목적성분의빠른스크리닝과미지성분의정확한동정을위한텐덤고분해능질량분석기의활용 목적성분의빠른스크리닝과미지성분의정확한동정을위한텐덤고분해능질량분석기의활용 정보라과장ㅣ영인과학마케팅팀 (brjung@youngin.com) 다양한응용분야에서널리사용되고있는질량분석기는질량분석관이한개인단일질량분석기 (Single Mass Spectrometer, MS) 뿐만아니라질량분석관이두개가연이어구성된텐덤질량분석기 (Tandem Mass Spectrometer, MS/MS) 까지다양한종류가사용되고있다. 또한불과 10년전만하더라도텐덤질량분석기에의관심보다는질량분해능이높은고분해능질량분석기 (High Resolution Mass Spectrometer, 이하 HRMS) 에대한관심이더높았으며, 최근 5년전부터는저분해능질량분석기 (Low Resolution Mass Spectrometer, 이하 LRMS) 인사중극자 (Quadrupole) 질량분석관이두개연이은형태의삼중사중극자 (Triple Quadrupole, 이하 QQQ) 텐덤질량분석기를이용한극미량목적성분의정확한스크리닝분석에굉장한관심이집중되고있었다. 그러나이제목적성분에대한분석뿐만아니라미지성분의정확한동정에대한관심이증폭되면서두마리토끼를모두잡기위한목적으로저분해능질량분석기인사중극자질량분석관에고분해능질량분석기인비행시간 (Time of Flight, 이하 TOF) 질량분석관이연이어장착된사중극자-비행시간 (Quadrupol- TOF, 이하 Q-TOF) 텐덤질량분석기로그관심이옮겨가고있다. LC-QTOF 액체크로마토그래피 (Liquid Chromatography, 이하 그림 1. Agilent 6550 i-funnel Q-TOF LC/MS LC) 에 Q-TOF 가장착되어분석되는시스템으로 TOF 모드분석법을통하여 LC/MS 의전형적인분석방법인모분자이온의질량값측정을보다정확히수행할수있으며, Q-TOF 모드분석법을통하여정확한조각이온의질량값을측정할수있다. LC-QQQ 의경우복잡한매트릭스중극미량 ( 수 ppt- 수백 ppb) 으로존재하는다양한종류 (~300 종 ) 의목적성분을고감도동시분석하기위해주로사용하고있으나, 이는분석하고자하는각각의성분에대한 RT ( 머무름시간 ) 및 MRM 조건을찾아내고각각의조건을모두찾아내고각각을입력하여야하므로분석법셋업에굉장한노력과시간이 2013. 09 화학세계 53
기획 과학기기스페셜 - 앞서가는기술, 눈에띄는기기 그림 2. TOF 모드분석을통해획득한정확한분자량뿐만아니라정확한동위원소패턴까지모두고려하여분자화학식을생성하고데이터베이스검색을실시하므로보다정확한정성분석결과를산출할수있다. 투자된다. 여기서각성분에대한개별적인조건을각각입력한다는말은관심을두고있는분석목적성분에대해서만분석이가능하다는것을뜻한다. 더불어 QQQ 시스템은동시에분석하고자하는성분이많아질수록감도가떨어지는현상이발생하는치명적인단점이있다. 그러나 LC-QTOF 의경우에는각성분에대한개개의조건을입력하는것이아니라단지질량범위만입력하여분석하므로분석법셋업에소요되는시간이거의없고, 관심을두고있는목적성분뿐만아니라기타주요성분의존재유무까지도확인이가능하며, 기본적으로스캔속도가빠른 TOF 의특성덕분에한번에분석할수있는성분의수에제한이없다 (1,000 종이상 ). 뿐만아니라정확한분자량및그조각이온의정확한패턴을확인할수있으므로라이브러리검색을통한정성분석및조각이온해석을통한미지성분의동정 ( 구조해석 ) 까지모두수행할수있는강력한특징을겸비하고있다. - TOF 모드 TOF 의높은질량정확도및높은질량분해능을바탕으로정확한분자량 (Monoisotopic mass) 측정및그동위원 그림 3. QTOF 모드분석을통하여조각이온의정확한질량값을토대로조각이온의정확한화학식추정이가능함에따라 TOF 모드분석에비하여정확한구조해석이가능하며, 또한이들정보를토대로하여 LC/MS/MS 라이브러리검색을통해더욱정확한정성분석이가능하다. 54 화학세계 2013. 09
목적성분의빠른스크리닝과미지성분의정확한동정을위한텐덤고분해능질량분석기의활용 그림 4. Agilent MSC 소프트웨어를이용하면 Q-TOF 모드분석을통해획득한정확한모분자량및그조각이온패턴을통해특정성분의구조해석이가능함에따라일반적인 LC/MS/MS 라이브러리에없는성분에대해서까지도쉽고빠르게동정할수있어, 미지성분에대한정확한정성분석을위해별도로분석법을변경하여 (NMR 분석등 ) 진행하지않더라도비교적정확한정성결과를도출할수있게된다. 소의정확한비율 (Isotope distribution) 및공간 ( 질량, Isotope spacing) 측정이가능함에따라가장적합한화학식을추정할수있다. 따라서단일 LC-LRMS ( 사중극자또는이온트랩 ) 에서는불가능하였던데이터베이스검색을통한정성분석까지도가능하여성분명, 성분구조확인까지도확인할수있다 [ 그림 2]. - QTOF 모드 LC-QTOF 의 QTOF 모드분석은첫번째질량분석관인사중극자를통해걸러진분자이온이충돌관 (Collision cell) 을지나면서충돌에너지와충돌기체에의해조각화가일어나고, 이때생성된조각이온들이두번째질량분석관인 TOF 를통과하면서정확한조각이온의질량을측정하게된다. 또한 LC-QTOF 의특징적인장점인 Auto MS/MS 분석이가능함에따라사중극자에서걸러낼분자량값을지정하지않더라도자동으로 Q-TOF 모드분석을진행할수있어매우쉽고편리하게분석에접근할수있다. 또한이들정확한조각이온의패턴정보를획득함에따라 GC/MS 에서그렇하듯라이브러리검색을통한정성분석이가능해진다 [ 그림 3]. 또한애질런트만의독자적인미지성분구조해석소프트 웨어 (Molecular Structure Correlator, 이하 MSC) 를이용하면애질런트의 Auto MS/MS 모드분석을통해획득한모분자질량값및조각이온의질량값들을토대로애질런트데이터베이스또는무료온라인데이터베이스 (Chemspider 또는 Pubchem) 와연동하여미지성분에대한동정분석을쉽고빠르고정확하게수행할수있게된다. MSC 의미지성분동정메커니즘은데이터베이스에저장된수백 ~ 수천만가지성분들중모분자량및화학식이일치하는것만추려낸후, 조각이온의패턴을비교하여가장적합한것으로추정되는성분의순서대로나열하여준다 [ 그림 4]. GC-QTOF 기체크로마토그래피 (Gas Chromatography, 이하 GC) 에 Q-TOF 가장착되어분석되는시스템으로 TOF 모드분석법을통하여 GC/MS 의전형적인분석방법인조각이온의질량값측정을보다정확히수행할수있으며, Q-TOF 모드분석법을통하여시료의매트릭스효과를제거하여분석하거나특정조각이온의조각이온패턴을확인할수있다. GC-QQQ 의경우앞서기술한 LC-QQQ 와마찬가지로극미량목적성분에대한고감도동시분석에사용되고있으며, 또한분석하고자하는성분이많아질수록감도가떨어 2013. 09 화학세계 55
기획 과학기기스페셜 - 앞서가는기술, 눈에띄는기기 확인할수있음에따라더욱세밀한구조해석이가능하여미지성분에대한동정을보다정확하게수행할수있다는점에서단일고분해능질량분석기 ( 심지어 TOF 보다질량분해능및질량정확성이높다하더라도 ) 보다월등한성능을발휘한다할수있겠다. 그림 5. Agilent 7200 Series Q-TOF GC/MS 지는현상이나타나고분석법셋업에많은시간이소요된다. 그러나 GC-QTOF 의경우에는 LC-QTOF 와마찬가지로한번에분석할수있는성분의수에제한이없다. 또한 GC-QQQ 에서그랬던것처럼특정성분의검출에방해요소로작용하는매트릭스를효과적으로제거함으로써목적성분에대한정확한스크리닝분석을할수있을뿐만아니라특정피크가가지는특정조각이온의조각이온패턴을 - TOF 모드질량분해능및질량정확성이뛰어난특징을바탕으로 LC-QTOF 와비슷하게정확한조각이온의질량을측정함에따라목적성분에대한선택적인검출이가능하여매트릭스방해효과가큰시료중의목적성분을보다잘검출할수있다 [ 그림 6]. 또한 TOF 의빠른스캔속도덕분에매트릭스중에섞여있는목적성분뿐만아니라비목적 (Non-target) 성분에대해서도디컨볼루션을적용하여잘분리 / 검출할수있다는장점을지닌다. 뿐만아니라이들비목적성분이 GC/MS 라이브러리에없는미지성분이라하더라도 Q-TOF 모드분석을통하여구조해석이가능하므로어떤성분인지비교적쉽게확인할수있게된다 [ 그림 7]. - QTOF 모드 Q-TOF 를이용하여분석한데이터는기존의단일질량분석기 (HRMS & LRMS) 및텐덤질량분석기 (QQQ) 를통 그림 6. 커피에존재함으로써좋지못한향미를나타내는주요성분중하나로꼽히는 2-formyl thiophene 및 2-acetyl thiazole 은성분자체만으로는분석이어렵지않지만이들성분들이커피에포함됨으로써커피추출물의매트릭스영향이크게작용하여그분석이어렵다고한다. 그러나질량분해능및질량정확성이뛰어난 TOF 모드로분석을진행하면시료의매트릭스영향을효과적으로제거하고그성분에대한고유의이온만을검출함으로써보다쉽게분석에접근할수있게된다. 56 화학세계 2013. 09
목적성분의빠른스크리닝과미지성분의정확한동정을위한텐덤고분해능질량분석기의활용 그림 7. TOF 질량분석관의빠른스캔속도는디컨볼루션을이용하여크로마토그래피적으로분리되지못하고하나의피크로합쳐져나타나는성분들을쉽게분리할수있어스캔속도가비교적느린질량분석관에서는미쳐얻을수없었던숨은정보들까지획득할수있는장점을가져다준다. 하여분석한데이터에비하여훨씬많은정보를포함하고있다. 왜냐하면앞서기술한바와같이 TOF 의높은질량분해능덕분에보다세밀한질량정보를지니며동시에높은스캔속도덕분에보다많은데이터포인트를획득하므로각각의데이터포인트에서보다세밀한질량정보를포함하기때문이다. 다만 QTOF 모드분석시, LC-QTOF 와는달리첫번째질량분석관인사중극자에서추출할대표조각이온을반드시선택하여야하므로분석법셋업에시간이조금소요되기는하지만 GC-QQQ 보다는간단하다. GC-QQQ 에서는첫번째및두번째질량분석관모두에서대표조각이온을선택해야하지만 GC-QTOF 에서는첫번째질량분석관에서만선택하면되기때문에보다간단하다고할수있다. 또한 Q-TOF 모드에서는사중극자에서특정조각이온만을선택적으로분리하여 TOF 로이동하여주기때문에시료중의매트릭스를한번제거하는효과를나타내므로보다높은선택성을지니는정확한스크리닝분석결과를나타낼수있으며, 동시에앞서 GC-TOF 모드분석에서설명한바와같이높은질량분해능및질량정확성을지님에따라특정성분에대한조각이온의정확한조각이온패턴을측정함에따라매트릭스의효과를한단계더제거한결과또는조각이온의조각이온패턴을보다정확히확인함으로써미 지성분에대한동정을보다세밀하게할수있다는특징을지니는것이바로 GC-QTOF 이다. 미지성분에대한동정분석은 LC-QTOF 와마찬가지로애질런트 MCS 를쉽고빠르게접근할수있다 [ 그림 8]. QTOF 분석데이터의재발견 Q-TOF 질량분석기를이용하여다양한시료들을분석한많은데이터들을보유하고있다. 이들데이터들의정성 / 정량데이터해석을통해이들시료에는어떤성분이또는어떤성분이얼마만큼함유되어있는지알수있었다. 그리고더나아가시료의종류 ( 시료채취시간, 시료채취장소, 시료상태 ( 기 / 액 / 고체, 보관기관, 보관온도등 ) 에따른데이터 2013. 09 화학세계 57
기획 과학기기스페셜 - 앞서가는기술, 눈에띄는기기 그림 8. 리크 ( 큰부추같이생긴채소 ) 에드린류표준물질을첨가하여분석하였을때 LR 모드 (262.8564±0.5 Da) 로크로마토그램을확인시에는엔드린을확인할수없지만, HR 모드 (262.8564±20 ppm) 로크로마토그램을확인시에는그피크를확인할수있다. 그러나엔드린피크바로앞서나타나는방해물질의피크때문에엔드린의농도에따라분석결과에영향을받을수있기때문에이러한매트릭스영향을제거하기위해 Q-TOF 모드로분석을진행함으로써엔드린에대한고유의이온만을검출하여목적성분에대한고감도분석이가능해진다. 의차이점을확인하고자한다. 이들차이분석의정보를어떻게접근하여획득할수있을까? 일반적으로는질량분석데이터들을비교하고자하는조건으로분류하여 1크로마토그램겹쳐보기또는 2질량분석데이터로부터획득한피크들의크기 ( 농도 ) 와성분명등의정보를엑셀로정리하여비교하기등의방법을이용할것이다. 그러나이러한방법은손쉽게접근할수있다는장점에비해엄청난시간이소요되는비효율성을수반한다. 왜냐하면질량분석기를이용하여분석한데이터로부터추출할수있는피크의수가적게는수개에서많게는수백개에이르기때문에이들피크들에대한정성 / 정량데이터해석에소요되는시간뿐만아니라각시료군에따른차이 ( 동일한분류에속하는데이터들간의차이, 서로다른분류에속하는데이터들간의차이등 ) 를일일이분석자가확인해야하기때문이다 [ 그림 9,10]. 그러나이제이방대한정보를포함하고있는질량분석 데이터들을보다쉽게분류하고이들의차이를보다쉽게시각화할수있는소프트웨어를이용하여보다효율적인차이분석이가능하다. 최근 2, 3년사이핫이슈로제기되는주제중하나로 빅데이터 를꼽을수있는데, 이빅데이터라는단어의의미는단순히많은양의데이터에서그치는것이아니라이들많은데이터들중나에게중요한정보를쉽게찾아내는기술까지포괄한다. 또한질량분석데이터들중에숨어있는중요한정보 ( 시료군의차이를알려주는 ) 를쉽게찾아주는것역시빅데이터의일환으로이해할수있겠다. Q-TOF 를이용하여분석한데이터는기존의단일질량분석기및텐덤질량분석기를통하여분석한데이터에비하여훨씬많은정보를포함하고있다 (GC-QTOF 의 QTOF 모드내용참조 ). 각각의데이터만으로도많은정보를포함하고있지만, 비교하고자하는전체시료개수에해당하는 58 화학세계 2013. 09
목적성분의빠른스크리닝과미지성분의정확한동정을위한텐덤고분해능질량분석기의활용 그림 9. 크로마토그램겹쳐보기 그림 10. 질량분석데이터결과를엑셀로정리하여비교하기 데이터들을모두비교 / 확인하기위해앞서기술한일반적인방법을이용하는것은상상그이상의노력과시간이소비될것이다. 이때애질런트 Mass Profiler Professional ( 이하 MPP) 소프트웨어를이용하면이러한방대한양의데이터들의차이분석에효율적접근이가능해진다. 빅데이터및애질런트 MPP 의공통점은이들모두처음부터방대한양의각각의데이터에대한개별해석을진행하지않고, 종류별로분류된모든데이터에수학적알고리즘을적용한뒤, 이들결과로부터중요한것으로추출된정보 * 에대해서만역추적하여그정보 * 가무엇인지찾아냄으로써방대한양의데이터해석에투자되는시간을극단적으 로줄일수있다는점이다. 즉, 애질런트 MPP 를이용하여 Q-TOF 질량분석데이터들의차이분석을진행하는과정은각개별시료들에대한크로마토그램의정성 / 정량해석을하지않고, 가지고있는데이터그대로를 MPP 에적용시키면 MPP 내에저장된알고리즘에의하여자동으로데이터중의정보 * 들이분류되고시각화되면데이터가포함하는많은정보 * 들중특정정보 * 만이데이터들을분류시키는데중요한역할을하는것을알수있게되고이들주요정보 * 들을개별크로마토그램에서확인할수있게된다 ( 여기서 정보 라함은 MPP 에서는 Entities 라칭하고해당피크의크기, 스펙트럼, 머무름시간을포함하며주로머무름시 그림 11. 주성분분석 : 서로다른그룹간의차이를시각화 그림 12. 군집분석 : 개체간, 시료간의관계를군집단위으로표현하여시각화 2013. 09 화학세계 59
기획 과학기기스페셜 - 앞서가는기술, 눈에띄는기기 그림 13. ID Browser : MPP 소프트웨어에서처리된개체리스트를데이터베이스또는라이브러리로검색하여성분명및화학식을자동으로표기 그림 14. Pathway 분석 : 대사경로지도에서 MPP 소프트웨어를통해처리된대사체및유전자의위치를표기 간과대표이온으로표기된다 ). 이렇게최종확인된정보 * 는다양한시료에대한데이터에포함된수만가지정보 * 들중수십가지로추려지게되고이들제한된최종정보 * 에대해서만정성 / 정량데이터해석을진행함으로써분석자가목적으로한진짜정보 ( 각시료들간의차이를나타내는성분 ) 를획득할수있다. 이상과같이데이터해석에투자되는시간을단축시키고, 단지정리된데이터들을나열해놓은표또는도표만으로알수없었던중요한정보들을시각화하여보여주는애질런 트 MPP 를이용하면 Q-TOF 질량분석데이터의진가를확인할수있게되는것이다. 애질런트 MPP 를이용하여 LC/MS (TOF, QQQ, Q- TOF), GC/MS (Quad, QQQ, Q-TOF), CE/MS, ICP-MS 등다양한질량분석데이터유형에대한계량분석화학 (Chemometrics) 을실행할수있으며, 더나아가 Microarray, NGS 로분석한결과와통합하여 Pathway 분석등을통하여메타볼로믹스, 프로테오믹스, 멀티- 오믹스등까지확장하여분석할수있다 [ 그림 11, 12, 13, 14]. 60 화학세계 2013. 09