농림수산식품부장관귀하 이보고서를 무공해양봉생산시스템을위한꿀벌프로바이오틱스미생물제제개발 과제의보고서로제출합니다. 2012 년 04 월 09 일 주관연구기관명 : 영남대학교산학협력단 주관연구책임자 : 박용하 세부연구책임자 : 박용하 연 구 원 : 강국희 연 구 원 : 임정희 연 구 원 : 서병주 연 구 원 : 라더이르판아흐마드 연 구 원 : 최욱한 연 구 원 : 장윤정 연 구 원 : 최광호 연 구 원 : 유미선 연 구 원 : 노지나 연 구 원 : 원반푸 협동연구기관명 : 경기대학교산학협력단 협동연구책임자 : 윤병수 -1-
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(7) (8) -6- -7-
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가. 참여기업을통한제품화실시할계획나. 제품화실시후홍보를위하여바이오산업전시회등을통하여관련산업전문인은물론일반인을대상으로한적극적인홍보를실시할계획임다. 본연구결과를바탕으로무공해양봉생산을위한추가연구를추진계획중임라. 국내특허등록및국제특허출원준비중임 α -12- -13-
CONTENTS -14- -15-
목 차 -16- -17-
제 1 장 연구개발과제의개요 -18- -19-
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제 2 장국내외기술개발현황 -24- -25-
제 3 장연구개발수행내용및결과 ~ -26- -27-
Non-treatment Treatment 그림 3-1-2. ATCC CCL-80 cell line에 양봉군 Positive control Negative control Silkworm egg Silkworm 그림 3-1-3. Silkworm 에 -28- -29-
A B C -30- -31-
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λ -42- -43-
λ -44- -45-
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~ α α α α -48- -49-
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제 4 절 1차 후보균주를 이용한 in vivo 실험 적용 1. Bee egg 및 Bee larvae에 의한 probiotics후보의 저항성 test의 설계 및 적용(AFB) Bee pathogens에 대한 우수한 probiotics의 선발을 위하여 새로이 bee hive를 직접 이용하는 새로운 실험방법의 개발을 추구했다. 이 방법은 종래의 벌통 단위로 수행하던 1개 실험군을 bee hive내의 수천 cell의 각 개체 (individual)로 대치할 수 있는 것으로, 각 실험에서 3만 개 체의 1개 벌통에서 보여줄 수 있는 1개 실험결과를, 1개 벌통에서 수천개 수준의 실험결과를 도출할 수 있는 가능성을 보여 주었다. 즉, 종래의 급성 또는 만성 toxicity test들은 1개 벌통을 최소단위로 chemical 또는 drug를 처리하며, 1개 벌통단위로 죽은 성체, larvae, egg등의 수를 계수하며, 벌통 내부의 무게, 성체 벌 전체의 무게 등을 측정했다. 이는 1개 chemical 또는 drug의 LD50을 측정하기 위하여도 수 개 이상의 벌통이 소요되었으며, 수십 또는 수백의 후보약제 중 우수한 것을 선발하기 위하여 는 수십 또는 수백 통의 벌통이 소요되어 그 실험규모를 감당하기 어려웠었다[14] 그림 3-4-2. 전체 hive를 사용한 4x8 sector 위의 사진은 4x8 sector를 사용한 것이며, hatching rate 측정시에 촬 영된 것이다. cell이 어두운 부분은 그 시기에 따라 larvae상태에서 발 생이 지연 또는 정지되어 capping을 하지 않은 것 또는 성공적인 발 생이 진행되어 이미 hatch한 것들 2가지 경우에서 나타남 4x8 sector는 중국 길림성 양봉연구소에서 확립된 방법으로 각 5cm변의 정사각형으로 그 위치 가 지정되어 꿀벌의 capping 및 hatching의 계수에 유리한 면이 있으나, hive의 상하에 따라 발생빈도가 달라지는 벌의 생태 때문에 일률적인 조건을 요구하는 drug test에는 불리한 점이 있었다. 따라서 본 과제에서는 새로로 산란면 전체를 커버할 수 있는 새로운 sector를 설정하 였고, 이에 따른 전용 커버를 고안하여 이후의 실험에 사용했다. 1x9 sector는 가로로 3개의 cell이 들어갈 수 있도록 하였으며 세로로 16개의 cell이 포함되도 록 했다. 또한 경계에 겹처진 cell은 계수에서 제외하였으며, 40개의 cell만을 계수 대상으로 하 였다 (그림 3-4-3). 그림 3-4-1. Hive내 각 cell에 산란된 egg와 larvae 사진의 좌측은 산란 직후의 egg를 불수 있으며, 각 egg들은 바닥면에 수직으로 서있기에 산란 후 수시간이내의 상태임을 보여준다. 한편 우측사진은 larvae로 발생된 것임 본 과제에서 고안하고 개발한 실험법은 꿀벌의 발생시간과 여왕벌이 알을 낳는 생태에 기반을 둔 것으로, 간단히, 왕성한 산란력을 보이는 여왕벌은 1개 hive의 1면에 짧은 시간대에 모든 cell에 알을 낳고 이는 인위적으로 넣어준 빈 hive에서도 같은 행태가 일어난다는 데 착안한 것이다. 이런 동시(synchronized) 산란은 산란전, 산란직후, larvae 직후 및 pupae 직적 약물의 처리가 가능하였다(그림 3-4-1). 개발이 진행됨에 따라 각 hive는 sector로 나누어 반복실험을 수행하는 것이 유리함을 알게 되 었고, 이 sector들은 개체단위 및 개체수의 합 (sector당), 그리고 sector의 합으로 통계처리에 유리함을 보여 주었다. 그림 3-4-2는 sector의 분할 및 처치 과정을 보여준 것이다. -52- 그림 3-4-3. 1x9 sector를 이용한 Capping rate의 측정 이들은 모두 1x9 sector를 사용한 것이며, 모두 capping rate를 측정시에 촬영된 것이다. 위의 사진에서 cell 이 어두운 부분은 larvae상태에서 발생이 지연 또는 정지되어 capping을 하지 않은 것을 보여주며, 특히 20 ul의 고용량 약제의 처리에서 capping이 지연되는 효과가 두드러짐을 보여 주었다. 또한 cell의 일부에서는 larvae가 생존하고 있는 것을 볼 수 잇으며, 일부의 cell에서는 larvae가 치사되어 제거된 모양을 보여 줌 -53-
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A B Blank C Blank 1pg = 15.6 100fg = 19.4 Blank 10fg =22.9 1fg = 25.7 Blank = 29.7 0.1fg = 29.2 1pg 100fg 10fg 1fg 0.1fg -70- -71-
β -72- -73-
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β -96- -97-
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π π π -100- -101-
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한편, 초고농도군의 산란권 벌집수 변화에서 45일경의 성장세 둔화(그래프의 꺽임)된 것은 AFB 실험의 경우와 같이 꿀벌응애의 피해가 반영된 것이라 해석되며, 한편, 이 시기를 전후하 여 천연화분의 유입이 증가되었다고 판단된다(화분섭식량이 전반적으로 감소됨). 그림 3-5-14. AFB-probiotics 함유 화분떡을 처리한 실험군 중 고농도군 1번 벌통의 1변 소비 R면의 봉세 측정 영상(예) 그림 3-5-13. Nosema-probiotics 함유 화분떡을 처리한각 실험군별 봉군 당산란권내평균벌집수의변화(종합) 산란권벌집의 수는 봉세의 객관적 척도로써 가장 우수한 도구 중 하나이다. 본 실험의 각 실험군들은 Nosema-probiotics함량에 따른 조금씩 다른 성장 패턴을 보이고 있으며, 특히 고농도 및 초고농도의 Nosema-probiotics 화분떡이 투여된 실험군들은 다른 실험군보다 높은 산란권 벌집수의 상승을 나타내고 있다. 초고농도군의 산란권벌집수 증가에서 45일이 후 증가세가 약해진 것은 꿀벌응애의 기생에 의한 피해로 해석됨(자료 미제시) 본 실험의 목적은 AFB의 병원체 또는 Nosema apis에 감염된 꿀벌집단에 각각 AFB- 또는 Nosema- Probiotics 화분떡을 투여하여, 봉세의 회복 또는 해당 질병의 완화 여부를 판단하고자 하는 것이었다. 본 실험의 결과에 의하여 각 probiotics는 모두 해당 질병에 의한 피해를 극복하였다 판단되며, 양자 모두 각 probiotics의 농도 는 해당 봉군의 육아권 벌집수와 용량-반응관계(Dose-response relationships)가 있 는 것으로 판단된다. 바. 본 실험의 통계에 활용된 영상화일들 앞의 실험 결과들은 각 실험 봉군의 각 소비에 대한 영상화일을 작성하고, 그 영상을 수치화하여, 이를 분석함으로 이루어 졌다. 이하 그림은 본 실험에서 봉세 판정에 사용 된 영상과 산란권 벌집수의 측정에 사용된 영상과 꿀벌응애수 측정에 사용된 영상의 에를 제시한 것이다. 영상화일은 총 600개를 초과하는 방대한 양이기에, 본 보고에서 수록하지 아니했다. -108- 그림 3-5-15. AFB-probiotics 함유 화분떡을 처리한 실험군 중 고농도군 1번 벌통의 1변 소비 R면의 산란권 벌집수 측정용 영상(예) 그림 3-5-16. AFB-probiotics 함유 화분떡을 처리한 실험군 중 초고농도군 벌통의 바 닥에 설치한 시트지 영상(예). 이는 잔류 꿀벌응애의 게수에 사용되었음. -109-
Abbreviation: un (uncultivable), g (genus), and s (species) The number in parenthesis indicates relative percent of each classified level identified in a community -110- -111-
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제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 연구개발목표 미생물자원확보 - 꿀벌질병원인균에대한항균력이우수한미생물자원확보 후보균주의생물학적및이화학적특성분석 - 항균활성우수균주의생장특성분석 항생기능을갖는물질분석및특성연구 - Probiotics 물질추출및정제 - Probiotics 물질의특성 1차후보균주를이용한 in vivo 실험적용 - Bee egg 및 Bee larvae에의한 probiotics후보의저항성 test의설계및적용 (AFB, Nosema) AFB, Nosema의예방제및치료제로새로운 probiotics 후보의신규적용및선발된 probiotics의용량-효과관계확립 대량생산시스템의확립및시제품제작 - 액상발효조를이용한대량생산시스템확립 - 시제품개발 목표달성도및기여도 - 꿀벌질병원인균에대한항균활성이우수한미생물자원확보 (4종; L. plantarum YML001, P. parvulus YML002, L. plantarum YML004, Leu. citreum KM20) - 선발된후보균주배양상등액을처리한시험구는미국부저병원인균의생장을억제시켰으며, 특히 L. plantarum YML004는 70% 정도의생장을억제시킴 - 꿀벌에 Nosema 포자를투여한후선발된후보균주를투여하여포자발아를확인한결과후보균주를투여하지않은시험구에비해약 100배의포자발아가억제됨 - 확보된선발균주의배양상등액에 NaOH로중화시킨결과, 항균력은감소된결과를나타냈으나항균력을상실하지않음 - L. plantarum YML001의물질분석은 NMR을실시하였으며, 꿀벌질병원인균에항균력을가진물질은 lactic acid와유사한물질로판단됨 - L. plantarum YML004의물질분석은 MALDI-TOF를실시하였으며, 분석결과 2가지물질의 peak가나타남. 6656.648 m/z의분자량을가진물질은 lactic acid으로판명되었으며, 추가적으로 5043.464 m/z의분자량을가진물질을확인할수있었음. - 열처리, ph 변화, 효소처리에도의한항균활성능이유지되어산업적활용에적합함 - 항생제에내성을가지고있어, 항생제와혼합사용이가능함 - 꿀벌의발생과정중변태의특성에착안하여약물선발, 독성판별의다목적 test로활용할수있는새로운실험방법을개발함. 이를변태독성실험법으로명명함. 변태독성실험법을미국부저병과노제마질병에저항성이있는 probiotics 선발에적용하도록설계함 - AFB-specific Real-Time quantitative PCR법을신규개발함 - Nosema-specific Real-Time quantitative PCR법을신규개발함 - 시제품으로개발된 probiotics의생균제를이용한 AFB-probiotics 함유또는 Nosema-probiotics 함유화분떡제조 - AFB-probiotics 또는 Nosema-probiotics의과다투여는꿀벌의이상비행활동및이상행동을야기하지않음 - AFB-probiotics 화분떡처리한전체봉군중저농도군및중농도군의평균총사체수가적음. 대조군의경우실험후기부터말기까지사체수가계속증가됨 - Nosema-probiotics 화분떡처리한전체봉군중저농도군및중농도군의평균총사체수가적음 - Nosema-probiotics 화분떡을처리한각실험군의봉세는초고농도및고농도실험군에서대조군을크게앞서는봉세성장을보여주어 Nosema-probiotics가긍정적성장촉진을하였음 - 이연구에서개발된 Probiotics는해당두꿀벌질병에의한피해를극복하는것으로판단되며, 각 probiotics의농도는해당봉군의육아권벌집수와용량-반응관계가있는것으로판단됨 - 탄소원과질소원을그룹지어생장률을조사한결과 glucose와 tryptone으로이용한대량배양배지조건에서최대생장률을나타냄 - 질소원으로 tryptone을이용한결과 probiotics의생장유도기가단축되어생장이촉진되는것을확인하였으며, 산업적으로이용이용이함 - 기선발된최적배지조성을기반으로하여 7L, 30L 발효조로 scale up하였으며, probiotics의최적배지인 MRS에비해 10배이상의생장을확인함 - 균수가 1x10 9 CFU/ml 이상이되도록배양하여생균제로제조함 - 개발된시제품은화분떡발효에이용되어현장평가실시함 -128- -129-
제 5 장연구개발성과및성과활용계획 -130- -131-
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제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 -134- -135-
제 7 장참고문헌 -136- -137-
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