(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 10-2010-0114713 (43) 공개일자 2010년10월26일 (51) Int. Cl. A23L 1/212 (2006.01) A23P 1/06 (2006.01) A61K 36/17 (2006.01) A61P 17/18 (2006.01) (21) 출원번호 10-2009-0033227 (22) 출원일자 2009 년 04 월 16 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 4 항 2009 년 04 월 16 일 (71) 출원인 강원대학교산학협력단 강원춘천시효자동 192-1 강원대학로 42 (72) 발명자 이현용 강원도춘천시동면만천 2 리 406 번지 정향숙 강원도춘천시후평 3 동석사 2 지구아파트 207 동 304 호 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 우광제 (54) 마황의피부노화억제활성을위한식용소재나노입자화방법및그생산물 (57) 요약 본발명은마황의피부노화억제활성을위한식용소재나노입자화방법및그생산물에관한것으로서, 이는기본적으로레시틴으로마황의저온열수추출물을나노입자화하는것을특징으로한다. 본발명에따르면마황의지용성레시틴나노입자화를통해, 마황특유의냄새에대한거부감없이저온추출로용출된유용생리활성물질이효과적인방법으로피부에전달될수있어, 미백활성증진을위한향장품으로서의마황의가치가크게증진된다. - 1 -
(72) 발명자 한재건 강원도춘천시석사동퇴계주공아파트 306 동 1003 호 하지혜 강원도춘천시석사동퇴계주공아파트 402 동 1505 호 오성호 강원도강릉시포남동진달래아파트다동 302 호 정명훈 강원도춘천시후평동대우아파트 3 동 203 호 김승섭 강원도원주시명륜 2 동명륜 2 차아파트 103 동 403 호 김영 강원도춘천시효자 2 동강원대학교제 2 기숙사국지원 113 호 권민철 강원도춘천시석사동 704-8 번지 곽형근 강원도강릉시교 1 동 1898-14 황보영 강원도원주시일산동우보삼성아파트 3 동 108 호 나천수 경기도수원시팔달구화서동 703 번지대우아파트 124 동 801 호 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 20070401034013 부처명 농촌진흥청 연구관리전문기관 연구사업명 바이오그린21 연구과제명 면역능과항노화능증진을위한복합가공공정및나노소재화기술개발 기여율 주관기관 강원대학교 연구기간 2009년 01월 ~2009년 12월 - 2 -
특허청구의범위청구항 1 레시틴으로마황의저온열수추출물을나노입자화하는것을특징으로하는, 마황의피부노화억제활성을위한식용소재나노입자화방법. 청구항 2 (1) 마황을분쇄하는단계 ; (2) 분쇄된마황을 10배수의증류수를용매로하여 60 에서 24시간동안저온열수추출하는단계 ; (3) 위열수추출물을감압여과장치로여과 농축한다음, 동결건조를하여파우더로만드는단계 ; (4) 위파우더를 1mg/ml의농도로증류수에녹이는단계 ; (5) 전술한단계들과는별도로용기에서레시틴을클로로포름과혼합하여녹인후감압기를이용해클로로포름은날리고레시틴의멀티레이어 (multilayer) 를형성하는단계 ; 및 (6) 완전히건조되어레이어가형성된 (5) 의용기에 (4) 의액상마황추출시료를넣고, 초음파분산기로균일화시켜수용성나노입자를제조하는단계 ; 로이루어지는것을특징으로하는, 마황의피부노화억제활성을위한식용소재나노입자화방법. 청구항 3 레시틴으로마황의저온열수추출물을나노입자화하여제조되는것을특징으로하는, 마황의피부노화억제활성을위한식용소재나노입자. 청구항 4 제1항또는제2항의방법으로제조되는것을특징으로하는, 마황의피부노화억제활성을위한식용소재나노입자. 명세서 발명의상세한설명 [0001] [0002] 기술분야본발명은마황 [ 麻黃, Ephedra sinica] 의피부노화억제활성을위한식용소재나노입자화방법및그생산물에관한것으로, 더욱상세하게는식용소재인레시틴 (lecithin) 제재를이용하여마황을나노입자화함으로써마황의화장품으로서의기능을재발견하고그활성을극대화한기술에관한것이다. 본발명은호흡기질환의치료및면역증진효과가뛰어나한방에서한약재로널리쓰이고있지만특유의향이진하여향장품및의용소재로서의가치를인정받지못하고있는마황소재의지용성나노입자화를통해, 체내침투율을높여미백활성을올리는동시에향장품으로서단점을극복하도록함으로써마황의유용성을극대화하고자한다. 본발명은마황의생리활성을근거로한생물소재탐색의최초시도로서가치가있다. [0003] [0004] 배경기술최근대기의오염이심각해짐에따라오존층의파괴가가속화되고있어자외선으로부터깨끗한피부를지키기위한노력도많아지고있다. 이런경향에따라미백효과가있는향장품에대한인기가날로높아지고있다. 특히, 유해한화학성분을대체할수있는천연물이나한약재를이용한기능성화장품이주목받는상황으로서기능성성분과항산화물질이함유된열매나식물을개발하는연구가활발히진행되고있다. 최근연구에의하 - 3 -
면과실은암이나심장마비와같은다양한질병의위험을감소시키는데크게기여한다고보고되고있다. [0005] [0006] [0007] [0008] [0009] [0010] [0011] 본발명에서소재로삼은마황 (Ephedra sinica) 은중국북부, 몽골등지에주로분포하고그길이가 30 70cm로기존연구에서발한, 해열, 항염증에효과가있다고보고되었으며, 실제로한약재로서천식치료및열병을다스리는데쓰이고있다. 또한마황의알카로이드성분인 Ephedrine과 Pseudoephedrine, ephedroxane, norephedrine 등의체액성면역과관련된약리작용이연구보고되었다. 이외에도마황의알러지성피부염억제효과에대해보고된바있다. 그런데마황을기존의열수추출방법으로추출할경우, 낮은추출효율과이로인한큰에너지소비, 열로인한유용성분의파괴, 단백질의변이, 성분의손실등의단점이발견된다. 이에본발명에서는저온열수추출법을도입하여마황의유용생리활성물질용출증진, 물성유지, 기능성향상을이루고자한다. 마황의가공에서열처리는소화성을향상시키는데, 그중에서도화학변화가많이일어나는고온처리에비하여저온처리는화학적으로큰변화를일으키지않는장점이있다. 따라서저온추출은마황내주요성분을크게변성시키지않아신선감을유지시킬수있을뿐아니라기존의고온처리에의한마황의조직감및풍미저하등을극복할수있는대안으로생각된다. 한편, 사람의피부는체표를덮은조직으로서물리적 화학적으로외계로부터신체를보호하는동시에전신의대사 ( 代謝 ) 에필요한생화학적기능을영위하는, 생명유지에불가결한기관이다. 피부에서의효소활성은간장에서의효소활성과비교했을때 30배이상적게나타난다. 효소의활성이적다는것은유용생리활성물질을체내로통과시키기용이하다는것을의미한다. 진피의상부에는혈관과림프관이존재하고각질층과표피층이있다. 피부의진피는 3 5mm의결합조직인매트릭스와콜라겐섬유로구성되어있기때문에진피상부의혈관을통해체내순환계로유용물질의대사를이행시키는것이가장이상적이다. 다른한편, 마황은호흡기질환의치료및면역증진효과가뛰어나한방에서한약재로널리쓰이고있지만특유의향이진하여향장품및의용소재로서의가치를인정받지못하고있다. 본발명의발명자들은진피상부에서마황추출물의유용물질이쉽게통과하도록하는동시에, 그특유의향에의해향장품으로서단점을가진마황의소재상문제점을극복하기위해, 레시틴제재를이용하여소수성표면을가지는리포솜형태의나노입자를제조하는방안을안출하였다. 나노기술은나노미터 (10-9, 10억분의 1m) 수준을제어하는기술로서, 최근질병치료의새로운수단으로각광받고있다. 현재기술개발이진행되고있는나노의약품관련기술로는나노약물전달체, 의료용나노입자, 나노진단시약, 나노바이오물질등이있다. 본발명에서는나노약물전달체관련기술의일부를한약재인마황에접목시켜기존추출물의세포전달체계수준에서의장벽을극복하며, 기능성소재로서의마황추출물을재평가하고자한다. 본발명에이용된레시틴은세포구조와대사작용에중요한생체적합성인지질의일종으로, 사료, 습윤제, 유화제, 구운제품과즉석식품, 초콜릿, 화장품, 비누, 염료, 살충제, 페인트, 플라스틱에사용된다. 순수한레시틴은희고부드러우며, 공기중상온에방치하면검어지는물성이있다. 본발명에서사용한레시틴은내외용재겸용으로널리사용되므로피부노화억제활성을위한향장품의개발에유리하게작용할수있다. 발명의내용 [0012] [0013] [0014] 해결하고자하는과제앞에서기재한바에의하여이미어느정도암시되었지만, 본발명의목적은종래행해져오던고온추출법에따른문제점을극복하여마황의유용생리활성물질용출증진, 물성유지, 기능성향상을꾀하는데있다. 본발명은또한마황이가진특유의향을제거하여향장품으로서의가치를극대화하는데그목적이있다. 아울러피부에서흡수가용이하도록하여한약재인마황성분의효율적인체내전달을제고하는데그목적이있다. [0015] 본발명의발명자들은마황에저온열수추출공정을적용하여한약재의유용성분용출을유도하고, 식용소재 - 4 -
인레시틴나노입자제조공정을적용한다음, 피부미백과관련된생리활성측정을통해상기공정의특정조 건에대한효과적인기능을확인하였다. [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] 과제해결수단상기한목적을달성하기위한본발명은, 레시틴으로마황의저온열수추출물을나노입자화하는것을특징으로한다. 보다구체적으로본발명에따른마황의피부노화억제활성을위한식용소재나노입자화방법은, (1) 마황을분쇄하는단계 ; (2) 분쇄된마황을 10배수의증류수를용매로하여 60 에서 24시간동안저온열수추출하는단계 ; (3) 위열수추출물을감압여과장치로여과 농축한다음, 동결건조를하여파우더로만드는단계 ; (4) 위파우더를 1mg/ml의농도로증류수에녹이는단계 ; (5) 전술한단계들과는별도로용기에서레시틴을클로로포름과혼합하여녹인후감압기를이용해클로로포름은날리고레시틴의멀티레이어 (multilayer) 를형성하는단계 ; 및 (6) 완전히건조되어레이어가형성된 (5) 의용기에 (4) 의액상마황추출시료를넣고, 초음파분산기로균일화시켜수용성나노입자를제조하는단계로이루어지는것을특징으로한다. 본발명은또한레시틴으로마황의저온열수추출물을나노입자화하여제조되는마황의피부노화억제활성을위한식용소재나노입자인것을특징으로한다. 또한전술한방법에따라제조되는, 마황의피부노화억제활성을위한식용소재나노입자인것을특징으로한다. [0026] [0027] [0028] 본발명은최근한약재의효율적인체내전달에대한관심이높아짐에따라한방소재에대한연구범위가넓어지고있으며피부미백과천연화장품에대한관심이증폭되는상황에서, 마황의유용성분의효과적인체내전달을위한저온추출법에의한나노입자화를접목시킨것을특징으로한다. 저온추출법을통해지금까지고온열수추출방법으로인해독성이증가하거나생리활성물질의변성이일어나는현상을막을수있으며, 나노입자화를통해마황의유용성분의효과적인체내전달이라는성과외에, 마황이가진특유의향이완화될수있어향장품으로서의가치를대폭높일수있다. 그효과에도불구하고특유의향으로인해대중으로부터한방소재향장품으로의사용에거부감을낳았던단점을개선할수있는것이다. 더구체적으로, 본발명에서는마황추출물을식용소재인레시틴을이용하여소수성표면을가지는리포솜형태로서 100 200nm 크기의미세한나노입자로제조함으로써표피투과가용이하게하고 200nm 크기의세포간극에의한피부투과장벽을극복할수있게한다. 나노입자화한마황의효과적인세포투과기능은적은농도의추출물로도높은활성을기대할수있으므로비용과시간면에서경제적이다. 마황수용성추출물의지용성나노입자는투과장벽이상대적으로큰인간의피부에효과적으로침투하여유용물질의효과를극대화하게된다. 물질은나노미터 (10-9 m) 스케일에서새로운물리화학적특성을나타내게되고, 이러한특성들을잘활용하여기존에구현하지못했던많은기술적성과들을얻을수있다. 나노입자는인체에쉽게침투할수있기때문에순환을통하여각기다른신체부위로전달되며, 본발명의공정에따라발생하는, 소수성표면을갖는리포솜은분자성약물의운반을용이하게하여세포에대한친화성을증가시킨다. 일반적으로수용성성분은용매에이온상태로존재하여그활용성이높을것으로기대되지만, 그럼에도인체피부의내피세포는인지질로구성되어있어수용성성분이침투하기어려운구조로되어있다. 따라서수용성물질의세포내침투효율향상을위해서활성물질을유상이포집한리포솜형태로제조하고이를생체에적용시켜높은침투력및생체활용성을나타내고자하였다. 효과 - 5 -
[0029] [0030] 본발명은천연한약재인마황의효율적인추출및피부투과장벽의극복등을고려해고안된것으로, 본발명에따르면 60 의저온추출공정을통해마황으로부터활성물질의파괴없이목적하는활성물질을얻을수있다. 또한마황의지용성레시틴나노입자화를통해, 마황특유의냄새에대한거부감없이저온추출로용출된유용생리활성물질이효과적인방법으로피부에전달될수있어, 미백활성증진을위한향장품으로서의마황의가치가크게증진된다. [0031] [0032] [0033] [0034] 발명의실시를위한구체적인내용본발명은견고한세포벽을가지고있는마황을저온에서추출하기때문에온도에의한성분의변화가적어기능성식품및향장소재의추출공정에활용가치가높다. 또한마황추출물을소수성표면을가지는리포솜형태로서, 식용소재인레시틴을이용하여 100 200nm 크기의미세한나노입자로제조함으로써표피투과가용이하게하고 200nm 크기의세포간극에의한피부투과장벽을극복할수있게한다. 본발명은저온추출공정에의한마황을생체적합성소재인레시틴으로나노입자화함으로써, 추출물자체의온도상승을수반하지않고신속히유용물질의생성을유도하고, 나노입자제조공정후에도피부내에서물리적, 화학적및영양학적특성을유지할수있는장점을가진다. 특히, 마황특유의한약재가가지는진한향으로인해한방향장품으로의응용사례가적었던것을고려해레시틴제재로나노입자화함으로서은은한향을가지고활성은증진되는효과를가진다. 국내에서는나노관련연구는많이진행되고있는반면마황의유용성분을이용하여나노바이오기술에의한나노입자화하는기술에대한연구및이를이용한제품개발에대한내용은보고된바없으며이러한기술은본연구진이국내에서유일하게보유하고있는기술이다. 발명자들은피부미백효과실험에서저온추출공정을통해얻은마황추출물의나노입자화가종래의일반적인추출공정을통한마황추출물과비교하여나타내는차이를알아보았다. 이하본발명을실시예와함께상세히설명한다. [0035] [0036] [0037] 1. 시료전처리공정추출하고자하는국내산마황을적당한크기로분쇄하였다. 마황시료는수직환류냉각기에부착된추출플라스크에, 10배중량의증류수에침지시켜 60 에서 24시간열수추출을하였다. 얻어진추출물을감압여과장치 (Rotary Vacuum Evaporator N-N series, EYELA) 로여과 농축한다음, 동결건조를하여파우더를얻었다. [0038] [0039] [0040] 2. 나노입자화공정나노입자화한마황의생체활용성증진효과의탐색을해보기위해, 미백효과가기대되는마황추출물과식용지용성레시틴제재로나노파티클 (nanoparticle) 을제조하였다. 이를위해 60 증류수추출시료 50mg을 1mg/ml의농도로증류수에녹였다. 그리고둥근바닥플라스크에레시틴과유기용매인클로로포름을소량넣어녹인후감압기를사용해 multilayer를형성시켰다. 완전히건조되어클로로포름이제거되도록한다음, layer가형성된둥근바닥플라스크에액상의마황추출시료를넣고, 초음파분산기를이용하여 25 에서 2시간동안 Amp 38%, 펄스 7:5의조건으로균일화시켜수용성나노입자를제조하였다. 그리고이를, 전하차에의해나노입자의변성이일어나지않도록유리로된병에보관하였다. [0041] [0042] 3. 나노입자의관찰발명자들은다른식용소재인젤라틴과키토산으로포집한마황나노입자의구조를본발명에서사용한레시틴의구조와비교하였다. 젤라틴나노입자는유기용매인클로로포름대신 45 의증류수를소량넣어녹인후감압기를사용해 multilayer를형성시켰고, 키토산나노입자는 1% 아세트산을소량넣어녹인후감압기를사용해 - 6 -
multilayer 를형성시켰다. 이하의나노입자제조과정은레시틴나노입자제조공정과동일하다. [0043] [0044] 나노입자의구조는대상시료에전자선을쏘여전자선이통과해서나온전자를확대하여관찰하는원리인투과전자현미경을이용하여관찰하였다. 관찰결과, 레시틴으로포집한마황나노입자가다른소재로코팅한나노입자에비해안정적으로분포함을확인하였다. 같은배율의 TEM 사진 1에서레시틴마황나노입자는젤라틴, 키토산나노입자와비교했을때더많은양의추출물을포집하며, 나노입자특유의동그란모양이더고르게분포한다. 또한 DLS(dynamic light scattering) 로생성된각각의나노입자의크기를측정한결과표 1과같은데이터를얻었다 ( 표 1). 레시틴으로제조한마황나노입자의분포에대해서도데이터를얻었다 ( 그래프 1). 나노입자의크기와분포의분석을통해식용레시틴소재로나노입자화했을때피부세포투과에가장최적의조건이될수있는 100 200nm 사이의나노입자가생성되었음을알수있다. [0045] [0046] - 7 -
[0047] [0048] 그래프 1. 레시틴으로제조한마황나노입자의분포 (DLS) [0049] [0050] [0051] 4. 생리활성효과의검증본발명으로인한추출물의수율증진을통한생리활성효과를알아보기위한일환으로, 위에서얻은마황추출물의나노입자를이용하여추출물의세포독성실험을실시하였다. 본실험에서는 1mg / ml의시료첨가를통해인간신장세포인 HEK293 (Kidney nomal, Human, ATCC, USA) 의정상세포독성을알아보았다. 세포독성측정을위해서 SRB assay를이용하였다. 마황레시틴나노시료의 HEK293 cell 정상세포독성을나노입자화하지않은마황열수추출물과비교함으로써, 세포독성을확인하였다 ( 그래프 2). 그결과레시틴으로포집한마황나노입자와열수추출에의한마황추출물의정상세포독성이비슷한수치로기록되었다. 생체에무해한유상의소재인레시틴으로나노입자를리포솜화하였기때문에전체적인세포독성이낮게나타난것으로사료된다. 마황의레시틴나노입자화가기존의열수추출방법에비해세포독성을근소하게증가시키지만기존의열수추출물의세포독성과오차범위이내의차이를보이므로세포에유해하지않으며생체에효과적으로작용할수있을것으로사료된다. - 8 -
[0052] [0053] 그래프 2. 레시틴으로포집한마황과일반열수추출물의정상세포독성비교 [0054] [0055] [0056] 5. 멜라닌생성에미치는영향검증다음은마황을 60 저온에서 24시간동안열수추출한보통의마황열수추출물과이를레시틴으로포집한나노추출물로분류하여, Clone M-3 세포주 melanin 생성에미치는영향을알아보기위해서각각 12.5, 25, 50 μg / ml의농도로샘플처리하여멜라닌생성량을측정하였다 ( 그래프 3). Melasolv는대조군으로서미백제로알려진합성물질이며처리시 56% 의활성을보인다. 마황은레시틴으로나노입자화한조건의추출물이 60% 가넘는멜라닌생성저해율을보인다. 미백제로사용되는 Melasolv와비교했을때 60% 가넘는높은비율로미백작용을하는레시틴소재나노입자는보통열수추출로용출되어나오지못했던유용생리활성물질이나노제조공정을통해용출되어나온것으로사료된다. [0057] - 9 -
[0058] 그래프 3. 추출공정에따른멜라닌생성저해율 (%) [0059] [0060] [0061] 위와같이발명자들은본발명을통해식용소재인유상의레시틴을사용한마황추출물의나노입자화는피부노화억제활성을지님을밝혔다. 본발명은레시틴을이용해포집한마황추출물이피부미백효과를증진시킬수있다는점과향장품으로활용하기위해한약재특유의진한향을완화시킬수있다는점을특징으로한다. 유상의레시틴소재를이용한마황수용성추출물은젤라틴및키토산으로포집한마황추출물과비교했을때피부투과에안정적인크기로나노입자화할수있다는점과나노공정이후고른분포를가진다는점을통해향장품으로의가능성을찾을수있었으며, 정상세포독성실험과멜라닌세포의미백활성실험을통해피부노화억제활성을가지는소재로의적합성을검증하였다. 국내에서나노관련연구는많이진행되고있는반면마황의유용성분을이용하여나노바이오기술에의해유상의레시틴제재를사용해나노향장품으로발전시키는기술에대한연구및이를이용한제품개발에대한내용은보고된바없으며본발명의기술은본연구진이국내에서유일하게보유하고있는기술로서가치가있다하겠다. - 10 -