Polymer(Korea), Vol. 32, No. 6, pp 561-565, 2008 히알루론산에결합된리포산자기조립체의제조및특성 홍인림 ㆍ김영진 충남대학교공과대학바이오응용화학과, 충남대학교공과대학나노기술학과 (2008년 6월 27일접수, 2008년 7월 29일수정, 2008년 8월 21일채택 ) elf-aggregated Naopartiles of Lipoi Aid Cojugated yaluroi Aid I Rim og ad Youg Ji Kim Departmet of Applied Chemistry & Biologial Egieerig, Chugam Natioal Uiversity, 220, Gug-dog, Yuseog-gu, Daejeo 305-764, Korea Departmet of Nao Tehology, Chugam Natioal Uiversity, 220, Gug-dog, Yuseog-gu, Daejeo 305-764, Korea (Reeived Jue 27, 2008; Revised July 29, 2008; Aepted August 21, 2008) 초록 : 본연구에서는천연고분자인히알루론산 (hyaluroi aid, A) 에항산화제인리포산 (lipoi aid, LA) 을그래프트시켜양친성공중합체를결합하였다. 이공중합체는수용액상에서자기조립에의해서친수성인히알루론산이소수성인리포산을감싸는형태의고분자입자를형성한다. 히알루론산과리포산을결합하기전에 adipi aid dihydrazide(ad) 을이용하여히알루론산의카복실부분을개질시켰다. 히알루론산의개질분석과 A-g-LA의결합을확인하기위해분광학적분석방법을이용하여분석하였다. 형성된입자는 DL 와 TEM 을사용하여크기를측정하였고나노크기의구조를이룬다는것을확인하였다. 나노크기의고분자입자는소수성물질을포함하는전달체로사용될수있다. Astrat: yaluroi aid (A) is a atural glyosamioglya ad is used widely i the pharmaeutial field. Lipoi aid (LA) helps the regeeratio of exogeous ad edogeous atioxidats suh as Vitami C ad Vitami E as well as glutathioe. It also ats as atioxidat idiretly. ydrophili A as a iodegradale ad ioompatile polymer was ojugated with hydrophoi LA as a atioxidat to form the graft opolymer. The aroxyl group of A was modified y adipi aid dihydrazide (AD). The sythesis of A-g-LA graft opolymers was haraterized y FT-IR, 1 -NMR spetrosopy. The ojugates ould form the self-assemled aopartiles i aqueous solutio. The partile size ad ritial aggregatio oetratio were verified to use the aopartile as a arrier for the hydrophoi material. Keywords: hyaluroi aid, lipoi aid, graft opolymer, atioxidat. 서론최근피부노화를방지하기위한기능성화장품이많이연구되고있다. 피부노화를방지, 관리를하는수많은물질중중심을이루는물질이바로항산화제이다. 노화는나이가듦에따라자유라디칼이라고불리는불순물이체내에쌓임으로써진행되며이자유라디칼은피부노화, 악성종양, 혈관질환등의원인이된다. 항산화제는원천적으로이러한자유라디칼을억제하는성분이다. 항산화제의종류로알파리포산 (α-lipoi aid, LA) 과 vitami E(VE) 가가장널리이용되고있다. 리포산은맥아, 맥주효모, 붉은고기등에포함되어있으며강력한항산화효과로노화방지와주름을예방, 제거하는데효과적이다. 리포산의항산화제수용력은티올그룹에의해정해지며이러한 To whom orrespodee should e addressed. E-mail: kimyj@u.a.kr 티올그룹은자유라디칼과직접반응을한다. 리포산은또한 D (superoxid dismutase), 코엔자임 Q10, 글루타티온, 다른항산화제 (vitami C와 E) 등의효과를강화시킨다. 그러므로리포산은질병의치료적으로나자유라디칼의억제에중요한항산화제로고려된다. 1-4 히알루론산 (hyaluroi aid, A) 은생분해성, 생체적합성, 면역반응성이없는일직선의 polysaaride 이다. 분자량은 1000 에서 10000000 Da으로매우넓은범위를갖는다. 사람의몸에일정량포함되어있는물질로피부밖의표피와진피속의세포를서로결합시키는세포간질로서작용한다. 히알루론산은살아있는세포에영양분을전달할수있게하고윤활유역할을하며피부의수분증발을막는동시에수분을흡수하여피부가적절한양의수분을유지하도록한다. 히알루론산은피부에아주중요한작용을하는데피부를탄력있게하고피부손상시에피부하층부의손상을줄여주는역할을한다. 그래서히알루론산은피부주름방지와골관절염치료를위해서또는눈 561
562 홍인림 ᆞ 김영진 과인체수술시에보형물로서사용되는유익한물질이며주름을없애기위한주사제로또는캡슐과화장품으로많이알려지고사용되어지고있는성분이다. 눈의초자체나관절, 태반등에많이존재하는히알루론산은피부세포의재생과성장을돕는피부재생공학연구의핵심물질이다. 5-11 우리는히알루론산의일정부분에리포산을결합하기위해서히알루론산의카복실기에양쪽에아민기를갖는 adipi aid dihydrazide (AD) 로치환한후리포산과결합하였다. 이치환물은물속에서소수성상호작용에의해친수성인치환된히알루론산을외각으로하고소수성인리포산이내각을이루는자기조립나노입자를형성하였고노화방지제중지용성항산화제를함유하는캡슐형제재로기능성화장품에응용될수있다. 실 시료및재료. 본실험에서사용된히알루론산 (hyaluroi aid, A) 의분자량은 35000 Da와 12000 Da으로 Lifeore medial 사에서구입하였다. 히알루론산을개질시킬때사용한 adipi aid dihydrazide(ad) 와알파리포산 (α-lipoi aid, LA), 1-ethyl- 3-[3-(dimethylamio)propyl]arodiimide(EDC), N-hydroxysuiimide(N) 은 igma Aldrih 에서구입하였다. A-AD의합성. 리포산과결합하기전에히알루론산을개질하는실험으로히알루론산의카복실기를 AD 로치환하는것이다. A- 험 AD 합성은 Luo 등 6,8 방법에따르고있다. 실험과정은우선히알루론산 100 mg 을 20 ml 의물에넣어녹여 5 mg/ml 의히알루론산용액을만든다. 그리고히알루론산용액에 AD(1.736 g) 을넣고 10 분정도교반후에탄올을넣고 30 분교반한다. 그반응물은 1 N Cl 을이용하여 p 4.8로맞춘후 EDC(0.191 g) 넣고 p를 4.8로유지하면서 2시간교반한다. 교반이끝나면반응물의 p 를 1 N Na 를이용하여 7.0 으로올리고 moleular weight ut off(mwc)=2000 g/mol 투석막을사용하여투석한다. 동결건조를 3일동안하여가루상태의 A-AD 를얻는다. A-g-LA의합성. A-AD 80 mg을 aeti aid 1% 용액 20 ml 에녹인다. 리포산 48 mg 을 TF 5 ml 에녹인다. 히알루론산용액에 N 와 EDC 를넣어교반한후리포산용액을방울방울떨어뜨리고 72 시간교반시킨다. 반응물은 TF 에침전시킨후원심분리기로시료를얻는다. 미반응된리포산을제거하기위해 MWC= 2000 g/mol 투석막을사용하여투석시키고동결건조한다. 12 A-g-LA 입자의형성및 CAC 측정. A-g-LA 를 DM 와증류수혼합용액에녹인다. 이용액을투석막 (MWC=2000 g/mol) 에넣고증류수에서 24 시간투석하여 DM 를제거해주면서나노입자를형성하였다. 그리고동결건조하여가루형태의입자를얻는다. CAC(ritial aggregatio oetratio, 임계응집농도 ) 측정은다양한농도의고분자입자수용액을만든후형광물질 (pyree) 을넣어 fluororesee saig spetrometer 를이용하여각각의농도에서의형광세기를측정하였다. A(-C) + 2 N N AD N N N C C 2 N N C3 C3 N Figure 1. Reatio sheme of A-AD. A-AD N N C C N N C3 C3 A-AD 3 C 3 C N N C C N N + N N C A-g-LA LA Figure 2. ytheti sheme of A-g-LA. 폴리머, 제 32 권제 6 호, 2008 년
히알루론산에결합된리포산자기조립체의제조및특성 563 결과및토론 수소피크가나타난것을확인할수있었고아미드결합에의해서결합될것을예측한것이므로 FT-IR 에서 CN 의피크가증가된것으로보아결합되었음을확인하였다 (Figure 5). 수용액내고분자입자의형성. 결합된공중합체는친수성부분으로히알루론산을갖고소수성부분으로리포산을가지고있어서수용액상에서히알루론산을외부로하고리포산을내부로하는구형의입자를형성하게된다. 이고분자입자는자기조립과회합을통해어느농도이상에서입자를형성하게되는데그농도를임계응집농도 (CAC) 라고한다. 이농도를측정하기위해소수성형광물질은 pyree 을사용하여입자내부의소수성부분과소수성상호작용을시켜봉입시킨후형광정도를확인해보았다. Figure 6은고분자의다양한농도로희석시킨후입자내부에 pyree 을봉입하고그형광스펙트럼을측정하였다. CAC 는용액의농도가옅은농도에서짙은농도로갈수록형광강도를확인하여들뜬부분을가르킨다. 고분자를다양한농도에서 463 I /I 457 의값을구한뒤그래프가갑자기증가하는부분을찾는다. 히알루론산분자량 35000 Da의 CAC는 1.0 10-3 단위이고 12000 Da의 CAC 는 1.0 10-4 단위이다. CAC 도 AD 치환율에영향을받았다. 이유는 AD 가치환이많이될수록리포산도많이결합되었으므로그만큼소수성을띠는부분이강해져합성물의농도가더작아도입자를형성할수있었다. AD 로치환된 A. 히알루론산의개질실험은히알루론산의일정부분에리포산을그래프트시키기위한전단계로양쪽에아민기를갖는 AD 를히알루론산의카복실기에결합시켰다. Figure 1은히알루론산에 AD가치환되는개략적인반응도이다. Figure 3은 A-AD 의 1 -NMR 스펙트럼를보여주며 AD 의치환율을예측할수있다. N-aetyl-D-gluosamie 의메틸기의피크가 δ= 1.75~1.85 에서보이며이것을기준으로하여 AD 의치환율을측정할수있었다. 이실험에서는분자량이다른히알루론산을사용하였다. 히알루론산분자량 35000 Da은 50% 정도치환되었고분자량 12000 Da 은 20% 정도치환되었다. 이유는 akoe 에히알루론산의분자량이작아질수록 AD 가그래프트되는것이방해되기때문에분자량이낮은것이더낮은치환율을보였다. 그리고치환여부를확인하기위해서 FT-IR 로분석하였다. 히알루론산의카복실기와 AD 의아민기가합성이되어 CN 의특성피크가나타났다. 이분석을통해히알루론산의카복실부분에성공적으로 AD 가치환되었음을확인할수있었다 (Figure 1). 그래프트공중합체 (A-g-LA). 양친성그래프트공중합체 (Ag-LA) 는 AD 로치환시킨히알루론산의아민기와리포산의카복실기를결합하였다. Figure 2는히알루론산과리포산이결합되어지는개략적인반응도이다. 공중합체의분자구조와화학적성분은 1 -NMR 와 FT-IR 분석을통해서알아보았다. Figure 4는 Ag-LA 의 1 -NMR 스펙트럼으로리포산의 -C---C 2 - 의 N C C N N C3 C3 N a solvet solvet solvet solvet 5 4 3 2 1 Figure 4. 1 -NMR spetrum of A-g-LA(DM:D 2 =1:1). D 2 peak D2 peak a A A-AD A-g-LA CN 5 4 3 2 1 0 Figure 3. 1 -NMR spetrum of A-AD. 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Wavelegth(m) Wav elegth(m) Figure 5. FT-IR asorptio spetra of A, A-AD, ad Ag-LA. Polymer(Korea), Vol. 32, No. 6, 2008
564 홍인림 ᆞ 김영진 0.05 g/l () 0.05 g/l Itesity 0.00001 g/l Itesity 0.00005 g/l 430 440 450 460 470 480 Plot data Wavelegth(m) 430 440 450 460 470 480 Plot data Wavelegth(m) CAC I445/I452 CAC I445/I452-6 -5-4 -3-2 -1 0-6 -5-4 -3-2 -1 0 Log(g/L) Log(g/L) Figure 6. Fluoresee spetra of pyree i water i the presee of ireasig oetratios of the A-g-LA partiles. A(M.W. 35000 Da)-g-LA ad () A(M.W. 12000 Da)-g-LA. Mea diameter:178 m ltesity 0 500 1000 1500 2000 diameter(m) () Mea diameter:390 m ltesity -2000-1000 0 1000 2000 3000 4000 diameter(m) () Figure 7. Partile size distriutio of A-g-LA measured y DL. A(M.W.35000)-g-LA ad () A(M.W. 12000)-g-LA. Figure 8. TEM images of A-g-LA. A(M.W.35000)- g-la ad () A(M.W. 12000)-g-LA. 고분자입자의크기는수용액상에서 dyami light satterig (DL) 를사용하였다. 수용액의농도는 1 mg/ml 로준비하고 satterig agle은 90 고정하고온도는 25 로일정하게유지하여측정하였 폴리머, 제 32 권제 6 호, 2008 년
히알루론산에결합된리포산자기조립체의제조및특성 565 다. 측정결과크기분포는 Figure 7과같이나타났다. 히알루론산분자량 35000 Da에 50% 정도 AD가치환된후리포산이결합된 A-g-LA 의입자크기는 178 m 정도되고분자량 12000 Da 에 20% 정도 AD 가치환된것의입자크기는 390 m 정도된다. A-g-LA 결합물의크기뿐만아니라형태도알아보기위해 Ag-LA 입자수용액을동결건조를한후 trasmissio eletro mirosope(tem) 으로알아보았다. Figure 8과같이입자의형태가구형임을알수있었다. 결론생체친화적고분자인히알루론산은 AD 로개질되어항산화제인리포산과공중합체를형성하였다. 히알루론산의개질은히알루론산의분자량이작아질수록 AD 가그래프트되는것을방해하기때문에분자량이낮은것이큰것보다더낮은치환율을보였다. A-AD 의아민기와리포산의카복실기가결합되었기때문에 AD 의치환율에따라항산화제인리포산의결합정도가달라지게되었다. 이렇게얻어진 A-g-LA 는수용액상에서나노입자를형성하였다. CAC 도 AD 의치환율에영향을받아서치환이많이될수록소수성부분이강해져더작은농도에서입자를형성하게되었다. 입자의크기는분자량이높은히알루론산이소수성부분이더많아져서더작은입자를형성하게되었다. 분자량이높은히알루론산이 AD 의치환율이높아져항산화제인리포산의결합이잘되어소수성물질을전달하는전달체로더적합하며이는비타민A, E와같은지용성비타민을함유한기능성화장품에응용가능하다. 참고문헌 1. A. Gruzma, A. idmi, J. Katzhedler, Adalla aj-yehie, ad hlomo asso, Bioorg. Med. Chem., 12, 1183 (2004). 2. K. Kofiji, M. Nakamura, T. Isoe, Y. Murata, ad. Kawashima, Food Chem., 109, 167 (2008). 3.. Gozalez-Perez ad R. E. Gozalez-Castaeda, Nutr. Res., 26, 1 (2006). 4. R. Weeralkody, P. Faga, ad. L. Kosaraju, It. J. Pharm., 357, 213 (2008). 5.. K. ah, E. J. h,. Miyamoto, ad T. himouji, It. J. Pharm., 322, 44 (2006). 6.. K. ah, J. K. Park, T. Tomimatsu, ad T. himooji, It. J. Bio. Maromol., 40, 374 (2007). 7. Y. K. Ko,.. Kim, J.. eog, J. Y. Lim, ad G. Khag, Polymer(Korea), 31, 505 (2007). 8.. J. Kim,. K. ah, M. J. Kim, D.. Kim, ad Y. P. Lee, J. Cotrol. Release, 104, 323 (2005). 9. Y. Luo, K. R. Kirker, ad G. D. Prestwih, J. Cotrol. Release, 69, 169 (2000). 10. E. J. h, J.. Kim, ad. K. ah, Key Egieerig Materials, 342, 525 (2007). 11. F. Palumo, G. Pitarresi, D. Madrahia, G. Tripodo, ad G. Giammoa, Carohyd. Polym., 66, 379 (2006). 12. Y.. Wag, L. R. Liu, ad Q. Q. Zhag, Eur. Polym. J., 43, 43 (2007). 감사의글 : 본연구는대덕연구개발특구지원본부에서지원을받아이루어진것으로이에감사를드립니다 ( 과제번호 :M12008- M07010181). Polymer(Korea), Vol. 32, No. 6, 2008