Korean Journal of Microbiology (2016) Vol. 52, No. 1, pp. 120-124 pissn 0440-2413 DOI http://dx.doi.org/10.7845/kjm.2016.6009 eissn 2383-9902 Copyright c 2016, The Microbiological Society of Korea 단보 DNA 형태적응을거쳐 P2sir- 관련도움파지비효율성을극복하는박테리오파지 P4 sid + 유도체정성연구 김경진 * 선문대학교건강보건대학 BT- 융합제약공학과 Characterization of the bacteriophage P4 sid + derivative overcoming P2sir-associated helper inefficiency through DNA conformational adaptation Kyoung-Jin Kim* Department of BT-Convergent Pharmaceutical Engineering, College of Health Sciences, Sunmoon University, Asan 31460, Republic of Korea (Received February 25, 2016; Revised March 21, 2016; Accepted March 21, 2016) ABSTRACT: A certain size of DNA (28 29 kb long) to be packaged into P2-size head and the mutation in sid gene of bacteriophage P4 are the major factors to overcome P2 sir-associated helper inefficiency. To clarify whether the presence of sid mutation is essential to overcome P2 sir-associated helper inefficiency or not, we tested the P4 derivative, P4 delri::kmr, which is sid + and whose genome size supposed to be 28.5 kb long in the case of being packaged into P2 sir3-sized large head. As P4 delri::kmr showed the low EOP with P2 sir3 lysogen, P4 delri::kmr phage stock was prepared in P2 sir3 lysogen host to increase the EOP with P2 sir3 lysogen. Through this process, P4 delri::kmr had been adapted for P2 sir3 lysogen. With a CsCl buoyant equilibrium density gradient experiment and gel electrophoresis of the isolated DNA, it was evident that the adaptation of P4 delri::kmr for P2 sir3 lysogen was caused by the conformational change of DNA to be packaged into large head. The burst size determination experiments with P4 delri::kmr phage stock adapted for P2 sir3 lysogen and normal P4 delri::kmr phage stock showed that not the sid mutation but the size of DNA to be packaged (28 29 kb long) was essential to overcome P2 sir-associated helper inefficiency. Key words: adaptation, bacteriophage P2-P4, DNA conformation, sid mutation, sir mutation 박테리오파지 P4는머리와꼬리를생성하는유전자를갖고있지않으므로, Escherichia coli 세포내에플라스미드상태로있다가도움파지 (helper phage) 인박테리오파지 P2가존재할때만파지로증식할수있는위성파지 (satellite phage) 이다 (Bertani and Six, 1988). 박테리오파지 P4는박테리오파지로증식할때박테리오파지 P2의머리와꼬리생성유전자를이용하는데, 박테리오파지 P2의유전체보다 1/3 정도작은자신의유전체를 packaging하기에알맞게작은머리생성을위해머리크기결정유전자인 sid (size determination) 를갖고있다 *For correspondence. E-mail: kjkim@sunmoon.ac.kr; Tel.: +82-41-530-2273; Fax: +82-41-530-2939 (Shore et al., 1978). 그러므로박테리오파지 P4와박테리오파지 P2가같이존재할때증식되어생성된후손파지 (progeny phage) 들은대부분작은머리를가진 P4이다. 박테리오파지 P2와 P4의독특한생활상은박테리오파지머리조립및크기결정과정을연구하는좋은연구시스템이되어왔다 (Dokland et al., 1992; Dearborn et al., 2012). 박테리오파지 P4의머리크기결정유전자인 sid 에변이가생긴 P4 sid - 가분리되었고, 이변이체는박테리오파지 P2의유전체가 packaging 될수있는큰머리를생성하며그안에 2개또는 3개분량의박테리오파지 P4 유전체 DNA가들어있다는것을 CsCl 부양균등밀도편차실험 (CsCl buoyant equilibrium density gradient experiment) 을통해알아냈다 (Shore et al.,
DNA 형태적응을거친파지 P4 의정성연구 121 1978). 이러한 P4 sid - 변이체머리안에는 P4 유전체의 dimer 또는 trimer가 packaging 되어있을것이라추정하여왔으나, 큰머리속에들어있는 DNA를분리하여전기영동한결과 P4 유전체의 dimer, trimer외에 monomer도존재하는것으로확인되어 2개또는 3개의 P4 monomer가큰머리속에 packaging 될수있다는것이알려졌다 (Song and Kim, 2006). 유전자 sid는머리조립과정중외부지지 (outer scaffolding) 역할을수행하는단백질을 coding하는것으로밝혀졌다 (Marrvik et al., 1995). 박테리오파지 P2의주요캡시드단백질은유전자 N에의해 coding되며 triangulation number가 7 (T=7) 인 P2 크기의머리를조립하게되는데, 박테리오파지 P4가존재하게되면 sid에의해 coding되는단백질인 Sid가머리조립과정중외부지지단백질로작용하여 triangulation number가 4 (T=4) 인작은크기의머리가조립된다 (Dokland et al., 1992). 한편박테리오파지 P4 존재하에서도 P4의 Sid 기능에반응하지않으며박테리오파지 P2가 packaging될수있는큰머리를생성하는변이체들이분리되었고이것을 P2 sir (sid responsiveness) 라명명하였는데, 분리된 10여개의 sir 변이들은 N 유전자상에존재하였다 (Six et al., 1991). 박테리오파지 P4 유전체는 P2 유전체의 1/3 정도되므로, 이론상 2개또는 3 개의 P4 유전체가 P2 sir 가생성하는큰머리에 packaging될수있으나, 실제그 burst size (1 이하 ) 와 plating 할때의 EOP (Efficiency Of Plating) 는대단히낮게나타났다 (Six et al., 1991). 반면에, 박테리오파지 P4 sid 변이체는 2개또는 3개의 P4 유전체를큰머리에 packaging하여증식하므로, 큰머리만을생성하는 P2 sir 변이체가도움파지로있을때활발히증식할것으로예상되었으나 burst size 결정실험을통해사실이아닌것으로나타났다 (Kim et al., 1998). 이현상을 P2 sir-관련도움파지비효율성 (P2 sir-associated helper inefficiency) 이라는용어로불러왔다 (Kim, 2003). 이러한 P2 sir-관련도움파지비효율성 이어떠한기작에의해나타나는지규명하기위해, P2 sir 도움파지용원소숙주세포에서활발히증식하는 P4 유도체와변이체들을선별하고동정하는연구를통해 DNA의크기가 28 29 kb 정도되며 sid 유전자의변이를가진 P4 유도체가 P2 sir-관련도움파지비효율성 을극복하는것을알아냈다 (Kim, 2015). 현재까지는 packaging되는 DNA 크기와 sid 유전자의변이가 P2 sir-관련도움파지비효율성 을극복하는공통요인으로나타났다. 본연구에서는 sid 유전자의변이가 P2 sir-관련도움파지비효율성 을극복하기위해반드시필요한요인인지를규명하기위해, 정상적인 sid 유전자를가지며 packaging될 DNA 크기가 28 29 kb 정도되는박테리오파지 P4 유도체의 P2 sir- 관련도움파지비효율성 극복여부를조사하였다. 이러한실험목적에부합하는 P4 유도체로, 이전연구에서조성된 P4 delri::kmr 이사용되었다. 이것은 P4-크기의작은머리에 packaging될수있는최소크기의 P4 유도체연구를위해만들어진것으로, 그조성과정은이전연구에자세히설명되어있다 (Kim and Song, 2006). 간단히설명하면, P4 유전체의 DNA 중박테리오파지로증식하는데필요하지않은부분을제한효소반응을거쳐잘라내고대신선별이용이한항생제내성유전자를집어넣어전체유전체크기가 9.495 kb가되도록만든 in vitro 재조합 P4 유도체로, 3개의유전체 (9.495 kb 3 = 28.485 kb) 만이 P2 sir가생성하는큰머리속에들어갈수있다. P4 delri::kmr은정상적인 sid 유전자를가지고있으므로 P2 sir3 용원소에 plating 하였을때대단히낮은 EOP (7.4 10-3 ) 를보였다. 이 EOP는특정파지 stock을정상적인숙주세포 (P2 sir + 용원소 ) 에 plating 하였을때얻어진플라크 (plaque) 수를분모로삼고, P2 sir3 용원소에 plating 하였을때얻어진플라크수를분자로하여얻어진 ratio로, 특정파지가바꿔진숙주나환경에얼마나잘적응 (adaptation) 하는지를나타내는척도가될수있다. 정상적인숙주세포에서준비된 P4 delri::kmr 파지 stock은작은머리속에약 9.5 kb의유전체가 packaging 된파지입자들로이루어져있고, 숙주세포인 P2 sir3 용원소는 P2 sir3-크기의큰머리만을생성하고도움파지로도비효율적이므로파지와숙주세포사이의적응이일어나지않아 plating 의효율은매우낮았다. Bertani와 Weigle이박테리오파지 λ의 EOP 변화를통해제한과변형 (restriction and modification) 현상을발견했을때와같이, 일단의적응단계를거치면 EOP가높아지는것이알려져있다 (Bertani and Weigle, 1953). P4 delri::kmr 파지를 P2 sir3 용원소숙주세포에 plating하여얻은플라크는새로운숙주세포에적응하여만들어진아주드문후손파지들이므로, 이플라크로부터시작하여 P2 sir3 용원소숙주세포에서증식을반복하여만들어진새로운파지 stock은높은 EOP를보일것이라예상하였다. 파지 stock의제조는기존의실험방법과동일하게수행하였다 (Kim and Song, 2006). P4 delri::kmr 파지를 P2 sir3 용원소숙주세포에 plating하여드물게얻은단일플라크를멸균된파스퇴르피펫을사용해 agar plug 전체를들어내어 25 ml의 P2 sir3 용원소숙주세포배양액으로옮긴후 37 C에서흡광도를측정하며진탕배양하였다. 파지증식이일어남에따라흡광도가감소하기시작하고, 흡광도감소가정지하였을때원심분리를거쳐균체를제거하였다. 파지가떠있는상층액을 47,000 g로 2시간초고속원심분리 (Beckman사 LE-80K 초고속원심분리기, Type 35 rotor) 하여파지침전을얻고이를 1 ml 이하의 0.075 M Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 1
122 Kyoung-Jin Kim MgCl 2 완충액에녹여파지 stock을준비하였다. P2 sir3 용원소에서얻어진 P4 delri::kmr stock은 P2 sir3 용원소에적응하여예상대로높은 EOP를보였다 (Table 1). P4 delri::kmr이 P2 sir3 용원소숙주세포에서반복증식되며파지 stock으로만들어지는과정에서 P2 sir3 용원소에대해완전한적응이일어난것을 EOP 실험으로확인할수있었다. P2 sir3 용원소에적응한파지플라크를분리하여다시 P2 sir + 용원소를숙주세포로하여파지 stock을제조하였는데, 이것은 P2 sir3 용원소에적응한파지를다시 P2 sir + 용원소에서증식적응하게하여원래대로돌아가게할목적으로만든것이다. 이렇게제조된파지 stock의 EOP를측정하였더니, 예상한대로 P2 sir3 용원소에대한적응이사라져원래의낮은 EOP를보였다 (Table 1). P2 sir + 용원소에서만들어진파지 stock이 P2 sir3 용원소숙주세포에대해적응을보이는기작에대한연구는발표된것이없으나, 박테리오파지 P2와 P4의생활상과상호관계에따라다음과같이추론할수있다. 즉 P4 delri::kmr의파지입자들은 P4-크기의작은파지머리안에약 9.5 kb의유전체가들어있으므로, P2 sir3 용원소숙주세포안에감염후주입된유전체 DNA의형태 (conformation) 는 monomer일것이며증식과정중그로부터복제되어만들어진유전체의형태도 monomer 가대부분일것이다. 그러나 P2 sir3 용원소숙주세포는 P2 sir3- 크기의큰머리만을생성하므로, 복제된 monomer 형태의 P4 유도체유전체 DNA가큰머리에 3개가한꺼번에또는 trimer 가 packaging되어야하는과정 (Pruss et al., 1975; Six et al., 1991) 에서효율이떨어져낮은 EOP를보였을것으로생각된다. P2 sir3 용원소숙주세포에 plating 하였을때낮은빈도로드물게얻어진플라크는 P2 sir3-크기의큰머리안에 trimer 또는 3개의 P4 delri::kmr 유전체가 packaging된파지입자들로이루어진것이었고, 이를선별하여 P2 sir3 용원소숙주세포에서만들어진파지 stock은 P2 sir3-크기의큰머리에적응하여 trimer 또는 3개의 P4 delri::kmr 유전체가들어있는파지입자들로대부분구성되었을것이다. 그러므로이 stock의파지입자들이 P2 sir3 용원소에 plating되면, 감염후주입된파지입자들의유전체 DNA 는바로 P2 sir3-크기의큰머리에 packaging 될수있는형태를갖고있으므로 EOP가높아진것으로추정된다. 한편, 이렇게 P2 sir3 용원소에적응된파지 stock을 P2 sir + 용원소에 plating하였을때는별도의적응과정없이효율적으로 plaque를형성하여 EOP 값을정하는분모로삼았다. P2 sir3 용원소에서만들어진 P4 delri::kmr의 plaque를얻어다시 P2 sir + 용원소에서키워얻은 stock의경우, P2 sir3-크기의큰머리에 packaging될수있는형태의 DNA를가진파지입자를다시 P2 sir + 용원소숙주세포에감염시켜 P4-크기의작은 머리가생성되는환경으로옮겨적응시켜만들어진 stock이므로 P2 sir3 용원소지시균주 (indicator strain) 에적응하지못하여낮은 EOP를보이게된것으로생각된다. 파지 stock 제조과정에사용된숙주세포가가진 P2 용원소의 sir 변이여부에따라 packaging된 DNA의형태가실제로달라지는지를확인하기위해, 각기다른숙주세포에서제조된파지 stock을 CsCl 부양균등밀도편차실험 (CsCl buoyant equilibrium density gradient experiment) 을통해분석하였다. CsCl 부양균등밀도편차실험은기존의실험방법에따라수행하였다 (Nilssen et al., 1996). 즉파지 stock의일부를평균밀도가 1.38 g/ml로맞추어진 CsCl 용액이들어있는원심분리튜브에가하고, 4 C에서 55,000 g로 60시간동안초고속원심분리 (Beckman사 LE-80K 초고속원심분리기, SW41.1 Ti rotor) 하였다. 원심분리후튜브아래쪽에구멍을내어 8방울을 1분획 (fraction) 으로하여모은다음, 각분획의밀도는 refractometer (Atigo model DR-A1) 를사용하여측정하고각분획의파지역가 (titer) 는 P4 지시균주를상대로플라크 assay를통해결정하여밀도변화에따른파지분포도 (density gradient profile) 를얻었다. P2 sir + 용원소에서얻은 P4 delri::kmr 파지 stock과 P2 sir3 용원소에서얻은 P4 delri::kmr 파지 stock의 CsCl 부양균등밀도편차실험을거쳐밀도변화에따른파지분포도를얻었다 (Fig. 1). P2 sir + 용원소에서만들어진파지 stock은 P4-크기의작은머리에 1 개의유전체만이 packaging된파지입자들의밀도와일치하는밀도에서하나의 peak를보였다. 반면에 P2 sir3 용원소에서만들어진파지 stock은 P2 sir3-크기의큰머리에 3 개의유전체가 packaging된파지입자들의밀도와일치하는밀도에서하나의 peak를보였다. 각파지 stock에서 Lindqvist의방법 (1981) 에따라 DNA를추출하였다. 2회에걸쳐페놀추출하고페놀 / 클로로포름혼합액으로 1회추출한후 ethanol 침전법으로파지 DNA의침전물을얻고이를적당량의멸균증류수에녹였다. 각 stock의파지 DNA를 0.7% agarose gel에서전기영동하여 Fig. 2를얻었다. P2 sir3 용원소에서얻은 P4 delri::kmr 파지 stock의 DNA (lane 3) 에서는 trimer에해당하는진한 band와 monomer 크기의엷은 band가나타났는데, 이는 P2 sir + 용원소에서얻은 P4 delri::kmr 파지 stock의 DNA (lane 2) 에서나타나는진한 band와크기가일치하였다. Lane 3에서나타난 monomer band 는큰머리속에 3개의 P4 delri::kmr 유전체 monomer가 packaging된파지입자들이 P4 delri::kmr 유전체 trimer가 packaging된파지입자들에섞여있다는것을보여준다. 이것은 Song과 Kim (2006) 이 P4 sid71의큰머리에 packaging된 미생물학회지제 52 권제 1 호
DNA 형태적응을거친파지 P4 의정성연구 123 Table 1. EOP of various P4 delri::kmr phage stocks Phage EOP (P2 sir3) a P4 delri::kmr (P2 sir + lysogen) b 7.4±1.3 10-4 P4 delri::kmr (P2 sir3 lysogen) c 7.5±1.1 10-1 P4 delri::kmr (P2 sir3 lysogen) (P2 sir + lysogen) d 2.6±0.4 10-3 a EOP (Efficient of Plating) was expressed as the ratio of the number of plaques appeared on P2sir3 lysogen helpers to the number of plaques appeared on P2 sir + lysogen helper. All EOP data were the mean± standard deviation of more than three independent experiments. b The phage stock was prepared using the P2 sir + lysogen. c The phage stock was prepared using the P2 sir3 lysogen. d Starting from the plaque of P4 delri::kmr (P2 sir3 lysogen) stock, the phage stock was prepared using the P2 sir + lysogen. Fig. 1. CsCl buoyant equilibrium density gradient profiles of P4 delri::kmr stock prepared using the P2 sir + lysogen (A); P4 delri::kmr stock prepared using the P2 sir3 lysogen (B). The ordinates of the profiles show the P4 titer of each fraction expressed in log scale, and the abscissas show the density of each fraction measured with a refractometer. Fig. 2. Identification of the phage DNA isolated from two different P4 delri::kmr stocks on 0.7% agarose gel. Lanes: 1, 1 kb ladder size marker (Enzynomics, Korea); 2, DNA isolated from P4 delri::kmr stock prepared using the P2 sir + lysogen; 3, DNA isolated from P4 delri::kmr stock prepared using the P2 sir3 lysogen. DNA를 agarose gel에서분석하였을때얻은결과와일치한다. 앞에서추론한바와같이, 파지 stock이제조된숙주세포가가진 P2 용원소의 sir 변이여부에의해생성되는파지머리크기에맞추어, packaging된유전체 DNA의형태가적응되는것을알수있었다. Table 1이보여주는 EOP 변화는결국숙주세포가제공하는파지머리크기에, packaging되는 P4 유도체파지의 DNA 형태가적응되어나타난것이었다. 본연구의목적인, P2 sir-관련도움파지비효율성 을극복 하는데 P4의 sid 변이가반드시필요한요소인지를확인하기위해, P2 sir3 용원소숙주세포에완전히적응된 P2 sir3 용원소에서얻어진 P4 delri::kmr과적응되지않은 P2 sir + 용원소에서얻어진 P4 delri::kmr을사용하여 1단계생장실험 (onestep growth experiment) 을거쳐 burst size를결정하고비교하였다. 1단계생장실험은 Six와 Klug의표준적인방법에따라수행하였다 (Six and Klug, 1973). 간단히기술하면, 숙주세포에 M.O.I. (multiplicity of infection) 값이 3 이상되도록파지를가하고 7분간흡착하도록하였다. LB (Luria-Bertani) 배양액으로 100배희석하여 37 C에서파지에의한완전용해가일어날때까지배양한후, 완전용해된배양액의플라크 assay를거쳐얻은후손파지의역가를처음감염된숙주세포의수로나누어 burst size를결정하였다. 결정된각파지 stock의 burst size를비교하면, P2 sir3 용원소에적응된 P4 delri::kmr stock에서는 P2 sir3 용원소에대해 P2 sir-관련도움파지비효율성 을극복할만큼큰 burst size 를보였으나, 적응되지않은 stock에서는 P2 sir3 용원소를숙주세포로하여거의증식하지못하는것으로나타났다 (Table 2). P2 sir3 용원소를숙주세포로하여얻어진적응된 P4 delri::kmr stock의 P2 sir3 용원소에대한 burst size (15) 는, 최근발표된동일한유전체크기의 sid 변이체 version인 P4 sid71 delri::kmr의 P2 sir3 용원소에대한 burst size (38) 에는미치지못하였다 (Kim, 2015). 그러나 P2 sir3 용원소에적응되지않은 P4 delri::kmr stock의 P2 sir3 용원소에대한 burst size Table 2. Burst size of P4 delri::kmr phage stocks Burst size with E. coli lysogenic for a Phage stock P2 sir + P2 sir3 P4 delri::kmr (P2 sir + lysogen) 51.6 ± 10.5 0.003 ± 0.0007 P4 delri::kmr (P2 sir3 lysogen) 28.5 ± 6.1 15.2 ± 4.3 a All the burst size data were the mean±standard deviation of more than three independent experiments. Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 1
124 Kyoung-Jin Kim (0.003) 보다는약 5,000배정도증가된것으로나타나, 충분히 P2 sir-관련도움파지비효율성 을극복하는것을보여주었다. Table 2의 data로부터, sid 유전자의변이여부는 P2 sir-관련도움파지비효율성 을극복하는데필수적인요소가아니라는사실을알수있다. 정상적인 sid 유전자를가진 P4 유도체파지라도, packaging될유전체 DNA의크기가 28 29 kb 정도되고 P2-크기의큰머리속에들어갈수있게적응을거치면 P2 sir 용원소숙주세포에서도활발히증식할수있다는것을 Table 2에서볼수있었다. 본연구를통해, P4-크기의작은머리에들어있는정상적인 P4 sid + 파지의경우에도 P2 sir3 용원소숙주세포에서증식시키면 packaging되는 DNA의형태가 P2 sir3-크기의큰머리에잘 packaging될수있도록적응되는현상을 EOP 실험과 CsCl 부양균등밀도편차실험그리고분리된파지 DNA의전기영동을통해확인할수있었다. 연구에서사용한 P4 delri::kmr은 P2 sir3 - 크기의큰머리에 packaging될유전체 DNA의크기가 28 29 kb 정도되므로, 이러한적응과정을거쳐 P2 sir-관련도움파지비효율성 을극복하며강한 Sir - 표현형을보이는 P2 sir3 숙주세포에서도큰 burst size 를보이며증식하였다. 결론적으로, sid 유전자의변이와상관없이 P2 sir3-크기의큰머리에 packaging될 DNA의크기 (28 29 kb) 가 P2 sir-관련도움파지비효율성 을극복하는데가장중요한요소라는것이명확해졌다. 적요 P2-크기머리에 packaging 될특정 DAN 크기 (28 29 kb long) 와박테리오파지 P4 유전자 sid의변이가 P2 sir-관련도움파지비효율성 을극복할수있는요소로압축되었다. 유전자 sid의변이여부가필수적인지를확인하기위해, 정상적인 sid 유전자를가지며 P2 sir3-크기의큰머리에 packaging 될 DNA 크기가 28.5 kb되는 P4 delri::kmr을사용하여실험하였다. P4 delri::kmr이 P2 sir3 용원소에대해낮은 EOP를보이므로, 이를증가시키기위해 P2 sir3 용원소를숙주세포로하여파지 stock을제조하였다. 이과정에서 P4 delri::kmr이 P2 sir3 용원소에대해적응하는것을관찰하고, CsCl 부양균등밀도편차실험과분리된 DNA의전기영동을통해그것이 packaging 될머리크기에따른 DNA 형태변화에의한적응이라는것을알아냈다. P2 sir3 용원소에적응된 P4 delri::kmr과적응되지않은 P4 delri::kmr stock의 burst size 결정실험은, sid 유전자변이에상관없이 packaging 될 DNA 크기에의해 P2 sir-관련도움파지비효율성 이극복된다는것을보여주었다. References Bertani, L.E. and Six, E.W. 1988. The P2-like phages and their parasite, P4, pp. 73 143. In Calendar, R. (eds.), The bacteriophages, vol. 2. Plenumm Press, New York, USA. Bertani, G. and Weigle, J.J. 1953. Host controlled variations in bacterial viruses. J. Bacteriol. 65, 113 121. Dearborn, A.D., Larurinmaki, P., Chandramouli, P., Rodenburg, C.M., Wang, S., Butcher, S.J., and Dokland, T. 2012. Structure and size determination of bacteriophage P2 and P4 procapsids: Function of size responsiveness mutations. J. Struct. Biol. 178, 215 224. Dokland, T., Lindqvist, B.H., and Fuller, S. 1992. Image construction from cryo-electron micrographs reveals the morphopoietic mechanism in the P2-P4 bacteriophage system. EMBO J. 11, 839 846. Kim, K.J. 2003. Isolation and identification of the bacteriophage P4 mutant, P4 ost2, suppressing sir mutations of bacteriophage P2. Kor. J. Microbiol. 39, 277 282. Kim, K.J. 2015. Construction and characterization of the bacteriophage P4 derivatives whose genome size suitable for packaging into a P2 sir3-sized head. Kor. J. Microbiol. 51, 1 6. Kim, K.J. and Song J. 2006. Isolation and characterization of the smallest bacteriophage P4 derivatives packaged into P4-size head in bacteriophage P2-P4 system. J. Microbiol. 44, 530 536. Kim, K.J., Sunshine, M.G., and Six, E.W. 1998. Characterization and identification of the bacteriophage P4 mutant suppressing sir mutations of bacteriophage P2. J. Microbiol. 36, 262 265. Lindqvist, B.H. 1981. Recombination between satellite phage P4 and its helper P2. In vivo and in vitro construction of P4::P2 hybrid satellite phage. Gene 14, 231 242. Marrvik, O.J., Dokland, T., Hanoa, R.N., Jacobse, E., Larson, T., and Lindqvist, B.H. 1995. The capsid size determining protein Sid forms an external scaffold on phage P4 procapsids. J. Mol. Biol. 251, 59 75. Nilssen, O., Six, E.W., Sunshine, M.G., and Lindqvist, B.H. 1996. Mutational analysis of the bacteriophage P4 capsid-sizedetermining gene. Virology 219, 432 442. Pruss, G.J., Wang, J.C., and Calendar, R. 1975, In vitro packaging of covalently-closed circular monomers of bacteriophage DNA. J. Mol. Biol. 98, 465 478. Shore, D., Deho, G., Tsipis, J., and Goldstein, R. 1978. Determination of capsid size by satellite bacteriophage P4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 400 404. Six, E.W. and Klug, C.A.C. 1973. Bacteriophage P4: A satellite virus depending on a helper such as prophage P2. Virology 51, 327 344. Six, E.W., Sunshine, M.G., Williams, J., Haggard-Ljungquist, E., and Lindqvist, B.H. 1991. Morphoietic switch mutations of bacteriophage P2. Virology 182, 34 46. Song, J. and Kim, K.J. 2006. Analysis of DNA conformation in the particles of bacteriophage P4 mutant, P4 ash8 sid71. Kor. J. Microbiol. 42, 62 66. 미생물학회지제 52 권제 1 호