Endotoxin and Microbial Detection Newsletter 찰스리버래보래토리즈코리아 ( 주 ) 서울특별시서초구양재동 333-5 한아름빌딩 2, 3 층 T:(02)2057-5200 / F:(02)2057-5203 Vol.6, No.1 January 2012 FDA 의 LAL Test Guideline 철회 James Cooper, PharmD, Consultant and Founder of Endosafe, Inc. 예상했던대로, 2011 년 6월 22일자로, 미국식약청 (US FDA) 이, 1987년에발행된 인간과동물용비경구제의약품, 생물학제제그리고의료기기에대한최종제품시험으로써 Limulus Amebocyte Lysate Test의 Validation에대한가이드라인 을철회시켰습니다. 가이드라인의각부분들은이분야산업과관련되어참고자료로쓰여왔기때문에, 현재의시험방법에대해서도계속해서영향을미치고있다고볼수있습니다. 이번호에서는 LAL 가이드라인의내용들이오늘날실제사용되는방법에얼마나중요한영향을미치는지에대해다룹니다. LAL 시험가이드라인은실로주목할만한중요한역사적사실이었습니다. Terry Munson은지난해, 이뉴스레터를통해서가이드라인에대한회고기사를썼습니다. 그는말하기를, LAL 가이드라인은지침서를만드는데있어 FDA와제약산업의전문가들이협력할때어떤성과가이룩될수있는지를보여준첫번째사례라고말했습니다. 가이드라인은엔도톡신시험법이미생물학적시험의주류가되고, 문제가많았던토끼발열시험을엔도톡신시험으로대체하는것을가능하게만들었던중요한세가지요소를포함하고있습니다. 첫번째는, 얼마만큼의엔도톡신이안전한가? 라는질문. 즉, 엔도톡신기준의개념이었습니다. 두번째는 LAL시약의엔도톡신측정민감도를결정하는데에 RSE사용을도입한것이었습니다. 세번째는전통적인 gel-clot 시험을수행하여주사제의엔도톡신을검출하는데적합한테스트조건들을검증하기위한시험법의등장이었습니다. Endotoxin Limit : 엔도톡신기준 제약산업은 5 EU/kg/hr 라는일반적인엔도톡신기준설정으로제약산업이주사제와의료기기의종류별혹은개별제품에대하여투여량과연관하여엔도톡신기준을설정할수있도록해주었습니다. 토끼와인간에대한수많은연구들은정맥내주사의이러한기준의적정성에대한근거를제시하였습니다. 그러나, 뇌척수관주사에대한엔도톡신기준은임의로정해졌지, 과학적인근거로정해진것은아닙니다. LAL 가이드라인은엔도톡신시험을위한샘플의준비에대해서시험법별로, 최대유효희석배수 (Maximum Valid Dilution) 와최소유효농도 이번호에서는 FDA Withdraws LAL Test Guideline Evolution of the Endosafe -PTS LAL Regulation Update FAQ LAL Proficiency Test Program (Minimum Valid Concentration) 를이용하여시험파라미터를개발하기위한방법들을기술하였습니다. 개별의약품에대한엔도톡신기준표가부록에수록되었습니다. 이엔도톡신기준의역할은약전에의해적절하게추정된것이었습니다. 이것은 LAL 시험법에대한엔도톡신기준으로약전각조에서규격으로간주되었습니다. 토끼시험에서 LAL 시험으로의첫번째대규모변경은 1991 년에일어났는데, 185 USP 제품에대하여엔도톡신기준이적용되었습니다. 이숫자는전세계적으로통일된 BET 가나타나는 2001년까지약 650개의제품까지늘었습니다. 신약에대한엔도톡신기준의설정은신약의허가에있어중요한부분입니다. Continued on page 2 01
Continued from page 1 Endotoxin Standards : 엔도톡신표준품 초기엔도톡신표준품은서로차이가있어시험물질의발열정도 를정확히평가하기위한 RSE 의제조가요구되었습니다. 미국약전 (USP) 과 FDA 가이러한목적으로 E.coli lipopolysaccharide 의조제 와엔도톡신단위설정에대한재정지원을하였습니다. RSE 를모든 사용자가사용한다면빨리고갈될수있기때문에, LAL 시약공급자 들은 RSE 를대체하여사용하기위해 2 차표준품을제조하며그역 가를제공합니다. Control Standard Endotoxins (CSE) 의역가결정 (Calibration) 은 LAL 사용자들에게 EU/ng value 에대한정보를주고, EU 로 LAL 테스트결과들을설명하기위해 RSE/CSE 비율계산을필 요로했습니다. CSE 역가결정방법은 LAL 가이드라인이가진역할의 한예입니다. 이것은약전에서는기술되지않았습니다. 다행히, LAL 시약산업은 FDA 감독이나약전에명확한방법없이도이러한역할을 잘수행하고있는것으로보입니다. Standardized LAL Test Methods : LAL 시험법의표준화 LAL 가이드라인은 gel-clot 표준시험방법및 LAL 검증조건들을기 술한첫번째자료였습니다. 한도시험은시험물질에대한엔도톡신 기준이설정되어있을때사용할수있습니다. 한도시험은현재통일 된엔도톡신시험법에기술된대로 4 가지구성요소를가지고있습니 다. 중요한요소로는시험물질 ( 보통은유효한범위까지희석된 ) 과양 성대조가있는데, 양성대조는미리정해진범위안에회수가되어야 합니다. 양성제품대조 (Positive Product Control(PPC)) 의회수는실 험자가시험결과에대한확신을가질수있도록해줍니다. PPC 를준 비하는데에는몇가지방법이있습니다. 다행히도, BET 는이러한주 제에대해서는명확히규정하고있지않습니다. 따라서, LAL 사용자들 과 LAL 시약제조자들은가능한한시험이항상일정하게되도록시 험방법을만드는다양한혁신적인방법들을사용할수있게되었습니 다. 예를들어, PPC 를준비하는데있어서 hot-spike 방법은효율성과 강건성에좋은방법으로인식되고있으며, kinetic LAL 시험법에있어서 spiking 방법으로받아들여졌습니다. hot-spike 방법은한번에여러개의시험물질을 kinetic LAL 시험이나 gel-clot 테스트에서 PPC 를빨리준비할수있도록해줍니다. 약전에서유래한방법은아니지만, 이러한 hot-spike 접근법은가장널리사용되는방법입니다. BET는 gel-clot 시약의표시된감도인 lambda를입증하기위한 LAL 가이드라인절차를따르고있습니다. LAL 시약제조사의분석성적서는 LAL 사용자들에게 gel-clot 시험결과의정확성에대한추가적인외부의근거자료로제공되고있습니다. 미국약전 (USP) 은이러한절차에대해 RSE를명시하고있지만, 보편적으로제약산업에서는 CSE 를사용하고있으며, 규제기관에서이것에대해금지를한다는증거가없습니다. Kinetic 시험법에서는, LAL 시약의정확성에대한근거자료가없는데, 이것은표준품의조제에있어서표준품이부정확하게만들어질가능성과그로인해잘못된시험결과가나올가능성을열어두고있는것입니다. 역가가떨어진표준품은엔도톡신측정치를과대평가하게됩니다. 그러나이것은 FDA의관심사가아니므로크게문제가되지는않습니다. 하지만역가가더높은표준품은샘플에있어서엔도톡신값에과소치를주게되고, 실제적으로환자에게위험을주게됩니다. 찰스리버는이러한문제점에대하여 kinetic chromogenic 방법을 RSE을직접사용하여저장된표준곡선을이용하는독특한시험플랫폼을개발함으로써해결하였습니다. 정량분석법과관련하여약전에서요구하는유일한사항은직선성인데, 찰스리버의분석성적서에의해이것이증명됩니다. FDA는찰스리버의 LAL 카트리지의모든제품에대해승인하였습니다. 02
Impact of LAL Guideline Retirement : LAL 가이드라인철회의영향 엔도톡신측정에있어 LAL 가이드라인의역할을최소화하지않고도, 빠른기술개발이이미 LAL 가이드라인을필요없게만들어버렸습니다. 가이드라인에포함된여러요소들은다른가이던스여러곳에서발견되고있습니다. 훈련및시험자의적합성확인, 샘플채취방법과같은여러문제들이일반적으로 cgmp 규정하에다루어지고있습니다. 엔도톡신과같은미생물학적테스트들에해당하지는않을수있지만, OOS(Out of Specification) 결과들은 OOS 가이던스의측면에서다루어지고있습니다. FDA가아마도 LAL 테스트에대한이슈를훗날공표할지도모릅니다. 예를들면, FDA는 warning letter 들에서샘플링계획에대한염려를나타냈었습니다. 건전한과학이과학적으로건전한샘플링계획을도출할것입니다. 기존의 BME(beginning, middle and end) 방법은여전히단일용기나미생물학적오염이없는그런간단한제품에대해서는적용가능합니다. 하지만, 만일여러충전라인이있고, 고압증기멸균공정이제품생산에포함된다면, 좀더많은샘플링계획을기대할수있습니다. BME 샘플을합하여한번에시험하는것은의료기기를제외하고는이미오래된방법입니다. Medical Devices : 의료기기 의료기기는항상 LAL 테스트에있어서독특한위치에있어왔습니다. 의료기기산업은표준시험법과표준엔도톡신을최초로받아들인분 야였습니다. 의료기기는표면이매끈하고물을사용하지않고생산하며, 엔도톡신기준이굉장히엄격하기때문에엔도톡신과관련된문제가없다는것이일반적인공통의견입니다. 이산업은자체가이던스 (AAMI/ANSI ST72) 를가지고있습니다. LAL 가이드라인이없어졌지만이것이훨씬더보완을해주고있습니다. FDA s Role : FDA 의역할 LAL 가이드라인의철회는엔도톡신시험에있어서의 FDA의역할에어떠한변화도의미하고있지않습니다. LAL 산업은시약의허가와시설사찰등을포함하여, 규제기관의엄격한규제하에있을것입니다. FDA 조사관들은계속해서엔도톡신시험을하는실험실에대하여 cgmp에부합하는지를사찰할것이고, 이것은여러분회사의시험과정과사용설명서 ( 즉 FDA 에승인받은 LAL 시약사용설명서 (package insert)) 를사용하는데있어서규정에부합하는지를결정한다는말입니다. 간단히말해, 1987년의 LAL 가이드라인의각부분들은약전의문서들과 cgmp 규정들, 그리고관련된문서들에서찾아볼수있기때문에계속하여 BET 의기능에영향을미치고있습니다. FDA 행동은신중했으며, 모두에게가장큰관심사였습니다. 가이드라인의철회는 BET와관련된시험을적절하고보다강력하게개정할기회가됨을보여주고있습니다. References 1. Munson TE. The LAL Guideline - the rest of the story. Endotoxin Times. 14(2), 2010. 2. Weary ME. A short history of the Limulus Amebocyte Lysate(LAL) test. Endosafe Times. 13(2), 2007. 3. Cooper JF. Bacterial endotoxins test. Microbiology in Pharmaceutical Manufacturing, Vol.2, 2nd ed; Prince, R., Ed.; DHI, Bethesda, MD, pp. 245-274, 2008. 4. Bryans TD, et al. Bacterial endotoxin testing : A Report on the methods, background, data, and regulatory history of extraction recovery efficiency. Biomed Instrument & Technol 37:73-78, 2004. 03
Evolution of the Endosafe -PTS TM -PTS 의진화 Foster Jordan, Corporate Senior Vice President, Endotoxin and Microbial Detection, Charles River 초기개발 (Early Development) 1990년대후반, kinetic Limulus Amebocyte Lysate (LAL) 방법이엔도톡신테스트를장악하기시작했습니다. Kinetic 시험법은주로 96-well incubating microplate 리더기, 검증된엔도톡신시험전용소프트웨어와 FDA 승인을받은 kinetic chromogenic 혹은 turbidimetric LAL 시약을이용합니다. Kinetic 시험법은대용량샘플의시험, 경향분석, 전자결과보고서에있어서는 gel-clot 법에비해뛰어나지만, kinetic 시험법의기술적약점에대해서해결된것은없었습니다. 최종시험자들은여전히여러기술적인문제들에직면해있는데, 여기에는엔도톡신표준품의변이, 오염된소모품, 시험방법의복잡성, RSE/CSE의역가결정, 리더에따른온도편차등에문제가있었습니다. 찰스리버는완전히자동화되고견고한 LAL 시험법이필요한데, 이것은현재존재하는 LAL 시약과과학적분석기의총체적인새로운디자인을필요로한다는것을깨달았습니다. PTS 에대한초기의개념은시험이필요한곳에서직접시험하는그러한개념은아니었습니다. 하지만숙련된시험자없이도시험할수있도록고안된것이었습니다. 찰스리버는기기를다루는회사가아니었기때문에, 저희의시약과쉽게통합될수있는완전히자동화된시험토대를제공할만한협력파트너를찾았습니다. 저희는 FDA 510K 허가를받은가정내혈액응고시험 (home blood clotting test) 을할수있는장비와시약을생산했던회사를찾았습니다 : 뉴저지 (New Jersey) 에있는 International Technidyne Corporation (ITC) 이라는회사였습니다. 그들의시스템은일회용소모품과휴대용장비로구성되어있는시스템이었습니다. 저희는이시스템이 (1) 시험이필요한곳에서시험하는휴대장비 ( point-of-use ) 와즉, FDA 가추구하는실시간시험을할수있고, (2) 완전자동화시스템으로써많은수의샘플도시험할수있는두가지세계를열어주는잠재적시스템이라는것을깨닫게되었습니다. 1999년, 찰스리버와 ITC 는미래의정량 BET 분석을만들기위해공동개발계약을했습니다. 이프로젝트는 FDA 의승인을받은찰스리 버의 chromogenic LAL 시약 (Endochrome) 과 ITC 의기기사용을결합시키는것이었습니다. 이러한협력은몇년동안계속되었습니다 ; 하지만결과적으로 ITC가전략을바꾸게되면서, 2001년공동개발된지적재산권에대한모든권한을찰스리버가매수하게되었습니다. 저희는카트리지에시약을건조하여안정적인시험을할수있는방법을개선하면서, 기술을계속하여개발했습니다. 몇몇특허들이제출되었고승인되었습니다. 마침내, 저희는 2003년에처음 unlicensed 인 PTS 와카트리지를출시하게되었습니다. The FDA Approval Process 동시에저희는 FDA, 정확히는 생물학평가부 (CBER-the Center for Biologics Evaluation and Research) 에 PTS 제품디자인이요약된허가관련서류를제출하였습니다. 2003년에서 2004년동안에, 찰스리버와 CBER 은 FDA 의허가를받기위하여필요한서면상의논의, 전화상의회의, 직접만남을통한여러회의를가져왔습니다. 이러한토의는저장된표준직선, 직선성의요구조건, 시험의적정성, 음성대조, 시험샘플, 양성대조, 제조상의필요조건, 소프트웨어디자인등을포함하고있었습니다. 이러한토의에있어서모든참조자료들은현재이미 FDA 에허가를받은시약의 package inserts 와 USP BET (Figure 1 참조 ), 1987년 FDA 가이드라인, 1991 년임시가이드라인, 그리고지금의 BLA도물론포함하고있었습니다. 2004년, FDA 와찰스리버는 PTS100 기기와 PTS20F 카트리지 (F는 FDA의승인을의미합니다 ) 에대한최종제품사양과제조등에관한상호의견일치를보았습니다. 토의된모든안건중가장중점적이었던것은현 USP 와 LAL 가이드라인이기술된방법들에부합하는것에대한여부였습니다. 다음의세가지중요한요점들에대하여주로의논되었습니다. 1) Archived Standard Curve : 액체상태의 LAL 시약이 PTS 에서는사용되지않기때문에, FDA 는특정 lot별로 3-point RSE 표준직선및 mid-point PPC 를저장하는것이과학적으로유효하고 USP BET photometric 방법과일치한다는것을인정했습니다. 따라서, 주된염려는실제의저장된 curve validation 이아니라카트리지자체에대한실시간안정성시험이었습니다. 저희의실시간안정성자료가총 3번에걸쳐검토되었습니다 : 승인했을때한번, PTS 승인후첫번째 FDA 사찰중에다시한번, 그리고마지막으로고감도의 PTS 카트리지가도입된최근에있었습니다만, 그동안에아무런문제도나타나지않았습니다. 04
2) Negative Controls : 저희는또한각각의카트리지에있어일상실험에서음성대조가불필요하며, 오히려유 해할수있다는것을 FDA 에증명했습니다. FDA 가주로우려하는점은위양성을피하는것이아니라, 카트리지 가엔도톡신을제대로검출할수있는지에대한것이었습니다. 샘플을테스트할때, 표준직선혹은 PPC 를준비할필요가없기때문에, 오직 LAL Reagent Water(LRW) 가필요한경우는, 샘플희석이필요할때뿐입니다. 만약저희가각카트리지에 negative control 을포함시켰더라면, 사용자가 negative control 을샘플로여겨잘못된곳에분주함으로써위음성의결과를나타낼수있는가능성을높였을것입니다. 저희는각 lot의카트리지를생산할때, 96-well plate 에서나타나는것과같은 hotchannels ( 오염된채널 ) 이없다는것을보증하기위하여 negative control 을사용합니다. 하지만저희는 package insert 에샘플을희석하는데 Buffer 등의다른시약이필요할경우에는, 반드시엔도톡신이없다는것이사전에검증된것을사용해야한다고명시하였습니다 3) Process Validations : 규제기관은카트리지를생산할때혹은 QC 테스트에서요구하는사항들에대해상당한관심을가지고있습니다. 그래서그일환으로저희가 PTS 카트리지제조및제품출하시험과관련된 validation protocol 과시험자료를모두제출하기를요구했습니다. FDA 허가신청에요구되는최종사양, SOP, 프로토콜, 안정성테스트, validation 의완료후에저희 PTS 는 CBER license 1197 에추가적으로포함되었습니다. 그다음해에걸쳐, FDA 로부터요청받은허가신청자료와추가요구사항들과관련된서면연락및전화회의가이루어졌습니다. 2006년 7월, FDA 는 Endosafe -PTS 의 LAL 카트리지를승인했습니다. CBER 은 license 가단지카트리지의 LAL 시약에대해서만적용이된다고밝혔습니다 ; photometer(pts 기기 ) 장비는현재사용되는 96-well microplate 리더기처럼간주되고있습니다 (FDA의허가가필요한사항이아닙니다 ). FIGURE 1. Method LAL/TAL Reagent refers only to a product manufactured in accordance with the regulations of the competent authority Minimum 3-point curve Mid-point spike Negative control Use of RSE Kinetic Turbidimetric yes yes yes yes/no 1 yes yes/no 2 Kinetic Chromogenic yes yes yes yes/no 1 yes yes/no 2 End-point Chromogenic yes yes yes yes/no 1 yes yes/no 2 Recombinant Factor C no no yes no yes yes/no 2 Monocyte Activation Test (MAT) no no yes no yes yes/no 2 Portable Test (PTS ) yes yes yes 3 yes yes 3 yes 1 Curves such as 5-.005 EU/mL with spike at 0.5 EU/mL would not comply. 2 Use of CSE is not defined in USP, but is standard industry practice when valid RSE/CSE calibration is performed. 3 Pre-calibrated by vendor and data supplied on FDA-approved Certificate of Analysis. PTS 시스템은커다란반향을불러왔습니다. 수천의사용자와, 5000 대이상생산된기기, 그리고수백만개의카트리지판매등으로저희의모든기대를훨씬뛰어넘었습니다. 최근에저희는많은샘플을필요로하는사용자분들을위하여현재와같은개별포장이아닌, 다섯카트리지가한포장에들어있는제품을출시했습니다. 그외에도계속하여새롭고혁신적인것들이출시될예정입니다. 저희는곧완전히자동화된대용량 (high-throughput) 시스템인 MCS Robot 시스템을출시할것입니다. 또한차세대 PTS 및카트리지에대한디자인사양이이미완료되었고, 이것은현재시스템에비해더큰향상을가져올것입니다. 지난 12년간, 찰스리버는혁신적인 LAL 기술을개발하기위해엄청나게많은시간과자원을투자하였습니다. 저희의투자는세계도처에있는수천명의고객여러분들의요구를충족시키는성과를이루었으며, 저희는 PTS 를다른시험에도적용하기위해지속적으로연구개발노력을하고있습니다. 05
LAL Regulation Update Baterial Endotoxin Test 시험법에대한미국약전 (USP) 개정내용에대해서안내해드리겠습니다. 1. 시험법종류 USP 33 개정 : 엔도톡신시험을 Gel-clot( 겔화법 ), Turbidimetric( 비탁법 ), Chromogenic( 비색법 ) 세가지로구분 개정전 : Gel-clot( 겔화법 ) 과 Photometric( 광학적방법 ) 두가지로구분후, 광학적방법에서비탁법과비색법으로세분화하였음 대한약전 9 개정겔화법과광학적방법두가지로구분후, 광학적방법에서비탁법과비색법으로세분화함 2. LAL 시약의정의 USP 33개정 : LAL시약을다음문구에따라정함으로써반드시 FDA의승인을받은시약을사용하도록함 A lyophilized product obtained from the lysate of amoebocytes (white blood cells) from the horseshoe crab (Limulus polyphemus or Tachypleus tridentatus). This reagent refers only to a product manufactured in accordance with the regulations of the competent authority. 대한약전 9 개정 LAL 시약에대해아래문구로만정함으로써 FDA 승인여부에대한요구사항이없음. 엔도톡신시험법은참게의혈구추출성분으로만든라이세이트 (Lysate) 시약을써서.. 3. 글루칸 (beta-glucan) USP 33 개정 : 각주 (footnote) 에있던글루칸의내용을본문에실음 대한약전 9 개정글루칸에대한내용없음 4. 용어정의 : Lysate TS USP 33 개정 : 용해전동결건조상태의 LAL 시약에대해 Amoebocyte Lysate 로정하고, 용해된상태의 LAL 시약에대해 Lysate TS 로정함 대한약전 9 개정별도의항목에서정의하고있지않으나, 용해전상태의시약에대해 라이세이트시약 이라하고, 용해된상태의시약에대해 라이세이트시액 이라함 06
5. 용어정의 : Water for BET USP 33 개정 : 각주에정의되어있던 LAL reagent water 에대해 Water for BET 로용어변경하고, 이를본문에실음 대한약전 9 개정시험에사용되는물 (water) 에대해따로정의하지않고있으며, 엔도톡신표준액조제, 검액의조제및라이세이트시약용해에 엔도톡신시험용물 을사용하도록함 6. Standard Endotoxin (Stock) 제작방법및보관조건 USP 33 개정 : 제품의패키지인서트및라벨표시내용을참고하도록정하고있으며, 기존내용처럼제작과정및보관조건에대해별도로 정하지않음 대한약전 9 개정제작방법및보관조건에대해정하고있지않음 7. Standard Endotoxin (Dilution) 보관조건 USP 33 개정 : 이전에는엔도톡신역가에대한안정성데이터가있는경우보관할수있었으나, 보관에대한언급이전혀없으며, 역가가 떨어지지않도록가능한빨리사용하도록정하고있음 대한약전 9 개정보관에대한언급이없으며, 엔도톡신이용기에흡착되는것을피하기위하여가능한빨리사용하도록정하고있음 8. 검체의 ph 조건 USP 33 개정 : 검액과 LAL 시약의혼합물의 ph 가 6.0~8.0 사이에있도록정함 개정전 : 검액의 ph 에대해 6.0~8.0 사이에있도록하였음 대한약전 9 개정 LAL 시약과의혼합물이아닌검액의 ph 로만 6-8 사이에있도록정함 9. M- 최대투여량 (Maximum dose) USP 33 개정 : 최대투여량으로서, 사람체중 1kg 당, 1 회투여분량 (Bolus) 중, 최대분량을최대투여량으로정함. 단, 용법상, 반복투여또는지속적인투여를할경우, 사람체중 1kg 당, 1 시간동안투여하는최대분량을최대투여량으로정함 대한약전 9 개정 M 에대하여단회혹은반복투여구분없이 체중 1kg 당 1 시간이내에투여하는주사제의최대량 로정함 07
10. K- 체중 1kg 당발열을일으키는엔도톡신의양 (EU/kg) Interim Revision Announcement (1-Apr-2011) : 용법 / 용량에서투여량이체표면적기준일경우, K 값을 2.5EU/kg 으로정함. 개정전의 K 값 은 5EU/kg 이었으므로, 체표면적기준으로투여하는의약품 ( 주로항암제 ) 은엔도톡신기준이절반으로줄어드는것을의미함. 대한약전 9 개정체표면적기준에대한 K 값을별도로정하지않고있으며, 일반정보항목의 엔도톡신규격값의설정 따라 정맥내투여의 K 값인 5EU/kg 을따른다. 11. 시험용어변경 Interim Revision Announcement (1-Apr-2011) : 반응간섭인자시험용어 Interfering Factor Test for the Gel-Clot Techniques 이 Test for Interfering Factors 로변경됨 대한약전 9 개정 반응간섭인자시험 로정함 12. 겔화법 - 한도시험재시험 USP 33개정 : 개정전에는재시험결과에서 A액의두반복모두음성결과가나와야적합하다고정하였으나, A 액의두반복시험중모두또는한반복이양성결과가나올경우부적합하다 라는문장이추가됨으로써, 재시험결과의적합성에대해보다정확한판정기준을적용함. The preparation does not comply with the test if a positive result is found for one or both replicates of Solution A 대한약전 9 개정 USP33 개정내용과동일함 13. 검량선의신뢰성확인시험 USP 33 개정 : LAL 시약의매로트 (lot) 마다검량선의신뢰성확인시험을수행하도록정함 개정전 : 겔화법의감도확인시험에서만정하고있었음 대한약전 9 개정겔화법의감도확인시험과광학적방법의검량선의신뢰성확인시험모두 LAL 시약의각로트 (lot) 에대해수행하도록 정하고있음 Portable Test System for rapid Endotoxin testing 08
Frequently Asked Question PTS 에대한 FAQ PTS 는 FDA 승인을받았습니까? 네, 찰스리버는 2006 년 7 월에 PTS 카트리지에대해 FDA 승인을받았습니다. PTS 는원료또는완제품의최종승인 (release test) 목적으로사용할수있는승인된 LAL 시험법입니다. 카트리지는생산에있어어떤 QC 절차를거치나요? 카트리지에대한 QC는카트리지에대한역가시험수행 ( 엔도톡신검출정밀도 ), spike 회수율의검증, 그리고 Calibration code의결정및검증, 이세가지과정으로이루어집니다. Calibration code에는카트리지각배치 (batch) 별로저장된검량선 (archived standard curve) 의정보뿐만아니라, 역가시험시결정되는모든시험에대한파라미터정보를포함하고있습니다. Calibration code의검증은농도를알고있는 RSE 엔도톡신을샘플로하여동일 lot의카트리지를이용해이샘플을측정할때예상되는농도를제대로측정하는지를확인하는방법으로다시검증됩니다. 저장된검량선 (archived standard curve) 은어떻게결정됩니까? 검량선의각농도에대해카트리지 5개씩시험하고, 시험을통해얻은 5개의반응시간을평균내어각스탠다드농도의반응시간을결정합니다. 15개의카트리지는음성대조및스파이크역가결정에사용됩니다. 그리고한개의카트리지는역가및 calibration code 확인에사용됩니다. 카트리지의판매를위한 QC 요구사항은무엇입니까? 저장된검량선은위에서언급한바와같이결정되며, CV(Coefficient of Variation) 는 25% 미만, R(Correlation Coefficient) 값은 0.990 이상의 수용요건을만족해야합니다. 그리고, spike 의회수율은반드시 50%~200% 이내여야합니다. PTS 에서 spike 농도는어떻게결정됩니까? spike 되어있는 15 개의카트리지에대해 LRW 를넣고시험하여나온결과를평균내어 spike 농도를결정합니다. 이값은카트리지의각배 치마다다를수있습니다. PTS에서 spike회수율은어떻게계산됩니까? spike 회수율 % 는실제시험을통해나온 spike 농도를위에서언급한것과같이미리결정된 spike 농도로나누고, 이값에 100을곱하여계산됩니다. 예를들어, 시험을통해나온 spike의농도가 0.577EU/ml 이고, 미리결정된 spike 농도가 0.52EU/ml 이라면, (0.577 EU/ml 0.52 EU/mL) x 100= 111.0% 회수율이됩니다. 09
Frequently Asked Question 5-0.05EU/ml 검량선에서양성제품대조 (PPC) 는왜 0.5EU/ml 이아닌가요? USP 에서는엔도톡신검량선의중간또는근처의농도를선택하라고말합니다. 충전작업중에미리정해진나노그램양의 CSE 로 spike 됩 니다. EU/ng 값은 RSE 를사용하여출하테스트중에결정됩니다. PTS데이터는일반프린터에직접다운로드받을수있습니까? 찰스리버는 PTS 전용프린터로서 PTS 기기에바로연결되는프린터를제공하는데, 배터리충전방식의감열식프린터나시험기록을오래유지할수있게잉크로프린트되는엡손프린터를제공합니다. 별도의프린터에데이터를인쇄하려면, 기기를구입할때포함되어있던 PTS logger 소프트웨어를사용하여컴퓨터에데이터를다운받은후일반프린터를통해인쇄할수있습니다. 하지만이방법은데이터의편집을할수있으므로추천되지않으며, 찰스리버의 Endoscan-V software를이용하여다운받는방식을사용하면데이터의변경위험없이컴퓨터를통해데이터를인쇄할수있습니다. 여러테스트를한번에인쇄할수있습니까? PTS 기기에연결된엡손프린터나감열식프린터를통해마지막시험결과또는날짜별시험결과, 또는기기에저장된모든결과 (100 개까 지 ) 를출력할수있습니다. 또는찰스리버의 Endoscan-V software 를이용한다면여러데이터를한꺼번에인쇄할수있습니다. 엑셀로데이터를내보낼수있습니까? 직접은안됩니다. PTS 또는 MCS기기의데이터는 Endoscan-V 소프트웨어를통해엑셀로내보낼수있습니다. 하지만데이터를엑셀에받아들일때특정한형식을지정해서데이터를인식해야합니다. 데이터는찰스리버의엔도톡신경향분석소프트웨어인 Microtrend 를사용하여선택할수있는형식으로가져올수있습니다. 어떤종류의제품이 PTS로테스트되었나요? PTS로시험된제품은생물학제제 ( 인간혈청알부민 ), 원료 ( 식염수, 버퍼 ), 비경구용제제 ( 주사제의약품 ), 물시스템그리고의료기기등거의모든일반적인 LAL시험으로할수있는제품을시험할수있습니다. PTS 카트리지에승인된 LAL이사용되기때문에, 다른 LAL방법으로테스트되는모든제품은 PTS로테스트할수있습니다. 뜨겁거나차가운샘플도 PTS로시험이가능한가요? 너무낮거나높은온도는결과에영향을줄수있기때문에 LAL시험샘플처럼 PTS 샘플준비도같은방법으로준비할것을권장합니다. 사용하기전에상온에서시험할샘플과카트리지를준비합니다. 기기안에카트리지를넣고카트리지에샘플을넣기전에 Add sample 이란글자가화면에나타날때까지기다립니다. 다른 LAL 시험법과비교했을때비용이어떻게되나요? 언뜻보면, 카트리지가다른정량분석법보다더비싸게느껴질수있습니다. 하지만명심할것은, 시험하기위해필요한 LAL reagent, CSE, LRW같은모든시약이카트리지안에이미포함되어있다는것입니다. 또한, 기존정량분석법에서최소 6개의 well과물음성대조까지 2개의 well을필요로하는검량선에대해이미수행되었다는것입니다. 그래서 PTS로한번시험하는것은실제로 8well의검량선과 4well의샘플그래서총 12well 을포함한것입니다. 또한상당한시간과노동을절약할수있습니다. 0.01 EU/ml 보다더낮은감도의카트리지가있나요? 네, 가장낮은감도로 0.005EU/mL 카트리지가있습니다. 10
시험완료까지걸리는최대시간은얼마입니까? 카트리지의감도에따라, 그리고 Lot 마다다릅니다. 시간은 calibration code 에의해결정되고, 사용자가설정할수없습니다. 보통은 15-20 분정도소요됩니다. 하나이상의카트리지를사용할수있는시스템이있나요? 네, MCS 라는장비는 5 개의카트리지를사용할수있는시스템을가지고있습니다. 이장비는충전식이아니며, 반드시 PC 와 Endoscan-V 소프트웨어가함께사용되어야합니다. 정기적으로 calibration 을할수있습니까? 얼마나자주해야하나요? 공장의 calibration 은초기출하시 1 년간유효합니다. Re-certification 은고객에의해수행될수없습니다. 그래서찰스리버는기기가기대한 대로실행하고있다는것을확인하기위해 calibration re-certification 서비스를제공합니다. 시험은얼마나정확합니까? PTS 는 LAL 시험법으로서다른 LAL 시험과최소한동일하거나더정확한시험을제공합니다. PTS 에서생성된데이터는 Kinetic 과 Gel clot LAL 시험과대등합니까? 네. PTS 는 FDA 의승인을받은 LAL 시약을이용한광학적분석법입니다. 찰스리버는 calibration code 를결정하는역가시험에서다른 Gel clot LAL 이나 Kinetic LAL 시험의역가시험에사용하는것과동일한 RSE 스탠다드를사용하고있습니다. 카트리지의유효기간은얼마입니까? 현재유효기간은생산후 18 개월입니다. 배터리가얼마나방전되었는지, 얼마나충전되는지어떻게알수있습니까? 갑자기방전되지않도록배터리잔량을체크하는것이중요하며, 밤새충전하여전원이꺼지는것을예방해야합니다. 기기가켜져있을때, 배터리는충전된양을표시합니다. 기기가충전기로연결이된상태로켜져있다면, 외부전원공급 (External) 표시가될것입니다. 외부전원이공급되면시간이지남에따라배터리충전양의 % 가천천히증가할것입니다. 충전기에연결되어있지않은경우, 내부전원공급 (Internal) 표시가될것입니다. 내부배터리로사용할경우, 사용함에따라배터리충전양의 % 가천천히줄어들게됩니다. 충전양의 % 를보려면, Menu 6을선택하면충전양이표시될것입니다. 차후버전에서는시각적으로배터리잔량을표시하기위한 power bar를스크린에추가할계획입니다. 보증및유지보수프로그램은어떤것이있습니까? PTS 는구입시 1 년간품질보증합니다. 이기간동안수리는무료로이루어집니다. 필요하다면, 추가로 4 년연장가능한보증프로그램을구입 할수있으며, 기기구입후 1 년이내에구입하시면됩니다. Endoscan-V 소프트웨어를이용하여 PTS 를사용할수있나요? 네. Endoscan-V 를이용하여 PTS 를사용할수있습니다. PTS 는 MCS 에있는다른 bay 처럼 Encoscan-V 를통해실행할수있습니다. 또 한다른장소에서 PTS 로시험하고, PTS 에저장된데이터를 Endoscan-V 소프트웨어를이용하여불러올수도있습니다. 11
Frequently Asked Question MCS 를사용할때, 다른분석을시작하기전에모든테스트가끝날때까지기다려야합니까? 아닙니다. MCS 의각 bay 는독립적으로작동합니다. 랜덤액세스가가능하기때문에다른 bay 에서시험이끝나지않았더라도한 bay 에서 테스트가끝나자마자시험완료된카트리지는버리고새로운시험을할수있습니다. EndoScan - V 를사용하는경우에데이터는어떤종류의파일로저장되나요? EndoScan - V 에저장된모든파일은 plt 파일 (. plt) 로저장되며변경이불가능합니다. Plt 파일은 EndoScan-V 에서만사용가능합니다. EndoScan-V 는 21 CFR part11 를준수하나요? 네. Endoscan-V 는 21CFR part 11 을준수합니다. 엔도톡신시험에대한 FAQ 찰스리버는엔도톡신시험에있어서새로운회사인가요? 찰스리버엔도세이프 (Endosafe) 는 1987 년에 Dr. James F. Cooper 에의해설립된이래엔도톡신시험사업을하고있습니다. Dr. Cooper 는 LAL 분야의개척자중한사람이고엔도세이프가세계적인시장선두주자가되기까지많은도움을주었습니다. 찰스리버의시약은 FDA 승인을받았습니까? 찰스리버는 LAL 시약뿐만아니라생산하는시설또한 FDA 승인을받았습니다. 드라이오븐검증 (validation) 을위한제품이있나요? 찰스리버는업계에서오븐검증을위한가장광범위한종류의제품을제공합니다. 찰스리버는 2000EU 에서 10,000,000 EU 까지 6 개의다양 한농도의 endotoxin indicator 를판매하고있습니다. 자동화된 LAL 시스템을판매하고있습니까? 찰스리버는엔도세이프의엔도톡신측정과데이터베이스 trending 소프트웨어패키지와함께 incubating plate reader로구성되어있는패키지시스템을판매합니다. 또한최근 MCS를이용한자동화시스템 (robot system) 도개발완료단계에있습니다. 이시스템은자체적으로검교정할수있는설명서와함께제공됩니다. 엔도세이프소프트웨어는검증되었나요? Endoscan-V는밸리데이션을위한 21 CFR Part 11 의요구사항을만족한최초의엔도톡신전용소프트웨어입니다. EndoScan-V와 Microtrend 3.0b database trending software 둘다 USFDA 및 CE마크요구사항에따라검증및밸리데이션되었으며, CFR 820.30 사항을준수하고있습니다. 말발굽게 ( 투구게 ) 를수확하는과정에서죽거나상해를입는게가있나요? 말발굽게에서혈액을채취할때는말발굽게의아래쪽에있는격막을주사바늘을이용하여채취하고있습니다. 말발굽게의혈액중약 25% 의혈액만뽑으며, 이것이말발굽게를죽이거나해를입히지않는다고검증하였습니다. 말발굽게는혈액의채혈이끝나는것과동시에바로잡은다음부터 18시간이내에바다에다시놓아줍니다. 이과정의결과로게가죽는것은 10% 미만으로, 자연상태에서의치사율과비슷한수치입니다. 12
찰스리버엔도세이프의 LAL시약은다른경쟁사에비해어떤특성을가지나요? 모든 LAL시약은말발굽게의혈액에서유래한효소가엔도톡신을감지할수있는능력을이용한것이지만, 실제로시약의성능을좌우하는것은시약의조제방법입니다. 시약의안정성, 감도, 속도, 직선성과같은특성은각제조업체의 LAL 조제방법 (LAL formulation) 에의존하고있으며, 조제방법에따라반응억제 / 촉진성질이컨트롤됩니다. 찰스리버의 LAL시약조제방법은반응간섭인자에대한뛰어난조절능력이있습니다. 창설이래, 찰스리버는경쟁사에서제공하는시약들보다우수한 LAL시약을개발하기위해많은노력을하고있습니다. 간섭문제를극복하기위한최선의방법은무엇입니까? 반응억제 (Inhibition) 간섭은간섭이많은복잡한제약제품과원료를테스트하기위해특별히고안된 LAL시약을사용하여극복할수있습니다. 찰스리버 LAL시약은가장최근에 FDA에서승인받았고, 가장최근의기술로제조되었기에이전의시약들이가지고있던간섭문제를향상시킬수있도록제조되었습니다. Kinetic Test 에서데이터의경향성을알수있는방법이있나요? 네. 찰스리버는새로운데이터베이스경향분석을위한패키지인 Microtrend를제공합니다. LAL고객은엔도톡신측정소프트웨어인 EndoScan-V로부터시험된데이터를자동으로다운로드받아 Microtrend 소프트웨어를사용하여다양한분석데이터를생성하여여러가지방면으로시험의경향을분석할수있습니다. LAL시험에서비탁법보다비색법이더좋은가요? 그것은오해입니다. 비색시약이더인기있게된이유는높은감도 (0.005EU/ml) 및 LAL과제품을 1:1 비율로희석할때간섭이잘극복되었기때문입니다. 하지만 Endosafe 에의해개발된혁신적인비탁시약은이제비탁시약의가격으로비색시약의특성, 즉더높은민감도와간섭에대한높은저항성을가질수있게되었습니다. 찰스리버는고객에게어떤종류의기술지원을제공합니까? 찰스리버는전화, 이메일, 직접방문을통해기술지원을하고있으며, 고객이겪고있는문제의해결, 교육및세미나, 시험법개발, SOP 작성, 규제기관에대한대응등다양한기술지원을하고있습니다. 찰스리버는국제적으로판매하나요? 찰스리버제품은각국의현지법인이나대리점을통해전세계어디에서나이용할수있습니다. PTP (Proficiency Test Program) 에대한 FAQ 왜 Proficiency Test Program 를사용해야합니까? PTP 는각실험실에서시험하는시험자에대한검증을위한내부품질보증수단이자내가사용하는시험법이밸리데이션이되어있는지를 확인할수있게해줍니다. 왜찰스리버의 PTP 를사용해야합니까? 찰스리버는유럽및전세계에걸쳐 350 개이상의실험실의참가자와함께 15 년이상의경험을가지고있습니다. 이프로그램은 EP 규정에따 라수행되고뛰어난기술지원을제공합니다. 프로그램의결과는비밀보장됩니다. 13
Frequently Asked Question PTP는어떻게작동합니까? 찰스리버는참가자에게 blind sample( 미지의시료 ) 을보내드릴것입니다. 참가자는참여하고자하는시험방법을선택합니다. 개별시험결과를인터넷인터페이스를통해입력하고난후, 찰스리버는모든참가자의결과를취합하며개별참가자는인터넷을통해결과리포트를출력할수있습니다. 결과리포트는비밀이보장되며, 각참가자는개인번호가배정됩니다. PTP 에참가하는데있어제한이있습니까? 없습니다. PTP 는찰스리버의제품을사용하지않는시험자에게도개방되어있으며, 시험법의종류나시약의제조사, 시험장비등어떤것을 사용하던지제약은없습니다. 언제 PTP 에참가할수있습니까? 1 년에 4 차례실시합니다. 2012 년의일정은아래 LAL 시험에대한숙련도평가프로그램 의일정부분 (14 page) 을참고하세요. 약한달 전에참가신청이마감됩니다. 참가신청은어떻게합니까? 찰스리버코리아로문의주세요. endo-asia@crl.com PTP (Proficiency Test Program) 에대한 FAQ LAL 시험에대한숙련도평가프로그램 고객여러분의제품이안전하다는것을증명하기위해실시하는 LAL 시험에서시험자들이 LAL 시험을제대로수행하고있는지를자체적으로평가할수있는방법은없을까요? 저희찰스리버 LAL 시험에대한숙련도평가프로그램 (PTP) 은그동안전유럽및전세계에걸쳐 350개실험실의참가자와함께하였으며, 15년이상의경력을자랑하고있습니다. PTP는각실험실에서시험하는시험자의검증을위한내부품질보증수단이며, 시험법및리포트밸리데이션을검증하는수단이되기도합니다. 시험결과및기타정보에대한비밀유지를해드리고있으며 1년에 4번프로그램을제공해드리고있습니다. 저희프로그램은, 찰스리버가아닌타회사의 LAL 시약을사용하고계시더라 도, 실험과정을증명하길원하시는 LAL 사용자분이시라면어떤분이라도참 여가능하십니다. 또한 USP( 미국약전 ), EP( 유럽약전 ) 규정에따라수행됩니다 참가자들은저희찰스리버에서제공해드리는미지의시료로시험하시게됩니 다. 각참가자들은시험이완료가되면, 웹인터페이스를통해, 즉, 온라인상으 로결과를곧바로제출하실수있습니다. 14
PTP 의목표 시험자들의분석방법, 결과및보고서는 EP( 유럽약전 ) 과 USP( 미국약전 ) 의규정에따라정확성을평가받게됩니다. 시험과정및결과검토를통해세부적인내용을포함하여작성된보고서를확인하실수있습니다. 물론개개의보고서에는실험실의이름을표시하지않으며개개참가자에게부여받은코드명으로만표기되며, 모두기밀로다루어집니다. For user 고객여러분의분석기술을확인하고증명할수있습니다. 약전에서요구하는대로절차를따르고있다는점을증명할수있습니다. 절차를따르는도중일어날수있는문제를관리하고바로잡을수있습니다. 오염의정도를파악할수있는여러분의능력을증명할수있습니다. 고객여러분의분석결과를다른시험자들의결과와비교해보실수있습니다. For Charles River Laboratories 시험자들이약전에서요구하는것을최대한따를수있도록기여합니다. 예 : 1993년첫 PTP 에서단 21% 정도가약전에따른분석을했었지만, 2011 년 9월에는 92% 가약전에부합한분석을했습니다. 기술적인문제혹은일반적이지않은결과를얻은분들께도움을드리고방향을제시해드립니다. 예 : 1993년첫 PTP 에서단지 7% 가정확한오염정도를파악했다면, 2011 년 9월에는시험자의 91% 가정확한오염정도를파악했습니다. 2012 년프로그램일정및비용 Study A12 : February 2012 (week 7) Study B12 : April 2012 (week 17) Study C12 : July 2012 (week 27) Study D12 : October 2012 (week 44) * 샘플전달시배송일정은일주일내외로예상하고있습니다. * 비용관련및구체적상담을원하시면담당자김소희 ( 내선번호 216 번 ) 사원에게연락주시기바랍니다. UPCOMING SEMINARS 찰스리버코리아는주기적으로 LAL시험법에대한교육을실시하고있습니다. 정량분석법, 겔화법및맞춤형소규모 (4~8명) 의세미나를최소 2개월에한번씩진행하고있습니다. LAL 세미나에참석하시면제약, 의료기기, 생명공학및투석산업에적용되는 LAL 시험관련, 풍부한경험의전문가들로부터가치있는기술및규정정보를제공받으실수있으며또한직접실습의기회도제공해드리고있습니다. 모든관련산업에걸쳐엔도톡신테스트에대한요구정도가높아지고있습니다. 엔도톡신테스트에대한이해와기술능력의향상, 규정에대한이해가필요하시다면, 찰스리버 LAL 세미나에참가하시기바랍니다. 자세한세미나일정은찰스리버코리아로문의주시기바랍니다. 문의전화 : TEL 02.2057.5200 FAX 02.2057.5203 이메일 : Endo-asia@crl. com 15