ISSN 0377-9556 (PRINT) ISSN 2383-9457 (ONLINE) 약학회지제 62 권제 5 호 313~318 (2018) Yakhak Hoeji Vol. 62, No. 5 DOI 10.17480/psk.2018.62.5.313 종설 Short Report 혈관생성연구를위한세포혼합평가법개발 강규태 # 덕성여자대학교약학대학, 덕성혁신신약센터 (Received September 4, 2018; Revised October 2, 2018; Accepted October 2, 2018) Two-cell tube formation assay system for angiogenesis research Kyu-Tae Kang # College of Pharmacy, Duksung Innovative Drug Center Duksung Women s University Abstract Blood vessels are formed by two cell types: endothelial cells and vascular mural cells. However, most in vitro angiogenesis assays are performed by only endothelial cells. Here, we developed an in vitro angiogenesis assay system using two human vascular cell precursors: endothelial colony forming cells (ECFC) and mesenchymal stem cells (MSC). The progression of tube formation was monitored by a real-time cell recorder for 24 hours. We also utilized an image-stitching software to increase the analyzed image area up to 9-times larger than one image from 10X object lens. Tube number was higher in ECFC+MSC than ECFC at 6 hour time point, but became lower at 12 and 24 hours when compared with ECFC. The length per tube was higher in ECFC+MSC than ECFC at all-time points. VEGF treatment increased tube formation in both ECFC+MSC and ECFC. Vatalanib, VEGF inhibitor, inhibited tube formation of ECFC dose-dependently. Interestingly, ECFC+MSC-induced tube formation was not changed by vatalanib, suggesting that MSC may potentiate the stability and durability of tubular structures. These results indicate that two-cell tube formation assay system can mimic in vivo angiogenic process by two vascular cells, and will be an effective pre-clinical in vitro assay model to evaluate pro- or anti-angiogenic property. Keywords endothelial colony forming cells, mesenchymal stem cells, angiogenesis, tube formation assay 서 론 (Introduction) 혈관생성은 vasculogenesis와 angiogenesis의과정을거쳐형성된다. 1) Vasculogenesis는혈관내피전구세포 (endothelial progenitor cells or endothelial colony forming cells; ECFC) 가혈관내피세포 (endothelial cells) 로분화하면서혈관구조의내벽을형성한다음, 그외벽을중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cells; MSC) 에서분화된혈관벽세포 (vascular mural cells) 가감싸면서새로운혈관이만들어지는과정을의미한다. 2) 반면에 angiogenesis # Corresponding Author Kyu-Tae Kang College of Pharmacy, Duksung Innovative Drug Center Duksung Women s University 01369, Samyangro 144-gil 33, Dobong-gu, Seoul, Republic of Korea Tel.: 02-901-8738 Fax.: 02-901-8386 E-mail: ktkang@duksung.ac.kr 는기존의혈관을구성하고있던혈관내피세포가자극에의해활성화되면서바깥방향으로혈관발아 (sprouting) 를하고, 새로뻗어나간혈관의외벽을혈관벽세포가둘러싸면서새로운혈관이형성되는과정이다. 3) 성인의경우, 임신중의태반이나상처재생과같은생리적상황에서일시적으로혈관생성이일어난다. 4) 그러나, 특정질환상태에서는비정상적인혈관생성이유도될수있는데, 예를들면당뇨병성망막병증, 류마티스성관절염, 건선, 습성황반변성, 악성종양과같은질병상태에서는혈관생성이비정상적으로과도하게유발되고, 반대로심근경색과같은허혈성조직에서는불충분한혈관생성의양상이나타난다. 4) 혈관생성은혈관내피세포의증식, 부착, 이동, 혈관구조형성과, 혈관벽세포의혈관안정화가관여하는다단계과정으로, 혈관신생유도인자들과억제인자들에의해정교하게조절된다. 이러한일련의조절과정에이상이발생하면다양한질병의원인이되기도하고, 또는질병의악화요인으로작용하기도한다. 4) 따라서, 많은제약회사와연구소에서혈관생성을조절하는약물을개 313
314 강규태 발하기위해많은노력을기울여왔으나, 이제까지임상허가를받은약물은 Bevacizumab (Avastin, Genetech-Roche), Sunitinib (Sutent, Pfizer) 등몇가지약물에불과하다. 5) 약물을개발하는과정에서 in vitro 평가법의데이터는동물실험과임상실험으로의진행여부를판단하는데있어서중요한근거가된다. 따라서생체내의현상을보다유사하게모사할수있는 in vitro 평가법의개발이끊임없이요구된다. 현재까지다양한 in vitro 혈관작용평가법들이개발되었는데, 그중 in vitro 혈관생성평가법 (tube formation assay) 은혈관생성유도및억제약물을발굴하고그기전을연구하는대표적인평가법으로서널리활용되어져왔다. 6,7) 그러나대부분의실험실에서혈관생성평가법은제대정맥혈관내피세포 (human umbilical vein endothelial cell, HUVEC) 또는피부미세혈관내피세포 (human dermal microvascular endothelial cells, HDMEC) 등과같은혈관내피세포한종류의세포만을활용하여수행되어지고있다. 6) 생체내에서일어나는혈관생성과정은혈관내피세포가새로운혈관의내벽을형성한다음, 혈관벽세포가새롭게형성된혈관의외벽을감싸면서완성되는데, 이때두세포간의상호작용이중요하게작용한다. 8) 따라서, 본연구에서는혈관을구성하는두종류의세포인혈관내피세포와혈관벽세포의전구세포들, 즉 ECFC와 MSC의혼합배양을통하여생체내에서일어나는혈관생성을보다유사하게모사할수있는 in vitro 세포혼합배양혈관생성평가법을구축하고자시도하였고, 새로운평가법을혈관생성유도인자인 vascular endothelial growth factor (VEGF) 와 VEGF receptor tyrosine kinases 억제제인 vatalanib로검증하였다. 실험방법 (Experimental Methods) 세포분리및배양본연구방법은덕성여자대학교 IRB의승인을받았다 (IRB approval No. 2017-002-001). ECFC는말초혈액에서분리한단핵구 (mononuclear cell) 에서 CD31-coated magnetic beads (Invitrogen, Carlsbad, MA, USA) 를이용하여정제하였다. 9) 분리된 ECFC는 1% gelatin (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) 으로코팅된 plate에서 10% fetal bovine serum (FBS; Atlas Biologicals, Fort Collins, CO, USA), 100 U/mL penicillin (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 100 µg/ml streptomycin (Thermo Fisher Scientific) 이포함된 endothelial growth medium-2 (EGM-2, without hydrocortisone; Lonza, Basel, Switzerland) 로배양하였다. 모든실험에서 ECFC 는 5-8회계대한세포를실험에사용하였다. MSC는 Lonza사에서구입하여 10% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 µg/ml streptomycin이포함된 MSC growth medium (Lonza) 에서배양하였다. MSC는 5-8회계대한세포를실험에사용하였다. In vitro 세포혼합배양혈관생성평가법구축 24-well culture plate의각각의 well을 ice-cold Matrigel solution (Phenol Red-Free; BD Biosciences) 으로코팅 (100 µl/ well) 한후, 37 o C에서최소 30분간 gelation하였다. Trypsin을처리하여떼어낸 ECFC와 MSC를 FBS-reduced 배지 (2%) 에혼합하여 15 10 4 cells/1 ml/well 세포농도로 Matrigel-coated well 에 seeding하였다. 세포를 seeding한 plate를 37 o C 인큐베이터내에설치된실시간세포촬영장비 (real-time cell recorder; NanoEnTek, Seoul, Korea) 에장착한후, 10X 대물렌즈를활용하여각 well마다지정된위치에서세포가혈관구조를형성하는과정을 24시간동안 1시간마다촬영하였다. 혈관생성분석 10X 대물렌즈를이용하여각 well마다 3 3 배열로 9개의이미지를한시간마다획득한후, image-stitching software (NanoEnTek) 를이용하여각시간대별로 3 3 stitched image를완성하였다. 3 3 stitched image는 10X 대물렌즈하나의이미지보다 9배넓은면적을정량적분석에활용할수있기때문에, 혈관생성정도를보다정확하게분석할수있는장점이있다. 혈관생성정도는 Image J software (NIH, Bethesda, MD, USA) 를이용하여혈관구조의개수와길이로측정하였다. 통계처리모든그래프는최소 3번의독립적인반복실험을통해얻어진평균값 ± 표준오차로제작하였다. 통계학적유의성은 Origin software (OriginLab, Northampton, MA, USA) 을이용하여처리하였는데, 세개이상의실험군들간의통계학적유의성은 oneway ANOVA 및 post hoc test인 Fishers least significant difference를시행하여판정하였고, 두개의실험군간의통계학적유의성은 Student s t-test를시행하여판정하였다. p값이 0.05 이하인경우통계학적으로유의한것으로판정하였다. 결과및고찰 (Results and Discussion) 모든혈관은혈관내피세포와혈관벽세포두종류의세포로이루어져있다. 새로운혈관의생성도혈관내피세포와혈관벽세포의상호작용에의해촉진되고완성된다. 본연구에서는생체내의혈관생성과정을유사하게모사하기위해혈관을구성하는두세포의전구세포인 ECFC와 MSC를혼합배양하는방법을혈관생성평가법에도입하였다. 이제까지대부분의혈관생성평가법은 HUVEC, HDMEC 등과같은성숙한혈관내피세포한종류만을활용해왔는데, 성숙한세포들은계대배양과정을거치면서증식능력과분화능력이감소하는경향이있고 10), 이러한형질의변화는세포의혈관생성능력의저하를야기할수있 Vol. 62, No. 5, 2018
세포혼합혈관생성평가법 315 다. 본연구에서는이러한한계점을개선하기위하여혈관을구성하는세포들의전구세포를혈관생성평가법에활용하고자하였다. 혈관내피세포의전구세포로는 ECFC를도입하였는데, ECFC 는 endothelial progenitor cells (EPC) 의한부류로서 late-epc 로도불린다. Asahara et al. 11) 에의해혈액에서처음분리된 EPC 는강력한증식능력을가진전구세포로서, 다시 early-epc와 late-epc로나뉜다. early-epc는혈관생성인자들을분비하는역할이밝혀진반면, later-epc는혈관내피세포로의분화능력이보고되었다. 12) 골수에서유래되어혈관을순환하는 late-epc 인 ECFC는다양한질병상태에서혈관생성과정에관여한다. 예를들면, ECFC는허혈성병변에몰려들어혈관내피세포로분화하여새로운혈관생성에기여한다는사실이보고되었다. 13) 또한, 종양조직에서비정상적으로생성된암혈관의내피세포중 40% 가골수에서유래된 ECFC로부터분화한것이라는사실도보고되었다. 14) 따라서, 지속적인증식능력과분화능력을보유하고있으며다양한질병상태에서혈관생성에관여하는 ECFC 를혈관생성평가법에도입하는것은혈관생성작용을평가하고약물을발굴하는데보다정확하고의미있는결과를도출할수있을것이다. 혈관벽세포의전구세포로는 MSC를선택하였다. MSC는다양한세포로분화할수있는줄기세포로서, 기존의보고에의하면, ECFC와혼합배양시세포간상호작용에의하여혈관벽세포로분화된다는사실이밝혀졌다. 15) 또한, 실험동물의대퇴부허혈부위에 ECFC와 MSC를혼합하여주입했을경우, ECFC를단독으로주입했을때보다혈관생성이증가되고허혈부위도유의하게감소시키는것이관찰되었다. 16) 이와같은기존의연구결과들을바탕으로, 본연구에서는 in vivo 혈관생성과정에미치는효과를보다정밀하게측정하기위하여 in vitro 세포혼합배양혈관생성평가법의개발을시도하였다. 혈관생성과정은실시간세포촬영장비를활용하여각 well마다지정된위치를한시간간격으로 24 시간동안측정하였다. 그리고, image-stitching software를이용하여 3 3 배열의 9장 image들을연결하여 9배넓은영역의 image를정량적분석에활용함으로써분석과정의오차를줄이고자하였다 (Fig. 1). 혈관생성을유도하는데가장적절한 ECFC와 MSC의혼합비율을결정하기위하여, ECFC와 MSC를각각 0:1, 2:1, 3:1, 4:1, 9:1 Fig. 1 Comparison of image areas. (A) A single image taken with a 10X object lens. (B) A 3 3 stitched image made by nine images side-by-side taken with a 10X object lens. Fig. 2 Tube formation from ECFC+MSC. Representative images of the tubular structures formed by ECFC+MSC with different ratios for 24 hours (scale bar is 700 µm in the ratio of ECFC:MSC = 0:1, 2:1, 3:1, and 300 µm in the ratio of ECFC:MSC = 4:1, 9:1). J. Pharm. Soc. Korea
316 강규태 비율로혼합하여실험을실시하였다. 생체내미세혈관의혈관내피세포와혈관벽세포의비율은 1:1에서 10:1까지의범위로알려져있다. 17) 실험결과, ECFC와 MSC을 0:1, 2:1, 3:1로혼합한경우에는혈관구조가거의형성되지않았지만, 4:1과 9:1 비율로혼합한경우유효한혈관구조가형성됨을관찰할수있었다 (Fig. 2). 4:1과 9:1 비율모두 6시간째혈관개수가가장많이 증가하였고, 단위혈관당길이는 24시간대에서가장길게측정되었는데, 번복실험을수행한결과 9:1 비율에서혈관생성정도가재연성있게도출되었다. 이러한실험결과에근거하여 ECFC:MSC 혼합비율을 9:1로결정하고후속실험을진행하였다. ECFC+MSC 혼합배양혈관생성평가법과 ECFC 단일배양평가법에의한혈관생성정도를비교하였다 (Fig. 3). 혈관생 Fig. 3 Progression of tube formation from ECFC or ECFC+MSC in the presence and absence of VEGF. (A) Representative images of the tubular structures formed by ECFC or ECFC+MSC for 24 hours (scale bar = 300 µm). (B) Graph of the tube number formed by ECFC or ECFC+MSC with/without VEGF treatment for 24 hours (n = 3). (C) Graph of the length per tube formed by ECFC or ECFC+MSC with/without VEGF treatment for 24 hours (n = 3). (D) Statistical analysis of the tube number comparing 6, 12, and 24 hours (n = 3). (E) Statistical analysis of the length per tube comparing 6, 12, and 24 hours (n = 3). * indicates a significant difference (P 0.05) between groups. Vol. 62, No. 5, 2018
세포혼합혈관생성평가법 317 성정도는형성된혈관의개수와단위혈관당길이로측정하였다. ECFC 단일배양에서는첫 6시간까지혈관의개수가증가하였고, 그이후에는비슷하게유지되었다 (Fig. 2A, 2B). 반면에 ECFC+MSC 혼합배양에서는첫 6시간까지혈관개수가급격히증가하였고, 그이후에는감소하는것이관찰되었다 (Fig. 2A, 2B). 두실험군을비교해볼때, 6시간대에서는 ECFC+MSC가 ECFC에비해혈관의개수가유의하게증가하였고, 24시간대에서는 ECFC+MSC가 ECFC와비해오히려유의하게감소하였다 (Fig. 1B, 1D). 그러나, 단위혈관당길이는 6, 12, 24 시간대모두에서 ECFC+MSC가 ECFC보다유의하게증가한것으로측정되었다 (Fig. 1C, 1E). 이전의연구결과에의하면, MSC는 VEGF를비롯한다양한혈관생성인자들을분비한다는것이밝혀졌다. 15,18) VEGF는혈관생성초기단계에강력하게작용하여혈관의투과성과혈관신생을유도한다. 19) MSC는또한새롭게형성된혈관의외벽을감쌈으로써혈관의안정화에기여하는기능도제시되었다. 15) Fig 3B의결과에서보는바와같이, ECFC+MSC의혈관생성이 ECFC보다 6 시간대에증가하는것은 MSC의혈관생성촉진작용에기인한것으로사료된다. 혈관생성유도인자인 VEGF를처리하였을때 ECFC+MSC 혼합배양과 ECFC 단독배양에서혈관생성변화를관찰하였다. 6, 12 시간대에서는 ECFC+MSC와 ECFC 모두 VEGF (30 ng/ml) 를처리한실험군에서 VEGF를처리하지않은대조군에비해혈관의개수가증가하였다 (Fig. 1B, 1D). 그러나, 24 시간대에서는 VEGF를처리한실험군과처리하지않은대조군사이에차이를보이지않았다 (Fig. 1B, 1D). 이와같은결과로부터, VEGF은혈관생성초기에작용하여혈관의개수를증가시킨다는것을확인할수있었다. 단위혈관당길이의변화도측정하였는데, VEGF 처리는 ECFC에의해생성된혈관의길이에는영향을미치지않았다 (Fig. 1C, 1E). 그러나, ECFC+MSC에서는 6, 12시간대에단위혈관당길이가 VEGF 처리에의해감소하는경향이나타났다 (Fig. 1C, 1E). 이는같은관찰시간대에혈관개수가 VEGF 처리에의해증가하면서결과적으로단위혈관당길이의감소를유발하는것으로판단된다. 혈관의개수가비슷해지는 24시간대에는단위혈관당길이도유사하였다 (Fig. 1E). 본연구결과를통해 VEGF에의한혈관생성과정에서혈관벽세포의전구세포인 MSC의유무가혈관생성패턴에영향을미침을확인할수있었다. 본연구에서개발한 ECFC+MSC 혼합배양혈관생성평가법을활용하여 VEGF receptor tyrosine kinases 억제제인 vatalanib의효능을측정하였다. ECFC 단일배양평가법에서는 vatalanib가용량의존적으로혈관의개수를감소시켰다 (Fig. 3A, 3B). 그러나 ECFC+MSC 혼합배양평가법에서는 vatalanib 처리군에서혈관개수억제효과가나타나지않았다 (Fig. 3A, 3B). 이는 ECFC+MSC 혼합배양시 MSC가분비하는다양한혈관 Fig. 4 Inhibitory effect of vatalanib on the tube formation from ECFC or ECFC+MSC. (A) Representative images of the tubular structures formed by ECFC or ECFC+MSC with/ without vatalanib treatment at 12 hour (scale bar = 300 µm). (B) Statistical analysis of the tube number formed by ECFC or ECFC+MSC with vatalanib treatment at 12 hour (n = 3). * indicates a significant difference (P 0.05) between groups. 생성인자들에의해혈관생성이촉진되고, 15) 또한 ECFC에의해 MSC가혈관벽세포로분화되면서생성된혈관의안정성에기여함으로써 15) vatalanib의효과가유의미하게보이지않았음을의미한다. 이와같은결과로부터, 혈관생성을효과적으로억제하는약물을찾기위해서는 ECFC+MSC 혼합배양혈관생성평가법을활용하여유효한결과를도출하는것이동물실험과임상실험에서효과를나타내는약물을개발하는데효율성을높일수있을것으로사료된다. 결 론 (Conclusion) 본연구에서는생체내의혈관을구성하는세포들을혼합배양함으로써생체내에서일어나는혈관생성과정을보다유사하게모사할수있는혈관생성평가법을제시하였다. ECFC+ MSC 혼합배양혈관생성평가법은단일세포평가법과비교하여혈관개수가초기에증가하고, 시간이갈수록혈관개수는감소하면서남아있는혈관의길이가길어지는것이관찰되었다. 이는혈관벽세포의전구세포인 MSC가혈관생성인자를분비하 J. Pharm. Soc. Korea
318 강규태 여 ECFC의혈관생성을촉진시키고, 또한새롭게형성된혈관구조를안정화시키는혈관벽세포로서의역할에기인한것으로사료된다. 따라서, 새로운평가법은혈관작용물질에대한동물실험결과를 in vitro 실험적으로보다정확하게예측할수있을것으로사료되며, 향후혈관생성유도및억제약물을검색하고기전을연구하는전임상연구에서유용하게사용될수있을것이다. 감사의말씀 (Acknowledgment) 본연구는 2018년도식품의약품안전처의연구개발비 (17172MFDS215) 와, 2018년도정부 ( 교육부 ) 의재원으로한국연구재단의지원을받아수행된기초연구사업임 (2016R1A6A 1A03007648). References 1) Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature 386, 671 (1997). 2) Patan, S. Vasculogenesis and angiogenesis. Cancer Treat Res 117, 3 (2004). 3) Carmeliet, P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med 6, 389 (2000). 4) Carmeliet, P. & Jain, R.K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature 407, 249 (2000). 5) Rajabi, M. & Mousa, S.A. The Role of Angiogenesis in Cancer Treatment. Biomedicines 5 (2017). 6) Arnaoutova, I. & Kleinman, H.K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc 5, 628 (2010). 7) Tahergorabi, Z. & Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci 15, 1110 (2012). 8) Stapor, P.C., Sweat, R.S., Dashti, D.C., Betancourt, A.M. & Murfee, W.L. Pericyte dynamics during angiogenesis: new insights from new identities. J Vasc Res 51, 163 (2014). 9) Melero-Martin, J.M. & Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods Enzymol 445, 303 (2008). 10) Delia, D. et al. CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro. Blood 81, 1001 (1993). 11) Asahara, T. et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 275, 964 (1997). 12) Melero-Martin, J.M. et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood 109, 4761 (2007). 13) Murasawa, S. & Asahara, T. Endothelial progenitor cells for vasculogenesis. Physiology (Bethesda) 20, 36 (2005). 14) Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K. & Heissig, B. Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for antiangiogenesis therapy? Nature reviews. Cancer 2, 826 (2002). 15) Melero-Martin, J.M. et al. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord bloodderived progenitor cells. Circ Res 103, 194 (2008). 16) Kang, K.T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A. & Bischoff, J. Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats. Angiogenesis. 17) Geevarghese, A. & Herman, I.M. Pericyte-endothelial crosstalk: implications and opportunities for advanced cellular therapies. Transl Res 163, 296 (2014). 18) Lin, R.Z., Moreno-Luna, R., Zhou, B., Pu, W.T. & Melero-Martin, J.M. Equal modulation of endothelial cell function by four distinct tissue-specific mesenchymal stem cells. Angiogenesis 15, 443 (2012). 19) Hoeben, A. et al. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev 56, 549 (2004). Vol. 62, No. 5, 2018