22장 기체, 액체 크로마토그래피

Daniel C. Harris Exploring Chemical Analysis Fourth Edition Chapter 22: Gas and Liquid Chromatography Copyright 2005 by W. H. Freeman & Company 1

22 장기체, 액체크로마토그래피

질량분석계의입구에대해약 5 kv 의전위차가적용되는모세관으로부터액체의전기분무 3

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세포의 retinoic acid 와결합한단백질의전기분사질량스펙트럼 5

22-1 기체크로마토그래피 그림 22-1. 기체크로마토그래피의개략도 6

기체 ( 또는휘발성액체 ) 시료 고무마개 (septum) 가열된주입구 (injector port) 시료의증발 칼럼 검출기 오븐 (3) : 기체상태유지 7

칼럼 (column) 열린관칼럼 (open tubular column) 그림 22-2 기벽코팅, 지지체 - 코팅, 다공성 - 층칼럼의단면도. 현미경사진은용융실리카열린관칼럼내부의다공성탄소정지상을보여준다. 8

열린관칼럼 정지상 : 내벽에코팅된액체또는고체 용융실리카 (SiO 2 ) 로제작 꼬리끌기 (tailing) : 정지상이벗겨져서실리카표면의 Si-O-H 가노출되어극성화합물들을강하게붙드는경우발생 Bleeding : 높은온도에서정지상이칼럼에서빠져나오는현상 9

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분리에미치는칼럼극성의영향 - 비극성정지상 11 비극성정지상 : 끓는점이증가하는순서로용출 그림 22-3 70 o C 에서 0.32 mm ( 직경 ) x 30 m ( 길이 ) 의열린관칼럼에 1μm 두께로입혀진비극성이강한 poly(dimethylsiloxane) 정지상에의한화합물의분리

분리에미치는칼럼극성의영향 - 비극성정지상 12 4 alkanes 3 ketones 3 alcohols 그림 22-3 70 o C 에서 0.32 mm ( 직경 ) x 30 m ( 길이 ) 의열린관칼럼에 1μm 두께로입혀진극성이강한 polyethylene glycol 정지상에의한화합물의분리

고체정지상 나노크기의동공을갖고있는다공성탄소, 분자체 (molecular sieve) H 2, O 2, N 2, CO 2, CH 4 와같은작은분자들의분리 그림 22-2 용융실리카열린관칼럼내부의다공성탄소정지상을보여준다. 13

분리도 vs. 시료의양 14 그림 22-5 5A 분자체를정지상으로이용한 GC. 위의크로마토그램은 40 0 C 에서 3.2 mm ( 직경 ) x 4.6 m ( 길이 ) 의충전칼럼을이용하여각성분의농도가 1 ppm 인시료 1 ml 를주입하여얻었고, 아래의크로마토그램은 30 o C 에서 0.32 mm ( 직경 ) x 30 m ( 길이 ) 의열린관칼럼에같은농도의시료 4 μl 를주입하여얻었다.

보호칼럼 (guard column) 칼럼앞에위치, 5~10 m 길이 정지상은없고내부벽은 silanized : 용질의머무름최소화 실란화 : 극성 OH 비극성 OSi(CH 3 ) 3, 꼬리끌기제거 비휘발성화합물이칼럼에유입되는것방지 15

온도프로그래밍 (temperature programming) 칼럼의온도증가 용질의증기압증가 머무름시간감소 넓은범위의끓는점과극성을갖는물질의분리 온도프로그래밍이용 그림 22-6 비극성정지상인충전칼럼에서선형알케인을포함하는각시료들의 (a) 등온과 (b) 온도프로그래밍크로마토그래피의비교. 검출기의감도는 (a) 가 (b) 보다 16 배높다. 16

운반기체 용질의확산속도가 N 2 에서보다 He, H 2 에서더빠르기때문 그림 21-9. 중간정도의흐름속도에서가능한최적분리도. 이동상으로 N 2, He 혹은 H 2 를사용하고 175 에서측정한 n-c 17 H 36 의기체크로마토그래피에서얻은단높이의곡선. 17

시료주입 (X) 그림 22-7 열린관칼럼안으로주입하는 (a) 분할주입, (b) 비분할주입, (c) 칼럼내주입장치. 18

GC 검출기 불꽃이온화검출기 (flame ionization detector) 열전도도검출기 (thermal conductivity) 전자포착검출기 (electron capture detector) 19

불꽃이온화검출기 (flame ionization detector) 시료중의탄소원자 수소와공기혼합물에의해연소 CHO + 이온생성 음극으로이동 전류발생 전류 농도 O 2, CO 2, H 2 O, NH 3 에대해무감응 그림 22-8. 불꽃이온화검출기 20

열전도도검출기 (thermal conductivity) 운반기체 : H 2, He 열전도도우수 운반기체 + 시료 열전도도감소 필라멘트의온도증가 저항증가 전압증가 농도 운반기체를제외한모든기체에감응 그림 22-9. 열전도도검출기 21

전자포착검출기 (electron capture detector) 63 Ni β - ( 높은에너지의전자 ) β - + N 2 N 2 + + 2e - ( 양극으로이동 ) 전자친화도가큰분자 (halogen containing) + e - 전자의일부를포획 전류감소 전류의감소 시료의농도 22

James Ephraim Lovelock (1919 ~ ) Lovelock invented the electron capture detector, which ultimately assisted in discoveries about the persistence of CFCs and their role in stratospheric ozone depletion. Lovelock was the first to detect the widespread presence of CFCs in the atmosphere. He found a concentration of 60 parts per trillion of CFC-11 over Ireland He found the gas in each of the 50 air samples that he collected but, not realising that the breakdown of CFCs in the stratosphere would release chlorine that posed a threat to the ozone layer, concluded that the level of CFCs constituted "no conceivable hazard. 23

The damage caused to the ozone layer by the photolysis of CFCs was later discovered by Sherwood Rowland and Mario Molina. After hearing a lecture on the subject of Lovelock's results, they embarked on research that resulted in the first published paper that suggested a link between stratospheric CFCs and ozone depletion in 1974, and later shared the 1995 Nobel Prize in Chemistry (with Paul Crutzen) for their work. 24

O 3 의분해 (1)CCl 2 F 2 hv CClF 2 Cl (2)Cl O (3)O 3 net : 2O 3 3 ClO O hv O O (4)O ClO Cl O 3O 2 2 2 2 1987 년분광법으로측정한남극성층권에서의 O 3 와 ClO 의농도. ClO 가증가하는위도에서 O 3 의감소는오존의분해과정과잘일치하고있다.

The Nobel Prize in Chemistry 1995 was awarded jointly to Paul J. Crutzen, Mario J. Molina and F. Sherwood Rowland "for their work in atmospheric chemistry, particularly concerning the formation and decomposition of ozone". Paul J. Crutzen Mario J. Molina F. Sherwood Rowland 26

22-2 고전액체크로마토그래피 고전 LC (vs. HPLC) 정지상이들어있는열린칼럼 중력을이용하여시료와용리액주입 HPLC 고압, 밀폐된칼럼, 펌프이용 27

그림 21-1. 크로마토그래피분리. 용질 A 는용질 B 보다정지상에대한친화력이더크다. 그래서 A 는 B 보다칼럼에더오래머문다. 크로마토그래피란용어는 1903 년에 M. Tswett 의실험으로부터유래되었는데그는고체 CaCO 3 ( 정지상 ) 로채워진칼럼과탄화수소용매 ( 이동상 ) 로식물의색소를분리했다. 색깔을띤띠들의분리이기때문에 색 이라는뜻을가진그리스어의크로마토스 (chromatos) 로부터크로마토그래피란이름이유래되었다. 28

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정지상 - 흡착크로마토그래피 실리카 (silica, SiO 2 xh 2 O) 알루미나 (alumina, Al 2 O 3 xh 2 O) 슬러리형태로칼럼에충전 31

용매 - 흡착크로마토그래피 정지상의흡착자리에대해용질과경쟁 용리 : 용질을용매로치환시키는것 Figure 22-12 Solvent molecules compete with solute molecules for binding sites on the stationary phase. The more strongly the solvent binds to the stationary phase, the greater the eluent strength of the solvent. 32

용리서열 (eluotropic series) 용질을치환시킬수있는용매의능력 펜테인 : 0 용매의극성증가 용리액세기증가 용질의머무름시간감소 ( 더빨리용리 ) 기울기용리 낮은세기의용매 ( 약하게흡착한용질용리 ) 용리액세기증가 강하게흡착된용질용리 33

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22-3 고성능액체크로마토그래피 High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) 높은압력, 마이크로크기입자로충전된칼럼 Figure 22-13 Typical laboratory equipment for HPLC. 35

칼럼 직경 1~5 mm, 길이 5~30 cm, 5 만 ~10 만단 /m 정지상의입자크기감소 분리도증가 Figure 22-15 (a and b) Chromatograms of the same sample run at the same linear velocity on 5.0 cm-long columns packed with C 18 -silica of different particle size. (c) A stronger solvent was used to elute solutes more rapidly from the column in panel b. 36

정지상 정상 (normal-phase) 크로마토그래피 극성정지상 + 비극성용매 극성용매를더할수록용리액세기증가 역상 (reverse-phase) 크로마토그래피 비극성 ( 약한 ) 극성정지상 + 극성용매 비극성이증가할수록용리액세기증가 분리성능증가, 꼬리끌기제거 37

? Low? High?? Low? High?? A>B>C or C>B>A? 38

지지체 (stationary phase support) 1.5~10 μm의미세다공성실리카입자 39

흡착크로마토그래피 용질은실리카입자표면에흡착 액체 - 액체분배크로마토그래피 실리카표면의 silanol group 에공유결합된결합정지상에서분배 가장일반적칼럼 : octadecyl (C18) 칼럼 40

Bonded polar phases Bonded nonpolar phases R=(CH 2 ) 3 NH 2 amino R=(CH 2 ) 17 CH 3 octadecyl R=(CH 2 ) 3 C N cyano R=(CH 2 ) 7 CH 3 octyl R=(CH 2 ) 2 OCH 2 CH(OH)CH 2 OH diol R=(CH 2 ) 3 C 6 H 5 phenyl 41

광학이성질체 (optical isomers) 거울상을가지고있는화합물 광학이성질체정지상을이용하여분리 42

Figure 22-17 (a) HPLC separation of the two optical isomers (mirror image isomers) of the drug Naproxen eluted with 0.05 M ammonium acetate in methanol. Naproxen is the active ingredient of the anti-inflammatory drug Aleve. (b) Structure of the bonded stationary phase. 43

칼럼 44 Figure 22-18 HPLC column with replaceable guard column to collect irreversibly adsorbed impurities. Titanium frits distribute the liquid evenly over the diameter of the column.

Figure 22-19 Injection valve for HPLC. Replaceable sample loop comes in various fixed-volume sizes 45

용매 등용매용리 (isocratic elution) 한가지용매나균일용매혼합물로용리 기울기용리 (gradient elution) 용리액의세기증가 46

Figure 22-20 Isocratic HPLC separation of a mixture of aromatic compounds at 1.0 ml/min on a 0.46 x 25 cm Hypersil ODS column (C 18 on 5- μm silica) at ambient temperature (~22 o C): (1) benzyl alcohol ~ (8) o-methoxybiphenyl. Eluent consisted of aqueous buffer (designated A) and acetonitrile (designated B). The notation 90% B in the first chromatogram means 10 vol% A and 90 vol% B. The buffer contained 25 mm KH 2 PO 4 plus 0.1 g/l sodium azide adjusted to ph 3.5 with HCl. 47

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Figure 22-21 Gradient elution of the same mixture of aromatic compounds shown in Figure 22-20 with the same column, flow rate, and solvent. The upper trace is the segment gradient profile, as named because it is divided into several different segments. 50

Figure 22-21 Gradient elution of the same mixture of aromatic compounds shown in Figure 22-20 with the same column, flow rate, and solvent. Figure 22-21 Gradient elution of the same mixture of aromatic compounds shown in Figure 22-20 with the same column, flow rate, and solvent. 51

검출기 자외선검출기 (UV detector) 수은램프의 254 nm 이용 자외선을흡수하는물질의분석에만사용가능 Figure 22-22 Light path in a micro flow cell of a spectrophotometric detector. Cells are available with a 0.5- cm pathlength containing only 10 μl of liquid. 52

굴절률검출기 (refractive index detector) 모든용질에감응, UV 검출기보다높은검출한계 용매를바꾸면바탕선이변하므로기울기용리에는사용불가 용질과용매의굴절률이다르므로용출액에의한빛의굴절을측정 53

기화빛 - 산란검출기 (evaporative light scattering detector) 용출액의증발 미립자의에어로솔 빛의산란 전기화학검출기 (electrochemical detector) 용출액이지나가는전극에서산화나환원이될수있는물질에감응 The End

Chapter Summary Homework 22장 12월 5일오전 10시까지 객관식문제는제외 A4 양면 55