스의비장세포에서의 CD4/CD8 T세포함량을유세포분석기 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 를사용하여측정하였다. 그결과, 도 3에나타낸바와같이, 바셀린을처리한 NC/PrxⅡ -/- 마우스는바셀린을처리한 NC/PrxⅡ+/+ 마우스보다 CD4/CD8 T세포의비율이유의적으로증가하였고, AD 연고를처리한실험군에서도 NC/PrxⅡ -/- 마우스에서의 CD4/CD8 T세포비율이 NC/PrxⅡ+/+ 마우스보다증가하였다 ( 도 3). [0058] [0059] <3-3> 비장세포에서사이토카인의발현량분석 NC/PrxⅡ -/- 마우스및 NC/PrxⅡ+/+ 마우스의아토피피부염조직에서사이토카인유전자의발현량을확인하기위하여, 실시간중합효소연쇄반응 (real time polymerase chain reaction) 을실시하였다. [0060] 그결과, 도 4 에나타낸바와같이, NC/PrxⅡ+/+ 마우스보다 NC/PrxⅡ -/- 가유의적으로증가되어있음을확인하였다 ( 도 4). 마우스에서 Th2 세포타입인 IL-4 mrna [0061] <3-4> 활성산소 (Reactive Oxygen Species, ROS) 의변화 [0062] NC/PrxⅡ -/- 마우스및 NC/PrxⅡ+/+ 마우스에서의 ROS 의변화를확인하기위하여, 혈중 ROS 및피부의 ROS 수준 을각각 FACS 및 DHE 형광염색을통해분석하였다. [0063] 그결과, 도 5 에나타낸바와같이, NC/PrxⅡ -/- 준이증가되어있음을확인하였다 ( 도 5). 마우스가 NC/PrxⅡ+/+ 마우스보다혈중또는피부에서의 ROS 수 [0064] <3-5> 조직병리학적변화 [0065] [0066] NC/PrxⅡ -/- 마우스및 NC/PrxⅡ+/+ 마우스의조직병리학적변화를확인하기위하여, 마우스피부를육안적으로관찰하였고 H&E 염색및프러시안블루 (prussian blue) 염색을실시하였다. 그결과, 도 6a에나타낸바와같이, 바셀린처리군에서 NC/PrxⅡ -/- 마우스의등머리쪽에피부염증상이나타났으나 NC/PrxⅡ+/+ 마우스에서는피부염증상이관찰되지않았다. AD 연고를처리한군에서도 NC/PrxⅡ -/- 마우스의피부에각질이관찰되어아토피증상이 NC/PrxⅡ+/+ 마우스보다더욱심화된것을확인하였다 ( 도 6a). - 9 -
한편, 병리학적실험결과, 표 1 및도 6b에나타낸바와같이, NC/PrxⅡ+/+ 마우스보다 NC/PrxⅡ -/- 마우스에서림프구가더욱증가되어있었고, 비만세포도그정도가더욱심화된것을관찰하였다. 또한, 표피층의두께도 NC/PrxⅡ+/+ 마우스보다 NC/PrxⅡ -/- 마우스에서더두터워진것을확인하였다 ( 표 1 및도 6b). 표 1 [0067] [0068] NC/PrxⅡ -/- 마우스및 NC/PrxⅡ -/- 마우스피부의병리학적소견 [0069] 수탁번호 기탁기관명 : 한국생명공학연구원 수탁번호 : KCTC11764BP 수탁일자 : 20100913-10 -
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