세라미스트편집위원회 [ 편집운영위원장 ] 이선영 ( 한양대학교 ) [ 편집위원 ] 권순용 (UNIST) 변재철 ( 연세대학교 ) 오윤석 ( 한국세라믹기술원 ) 이관형 ( 연세대학교 ) 이규형 ( 연세대학교 ) 이승용 ( 한국과학기술연구원 ) 함문호 (GIST) 세라미스

세라미스트편집위원회 [ 편집운영위원장 ] 이선영 ( 한양대학교 ) [ 편집위원 ] 권순용 (UNIST) 변재철 ( 연세대학교 ) 오윤석 ( 한국세라믹기술원 ) 이관형 ( 연세대학교 ) 이규형 ( 연세대학교 ) 이승용 ( 한국과학기술연구원 ) 함문호 (GIST) 세라미스트 제 21 권제 3 호 2018 년 9 월 29 일인쇄 2018 년 9 월 30 일발행 발행인김득중 발행사단법인한국세라믹학회서울특별시서울시서초구방배로 76( 머리재빌딩 403 호 ) TEL : 02)584-0185, 588-5140 FAX : 02)586-4582 E-mail:ceramic@kcers.or.kr Homepage:http://www.ceramics.or.kr 인쇄한림원 ( 주 ) 서울특별시중구퇴계로 51 길 20 넥서스타워 14F TEL : 02)2273-4201 FAX : 02)2266-9083 Homepage : http://www.hanrimwon.co.kr 가격 10,000 원 / 권, 40,000 원 / 년

목차 2018 년제 21 권제 3 호 특집 : 바이오세라믹 나노입자를 활용한 In vitro 및세포이미징기반단백질분해효소활성분석법 ( 김계백, 김영필 ) 204 생체활성유리국내외현황 ( 김형준 ) 216 광합성전자추출기반바이오태양광에너지전환기술동향 ( 김용재, 홍현욱, 신혜인, 윤재형, 류원형 ) 233 나노물질을이용한질량분석기술개발동향 ( 박종민, 노주윤, 김문주, 변재철 ) 249 바이오이미징을위한업컨버전나노입자 (upconversion nanoparticles) 의합성및특성화 ( 조혜인, 이재승 ) 270 바이오세라믹실리카를이용한복합나노입자구조체의합성 ( 윤석영, 이정헌 ) 283 종이기반미세유체분석소자를활용한현장검사기술과그응용 ( 유용경, 김천중, 이준우, 이정훈 ) 293 뷰티케어용세라믹소재기술동향 ( 장정호 ) 302

특집 바이오세라믹 Ceramist Vol. 21, No. 3, pp. 270~282, 2018. https://doi.org/10.31613/ceramist.2018.21.3.01 Synthesis and Functionalization of Upconversion Nanoparticles for Bioimaging Hye In Cho, Jae-Seung Lee Department of Materials Science and Engineering, Korea University, 145 Anam-ro, Seongbuk-gu, Seoul 02841, Republic of Korea 바이오이미징을위한업컨버전나노입자 (upconversion nanoparticles) 의합성및특성화 조혜인, 이재승 고려대학교신소재공학부 (Received August 8, 2018; Accepted August 23, 2018) Abstracts The increasing importance of biomedical imaging technology has led to the development of a variety of luminescent materials, including molecular fluorophores, fluorescent proteins, and quantum dots. Owing to their inherent disadvantages, such as insufficient chemical stability and limited biocompatability, their utilization has been limited with imaging only under highly optimized and controlled conditions. Recently, a new class of luminescent nanoparticles, upconversion nanoparticles (UCNPs), have been emerging as a practically useful nanoprobe for various bioimaging applications. The detailed synthesis, functionalization, properties and in-vitro / in-vivo applications of the UCNPs are introduced and discussed in this Review. Keywords: UCNP, Bioimaging, Photoluminescence 1. 서론바이오이미징은분자영상기술이라고도불리며, 생물체내의생물학적또는화학적변화를분자수준에서영상화하여관찰하는기법이다. 바이오이미징은영상을얻는광신호의생성원리에따라여러종류로구분되며, 생 체에서생성된빛을영상으로이용하는광학영상 (optical imaging), 방사선반응에의해발생하는광자를이용하는핵의학영상 (nuclear imaging), 자기장속에놓여있는원자핵에서발생하는자기공명신호를영상화하는자기공명영상 (magnetic resonance imaging), 그리고, X 선을투사하여얻은정보를영상으로이용하는컴퓨터단 270 세라미스트

바이오이미징을위한업컨버전나노입자 (upconversion nanoparticles) 의합성및특성화 층촬영영상 (computed tomography) 등으로나눌수있다. 이중광학영상기법은크게비싼장비를필요로하지않으면서영상의민감도및분해능이상대적으로좋고, 방사선을사용하지않기때문에임상적으로활용가능성이가장높으며, 매우활발하게연구되고있다. 과거에는발광물질로서유기염료분자 (organic fluorophores), 형광단백질 (fluorescent proteins), 반도체나노결정 ( 양자점, quantum dots) 이바이오이미징에대표적으로많이사용되어왔다. 유기염료분자와형광단백질은크기가작아서생체적합성 (biocompatibility) 이우수하고, 표면개질 (surface modification) 이용이하지만, 화학적으로불안정하고짧은시간내에광표백현상 (photobleaching) 이일어난다. 따라서굉장히짧은시간동안만형광측정이가능하기때문에검출시간이제한된다는한계가있다. 1,2) 게다가이형광물질들은일반적으로자외선또는가시광선에의해여기되기때문에생물체내의조직에서자가형광 (autofluorescence) 을일으키고, DNA를손상시키거나세포를사멸시켜서민감도가좋지않을뿐만아니라, 신호대잡음비 (signal-tonoise ratio) 가낮다. 3) 이러한단점을보완하면서, 높은양자수득률 (quantum yield) 과광안정성이특징인양자점이등장하였다. 양자점은일반적으로아연 (Ⅱ), 카드뮴 (Ⅱ), 셀레나이드, 황화물의조합으로구성되어있다. 양자점합성에부가적으로사용되는수많은성분과도펀트 (dopant) 들이발견되어져있고, 표면을개질하고, 껍질을씌우는등의다양한방법들이개발되어왔다. 양자점은광양자효과 (photonic quantum effect) 로인해별도의형광체가도핑될필요가없고, 방출하는빛의색깔과세기가쉽게조절가능하기때문에개발당시부터큰화제였으며, 이후매우광범위하게연구되어왔다. 게다가양자점은팽윤 (swelling) 되거나광표백현상이일어나지않는장점역시주목할만하다. 하지만모든양자점은 500 nm 이상의광여기를필요로하기때문에바이오물질들은이빛을흡수하여내부필터효과 (inner filter effect) 를유발하고, 결국형광이충분히강하게나타나지못하는단점이있다. 또한양자점의형광강도가시간에대해일정하게유지하지않고변하는광깜빡임현상 (photoblinking) 도바이오이미징의발광체로서적절하지못한특성이라볼수있으며, 온도에의해양자점의발광이변할수있고, 비활성의껍질을입히지않으면세포독성이있어서생물학적인응용에제한이있다는큰한계가존재한다. 4) 최근업컨버전나노입자 (upconversion nanoparticles, UCNP) 는유기염료분자, 양자점등의형광체를대신할물질로각광받고있다. 대부분의 UCNP는 3 가의란타넘족이온 (Er(Ⅲ), Yb(Ⅲ), Tm(Ⅲ) 등 ) 이도핑된육 Fig. 1. 세가지의발광성나노물질비교 : 유기염료분자 ( 왼쪽 ), 양자점 ( 중간 ), 란타넘족원소가도핑된 UCNP( 오른쪽 ), 두개의스톡스발광특성을가지고있는물질 ( 유기염료분자, 양자점 ) 과는달리, UCNP 는여기에너지보다더높은광자에너지를가지는안티스톡스발광특성을가진다. 5) 제 21 권제 3 호, 2018 년 9 월 271

특집 조혜인, 이재승 각형의 NaYF 4 나노결정으로구성되어있으며, 기존의하향변환식 (downconversion) 의형광물질과는달리두개이상의광자가순차적으로빛에너지를흡수하면서여기파장보다짧은파장영역인자외선또는가시광선영역의에너지를방출한다. 2) UCNP는다양한색을띤빛을방출하는데이색들은란타넘족의도펀트에의해변하는피크파장에의존한다. UCNP의크기는양자수득률에영향을미치며, 10 ~ 100 nm 로폭넓게조정할수있다. 최근에는은나노입자의핵에 UCNP의껍질을씌워서기존의은나노입자핵이없는 UCNP에비해밝기가 30 배증가한것을관찰하였다. 6) HeLa 세포를이미징하기위해사용된이 Ag@SiO 2 @Lu 2 O 3 :Gd/Yb/Er UCNP는 3 개의층의핵-껍질-껍질구조를가진다. 뿐만아니라, 은을코팅하여발광세기가증가한경우도있다. 7) 이러한많은장점들때문에바이오이미징, 질병치료, 약물전달시스템에서활발하게사용되고있다. 무엇보다도 UCNP는형광이세포의자가형광에의해전혀방해받지않기때문에바이오이미징에매우적합한입자라할수있다. 게다가독성이없고쉽게배설되기때문에생체에이용하기적합하고, 크기가작은 UCNP는세포투과성도좋다. 양자점과마찬가지로팽윤되거나광표백현상이일어나지않으며, 안티스톡스 (anti-stokes) 이동이크고, 방출대역폭이좁아서종래의방법보다향상된선택성및감도를보여줄잠재력이있다 (Fig. 1). 그러나발광이온도에크게좌우된다는문제점이여전히존재하며, 이는차후점진적으로해결되어야할문제라할수있다. UCNP는란타넘족이온으로구성되어있는데, 란타넘족이온은광자의업컨버전 (photon upconversion) 이라고알려진과정을통해장파장의근적외선여기방사선이단파장의가시광선으로변환되는독특한발광특성을가지고있다. 업컨버전은중간파장의장수명 (long-lived) 에너지상태를통해두개이상의펌프광자를연속적으로흡수한다음, 펌프파장보다더짧은파장의방사선을방출하는비선형광학프로세스이다. 8) 업컨버전프로세스는여기상태흡착 (excited state absorption, ESA), 에너지전달상향변환 (energy transfer upconversion, ETU), 광자전자사태 (photon avalanche, PA) 이렇게 Fig. 2. 란타넘족원소가도핑된 UCNP 의대표적인공정들 : (a) 여기상태흡수 (ESA), (b) 에너지전달상향변환 (ETU), (c) 광자전자사태 (PA). 파선 / 점선, 파선, 실선의화살표는각각광자의여기, 에너지의전달, 방출과정을나타낸다. 8) 크게세가지로분류가된다. 이세가지과정모두두개 이상의광자가연속적으로에너지를흡수하면서일어난 다는공통점이있다. ESA 의경우에는 Fig. 2(a) 에서볼 수있듯이단일이온에의해펌프광자가연속적으로에 너지를흡수한다. 여기에너지가기저준위인 G 에서여 기된준안정준위인 E1 로전이될때의에너지와같으면, 포논이흡수되고, G 에서 E1 으로이동하게된다. 이과정 을기저상태흡수 (ground state absorption, GSA) 라고 한다. 그리고두번째펌프광자는 E1 에서더높은상태 인 E2 로이온을이동시켜서최종적으로 E2 에서 G 로업 컨버전방출이일어난다. ETU 는두개의광자를준안정 준위로이동시키기위해연속적인흡수를이용한다는점 에서 ESA 와비슷하다. 하지만 ETU 는여기가두인접한 이온사이의에너지전달을통해이뤄진다. 두개의이웃 하는이온은각각동일한에너지를흡수하여준안정준위 인 E1 에위치한다. 비방사에너지전달과정은하나의이 온을더높은방출준위인 E2 로갈수있게하지만다른 이온은기저준위인 G 로내려오게된다. 인접한도펀트 이온들사이의평균거리를결정하는도펀트의농도는 ETU 공정의업컨버전효율에중요한역할을한다 (Fig. 2(b)). 마지막으로 PA 를유발하는업컨버전은특정임계 값보다높은펌프강도를필요로하는펌프메커니즘이 특징이다. PA 공정은비공진 (non-resonant) 의약한 GSA 로인해 E1 에위치하는것으로시작한다. 그리고공 진 (resonant) 의 ESA 에의해위쪽에위치한가시광선방 사준위인 E2 로올라간다. 준안정준위에위치하게된후 272 세라미스트

바이오이미징을위한업컨버전나노입자 (upconversion nanoparticles) 의합성및특성화 에는여기된이온과인접한기저상태의이온사이에서교차이완에너지전달 (cross-relaxation energy transfer) 또는이온쌍완화 (ion pair relaxation) 가발생하여두이온모두중간단계준위인 E1을차지하게된다. 두이온은쉽게 E2 레벨을채워교차이완을시작하고, ESA에의해 E2의이온분포가기하급수적으로증가하여마치눈사태처럼강력한업컨버전방출이일어난다 (Fig. 2(c)). 이세가지공정의업컨버전발광효율은서로크게차이가난다. ESA는가장비효율적인업컨버전공정이다. 준안정한중간준위가펌프에너지저장소의역할을할수있는 PA는 ESA보다훨씬효율적이지만, PA 공정은펌프전력에의존하고 ESA의수많은회로반복과교차이완프로세스때문에여기에의한반응이상당히느리다 ( 최대수초이내 ) 는단점이존재한다. 이에반해, ETU는즉각적이고펌프전력에독립적이어서지난 10년간고효율의업컨버전 (ESA 보다두배크다.) 공정으로널리사용되었다. 2. 본론 2.1 UCNP의합성대부분의무기결정은상온에서업컨버전발광을일으 키지않기때문에 UCNP는결정성의호스트와호스트격자 (host lattice) 에낮은농도로도핑된란타넘족의도펀트양이온으로구성된다. 하나의도펀트이온이비방사 (non-radiative) 이동을통해에너지를얻으면, 이에너지를이용하여다른도펀트이온이더높은에너지상태로여기된후방사선을방출한다. 이때, 방사선을방출하는도펀트이온을활성제 (activator) 라고하며, 에너지를주는역할을하는도펀트이온을증감제 (sensitizer) 라고한다. 대부분의란타넘족의이온이도핑된호스트물질로부터업컨버전이일어난다고이론적으로는기대될수있지만, 효율적인업컨버전은잘택해진소수의도펀트-호스트조합에서만일어난다. 8) 란타넘족이온이도핑된 UCNP를합성하는방법에는공침법 (coprecipitation), 열분해법 (thermal decomposition), 수열 / 용매열합성법 (hydrothermal/solvothermal synthesis), 졸-겔공정방식 (sol-gel processing), 연소합성법 (combustion synthesis) 등이있다 (Table 1). 공침법은입자의크기분포가좁고매우작은크기의 UCNP를합성하는데가장편리한합성법이다. 다른합성법에비해장비의비용이싸고, 엄격한반응조건이나복잡한절차가필요없기때문에합성하는데걸리는시간소비가적다. 이기술의초기사례의대표적인경우가 Table 1. 현재까지개발된 UCNP 합성방법들 8) 방법예시 ( 호스트 ) 특징 공침법 LaF 3 NaYF 4 LuPO 4 YbPO 4 열분해법 LaF 3 NaYF 4 GdOF 수열 / 용매열합성법 LaF 3 NaYF 4 La 2 (MoO 4 ) 3 YVO 4 졸-겔공정방식 ZrO 2 TiO 2 BaTiO 3 Lu 3 Ga 5 O 12 YVO 4 연소합성법 Y 2 O 3 Gd 2 O 3 La 2 O 2 S 값비싼장비또는복잡한절차없이빠르게성장이일어난다. 후열처리가일반적으로필요하다. 비싸고공기에민감한금속전구체를이용한다. 특성이매우좋은단분산입자가합성되지만독성부산물이생성되는단점이있다. 저렴한원료가사용되고, 후열처리가필요없으며입자크기와모양을효과적으로제어할수있지만특수한반응용기가필요하다. 저렴한원료가사용되지만고온에서의소성이필요하다. 시간과에너지가절약되지만입자의응집이많이일어난다. 제 21 권제 3 호, 2018 년 9 월 273

특집 조혜인, 이재승 Fig. 3. 다양한종류의합성법으로만들어진 UCNP 의 TEM 이미지 : (a), (b) 공침법, (c), (d), (e), (f) 열분해법, (g), (h) 수열 / 용매열합성법 8) LaF 3 나노입자를만든 Van Veggel 그룹의연구이다. 이그룹이 10 nm 미만의 UCNP를수용액에재분산시키는것에성공하면서 UCNP가생체분자의발광프로브로사용할수있는계기가되었다. 공침법에의해합성된 UCNP는발광세기가약해서세기를증가시키기위해서는합성후열처리과정이필요하다. 그리고나노입자의크기를조절하기위해서킬레이트제역할을하는 EDTA 를첨가하거나, 나노입자의용해도와표면기능을향상시키기위해서 PVP를첨가해서 UCNP를합성하기도했다 (Fig. 3(a), 3(b)). 3) 열분해법은 Yan 그룹에서처음으로단순분산 (monodisperse) 되어있는 LaF 3 를합성하면서발전되었다. 이방법은좋은특성의 NaYF 4 UCNP를합성하는일반적인방법으로보편화되었다. 예를들어, Capobianco 그룹은올레산 (oleic acid) 과옥타데켄 (octadecene) 존재하에금속트리플루오로아세테이트 (trifluoroacetate) 전구체 (precursor) 의열분해를통해서 Yb/Er 또는 Yb/Tm으로동시도핑된 NaYF 4 UCNP를합성했다. 여기서비배위 (non-coordinating) 옥타데켄은높은끓는점 (315 ) 때문에 1차용매로사용되었다. 올레산은용매로서뿐만아니라 UCNP가응집되는것을방지하는부동화리간드로도사용되었다 (Fig. 3(c) ~ 3(f)). 수열 / 용매열합성법은열분해법보다입자의크기가잘제어되고, 용액내에서우수한분산능력을가지는 UCNP를합성하기위해시작된방법이다. 수열 / 용매열합성법은고체의용해도와고체간의반응속도를높이기위해서임계점이상의압력과온도하에용매를사용한다. 다른합성법에비해훨씬낮은온도에서높은결정질상을생성할수있는반면, 오토클레이브 (autoclave) 가반드시필요하고, 나노입자가성장하는과정을관찰하는것이불가능하다는단점이있다. 입자의크기와모양을조율하기위하여주로폴리올 (polyol-) 또는마이셀 (micelle-) 매개의용매열합성법이사용되었다. Zhao 연구진은올레산매개의수열합성법을이용해서 NaYF 4 UC 나노막대 (nanorods), 나노튜브 (nanotubes), 꽃무늬의나노디스크 (nanodisks) 등을합성했다. 최근에는하이브리드열분해 / 용매열합성법으로다중색의업컨버젼형광을가지는 LaF 3 :Yb/Er(Tm,Ho) 나노플레이트 (nanoplates) 도합성하였다.(Fig. 3(g), 3(h)) 졸-겔공정방식은박막코팅과유리재료로응용되는 UCNP를제조하기위한전형적인습식화학 (wetchemical) 기법이다. 졸-겔공정은금속알콕사이드 (alkoxide) 또는할라이드 (halide) 계전구체의가수분해 (hydrolysis) 및중축합 (polycondensation) 이특징이 274 세라미스트

바이오이미징을위한업컨버전나노입자 (upconversion nanoparticles) 의합성및특성화 다. UCNP의발광효율은결정성과직접적으로관련되기때문에, 이결정성을향상시키기위해서고온에서소성 (calcination) 시키는것이종종필요하다. Prasad 그룹에서는 Er 3+ 가도핑된 ZrO 2 나노입자를합성하는새로운변형된졸-겔공정을개발하였다. 이방법은나노입자를성장시킬때에멀젼에서형성된역마이셀을반응기역할로이용하는졸-에멀젼-젤 (sol-emulsion-gel) 기술이다. 졸-겔공정은또한 TiO 2 :Er, BaTiO 3 :Er, Lu 3 Ga 5 O 12 : Er, YVO 4 :Yb/Er와같이금속산화물을호스트물질인다양한 UCNP를개발하는데이용되었다. 그러나많은연구노력에도불구하고, 졸-겔공정으로만들어진 UCNP 는입자의크기제어가어렵고, 수용액에분산될때상당히많이응집이일어나서생물학적분석을위한발광체로는그리적합하지않다. 합성을완료하기위해고온에서장기간가열해야하는졸-겔공정과수열 / 용매열합성법과는대조적으로, 연소합성법은몇분내에반응생성물을얻을수있다. 일단가열이시작되면, 추가적으로열이필요없이자체유지방식 (self-sustained manner) 의연소파 (combustion wave) 형태로반응물질을통해전달되어 500 ~ 3000 범위의온도에서발열반응이일어난다. 2.2 UCNP의표면개질 UCNP의표면개질 (modification) 은나노입자의광안정성을향상시킬뿐아니라다양한생물의학적응용을위한생물학적고분자를부착할수있는플랫폼역할을할수있다. UCNP는일반적으로불완전한배위환경에서표면도펀트이온의비율이높다. 표면의도펀트이온의발광은호스트격자에의한보호가효과적이지못해소광 (quenching) 되기쉽다. 따라서도핑된나노입자주위에도핑되지않은물질의불활성결정체껍질 (shell) 을씌우면 UCNP의업컨버전효율이향상된다. 껍질은주로나노입자의호스트와같은조성을가지고있다 (Fig. 4). 이러한구조에서모든도펀트이온은나노입자의내부핵에갇혀서입자표면에에너지가전달되는것을효과적으로억제하게되고, 결과적으로업컨버전발광의효율이높아진다. Fig. 4. (a) 껍질로보호되지않은 UCNP, (b) 코어 - 쉘 (core-shell) 형태의 UCNP 에서란타넘족도펀트들의예상분포. 보호되지않은 UCNP 는표면에발광이적은도펀트이온이많이존재한다. 반면코어 - 쉘 UCNP 는모든도펀트이온이내부의핵에갇혀있어효율적인발광이일어난다. 8) 바이오이미징응용에사용되기위해서 UCNP 는발광 효율이높아야할뿐만아니라, 살아있는세포와같은생 체분자와함께공존할수있는표면습윤 (wetting) 특성 을가지고있어야한다. 대부분의고온에서합성된 UCNP 는수용성이아니기때문에친수성리간드를입자 표면에기능화 (functionalization) 할필요성이있다. Fig. 5 에는바이오이미징을위해 UCNP 가생물학적시 스템에서사용될수있도록용해성과기능성을높이기위 한표면화학반응들을나타내었다. 리간드교환 (ligand exchange) 은원래존재했던리간드가두기능을가진중 합체분자 (bifunctional polymeric molecules) 로치환 되는것을말한다. 이때고분자는친수성표면또는추가 적인생체접합능력을제공할수있다. 리간드산화 (ligand oxidation) 는 Lemieux von Rudloff 시약에 의해리간드의탄소 - 탄소이중결합이산화되어펜던트 카르복시기의작용기를형성하는것을말한다. 이방법은 C=C 결합이존재하는특정종류의리간드에만적용가능 하다. 리간드인력 (ligand attraction) 은양친매성고분 자코팅방법 (amphiphilic polymer coating) 이라고도 하며원래의리간드와고분자의탄화수소사슬사이의소 수성인력을통해나노입자표면에추가적인양친매성블 록공중합체의흡수가일어나는방법이다. 중합체의친수 성외부블록은수용액에서잘분산될수있도록해주고, 생체적합능력을가지게한다. 층상조립법 (layer by 제 21 권제 3 호, 2018 년 9 월 275

특집 조혜인, 이재승 Fig. 5. UCNP 의가용화및기능화를위한방법 8) 276 세라미스트

바이오이미징을위한업컨버전나노입자 (upconversion nanoparticles) 의합성및특성화 layer assembly) 은나노입자표면에교대로대전된폴리 이온 (polyions) 의정전기흡수를이용한다. 폴리이온의 층두께는정밀하게제어될수있다. 하지만이방법은친 수성나노입자에만적용할수있다는한계가있다. 표면 실란화 (surface silanization) 는실록산 (siloxane) 단량 체의가수분해및축합에의해나노입자의핵에실리카 (silica) 껍질을성장시키는것을말한다. 다양한작용기 를갖는실란 (silane) 은나노입자가더단단해지고습윤 및접착 (adhesion) 과같은계면의성질을가지게한다. 8) 2.3 체외 (in vitro) 세포및조직이미징 9) Zijlmans 그룹은최초로 UCNP 를이용해서고성능바 이오이미징에성공하였다 (Fig. 6). 10) 1999 년에그들은 서브미크론 (submicron) 크기의 Y 2 O 2 S:Yb/Tm 입자를 사용해서표준면역조직학기법 (standard immunohistological techniques) 으로파라핀이끼워져 있는인간의전립선조직의전립선특이항원 (prostatespecific antigen, PSA) 의분포를연구하였다. 비특이적 인자가형광신호가근적외선여기하에완전히제거되 었음을확인하였고, 높은여기에너지에연속적으로노출 되어도 UCNP 가형광특성을잃지않는다는것을보여주 었다. 따라서 UCNP 로표지된조직샘플은영구적인기 록을위해편리하게보관될수있었다. 최근에는고품질 의 UCNP 가쉽게이용할수있게되어업컨버전기반의 이미징기술이세포표본의고해상도이미징에널리사용 되고있다. 다양한세포들과함께배양된기능화가되어 있지않은 UCNP 는세포에의해안으로함입된다 (endocytosed). 합입된 UCNP 가 980 nm 에서여기되 면, 자가형광없이강한업컨버전형광이세포안에서발 Fig. 6. UCNP 를이용한조직과세포의바이오이미징. 청색과근적외선여기광에노출된후조직의모습 ( 왼쪽 ), PSA- 특정청색형광체발광과일치하는녹색자가형광이근적외선여기만을이용하여효과적으로제거된모습 ( 오른쪽 ). 9) 생하고 UCNP의고유한높은광자변환효율과깜박거리지않는 (non-blinking) 방출덕분에기존의방법으로는불가능했던단일분자이미징이가능하게되었다. Yu 그룹 11) 은업컨버전기반의시각화기술이시간이지나도페이딩효과 (fading effect) 가거의없음을보여주었고, 그에따라서장기간의세포관찰에 UCNP가매우적합하다는것을암시하였다. 최근에 Jiang 그룹에서는 UCNP가 sirna(small interference RNA) 의전달및추적에사용될수있음을보여주었다. 12) 표적전달을성공시키기위해 sirna를 anti-her2 항체를단실리카가코팅된 NaYF 4 :Yb/Er 나노입자에부착시켰다. 나노입자의세포내섭취는공초점형 (confocal) 현미경에서가시화되었고, sirna의유전자침묵효과 (gene silencing effect) 는루시페라아제분석 (luciferase assay) 에의해평가되었다. 루시페라아제분석결과는 UCNP에적합한항체를부착함으로써특정세포에표적전달을위한 sirna의효율적인매개체역할을할수있음을보여주었다. 뿐만아니라, 후속연구에서 Jiang 과 Zhang 그룹에서는은 UCNP 운반체로부터 sirna의세포내방출을실시간으로추적해냈다. 13) 이를위해 sirna에 BOBO-3 인터칼레이팅염료 (intercalating dye) 를입혔다. UCNP와 BOBO-3의측정된 LRET(luminescence resonance energy transfer) 는 UCNP로부터 sirna가얼마나방출되는지알아볼수있는지표로이용되었다. 2.4 유기체및동물의생체내 (in vivo) 바이오이미징 UCNP를생체내염색물질로이용한연구는최근들어가장큰관심을끌고있다. Lim그룹에서는등은 UCNP 를이용하여살아있는유기체를이미징하는데처음으로성공했다. 14) 그들은 50 ~ 150 nm의크기의 Y 2 O 3 :Yb/Er UCNP를살아있는선충류 Caenorhabditis elegans (C. elegans) 벌레에주입하고, 이어서이벌레의소화계를영상화하는데성공했다. 980 nm의근저외선으로여기시키면장속의나노입자의통계적분포를명확하게시각화할수있었다. 중요한점은벌레가 UCNP를주입하고나서비정상적인행동을나타내지않을정도로 UCNP가 제 21 권제 3 호, 2018 년 9 월 277

특집 조혜인, 이재승 우수한생체적합성을보였다는것이다. 최근에는 10 nm 보다작은크기의초소형 Y 2 O 3 :Yb/Er 입자를합성하여매우미세한세포내구조체들을염색할수있을것으로기대하고있다. 하지만표면소광 (surface quenching) 으로인한초소형나노입자의엄청난방출손실이존재한다는문제점이존재한다. 한편 UCNP는생체내의인식부분과결합하여종양검출및약물전달 (drug delivery) 을위한표적이미징에도사용되고있다. Xiong 그룹에서는 UCNP에엽산과폴리펩티드인 RGD를연결시킴으로써흉선이없는누드마우스 (athymic nude mice) 에서 HeLa와 U87MG 종양을검출할수있었다. 중요한것은생체내에서업컨버전발광신호의관심영역 (region of interest, ROI) 분석을통하여업컨버전바이오이미징은종양과배경사이에높은신호대잡음비를달성한다는것을보여준점이다 (Fig. 7). 이는일반적으로단일광자또는두개의광자를이용한형광바이오이미징에서는얻을수없는결과이며, UCNP의높은활용도를보여준다. 이러한특성을기반으로하여최근 UCNP를생체내에서이식된세포의추적에도사용하는연구가활발히진행되고있다. 2.5 광학단층촬영 15) 형광확산광학단층촬영 (fluorescence diffuse optical tomography, FDOT) 은대상을통해산란된빛으로만든이미지를재구성하여형광체가지속되는대상의디지털체적 (volumetric) 모델을생성하는컴퓨터단층촬영의한형태이다. 전형적으로고도로산란하는조직배지는좁은콜리메이트빔 (collimated beam) 에의해빛을받아배지를통해전파되는지속된표적으로부터의발광은조직표면에부착된일련의검출기에의해수집된다. 타겟의형상은주변환경으로부터타겟을식별하는기록된광학데이터에기초하여재구성될수있다. FDOT 는형광표적의 3차원심부조직바이오이미징을위한작고, 빠르고매우민감한기술이다. 비외과적인 FDOT 는작은동물의종축 (longitudinal) 연구에활발하게이용되고있으며, 암종양, 프로테아제 (proteases), 알츠하이머병및다른약물효과의발달을가져오는데큰역할을하였다. 일반적으로 FDOT에는헤모글로빈, 콜라겐, 엘라스틴 Fig. 7. RGD- 접합 NaYF4:Yb/Er/Tm 입자를흉선이없는누드마우스의정맥내에주사한뒤 (a) 1 시간, (b) 4 시간, (c) 24 시간이지난뒤의 U87MG 종양 ( 왼쪽뒷다리, 짧은화살표로표시 ) 과 MCF-7 종양 ( 오른쪽뒷다리, 긴화살표로표시 ) 을바이오이미징한결과 9) Fig. 8. FDOT 에서 NaYF 4 :Yb 3+ /Tm 3+ UCNP( 왼쪽열 ) 와유기염료분자 ( 오른쪽열 ) 의비교. (a, b) 재구성된형광체의 3 차원모습. 박스는횡단면으로자른것을나타낸다. (a) UCNP 를사용했더니부드럽고일관된모습을보인다. (b) Rhodamine 6G 를이용한이미지는형광표적의두끝단에서심하게일그러진모습이보인다. (c, d) 2 차원으로표현한 (c) 정사각형모양으로전력에의존하는조영제로서의 UCNP, (d) 선형전력의존의 DY-781 형광체 FDOT 재구성플롯, 및해당강도의선형곡선 15) 278 세라미스트

바이오이미징을위한업컨버전나노입자 (upconversion nanoparticles) 의합성및특성화 과같은내인성 (endogenous) 형광체가조영제로이용된 다. 유기염료분자또는양자점과같은외인성 (exogenous) 스톡스이동이일어난조영제의이용은검출강도 를향상시킬수있다. 그러나조영제의종류와관계없이, 자가형광및신호노이즈는여전히 FDOT 의신호대비 (contrast) 를떨어뜨리는문젯거리이다. 잡음의대부분 은저잡음장비를사용하여억제할수있지만조직자체 의자가형광은전통적인스톡스이동형광체를이용해 측정하는것에방해가된다. UCNP 의안티스톡스광학특성을이용하면조직의자 가형광의영향을완전히제거할수있다. 따라서 UCNP 는 FDOT 에서기존에이용되어온형광물질들의대안으 로제시되었다. Xu 그룹은최근에젤라틴기반의가짜조 직을사용하여통제된환경에서 DOT 스캐닝을위한 NaYF 4 :Yb 3+ /Tm 3+ UCNP 의사용을시연하는데성공했 다. 16) UCNP 에서얻은광학데이터는재구성후균일하 고한정된인광분포를보였다 (Fig. 8a). 이와는대조적 으로, 유기염료분자 (Rhodamine 6G) 의사용으로얻어 진광학데이터는형광표적의두말단에서심하게일그 러진형상이나타났다 (Fig. 8b). 안티스톡스이동에의한 방출외에도업컨버전방출의비선형전력의존도가결과 이미지의품질과대비를향상시키는데추가로활용될수 있음이입증되었다. FDOT 재구성영상은합성된 NaYF 4 :Yb 3+ /Tm 3+ @NaYF 4 UCNP 를조영제로사용함 으로써품질이훨씬향상되었으며기존선형형광체를사 용하여얻은 FDT 이미지의현재공간해상도한계를극 복하였다 (Fig. 8c, d). FDOT 바이오이미징을위한 UCNP 은조영제로서여러가지장점을보이고있으며, 이 후생체내모델또는인간조직모델을위한 UCNP 의적 용이적극적으로검토되고있는중이다. 2.6 다중모드바이오이미징 (multimodal bioimaging) 17) MRI(magnetic resonance imaging), CT(X-ray computed tomography), PET(positron emission tomography), 광학이미징 (optical imaging) 등의다양 한분자이미징기술은공간분해능 (spatial resolutions), 침투깊이 (penetration depths) 및적용분야와관련하여고유한장단점을가지고있다. MRI는우수한공간분해능과높은침투깊이를제공하지만, 불충분한감도와낮은평면해상도가문제이고, CT 영상은연조직 (softtissue) 대비가좋지않고, 낮은평면해상도및제한된민감도를갖지만탁월한해부학적정보를제공한다. PET 이미징은높은감도로시각화방법을제공하지만낮은공간 / 평면해상도의단점이있다. 가장높은감도와탁월한평면해상도를제공하는광학이미징은세포 / 분자수준의정보를제공할수있는유일한기술이지만침투깊이가낮다. 따라서임상진단및예후를위한해부학적구조및생리기능에대한보다보완적이고정확한정보를얻기위해하나의나노입자에 2 개이상의영상기술의장점을통합하여다중모드바이오이미징을수행하는것이가장바람직한방법이다. 다중모드바이오이미징에는 UCL (upconversion luminescence)/mri, UCL/MRI/ CT, UCL/MRI/PET, UCL/CT, MRI/CT 등이있다. 2.6.1 UCL/MRI 이미징 MRI는자기장에있는양성자스핀의완화 (relaxation) 와함께핵자기공명에기반한무해한의료진단기술이다. 따라서 MRI 조영제는자성재료여야한다. MRI 조영제는조영제의단위농도당스핀-격자및스핀-스핀완화속도 (1/T 1 및 1/T 2 ) 의상자성성분을각각나타낼수있는종방향및횡방향의완화도 (r 1 및 r 2 ) 를통해평가될수있다. T 2 조영제 ( 산화철 ) 과비교했을때 T 1 조영제는조영제의농도에의해신호를증폭시킬수있는장점이있어높은공간해상도로해부학영상을극대화할수있다. MRI와 UCL 이미징이하나로통합되면높은공간분해능과감도의장점을동시에가지게되어결과적으로바이오이미징의품질을향상시킨다. 상자성 (paramagnetic) Gd 3+ 이온은 7개의 4f 비공유전자쌍의존재로인해널리사용되는 T1 MRI 조영제이다. 하나의 UCNP에 Gd 3+ 와 Ln 3+ (Ln 3+ = Er 3+, Ho 3+, Tm 3+ ) 이온을첨가함으로써 UCL과 MRI의통합이가능하게되었다. 또한 UCNP를사용함으로써 Gd 3+ -킬레이트조영제에서 제 21 권제 3 호, 2018 년 9 월 279

특집 조혜인, 이재승 Fig. 9. NaGdF 4 :Yb,Er,Tm-AA 입자를 1.5 mg/kg 만큼정맥내에주사하기전과후 40 분이지난뒤의 (L) 간, (S) 비장의이미지. (A) 전신 (B, C) 횡단면이미지 17) Gd 3+ 이온의침출 (leaching) 을극복할수있다. NaGdF 4, Gd 2 O 3, GdF 3, BaGdF 5 UCNP 와같은 Gd 기 반호스트는 T 1 MRI 조영제로사용되었다. 이러한 Gd 기 반호스트가 Er 3+, Ho 3+, Tm 3+ 등으로도핑되었을때이 중모드 UCL/MRI 조영제가형성되었다. Li 연구진은 NaGdF 4 :Yb,Er,Tm-PAA 입자가 5.6 s -1 mm -1 의높은 이완성 (relaxivity) 을보이고, 동시에 NIR-to-vis 과 NIR-to-NIR UCL 을쥐를대상으로하여이미징하는 것에성공했다. 18) Fig. 9 의전신에칠해져있는색은각기 다른기관 ( 특히간과비장 ) 에서선명한대비차이를보였 고, 이를통해 UCNP 의축적이확인되었다. 2.7 치료응용 (therapeutic application) 17) 현대의학의발전에도불구하고, 여전히매년수백만 명의사망자가발생하는암질환은여전히심각한질병이 며, 따라서암치료법에대한연구는전세계적으로중요 한문제로서간주되고있다. 바이러스의높은돌연변이 속도와유전적이질성으로인해암치료법에대한연구는여전히계속되고있으며, 사실과거에비해오히려더복잡해지고있는게현실이다. 이와같은암치료를위해많은새로운물질과메커니즘이개발되고있으며, 본글에서소개하고있는 UCNP는종양의위치와크기를확인하는훌륭한바이오이미징도구로서활용되고있다. 대개 UCNP가치료제와결합된다기능의프로브는영상유도및종양표적치료를위해정교하게디자인되어합성된다. 이러한다기능프로브는탁월한이미징기능, 종양타겟팅능력및치료효율을제공하여다기능진단시스템및치료시스템개발에이용된다. 현재까지광역동치료 (photodynamic therapy, PDT), 광열치료 (photothermal therapy, PTT) 등에 UCNP가적용되었으며, 그간단한치료메커니즘이 Fig. 10에서설명되어있다. 광역동치료는광감성분자이며빛에민감한약물인광증감제를반드시포함한다. 적절한파장의빛에노출되면감광제가여기되어주변산소분자에에너지를전달하는데, 이때세포독성이있고반응성산소인일중항산소 ( 1 O 2 ) 가생성되어암세포를산화시키고죽일수있다. 실제로대부분의감광제는가시광선에의해활성화된다. 따라서살아있는조직에서 PDT의효능은가시광선의세포내침투깊이가낮아서제한적이었다. 이를고려하여 UCNP에서감광제로의공명에너지전달을이용하여광역동치료로깊숙한곳에있는암을치료할수있도록광증감제 (photosensitizer) 와 UCNP의조합이개발됐다. 이결합된시스템에서감광제의최대흡수파장범위는 UCNP의방출가시광선의스펙트럼과겹쳐야한다. 따라서결합된시스템이 980 nm 근적외선레이저에의해여기될때, UCNP는근적외선을가시광선으로변환할것이다. 광열치료에서광흡수기 (photoabsorber) 는광조사 (optical irradiation) 를흡수하고열로변형시키는데사용된다. 열에의해상승된온도는세포내단백질의변성또는조직의막의파괴를유도하여암세포의열적사멸을유도한다. 화학요법또는수술과비교하여광열치료는덜침습적이어서환자의삶의질이크게향상될수있기 280 세라미스트

바이오이미징을위한업컨버전나노입자 (upconversion nanoparticles) 의합성및특성화 Fig. 10. 치료응용의대표적인예시인광역동치료 (PDT) 와광열치료 (PTT) 의메커니즘 17) 광활성화요법에폭넓게사용되고있다. 이와같이많은장점들이있음에도불구하고, 임상및현장진료설정에서실제응용가능성을발휘하기위해서는아직많은해결해야할사항들이남아있다. 예를들면, 높은콜로이드안정성과맞춤식광학특성을나타내는 UCNP의합성및표면개질을위한일반화된기법이아직확립되지않은상태이다. 다양한기판상에서 UCNP를패터닝 (patterning) 하는전략의개발에중점을두어다중화된고감도검출및저비용, 고생산량 (high-throughput) 플랫폼에서소형전자장치와의통합을가능하게하기위해앞으로도상당한노력이필요할것으로예상한다. 8) 때문에이를이용한암치료에대한관심이높아졌다. 이전에는금과은나노막대 (nanorods), 나노케이지 (nanocages) 및나노껍질 (nanoshells) 과같은귀금속물질이근적외선영역에서강한광흡수로인해광열치료제로사용되었다. 최근 Liu 연구진은 UCL/MRI 이미징가이드및자기표적광열암치료를위한다기능의 NaYF 4 :Yb,Er@ Fe 3 O 4 @Au-PEG 나노입자를고안했다. 자기적으로표적화된광열치료효과를확인하기위해서종양이있는쥐에게정맥에 NaYF 4 :Yb, Er@Fe 3 O 4 @Au-PEG 나노입자를주사하였다. UCL 이미징은자석에붙어있던종양에대해몇배증가된신호를보냈고, 808 nm NIR 레이저를받으면종양의표면온도는약 50 로증가했다. 자기적으로표적화된광열치료가끝나면모든종양이사라져 100 % 치료효능을나타냈다. 3. 결론 UCNP는분자의광손상없이매우민감한분자검출및상당한깊이의침투로세포의특징의시각화를가능하게하는새로운물질로크게주목받고있다. 광깜빡임현상과광표백현상, 자가형광이없을뿐만아니라, 독성이적고살아있는세포에서광손상이적어서 15) 유용한생물표지발광바이오라벨 (luminescent biolabels) 로의역할뿐만아니라의료진단및바이오이미징, 바이오센싱, 참고문헌 1. 송요한, 이강택, 업컨버팅나노입자 (upconverting nanoparticle, UCNP) 를이용한바이오이미징 (in Korean), 화학세계, 56 [2] 20-25 (2016). 2. 조은정, 김민곤, 업컨버팅나노입자 (upconverting nanoparticle, UCNP) 의합성및바이오센싱응용 (in Korean), 화학세계, 56 [2] 13-19 (2016). 3. Y. M. Yang, Upconversion nanophosphors for use in bioimaging, therapy, drug delivery and bioassays, Microchimica Acta, 181 [3-4] 263-94 (2014). 4. O. S. Wolfbeis, An overview of nanoparticles commonly used in fluorescent bioimaging, Chemical Society Reviews, 44 [14] 4743-68 (2015). 5. B. Zhou, B. Y. Shi, D. Y. Jin, and X. G. Liu, Controlling upconversion nanocrystals for emerging applications, Nat Nanotechnol, 10 [11] 924-36 (2015). 6. D. G. Yin, C. C. Wang, J. Ouyang, X. Y. Zhang, Z. Jiao, Y. Feng, K. L. Song, B. Liu, X. Z. Cao, L. Zhang, Y. L. Han, and M. H. Wu, Synthesis of a Novel Core-Shell Nanocomposite Ag@SiO 2 @ Lu 2 O 3 :Gd/Yb/Er for Large Enhancing Upconversion Luminescence and Bioimaging, Acs Appl Mater Inter, 6 [21] 18480-88 (2014). 7. D. W. Lu, S. K. Cho, S. Ahn, L. Brun, C. J. Summers, and W. Park, Plasmon Enhancement Mechanism for the Upconversion Processes in NaYF4: Yb 3+,Er 3+ Nanoparticles: Maxwell versus Forster, Acs Nano, 8 [8] 7780-92 (2014). 8. F. Wang and X. G. Liu, Recent advances in the chemistry of lanthanide-doped upconversion nanocrystals, Chemical Society Reviews, 38 [4] 976- 제 21 권제 3 호, 2018 년 9 월 281

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