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Polymer(Korea), Vol. 43, No. 4, pp. 491-495 (2019) https://doi.org/10.7317/pk.2019.43.4.491 ISSN 0379-153X(Print) ISSN 2234-8077(Online) 속보 β-sheet 구조를갖는폴리아미노산유도체의자기조립현상 박일우 # 정나슬 # 한사라 오승주 김희진 정재현 숭실대학교화학공학과 (2019 년 3 월 31 일접수, 2019 년 4 월 15 일수정, 2019 년 4 월 16 일채택 ) β-sheet Mediated Self-assembly of Poly(aspartamide) Grafted Oligo(L-valine) IL-Woo Park #, Naseul Jung #, Sa Ra Han, Seung Joo Oh, Hee-Jin Kim, and Jae Hyun Jeong Department of Chemical Engineering, Soongsil University, 369 Sangdo-ro, Dangjak-gu, Seoul 06978, Korea (Received March 31, 2019; Revised April 15, 2019; Accepted April 16, 2019) 초록 : 양친매성공중합체로형성된자기조립나노입자는치료효능을최대화하기위한효과적인약물전달체로활발하게연구되고있다. 본연구에서는베타시트구조의패킹정도를제어하여다양한형태의생체모방자기조립체를제조하였다. 친수성폴리아미노산유도체에베타시트구조를형성할수있는발린분자를접목하여그래프트공중합체, PHEA-g-oligo (L-valine) 를합성하였다. 이렇게합성한그래프트폴리아미노산공중합체는수용액상에서나노미터크기를갖는안정한자기조립체를형성하였다. 자기조립체의베타시트함량은발린분자의접목도 (DS) 에주도적으로, 자기조립체의형태는중합도 (DP) 에주도적으로영향을받는것이확인되었다. Abstract: Nano-sized self-assemblies formed with amphiphilic block and graft copolymers have been extensively studied for drug delivery. This study reports a novel strategy to prepare biomimetic self-assemblies with unique morphology by varying the packing of beta sheets. Specifically, the amphiphilic graft copolymers, PHEA-g-oligo(L-valine) composed of poly(amino acid)s derivative as the hydrophilic backbone and oligo(l-valine) as the grafted hydrophobic chain were successfully synthesized. Then, the effect of degree of substitution (DS) and polymerization (DP) on self-assemblies of PHEA-g-oligo(L-valine)s were investigated in an aqueous solution. This study discovered that the β- sheets of polymers are formed favorably by increasing of DS, # These authors equally contributed to this work. To whom correspondence should be addressed. nfejjh@ssu.ac.kr, 0000-003-4263-408X 2019 The Polymer Society of Korea. All rights reserved. while the structural transition of self-assemblies is influenced dominantly by DP. Keywords: self-assembly, β-sheet, oligo(l-valine), degree of substitution, poly(amino acid)s. 서 수용액상에서다양한형태를갖는자기조립나노입자는그형태적특이성으로말미암아표적지향약물전달을포함한다양한응용분야에서활발하게연구되고있다. 1-3 특히, 친수성백본에소수성분자 (grafts) 를접목한양친성그래프트공중합체를사용하여, 소수성분자단의접목도를변화시켜다양한형태의자기조립체를제조하는연구가진행중이다. 4,5 최근에는자기조립체의형태가구형보다는일정종횡비 (aspect ratio) 이상의타원형또는막대모양일때, 입자의표적지향및부착능력이향상된다는연구결과도보고되었다. 6 원하는크기및형태를갖는자기조립나노입자를효과적으로제조하기위해, 분자설계단계부터분자의친수성비, 접목도및중합도등의통합적제어기술이요구되고있다. 7 본연구에서는친수성폴리아미노산유도체에베타시트 (β-sheet) 구조를형성할수있는발린분자를접목하여 (Figure 1(a)), 수용액상에서생체모방자기조립현상을분석하였다. Figure 1(b) 에서보는것처럼, 발린분자가접목된양친성그래프트폴리아미노산분자의접목도 (DS: degree of substitution) 와중합도 (DP: degree of polymerization) 를각각제어하여, 수용액상에서분자의 2 차구조 (secondary structure) 형성정도와자기조립현상과의연관성을확인하였다. 그결과자기조립체의베타시트함량은발린분자의접목도에따라, 구조변이는중합도에주도적으로영향을받는것을확인할수있었다. 본연구에서제조한발린분자가접목된그래프트폴리아미노산분자및단백질구조를모사한생체모방분자설계기술은표적지향약물전달을포함하여다양한응용분야에서효과적으로활용되리라기대된다. 실 본연구에서전구체로사용한 poly(succinimide)(psi, Mw: 27000 g/mol) 는아스파르트산 (L-aspartic acid, Sigma) 을산촉매 (phosphoric acid, Sigma) 하에서 180 o C 로중합하여얻었다 (Figure 1(a-1)). 8 이렇게합성한 PSI 를 DMF(N',N'-dimethylformamide, Sigma) 에녹여적정량 (designated) 의에탄올아민 (ethanolamine, Sigma) 을첨가하고 6 시간반응후, 에틸렌디아민 (ethylenediamine, Sigma) 을과량으로첨가하여연속적으로 (sequentially) 반응시키는과정을통해, 아민기가도입된 poly(2-hydroxyehtyl aspartamide)(phea-nh 2 ) 를합성하였다 론 험 491

492 박일우 정나슬 한사라 오승주 김희진 정재현 합성법으로 9 얻었다. 합성한 valine-nca 와 PHEA-NH 2 는 DMSO-d 6, PHEA-g-OVal 는 TFA-d 를용매로 400 MHz 에서 1 H NMR(Avance II, Bruker Biospin) 로구조를분석하여, 최종고분자의 DS 와 DP 를결정하였다 (Table 1). 합성한 PHEAg-OVal 은친수성 PHEA 백본과소수성발린이모두녹는 cosolvent(tfa) 에녹인후, 증류수에도입하여자기조립을유도하였다. 이후, 투석 (dialysis, MWCO; 3500 g/mol) 하여잔존용매를제거하고동결건조하여최종적으로발린분자가접목된양친성고분자를파우더형태로얻었다. 이렇게준비된고분자는수용액에녹인후 750 W 로초음파처리 (tip type sonication, VCX-750, Sonics, USA) 를 10 분간진행하여자기조립체를형성시킨후, 이후에있는자기조립체분석에사용하였다. 자기조립체의크기분포도는 90 o 의산란각에서 He-Ne laser 를방출하는 DLS(dynamic light scattering, Nano S90, Malvern Inc., England) 로측정하였다. 임계자기조립농도, CAC(critical aggregation concentration) 는 pyrene probe 를사용하여 330 nm 에서여기하고방출되는스펙트럼을 photo luminescence(with bandwidth; 2.0 nm, QM40, PTI, USA) 로측정하여확인하였다. 자기조립체에형성된 2 차구조, β-sheet 구조는 CD(circular dichroism, J-815, JASCO) 로 180-250 nm 에서분석하였다. 마지막으로 80 kv 에서투과전자현미경 (TEM-2010, JEOL Ltd., Japan) 을이용하여수용액에서형성된 PHEA-g-OVal 자기조립체의형태를관찰하였다. Figure 1. (a) Overall synthetic scheme of valine-conjugated PHEA via NCA polymerization; (b) the effects of DS and DP on selfassemblies of PHEA-g-oligo(L-valine)s in an aqueous solution. (Figure 1(a-2)). PHEA-NH 2 을개시제 (macroinitiator) 로하여, 발린 NCA(valine N-carboxyanhydride) 를원하는중합도에맞게적정량첨가한후질소환경에서 40 o C 로 15 시간동안중합시켜, PHEA-g-oligo(L-valine)(PHEA-g-OVal) 을합성하였다 (Figure 1(a-3)). 이때, 발린 NCA 는발린분자 (L-valine, Sigma) 에트리포스겐 (triphosgene, Sigma) 을첨가하여 Fuchs-Farthing 결과및토론 베타시트구조를형성할수있는발린분자를접목하여그래프트공중합체, PHEA-g-OVal 를합성하였다. 발린분자의접목도 (DS) 는 PHEA 분자에도입된아민기접목도로제어할수있었다. 여기서접목도란친수성 PHEA 백본의반복단위마다접목된아민기의 mol% 를의미하며, 1 H NMR 분석결과를활용하여식 (1) 과같이계산할수있었다. The integral of the peak in 2.8~2.9 ppm/2 DS = 100(%) (1) The integral of the peak in 4.3~4.7 ppm Table 1. Molecular Characterization of Valine-Conjugated PHEAs Sample DS a DP b Number c Diameter d CAC e f f (w) PHEA - - - Highly soluble - 100 PHEA-g-OVal1 4.5 6 54 53 2.5 10-1 80 PHEA-g-OVal2 6.2 10 120 60 1.5 10-1 64 PHEA-g-OVal3 10.9 6 126 89 1.0 10-1 62 a Degree of substitution (succinimide units/amine groups, mol%) determined based on ¹H NMR. b Degree of polymerization (number of valine units) determined based on ¹H NMR of graft copolymers. c Number of valine molecules per a polymer chain. d Effective diameter (nm) obtained by DLS. e a Critical aggregation concentration(mg/ml) determined by pyrene assay. f Hydrophilic mass ratio to total mass, f ( w) = ------------------ w 100, where a w is a the mass of hydrophilic part, and b w is the mass of hydrophobic part. w + b w 폴리머, 제 43 권제 4 호, 2019 년

β-sheet 구조를갖는폴리아미노산유도체의자기조립현상 493 또한중합도 (DP) 는친수성 PHEA 에접목된각아민기로부터 valine-nca 가중합된발린분자의개수를의미하며, 식 (2) 를통해산출할수있었다. The integral of the peak in 0.55~0.59 ppm/3 DP = /DS (2) The integral of the peak in 3.32~3.37 ppm 그결과본연구에서는 Table 1 에정리한것과같이, 접목도가 4.5, 6.2, 10.9 mol%, 중합도 6, 10, 6 개를갖는양친성폴리아미노산을제조하였고각각을 PHEA-g-OVal1, PHEAg-OVal2, PHEA-g-OVal3 으로명명하였다. 여기서주목할것은 PHEA-g-OVal2 와 PHEA-g-OVal3 은접목도와중합도는다르지만분자한개당도입된전체발린분자개수는비슷한수준인것을확인할수있다. 이렇게합성한양친성폴리아미노산공중합체는수용액상에서안정한자기조립체를형성하였다. 각분자의임계자기조립농도 (CAC) 를측정하여 (Figure 2(a)), CAC 이상에서자기조립체가형성됨을확인하였고그값은 Table 1 에나타내었다. 발린분자의접목도가증가함에따라 CAC 는감소하는경향을보여주는데, 이는접목도가증가할수록자기조립체를쉽게형성할수있고더욱안정한자기조립체를형성할수있음을나타낸다. PHEA-g-OVal 의자기조립체형태는수용 액상에서발린분자의 2 차구조형성및결합정도에기인한다. 때문에자기조립체내에도입된 2 차구조를원형편광이색성 (CD, circular dichroism) 분광기를사용하여확인하는실험을진행하였다 (Figure 2(b)). 특히, 식 (3) 과같이, 분자당편광타원율 (mean residual ellipticity, [θ] MRW ) 로정규화 (normalized) 하여 2 차구조형성정도를확인하였다. 10 [ θ] = [ ------------------------------ θ] λ M MRW MRW 10 c l 여기서, [θ] λ 는측정된파장에따른 ellipticity 값, M MRW 는폴리아미노산분자의반복단위의평균분자량, c 는측정시료의농도, l 은측정 cuvette 의길이를의미한다. Figure 2(b) 결과에서볼수있는것처럼, 합성한양친성폴리아미노산으로제조한자기조립체는모두안정적인 β-sheet 구조를갖는것을확인할수있었다. 특히, 도입된발린분자의수가많을수록분자내의 β-sheet 형성비 (% of β-sheet) 가증가하는것을알수있다. 그런데 Figure 2(b-2) 의결과와같이, 전체도입된발린분자개수가비슷한 PHEA-g-OVal2 와 PHEA-g-OVal3 을비교해보면, PHEA-g-OVal2 가 β-sheet 형성이더잘되었음을확인할수있다. 이는양친성그래프트폴리아미노산분자의 β-sheet 형성이도입된발린분자수가 (3) Figure 2. (a-1) Fluorescence emission spectra and I 3 /I 1 ratio of pyrene loaded in the PHEA-g-oligo(L-valine)s solution; (a-2) critical aggregation concentration (CAC) determined by emission fluorescence spectra of pyrene; (b-1) circular dichroism spectra of PHEA-g-oligo(Lvaline)s solution; (b-2) the percent of β-sheet and number of valine molecules on self-assemblies in an aqueous solution. Polymer(Korea), Vol. 43, No. 4, 2019

494 박일우 정나슬 한사라 오승주 김희진 정재현 Figure 3. (a) Scheme for estimating the f (w) of valine-conjugated graft polymer system; (b) estimation of the f (w) of valine-conjugated PHEA with varying of DS and DP. TEM images of self-assemblies of (c) PHEA-g-OVal1; (d) PHEA-g-OVal2; (e) PHEA-g-OVal3. 동일한경우, DS 보다는 DP 에더영향을받기때문으로판단된다. 실제로 β-sheet 는친수성백본에접목된발린분자가이웃한그래프트의분자와수소결합 (inter hydrogen bonding) 에의해형성되기때문이다. 일반적으로자기조립체의형태는양친성분자의구조에따라예측이가능하다. 양친성그래프트공중합체의경우, Figure 3(a) 와같이친수성헤드그룹을소수성분자단이차지하는정도에따라상응하여나타내고또한이를친수성정도 (f hydrophilic ) 를계산하여예측하고있다. 7 예측모델에의하면 (Figure 3(b)) 본연구에서적용한접목도범위에서는모두미셀형태의구형의자기조립체를기대할수있다. 그러나 Figure 3 의 TEM 결과에서볼수있는것처럼, 접목도가증가함에따라자기조립체의형태가구형의입자 (spherical structure, Figure 3(c)) 에서층상구조 (lamellar-like structure, Figure 3(d)) 로나아가막대형태 (rod-like structure, Figure 3(e)) 로변화되는것을확인할수있었다. 일반적인소수성 - 소수성결합에의해형성되는자기조립체와비교할때, β-sheet mediated self-assembly 경우, 접목도에따라그래프트분자내이웃한분자 (inter interaction) 와의결합이증가하여, 층상구조를갖는형태의자기조립체가형성됨을알수있다. 결론적으로자 기조립체의베타시트함량은발린분자의접목도에따라, 구조변이는중합도에주도적으로영향을받는것을확인할수있었다. 본연구에서제조한발린분자가접목된그래프트폴리아미노산분자및이를활용한생체모방분자설계기술은표적지향약물전달을포함하여다양한응용분야에서효과적으로활용되리라기대된다. 11-13 결 베타시트구조의패킹정도를제어하여다양한형태의자기조립나노입자를제조하였다. 친수성폴리아미노산유도체에베타시트구조를형성할수있는발린분자를접목하여수용액상에서자기조립나노입자를형성할수있는그래프트폴리아미노산공중합체를성공적으로합성하였다. 이러한자기조립체는발린분자의접목도에따라베타시트의함량에영향을주며, 중합도에따라구조변화에영향을주는것을확인하였다. 이를통해접목도와중합도를조절하여자기조립체나노입자의크기, 형태및구조적특이성을제어할수있었다. 본연구에서제조한발린분자가접목된그래프트폴리아미노산분자및이를활용한생체모방분 론 폴리머, 제 43 권제 4 호, 2019 년

β-sheet 구조를갖는폴리아미노산유도체의자기조립현상 495 자설계기술은표적지향약물전달을포함하여다양한응용분야에서효과적으로활용되리라기대된다. 감사의글 : 본연구는한국연구재단의우주기술개발사업 (NFR-2016M1A3A3A02018239) 및기후변화대응기술개발사업 (2017M1A2A2086515) 의지원을받아수행된연구입니다. 참고문헌 1. J. D. Jang, C. Do, J. Bang, Y. S. Han, and T. H. Kim, Polymers, 11, 63 (2019). 2. F. Sua, P. Yun, C. Li, R. Li, L. Xi, Y. Wang, Y. Chen, and S. Li, Colloids Surf., A, 566, 120 (2019). 3. J. Y. Lee and K. H. Lee, Polym. Sci. Technol., 23, 282 (2012). 4. K. S. Jang, H. J. Lee, H. M. Yang, E. J. An, T. H. Kim, S. M. Choi, and J. D. Kim, Soft Matter, 4, 349 (2008). 5. J. H. Jeong, C. Y. Cha, A. Kacamarowski, J. Haan, S. N. Oh, and H. J. Kong, Soft Matter, 8, 2237 (2012). 6. R. Toy, E. Hayden, C. Shoup, H. Baskaran, and E. Karathanasis, Nanotechnology, 22, 115101 (2011). 7. D. E. Discher and A. Eisenberg, Science, 297, 967 (2002). 8. M. Tomida, T. Nakato, S. Matsunami, and T. Kakuchi, Polymer, 38, 4733 (1997). 9. W. H. Daly and D. Poche, Tetrahedron Lett., 29, 5859 (1988). 10. A. J Miles and B. A. Wallace, Chem. Soc. Rev., 35, 39 (2006). 11. J. Huh and W. H. Jo, Polym. Korea, 30, 453 (2006). 12. S. W. Cho, H. J. Kim, Y. N. Cho. J. H. Jeong, and H. J. Kong, Mater. Lett., 168, 184 (2016) 13. N. E. Clay, J. Leong, J. Chen, I. Choi, E. Liamas, J. H. Jeong, D. H. Kim, Z. Zhang, I. W. Kim, and H. J. Kong, Nanoscale, 9, 5194 (2017). Polymer(Korea), Vol. 43, No. 4, 2019