건강기능식품공전 시험법 해설서
건강기능식품 시험법 해설서 목차 Ⅲ.1 일반원칙 1 Ⅲ.2 일반시험법 3 Ⅲ.2.1 붕해시험법 3 Ⅲ.2.2 내용량 시험법 12 Ⅲ.2.3 입도시험법 14 Ⅲ.2.4 산도시험법 15 Ⅲ.2.4.1 산도 15 Ⅲ.2.4.2 유기산 산도 17 Ⅲ.2.5 유해물질 시험법 19 Ⅲ.2.5.1 시안화합물 19 Ⅲ.2.5.2 카페인 21 Ⅲ.2.5.3 디에틸렌글리콜 25 Ⅲ.2.5.4 시트리닌 33 Ⅲ.2.5.5. 초산에틸 41 Ⅲ.3 개별 성분별 시험법 45 Ⅲ.3.1 비타민 45 Ⅲ.3.1.1 비타민 A Ⅲ.3.1.3 비타민 D Ⅲ.3.1.2 베타카로틴 Ⅲ.3.1.4 비타민 E Ⅲ.3.1.5 비타민 K Ⅲ.3.1.6 비타민 B 1 Ⅲ.3.1.7 비타민 B 2 Ⅲ.3.1.8 나이아신 Ⅲ.3.1.9 판토텐산 Ⅲ.3.1.10 비타민 B 6 Ⅲ.3.1.11 엽산 Ⅲ.3.1.12 비타민 B 12 Ⅲ.3.1.13 비오틴 Ⅲ.3.1.14 비타민 C Ⅲ.3.2 무기질 182 Ⅲ.3.2.1 구리, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 셀렌, 크롬 182 Ⅲ.3.2.2 칼슘 188 Ⅲ.3.2.3 요오드 193 Ⅲ.3.2.4 철 198 Ⅲ.3.2.5 아연 203 Ⅲ.3.2.6 칼륨 206 Ⅲ.3.3 아미노산 및 단백질류 209 Ⅲ.3.3.1 조단백질 209
Ⅲ.3.3.2 아미노산 213 Ⅲ.3.4 당 및 탄수화물류 219 Ⅲ.3.4.1 글루코사민 219 Ⅲ.3.4.2 N-아세틸글루코사민 228 Ⅲ.3.4.3 베타글루칸 232 Ⅲ.3.4.4 식이섬유 236 Ⅲ.3.4.5 총 다당체 246 Ⅲ.3.4.6 콘드로이친황산 249 Ⅲ.3.4.7 키토산(총글루코사민으로서) 261 Ⅲ.3.4.8 키토올리고당 265 Ⅲ.3.4.9 프락토올리고당 267 Ⅲ.3.5 지방산 및 지질류 274 Ⅲ.3.5.1 지방산 274 Ⅲ.3.5.2 인지질(아세톤불용물로서) 283 Ⅲ.3.5.3 인지질 중 포스파티딜콜린의 함량 286 Ⅲ.3.5.4 콜레스테롤 298 Ⅲ.3.5.5 구연산 303 Ⅲ.3.5.6 스쿠알렌 307 Ⅲ.3.5.7 식물스테롤 311 Ⅲ.3.5.8 유리식물스테롤 317 Ⅲ.3.5.9 알콕시글리세롤 322 Ⅲ.3.5.10 바틸알콜 확인 327 Ⅲ.3.5.11 옥타코사놀 330 Ⅲ.3.5.12 10-히드록시-2-데센산(10-HDA) 334 Ⅲ.3.5.13 총(-)-Hydroxycitric acid 338 Ⅲ.3.5.14 루테인 342 Ⅲ.3.5.15 아스타잔틴 346 Ⅲ.3.6 페놀류 352 Ⅲ.3.6.1 카테킨 352 Ⅲ.3.6.2 안트라퀴논계화합물(무수바바로인으로서) 357 Ⅲ.3.6.3 총 플라보노이드 360 Ⅲ.3.6.4 파라(ρ)-쿠마르산(Coumaric acid), 계피산(Cinamic acid) 확인 364 Ⅲ.3.6.5 다이드제인 및 제니스테인 확인 369 Ⅲ.3.6.6 총 모나콜린 K 373 Ⅲ.3.6.7 코엔자임Q10 378 Ⅲ.3.6.8 대두이소플라본 381
Ⅲ.3.7 터핀류 391 Ⅲ.3.7.1 진세노사이드 Rb1과 Rg1 391 Ⅲ.3.7.2 총 엽록소 399 Ⅲ.3.7.3 총 페오포르바이드 405 Ⅲ.3.8 발효미생물류 412 Ⅲ.3.8.1 유산간균 및 구균 412 Ⅲ.3.8.2 비피더스균(Bifidobacterium) 418 Ⅲ.3.8.3 자실체 또는 균사체의 함량 및 확인 423 Ⅲ.3.8.4 효모수 438 Ⅲ.3.9 효소활성 441 Ⅲ.3.9.1 α-아밀라아제 441 Ⅲ.3.9.2 프로테아제 444
건강기능식품 시험법 해설서 범례 본 시험법 해설서는 아래 제시된 건강기능식품 공전 Ⅲ.1 일반원칙에 기재된 시료채취 방법과 용어의 정의 및 단위에 따라 기술되었다. Ⅲ.1 일반원칙 1. 시료채취 방법 1) 시료는 채취된 검체에서 시험에 직접 사용되는 물질을 말한다. 2) 시료채취는 시험의 대표성을 가질 수 있도록 균질하여 해당 시험항목에서 기재된 필요한 량을 정확히 채취한다. 3) 시험에 사용된 시료는 규격항목에 따라 채취 방법을 달리한다. (1) 미생물 (가) 캡슐은 외피를 포함하여 시험의 시료로 사용한다. (2) (1)항을 제외한 규격항목 (가) 캡슐은 외피는 제거하고 내용량을 취하여 균질화 시킨 후 시험의 시료 로 사용한다. (나) 과립, 정제 및 환은 분쇄하여 균질화 시킨 후 시험의 시료로 사용한다. (다) 분말 및 액상은 균질화 시킨 후 시험의 시료로 사용한다. 2. 용어의 정의 및 단위 1) 이 공전에서 계량의 단위는 다음의 기호를 사용한다. (1) 길이 : m, cm, mm, μm, nm (2) 용량 : L, ml, μl (3) 질량 : kg, g, mg, μg, ng, pg (4) 넓이 : cm 2, m 2, mm 2 (5) 열량 : kcal, kj (6) 온도 : 2) 원자량은 최신 국제원자량표에 의하고, 분자량은 국제원자량표에 의하여 계 산한다. 3) 질량백분율을 표시할 때에는 %의 기호를 쓰며, 용액 100 ml중의 물질함량(g)을 표시할 때에는 w/v%로, 용액 100 ml중의 물질함량(mL)을 표시할 때에는 v/v%의 기호를 쓴다. 질량백만분율을 표시할 때에는 mg/kg을 사용하며, mg/l도 사용할 수 있다. 4) 표준온도는 20, 상온은 15~25, 실온은 1~35, 미온은 30~40 로 한다. 1
5) 찬 곳(냉소) 이라 함은 따로 규정이 없는 한 0~15 의 장소를 말한다. 6) 시험은 따로 규정이 없는 한 상온에서 실시하고 조작 후 30초 이내에 관찰한 다. 다만, 온도의 영향이 있는 것에 대하여는 표준온도에서 행한다. 7) 시험에 쓰는 물은 따로 규정이 없는 한 증류수 또는 정제수로 한다. 8) 액성을 산성, 알카리성 또는 중성으로 표시한 것은 따로 규정이 없는 한 ph미 터기 또는 리트머스지를 써서 시험한다. 액성을 상세히 나타낼 때에는 ph값 을 쓴다. 또한, 강산성은 ph 약 3.0이하, 약산성은 ph 약 3.0~5.0, 미산성은 ph 약 5.0~6.5, 중성은 ph 약 6.5~7.5, 미알카리성은 ph 약 7.5~9.0, 약알카 리성은 ph 약 9.0~11.0, 강알카리성은 ph 약 11.0이상을 말한다. 9) 혼액을 (1 : 1), (4 : 2 : 1) 등으로 나타낸 것은 액체시약의 혼합 용량비 또 는 고체시약의 혼합 무게비를 말한다. 또한, 용액의 농도 (1 5), (1 10), (1 100) 등으로 나타낸 것은 고체 시약 1 g 또는 액체시약 1 ml를 용매에 녹여 전량을 각각 5 ml, 10 ml, 100 ml 등으로 하는 것을 뜻한다. 10) 무게를 정밀히 단다 라 함은 달아야 할 최소단위를 고려하여 0.1 mg, 0.01 mg 또는 0.001 mg까지 다는 것을 말한다. 또 무게를 정확히 단다 라 함은 규정된 수치의 무게를 그 자리수 까지 다는 것을 말한다. 11) 검체를 취하는 양에 약 이라고 한 것은 따로 규정이 없는 한 기재량의 90~ 110%의 범위 내에서 취하는 것을 말한다. 12) 건조 혹은 강열할 때 항량 이라고 기재한 것은 다시 계속하여 1시간 더 건조 혹은 강열할 때에 전후의 칭량차가 전회 측정한 무게의 0.1%이하임을 말한 다. 다만, 칭량차가 화학천칭을 썼을 때 0.5 mg이하, 마이크로 화학천칭을 썼 을 때 0.01 mg 이하인 경우에는 항량으로 본다. 13) 데시케이터의 건조제는 따로 규정이 없는 한 실리카겔로 한다. 14) 감압은 따로 규정이 없는 한 15 mmhg이하로 한다. 15) 시약, 시액, 표준용액을 보존하는 유리용기는 용해도 및 알카리도가 매우 낮 고 납 및 비소를 될 수 있는 대로 함유하지 아니하는 것을 사용한다. 16) 용매는 특별한 규격이 없는 한 HPLC용 을 사용한다. 17) 따로 규정이 없는 한 시약, 표준품은 최순품을 사용한다. 18) 따로 규정이 없는 한 표준용액을 이용하여 검량선을 작성할 경우 3가지 이상 의 농도로 검량선을 작성하여야 하고 시험용액 중 분석하고자 하는 농도가 검 량선 내에 포함될 수 있도록 표준용액 농도를 조절하여 사용한다. 19) 따로 규정이 없는 한 시험용액 시험 시 반드시 공시험을 함께 한다. 20) 영양정보에 표시된 열량, 탄수화물, 단백질, 지방 및 나트륨의 시험법은 식품 공전 제10. 일반시험법에 따른다. 21) 이 공전에 별도로 규정이 없는 시험법에 대해서는 식품공전 시험법을 따른다. 2
Ⅲ.2 일반시험법 Ⅲ.2.1 붕해시험법 1) 1. 시험방법의 원리 2) 붕해(disintegration)란 내복용의 성형제제가 소화관액 등의 액중에서 붕해되어 적 어도 그 구성입자까지 분산하는 현상 을 말하며 붕해과정이 활성부분의 완전한 용 해를 의미하는 것은 아니다. 그러나 고형제제의 붕해는 영양성분 등의 흡수나 효과 에 밀접한 관계가 있기 때문에 중요하다. 본 시험법은 시료가 물이나 시험액상에서 반복된 상하 움직임에 의하여 시료가 녹는 시간을 측정하는 방법으로, 내용고형제품 의 시험액에 대한 붕해성 또는 저항성을 시험하는 방법이다. 따로 규정이 없는 한 정 제제품, 적당한 제피제로 제피를 한 정제제품, 환제품, 캡슐제품, 과립제품, 장용성 제품은 각각 다음의 시험에 적합하여야 한다. 2. 안전 주의사항 시액 제조시 사용되는 염산(Hydrochloric acid)은 자극적인 냄새를 가지고 있고 피 부 화상, 점막 화상, 호흡 자극, 눈 자극 등의 건강 위험성이 있다. 물리적 위험으로 는 용기가 열에 노출되면 파열되거나 폭발할 수도 있고 물과 접촉 시 반응할 수 있 다. 또한 흡입 시 자극이 심한 경우도 있을 수 있으며 두통, 폐 울혈과 폐 이상이 생길 수 있다. 또한 피부에 접촉 시 자극 및 동상과 눈 접촉 시에는 실명 및 동상 마지막으로 섭취 시에는 화상, 구역, 구토 및 설사를 유발시킬 수 있으므로 환기가 잘되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안전장치를 착용하고 취급에 주의 를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 분석장비 이 시험에 쓰는 장치는 다음과 같으며 시험기, 안지름 약 110 mm이고 높이 약 155 mm인 비커, 적당한 가열기 및 전동기로 되어 있으며, 따로 조작법에 따라 보조판 또는 보조통을 쓴다. 3
3.1.1 시험기 그림 1-1 그림 1-2 그림 1-3 A : 플라스틱판 B : 체 눈의 간격 2.0 mm, 선재의 지름 6.0 mm의 내산성 망 C : 내산성 금속판 D : 유리관 J 및 M : 플라스틱통 E : 나사 K : 체 눈의 간격 0.42 mm F : 지주 및 나사 선재의 지름 0.29 mm의 내산성 망 G : 매다는 축 L : 내산성 철사 손잡이 H : 온도계 삽입구 시험기는 그림 1-1과 같이 지름 90 mm, 두께 6 mm의 상하 2장의 플라스틱 판 A가 있고 여기에 각각 지름 24 mm의 구멍이 같은 간격으로 6개 뚫어 져 있다. 아래의 플라스틱판의 아랫면에는 체 눈의 간격 2.0 mm, 선재( 線 材 )의 지름 0.6 mm의 내산성 망 B를 달고 위의 플라스틱판의 윗면과 아 래의 플라스틱판 망의 아랫면에는 각각의 구멍에 해당하는 부분에 지름 22~23 mm의 구멍을 6개 뚫은 지름 90 mm, 두께 1 mm의 내산성 금속판 C를 단다. 상하의 플라스틱판의 구멍에 안지름 21.5±0.5 mm, 바깥지름 23.5 mm, 길이 77.5±2.5 mm의 유리관 D 6개를 끼우고 지주( 支 柱 ) 3개를 써서 내산성 금속판 위에 나사로 유리관을 고정한다. 중심에 매단 축( 軸 ) G는 길이 80 mm로 하고 그 위 끝은 전동기를 써서 부드럽게 상하운동을 할 수 있도록 한 수축( 受 軸 )에 단다. 다만, 시험기는 유리관 및 망에 관한 규정 을 제외하고는 그 구조를 다소 변경할 수도 있다. 3.1.2 보조판 3) 보조판은 그림 1-2에 표시한 것과 같이 높이 9.50±0.15 mm, 지름 20.70±0.15 mm의 투명하고 매끄러운 플라스틱제의 원주로 비중은 1.18~1.20이다. 이 4
윗면에서 아랫면까지에 지름 2 mm의 구멍이 5개가 뚫어져 있으며 그 1개 는 중심을 통하고 다른 4개는 중심에서 6 mm의 거리에 같은 간격으로 위 치하고 있다. 보조판의 측면에는 V자형으로 자른 것이 4개 같은 간격으로 있고 각각 자른 부분의 폭은 윗면이 9.5 mm, 아랫면이 1.6 mm, 깊이는 윗 면 2.55 mm, 아랫면 1.6 mm이다. 3.1.3 보조통 4) 보조통은 그림 1-3에 표시한 것과 같이 안지름 12 mm, 바깥지름 17 mm, 길이 20 mm의 플라스틱통 M의 양단 바깥쪽의 나사를 풀고 안지름 12 mm, 바깥지름 17 mm, 길이 2.5 mm의 플라스틱통 J의 안쪽나사를 풀고 체 눈 간격 0.42 mm, 선재의 지름 0.29 mm의 내산성의 망을 놓고 먼저의 원통의 양단에 밀착시킨 것이다. 보조통의 상하 망의 간격은 20±1 mm로 하고 바깥쪽 중앙부에 지름 1 mm의 내산성 철사를 써서 높이 80 mm 의 손잡이를 단다. 3.3 분석장비의 준비 시험기를 수축에 달고 비커 속에 넣어 1분간 29~32회 왕복, 진폭 53~57 mm 로 부드럽게 상하운동을 하도록 조절한다. 시험기가 최대로 내려갔을 때 아래의 망 면이 비커의 바닥으로부터 25 mm가 되도록 하고 비커에 넣는 시험액의 양 은 시험기가 최하로 내려갔을 때 시험기의 윗면의 액의 표면에 일치하도록 한다. 시험하는 동안 액의 온도는 37±2 로 유지한다. 과립제품 이외는 시료 6개를 취하여 시험기의 유리관에 1개씩 넣고 시험기를 미리 온도 및 액량을 조절한 비커중의 시험액에 담그고, 일정시간 상하운동을 한 다음 시험기를 가만히 시험액에서 꺼내고 유리관 내의 시료상태를 관찰한 다. 보조판을 쓰도록 지정되어 있을 경우에는 시험기의 유리관에 시료를 넣고 다음에 보조판 윗면을 위로 하여 1개씩 가만히 넣은 다음 앞에서와 같은 조 작을 한다. 다만, 판정이 곤란할 때에는 보조판을 쓰지 않을 수 있다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 일반시약 4.1.1 염화나트륨(Sodium chloride) 4.1.2 염산(Hydrochloric acid) 4.1.3 증류수(Distilled water) 4.1.4 제1인산칼륨(Monopotassium phosphate) 4.1.5 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 4.2 시액의 조제 4.2.1 제1액 : 염화나트륨 2.0 g에 염산 7.0 ml 및 물을 넣어 녹여 1 L로 한다. 이 액은 무색투명하고 그 ph는 약 1.2 5) 이다. 4.2.2 제2액 : 0.2 mol/l 인산이수소칼륨시액 250 ml에 0.2 mol/l 수산화나트 5
륨시액 118 ml 및 물을 넣어 1 L로 한다. 이 액은 무색투명하고 그 ph 는 약 6.8 6) 이다. 5. 시험과정 5.1 조작 방법 5.1.1 과립제품 이외에는 시료 6개를 취하여 시험기의 유리관에 1개씩 넣는다. 5.1.2 시험기를 미리 온도 및 액량을 조절한 비커 중의 시험액에 담그고, 일정시간 상하운동을 한다. 5.1.3 시험기를 가만히 시험액에서 꺼내고 유리관 내의 시료상태를 관찰한다. 5.2 시험 방법 및 결과 판정 5.2.1 정제제품 7) 물을 시험액으로 하고 보조판을 넣어 30분간 상하운동을 시킨 다음 관찰 할 때 시료의 잔류물이 유리관 내에 없거나 있더라도 해면상( 海 綿 狀, 잔구 멍이 송송 배게 뚫리어 해면처럼 된 모양)의 물질이든가 또는 연질(부드러 운 성질)의 물질 또는 니상( 泥 狀, 진흙과 같은 반죽상태)의 물질이 약간 있 을 때에는 적합한 것으로 한다 8). 시료 6개 중 시료가 원형상태로 머무르는 것이 1개 또는 파편상태로 있 는 것이 1개가 있을 때에는 새로 시료 6개를 가지고 위의 시험을 되풀이 하여 시료의 잔류물이 유리관 내에 없거나 있더라도 해면상의 물질이든가 또는 연질의 물질 또는 니상의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다. 5.2.2 적당한 제피제로 제피를 한 정제제품 물을 시험액으로 하고 보조판을 넣어 60분간 상하운동을 시킨 다음 관찰 할 때 시료의 잔류물이 유리관 내에 없든가 있더라도 피막이든가 또는 연 질의 물질 또는 해면상의 물질 또는 니상의 물질이 약간 있을 때에는 적 합한 것으로 한다. 시료 6개 중 원형상태로 머무르는 것이 1개 또는 피막이 용해, 구멍 또는 벗겨져 있더라도 내용물의 방출이 인정되지 않는 것 1개가 남았을 때에는 시료 6개를 다시 취하여 이 시험을 반복하여 시료의 잔류물이 유리관 내에 없든가 있더라도 피막이든가 또는 연질의 물질 또는 해면상의 물질 또는 니상의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다. 5.2.3 환제품 정제제품의 시험법에 따른다. 다만, 시험은 제1액에서 60분간 하고 시료의 잔류물이 유리관 내에 남아 있을 때에는 계속하여 제2액에서 60분간 시험 한다. 5.2.4 캡슐제품 물을 시험액으로 쓰고 보조판을 넣어 20분간 상하운동을 시킨 다음 관찰 6
할 때 시료의 잔류물이 유리관 내에 없거나 있더라도 피막이든가 또는 연 질의 물질 또는 니상의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다. 시료 6개 중 원형상태로 머무르는 것이 1개 또는 피막이 용해, 구멍 또는 벗겨져 있더라도 내용물의 방출이 되지 않은 것이 1개 남았을 때에는 새로 시료 6개를 가지고 이 시험을 되풀이하여 시료의 잔류물이 유리관 내에 없든가 있더라도 피막이거나 또는 연질의 물질 또는 니상의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다. 5.2.5 과립제품 과립제품을 35호(500 μm) 체로 쳐서 35호 체 위에 잔류한 시료 0.1 g씩을 각각 보조통 6개에 넣고 보조통을 시험기 유리관 속에 각각 1개씩 넣어 아 래쪽에 고정시키고 따로 규정이 없는 한 시험액으로 물을 써서 30분간 상하운동을 시킨 다음, 보조통을 꺼내어 관찰할 때 시료의 잔류물이 보조 통 내에 없든가 있더라도 원형상태로 머무르는 것이 보조통 1개에만 있을 때 또는 피막이거나 또는 연질의 물질 또는 니상의 물질이 약간 있을 때 에는 적합한 것으로 한다. 다만, 제피를 한 과립에 대하여는 시험액으로 물 을 써서 60분간 상하운동을 시킨다. 5.2.6 장용성제품 5.2.6.1 과립제품 또는 과립상의 형으로 충전한 캡슐제품 다음의 1 제1액에 의한 시험 및 2 제2액에 의한 시험의 두 시험을 한다. 1 제1액에 의한 시험 과립제품 또는 캡슐제품 속에서 빼낸 내용물을 35호(500 μm) 체로 쳐서 35호 체 위의 잔류물 0.10 g씩을 각각 보조통 6개에 넣고 보 조통을 시험기의 유리관에 1개씩 넣어 밑에 고정하고 제1액을 시험 액으로 하여 60분간 상하운동을 시킨 다음 관찰할 때 시험기의 망목 으로부터 떨어지는 입자가 15알갱이 이내일 때에는 적합한 것으로 한다. 2 제2액에 의한 시험 따로 제1액에 의한 시험과 동일한 방법에 따라 시료 0.1 g씩을 각각 보조통 6개에 넣고 보조통을 시험기의 유리관에 1개씩 넣어 아래에 고정하고 제2액을 시험액으로 하여 30분간 상하운동을 한 다음 관 찰할 때 시료의 잔류물이 보조통 내에 없거나 있더라도 원형대로 있는 것이 보조통 1개에만 있을 때 또는 있더라도 피막이거나 또는 연질의 물질 또는 니상의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다. 5.2.6.2 과립제품 또는 과립상의 형으로 충전한 캡슐제 이외의 장용성 제품 다음의 1 제1액에 의한 시험 및 2 제2액에 의한 시험의 두 시험을 한 7
다. 1 제1액에 의한 시험 시험액으로 제1액을 써서 120분간 상하운동을 한 다음 관찰할 때 시료 6개 중 붕해, 장용성 피막의 구멍 또는 벗겨져 있거나 또는 파손 등으로 내용물이 방출되는 것이 1개 이하일 때에는 제1액에 의한 시험에 적합 한 것으로 하고 2개일 때에는 새로 시료 6개를 가지고 이 시험을 되풀 이한다. 이 때 6개 모두가 앞에서 말한 이상이 없을 때에는 적합한 것 으로 한다. 2 제2액에 의한 시험 따로 시료 6개를 취하여 제2액을 시험액으로 하고 보조판을 넣어 60분 간 상하운동을 시킨 다음 관찰할 때 시료의 잔류물이 유리관 내에 없든 가 있더라도 피막이거나 해면상의 물질이든가 또는 연질의 물질 또는 니상의 물질이 약간 있을 때에는 적합한 것으로 한다. 6. 참고문헌 6.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 2002 6.2 위생시험법 주해, 일본 약학회, 2005 7. 시험 주의사항 1) 붕해시험법으로서 약전에 처음 수재한 것은 스위스 약전(Pharmacoeia Helvetica Ⅴ, 1934년)이지만 JP에서는 이미 그 제4개정(1920년)에서 정제 (Pastilli)의 시험법에 정제는 이것을 37 의 수중에서 때때로 흔들어 방치할 때 30분 이내에 전부 붕해하여야 한다. 로 기재하고 있다. 여기에는 진동의 세 기, 회수, 붕해의 판정은 없어 시험자의 주관이 들어가기 쉬운 것이었다. 그 후 객관적 판정이 가능하도록 한 점, 재현성이 양호한 점, in vivo와 어느 정도 상 관성이 있다는 점 등을 조건으로 새로운 장치가 차차 개발되어 왔다. 현재의 붕해시험법의 원형이 되었던 장치는 Gershberg가 고안한 것으로 약간 개량된 다음 1950년 공정서로서는 처음으로 USP ⅩⅣ에 채용되었다. 미국에서 붕해시 험이 채용된 것은 이것이 처음인 것으로 당시의 시판제제에 붕해시간을 맞추 었기 때문에 다른 나라 약전과는 달리 의약품 각조에서 하나 하나 붕해시간을 규정하게 된 것이다. 현재의 USP 23에서도 이와 같은 체제가 계속되고 있다. 2) 붕해 시험법에서 제제는 장치 중에서의 마찰이나 교반으로 신속하게 붕해되지 만 생체 내에서는 이러한 물리적인 조건이 없기 때문에 붕해시험법의 결과를 직접적으로 소화관 흡수, 생체이용률 등과 관련하여 해석하는 것은 피해야 한 다. 그러나 붕해시험에 적합한 제제가 양호한 생체이용률을 나타낸다는 보증은 없다할지라도 붕해시험의 규정에 적합하지 않은 제제는 생체이용률에도 문제 를 일으킬 가능성이 매우 높다는 사실은 중요하다. 또 붕해시간 편차가 큰 제 8
제는 효과가 불안정하여 제품으로서의 신뢰성을 상실하게 된다. 그래서 내용 고형제제는 일정한 시간 내에 거의 균일하게 붕해하여야 하며, 이것을 in vitro 의 조건에서 시험하는 방법이 붕해 시험법이다. 다만, 직경 20.0 mm이상 크기 의 제제, 지효성의 제제 및 용출시험 2) 을 적용하는 제제는 이 시험법을 적용하 지 않는다. 3) 보조판 : 정제, 환제, 캅셀제, 제피정제, 장용성제제의 제2액에 의한 시험에 사 용한다. 비중 1.18 ~ 1.20의 플라스틱제 디스크로 검체의 부상을 억제할 목적으 로 사용한다. 약간의 압( 壓 )을 줌과 동시에 교반효과를 보이며 사용하지 않을 때에 비해 붕해시간이 약 1/2로 단축된다. 또 피막 등 연질부유물을 유리관 밖 으로 내보내기 때문에 붕해의 판정이 용이하게 된다. 4) 보조통 : 통부의 상하면은 금속제의 망으로 구성된다. 통내에 과립제 또는 장 용성캅셀중의 과립을 넣어 손잡이의 탄성으로 시험기의 유리관 중에 고정하여 사용한다. 5) 위와 장의 ph를 고려하여 만든 조건으로 대략적인 범위이지만, 실제 실험에서 는 붕해여부를 결정짓는 중요한 조건이 될 수 있으므로 제시된 ph를 맞춰서 실험하기 바란다. 9
6) 제제종류에 따른 시험조작과 적합조건 제형 시험액 보조판 시험시 적합조건 * 간 정제 물 + 30분 1)6개중 모두 붕해하면 적합 캅셀제 물 + 20분 제피정제 제1액 + 60분 환제 과립제 제피한 (비장용성) 과립제 장용성제제(과립 제 및 캅셀제중 에 충전된 과립 제가 아닌것) 장용성의 과립 제 및 캅셀제중 에 충전한 장용 성과립제 제1액 (제2액) 물 제1액 + - (보조통 ) - (보조통 ) 60분 (60분) 30분 60분 제1액 - 120분 2)1개만이 불완전할 때 재시험에서 6개 모두 붕해하면 적합 1)6개중 모두 붕해하면 적합 2)제1액중에서 붕해가 불완전 할 때에는 계속 제2액으로 시험. 붕해 유무를 본다. 붕해갯수의 규정은 정제와 같다. 붕해가 불완전한 보조통1개 이하면 적합 붕해,피막의 개구 박리 파손에 의한 내용물의 방출이 1개이하면 적합, 2개이면 재시험에서 6개 모 두 이상이 없을 때 적합 제2액** + 60분 규정시간내에 붕해 제1액 제2액 - (보조통 ) - (보조통 ) 60분 30분 시험기의 망목으로부터 떨어지는 입자는 약15알갱이 이내면 적합 붕해가 불완전한 보조통 1개 이하 면 적합 10
7) 붕해의 판정 규정시간까지 조작하고 시험기를 액에서 꺼내었을 때 관내에 잔류물이 없으면 적합이며 다음의 상태가 관찰되는 경우도 검체는 붕해한 것으로 판정한다. 다음 표 참조 제형 붕해했을때의 유리관 또는 보조통내의 상태 정제 잔류물이 유리관내에 없거나 있더라도 해면상의 물 질이던가 또는 연질의 물질이 약간 있을 때 환제 제1액 또는 제2액중에서 시험 후 유리관내에 잔류물 이 없을 때 캅셀제, 제피정제 잔류물이 유리관내에 없거나 있더라도 피막일 때 또 는 연질의 물질이 약간 있을 때 과립제, 장용성의 과립 원형상태로 머무르는 잔류물이 보조통 6개중 1개 이 제 및 캅셀제중에 충전 하이든가 각통내의 잔류물이 피막이든가 소량의 연 된 장용성과립제 질성 또는 죽상의 물질일 때 장용성 중 과립제 및 유리관내에 잔류물이 없거나 해면상물질 이든지 연 캅셀제중에 충전한 과 질의 물질이 약간 있을 때 립제가 아닌 제제 11
Ⅲ.2.2 내용량 시험법 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 시료의 내용량을 측정하고 표시량과 비교하여 허용된 오차범위 내의 결과 값을 나타내는 지를 판정하는 방법이다. 2. 제품 형태별 시험방법 및 계산방법 2.1 용량표시제품 2.1.1 시료의 내용물을 메스실린더에 완전히 옮겨 측정한다. 다만, 점성 등이 있어 내용물을 완전히 옮기기 어려운 시료에 대해서는 내용물이 들어 있는 용기에 물을 넣어 용기를 가득 채웠을 때의 양을 측정한다. 2.1.2 용기의 내용물을 제거하여 물 또는 적당한 용매로 용기의 내부를 깨끗이 씻 어 말린 후 물을 넣어 용기를 가득 채웠을 때의 양을 측정하여 전후의 용량 차로 계산한다(시료 3개를 가지고 시험하여 평균값을 내용량으로 한다). 2.2 중량표시제품 2.2.1 내용물이 들어있는 용기 외면을 깨끗이 닦고 무게를 정밀히 측정한다. 2.2.2 내용물을 완전히 제거하고 물 또는 용매 등으로 용기의 내부를 깨끗이 씻 어 말린 후 용기의 무게를 달아 전후의 무게차로 계산한다(시료 3개를 가지고 시험하여 평균값 내용량으로 한다). 다만, 내용량에 포함된 흡습제 등 비가식 대 상은 제외한다. 2.3 소포장제품 2.3.1 내용물이 소포장으로 20개 이하일 경우에는 전체를, 20개 이상일 경우에는 20개를 무작위로 취해 위와 같이 실험하여 평균값을 구한 후 전체 개수를 곱 하여 총량으로 계산한다. 2.4 캡슐제품 2.4.1 경질캡슐제품 2.4.1.1 표시된 시료의 전체 개수를 확인한 후, 캡슐 20개를 취하여 무게를 측정한다. 2.4.1.2 캡슐을 열고 내용물을 작은 붓 등을 사용하여 제거하고 빈 캡슐의 무게를 측정한다. 2.4.1.3 전후의 무게차를 20으로 나눈 평균값을 캡슐 당 무게로 하여 캡슐별로 무게와 총 개수에 대하여 각각 판정한다. 2.4.2 연질캡슐제품 12
2.4.2.1 표시된 시료의 전체 개수를 확인한 후, 캡슐 20개를 취하여 무게를 측정하고, 캡슐을 절개하여 그 내용물을 에테르 등의 휘발성 용매로 씻는 다 1). 2.4.2.2 여과지 등으로 빈 캡슐로부터 용매를 가볍게 제거하고 실온으로 30분 이상 방치하여 캡슐에 묻어 있는 용매를 제거한다.(이 때 캡슐이 흡습 또 는 건조되는 것을 피한다) 2.4.2.3 빈 캡슐의 무게를 측정한 후, 전후의 무게차를 20으로 나눈 평균값을 캡슐 당 무게로 하여 캡슐별의 무게와 총 개수에 대하여 각각 판정한다 2). 2.5 정제제품 2.5.1 표시된 시료의 전체 개수를 확인한 후 20정을 취하여 무게를 측정하고, 20 으로 나눈 평균값을 정 당 무게로 하여 정별로 무게와 총 개수에 대하여 각 각 판정한다 3. 참고문헌 3.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 2002 3.2 위생시험법 주해, 일본 약학회, 2005 4. 시험 주의사항 1) 캅셀을 절개한 후 화장지를 이용하여 내용물을 잘 닦아내고 에테르 등의 휘발 성 용매로 씻으면 캅셀의 내용물을 더 깨끗이 제거할 수 있다. 2) 분류에 따라 내용량을 측정한 후 표시된 양과 실제량과의 부족량의 허용오차 (범위)를 기준으로 판정한다. 13
Ⅲ.2.3 입도시험법 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 KS 규격의 체 를 통과하는 시료의 양을 측정하여 과립제형 제품의 성형 상태를 판정하는 방법이다. 2. 시험방법 및 결과 판정 2.1 과립제품 2.1.1 12호(1680 μm), 14호(1410 μm) 및 45호(350 μm) 체를 써서 시험한다. 다만 이 시험법에 쓰는 체 틀의 안지름은 75 mm로 한다. 2.1.2 시료 20 g을 정확하게 달아 앞에서 지정한 체 및 수기( 受 器 )를 겹쳐놓은 용 기의 상단 체에 넣고 뚜껑을 덮은 다음 3분간 수평으로 흔들어 주면서 때 때로 가볍게 두드려준 다음 각 체 및 수기 내 잔류물의 질량을 단다. 2.1.3 12호(1680 μm) 체를 전량 통과하고 14호(1410 μm) 체에 남는 것은 전체량의 5%이하이고 또 45호 (350 μm) 체를 통과하는 것은 전체량의 15%이하일 때 적 합하다. 14
Ⅲ.2.4 산도시험법 Ⅲ.2.4.1 산도 1. 시험방법의 원리 식품을 회화하였을 때 식품을 구성하고 있는 무기성분 가운데 Ma, Mg, Zn, Ca, K, Fe, Cu, Mn, Co등 양이온을 이루는 것을 알칼리 생성원소라 하고 P, O, S, Cl, Br, I등의 음이온을 이루는 것을 산 생성원소라 한다. 따라서 K+, Ca2+, Na+, Mg2+ 등 물과 결합해서 알칼리성을 나타내는 이온이, Cl-, P-, S- 등 산성을 나타 내는 것에 비해서 많은 식품이 알칼리성 식품이다. 본 시험법은 산의 총량측정을 이용한 분석법으로 ph 지시약(페놀프탈레 인)을 사용하여 알칼리 표준용액으로 적정함으로써 산의 함량을 구한다. 증류수로 용해 ph 지시약 첨가 표준용액으로 적정 2. 안전 주의 사항 시험 중 수산화나트륨(Sodium hydroxide)은 삼키면 유해하며 호흡기도, 피부, 눈, 점막에 화상을 입힐 수 있고 물과 접촉 시 반응 할 수 보안경으로 눈 보호, 실험복 착용 및 안전장갑 등의 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 3.1.1 삼각플라스크(250 ml) 3.2 분석장비 3.2.1 ph 측정기 3.3 분석장비의 준비 3.3.1 ph 측정 전에 충분히 안정화 시키고, 기기보정을 해둔다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 시액의 조제 4.1.1 0.1 N 수산화나트륨 용액(Sodium hydroxide) 1 N 수산화나트륨 용액을 취하여 증류수로 10배 용량으로 희석 1) 하여 사 용하거나 수산화나트륨 4.5 g을 취하여 일정량의 증류수에 녹이고 1000 ml 부피플라스크에 옮겨 담은 후 증류수를 표선까지 채운 다음 표정하여 사용 15
한다. 4.1.2 페놀프탈레인 시액(Phenolphthalein) 페놀프탈레인 1 g을 에탄올 100 ml에 녹인다. 5. 시험과정 5.1 시험용액의 조제 5.1.1 시료 0.5 g에 끓여서 식힌 증류수 50 ml를 가하여 페놀프탈레인 시액 0.5 ml를 가한다. 5.1.2 0.1 N 수산화나트륨용액으로 30초간 붉은색이 지속될 때까지 적정한다. 단, 시험용액이 착색되어 있는 경우는 ph 측정기를 이용하여 ph 8.3까 지 적정한다. 6. 분석 및 계산 6.1 계산 6.1.1 산도(1 N NaOH ml/100g) = S S : 0.1 N 수산화나트륨용액의 소비량(mL) f : 0.1 N 수산화나트륨용액의 역가 f 10 시료채취량( g) 7. 참고문헌 7.1. AOAC. 2006. Official Methods 2005. 02: Total Monomeric Anthocyanin Pigment Content of Fruit Juices, Beverages, Natural Colorants, and Wines ph Differential Method, Association of Official Analytical Chemists. Inc, (37. 1. 68), 2005. 8. 시험 주의사항 1) 표준용액을 제조 시 부피플라스크를 이용하여 목적하는 농도가 되도록 단계별 로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 16
Ⅲ.2.4.2 유기산 산도 Ⅲ.2.4.2.1 유기산 산도(젖산으로서) 1. 시험방법의 원리 유기산은 산성을 나타내는 유기 화합물로써 가장 대표적인 유기산은 카르복실산으 로 -COOH의 작용기를 갖고 있으며 젖산, 아세트산, 포름산, 시트르산, 옥살산, 요산 등이 있고, 동식물의 조직 중에 존재하고 특히, 과실, 야채, 발효성 식품에 많이 함 유되어 있다. 식초에는 초산이, 김치와 요구르트에는 젖산이, 레몬과 오렌지 등 과 일에는 사과산과 구연산이 신맛을 낸다. 화합물로써 지방으로부터 핵산에 이르기까 지 여러 가지 화합체가 있지만 모두가 영양과 생화학적으로 중요하다. 본 시험법은 산의 총량측정에 의한 분석법으로 ph 지시약(페놀프탈레인)을 사용하여 알칼리 규정액으로 적정함으로써 유기산 함량을 구한다. 증류수로 용해 ph 지시약 첨가 표준용액으로 적정 2. 안전 주의 사항 시험 중 수산화나트륨(Sodium hydroxide)은 삼키면 유해하며 호흡기도, 피부, 눈, 점막에 화상을 입힐 수 있고 물과 접촉 시 반응 할 수 보안경으로 눈 보호, 실험복 착용 및 안전장갑 등의 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 3.1.1 삼각플라스크(250 ml) 3.2 분석장비 3.2.1 ph 측정기 3.3 분석장비의 준비 3.3.1 ph 측정 전에 충분히 안정화 시키고, 기기보정을 해둔다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 시액의 조제 4.1.1 0.1 N 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 1 N 수산화나트륨 용액을 취하여 증류수로 10배 용량으로 희석 1) 하여 사 용하거나 수산화나트륨 4.5 g을 취하여 일정량의 증류수에 녹이고 1000 ml 17
부피플라스크에 옮겨 담은 후 증류수를 표선까지 채운 다음 표정하여 사용 한다. 4.1.2 페놀프탈레인 시액(Phenolphthalein) 페놀프탈레인 1 g을 에탄올 100 ml에 녹인다. 5. 시험과정 5.1 시험용액의 조제 5.1.1 시료 10 g에 끓여서 식힌 증류수 100 ml를 가하여 페놀프탈레인 시액 0.5 ml를 가한다. 5.1.2 0.1 N 수산화나트륨용액으로 30초간 붉은색이 지속될 때까지 적정한다. 단, 시험용액이 착색되어 있는 경우는 ph 측정기를 이용하여 ph 8.3까 지 적정한다. 6. 계산 6.1 계산 6.1.1 유기산 산도(젖산으로서, %) = S S : 0.1 N 수산화나트륨용액의 소비량(mL) f : 0.1 N 수산화나트륨용액의 역가 f 0.009 시료채취량(g) 100 7. 참고문헌 7.1. MARIE-VINCENTE ALBERTINI, ELODIE CARCOUET, OLIVIER PAILLY, CLAUDE GAMBOTTI, FRANCu OIS LURO, LILIANE BERTI : Changes in Organic Acids and Sugars during Early Stages of Development of Acidic and Acidless Citrus Fruit, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, 8335-8339, 2006. 8. 시험 주의사항 1) 표준용액을 제조 시 부피플라스크를 이용하여 목적하는 농도가 되도록 단계별 로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 18
Ⅲ.2.5 유해물질 시험법 Ⅲ.2.5.1 시안화합물 1. 시험방법의 원리 시안화수소(HCN, 청산)의 금속염을 시안화물이라 하고, 대표적인 것이 시안화 칼리(KCN), 시안화나트륨(NaCN) 등이다. HCN은 자연계에서는 매화나무속(체리, 아몬드)과 같은 어떤 종식물의 종자 속에 글리고시도아미다린으로 존재한다. HCN은 백금촉매에 의한 암모니아와 메탄의 반응, 포름아미드의 촉매에 의한 분 해, 시안화합물과 산의 반응 등에서 생산되고 옛날에는 살서ㆍ살충제로서 훈증작 업, 전기도금작업, 화학물질의 합성, 특히 아릴로니트릴. 아세트시안히드린의 제 조에 관계하는 작업 등, 산업현장에서의 시안화물에 노출 되는 경우가 많았지만, 최근에는 도금공장의 페액중 시안으로 인한 물 오염, 유기합성재ㆍ신건축재 등의 화재연소에 의한 시안가스의 발생, 자동차의 배기가스, 쓰레기 소각장의 연기중 의 시안가스 등, 환경오염에 의한 노출이 문제가 되고 있다. 시료를 수기에 밀전하고 시료로부터 휘발되는 시안화합물에 의한 피크린산지의 색변화를 관찰하여 시안화합물을 정성분석 한다. 완충액 혼합 피크린산지로 밀전 혼합 / 진탕 / 방치 피크린산지 색변화 2. 안전 주의 사항 피크린산 지를 만들 때 사용하는 피크린산은 삼키면 유해하며, 호흡기도를 자극 하고, 피부와 눈에 자극을 일으키며 알레르기 반응이 일어날 수 있다. 또한 충격이 나 마찰 또는 열에 노출되면 폭발할 수도 있으므로 밀페된 용기에서 서늘하고 건조 한 장소에 보관하도록 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 3.1.1 삼각플라스크(200 ml) 3.1.2 코르크 마개 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 일반시약 19
4.1.1 탄산나트륨(Sodium carbonate) 4.1.2 구연산(Citric acid) 4.1.3 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 4.1.4 피크린산(Picric acid) 4.1.5 주석산(Tartaric acid) 4.2 시액의 조제 4.2.1 구연산 완충액 구연산 128.1 g, 수산화나트륨 64.4 g을 증류수에 용해시켜 1 L로 하고 ph 5.9로 조절한다. 4.2.2 피크린산 지 여지를 포화 피크린산 용액에 담그고 실온에서 건조한 후 7 40 mm의 크 기로 잘라서 사용 시 10% 탄산나트륨용액에 담근다. 5. 시험과정 5.1 시험용액의 조제 5.1.1 시료 20 g을 200 ml 삼각플라스크에 취한다. 5.1.2 구연산 완충액 50 ml를 5.1.1에 가한다. 5.1.3 삼각플라스크를 피크린산지를 매달은 코르크 마개로 밀전한다. 5.1.4 25~35 에서 때때로 흔들어 혼합시키면서 3시간 방치한다. 5.1.5 이후 주석산 2 g을 가한다. 5.1.6 코르크마개를 신속히 밀전하고 때때로 흔들어 혼합하면서 50~60 에서 1 시간 방치 1) 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 결과 분석 6.1.1 피크린산지의 색변화를 관찰 (공시험 : 노란연두, 시료 : 갈색) 7. 참고문헌 7.1. 권훈정, 심순미, 조혜전, 한영아 : 식품 중 천연유래 시안화합물 규격관리, 식 품의약품안전청연구보고서, 10, 693-694, 2006. 7.2. 고용노동부, 한국산업안전보건공단 : 물질안전보건자료, 1-8, 2006. 8. 시험 주의사항 1) 모든 가열 반응은 반응시키는 수욕조나 가열기를 목적하는 온도로 미리 맞추 어 두어 목적온도에서의 시간을 정확히 유지토록 한다. 20
Ⅲ.2.5.2. 카페인 1. 시험방법의 원리 카페인은 융점 238. 견사상의 가벼운 백색결정, 승화는 178 로부터 시작된 다. 열수에 잘 녹고 쓴맛(역치 0.0007M)을 나타낸다. 유사 화합물에는 theobromine, theopurine이 있다. 커피나 차 같은 일부 식물의 열매, 잎, 씨앗 등에 함유된 알칼로이드(alkaloid) 의 일종으로, 커피, 차, 소프트드링크, 강장음료, 약품 등의 다양한 형태로 인체 에 흡수되며, 중추신경계에 작용하여 정신을 각성시키고 피로를 줄이는 등의 효 과가 있으며 장기간 다량을 복용할 경우 카페인 중독을 야기할 수 있다. 본 시험법은 카페인이 메탄올에 잘 용해되는 성질을 이용하여 초음파 처리를 통하 여 시료 중 카페인을 충분히 추출하여 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기 를 통해 분석하는 방법으로 카페인의 최대 흡수파장인 280 nm에서 정량분석을 한다. 메탄올 추출 초음파진탕 filtration 액체크로마토그래피 자외부흡광광도검출 2. 안전 주의 사항 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴(Acetonitrile)은 흡입이나 섭취시 구 토, 구역질, 혈압변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의식불명 등의 증상이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 3.1.1 부피플라스크(100 ml) 3.1.2 여과용 멤브레인 필터 3.1.3 액체크로마토그래프용 유리병 3.2 분석장비 3.2.1 고속액체크로마토그래프 3.2.2 자외부흡광광도검출기 3.2.3 칼럼오븐 3.2.4 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 21
3.3 분석장비의 준비 이동상인 아세토니트릴과 0.1%인산용액을 이용하여 분당 1.0 ml로 충분한 시 간동안 흘려 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 4.1.1 카페인(Caffeine, 1,3,7-trimethyl-1H-purine-2,6(3H,7H)-dione, 1,3,7-trimethylxanthine, trimethylxanthine, theine, methyltheobromine) 분자식 : C 8 H 10 N 4 O 2, 분자량 : 194.19, CAS No. : 58-08-2 4.2 일반시약 4.2.1 메탄올(Methanol) 4.2.2 아세토니트릴(Acetonitrile) 4.2.3 초산(Acetic acid) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 5.1.1 표준물질을 메탄올에 녹여 1,000 μg/ml 되도록 표준원액을 만든다. 5.1.2 표준원액을 적당량 희석 1) 하여 표준용액으로 한다. 5.2 시험용액의 조제 5.2.1 시료(카페인으로서 20~80 mg) 적당량을 취하여 100 ml 부피플라스크에 넣은 후 메탄올을 가하여 초음파 추출을 한다. 5.2.2 위의 시험액을 메탄올로 표선까지 채운 다음, 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다. 22
6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항목 주입량 검출기 파장 조건 20 μl 280 nm 칼럼 온도 40 이동상 유속 A : 0.1%초산용액, B : 100%아세토니트릴 1.0 ml/분 표 2. 이동상 조건(예) 시간(분) A용액(%) B용액(%) 0 95 5 10 85 15 11 0 100 20 0 100 21 95 5 40 95 5 6.2. 표준물질 크로마토그램 23
6.3 계산 카페인함량(mg/kg) = S V 시료채취량( g) S : 시험용액 중 카페인의 농도(μg/mL) V : 시험용액의 전량(mL) 7. 참고문헌 7.1. 김희연, 이영자, 홍기형, 이철원, 하상철 : HPLC를 이용한 카페인으 분석법 개 발 및 시판 식품중 함유량 조사, 한국식품과학회지, 31(6), 1471-1476, 1999. 7.2. Karen W, Andrews, Amy Schweitzer, Cuiwei Zhao, Joanne M. Holden, Janet M. Roseland, Mary Brandt, Johanna T. Dwyer, Mary Frances Picciano, Leila G. Saldanha, Kenneth D. Fisher, Elizabeth Yetley, Joseph M. Betz, Larry Douglass : The caffeine contents of dietary supplements commonly purchased in the US: analysis of 53 products with caffeine-containing ingredients, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 389(1), 231-239, 2007. 8. 시험 주의사항 1) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 24
Ⅲ.2.5.3 디에틸렌글리콜 Ⅲ.2.5.3.1 디에틸렌글리콜(제1법) 1. 시험방법의 원리 디에틸렌글리콜(Diethylene glycol, DEG)은 점조성이 있는 투명한 액체이며 알코올 의 일종으로 에탄올과 글리세린의 중간적 성질을 갖는다. 무취이며 약간의 단맛이 있고, 단맛이 식욕을 돋구기 때문에 포도주에 사용한 때도 있었다. 체내에 들어가 2 분자의 에틸렌글리콜이 되고, 이것이 다시 산화되어 옥살산을 생성하기 때문에, 신 장에 옥살산칼슘이 축적되는 경로로 만성독성을 나타낸다. 본 시험법은 시료를 메탄올로 추출한 후 알루미나칼럼을 통해 부분 정제하고 가스 크로마토그래프를 이용하여 분석하는 방법으로 표준물질과의 면적비를 이용하여 정성 정량한다. 메탄올 추출 감압농축 알루미나칼럼 가스크로마토그래피 2. 안전 주의 사항 표준용액 조제 시 사용되는 디에틸렌글리콜은 호흡기를 통한 흡입 시 구역, 두통, 졸음, 현기증, 조정(기능) 손실이 유발될 수 있으며, 섭취 시 저체온 또는 발열과, 혈 압변화, 구역, 구토, 설사, 위통, 흉통, 호흡곤란, 불규칙 심장박동, 신장이상 등이 올 수 있으므로 취급에 주의를 기울여야 한다. 시료 추출 시 사용되는 메탄올의 경우 포름알데하이드 제조나 부동액으로 사용되 는 독성을 갖는 무색의 가연성 알코올로서, 생체 내에서알코올탈수소효소에 의해 포름알데하이드나 포름산이 되기 때문에 독성이 강하다. 30mL 이하를 섭취하더라 도 사망에 이르며, 만성독성으로는 실명을 초래하는 것으로 알려져 있으므로 환기 가 잘되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 3.1.1 감압농축기 3.1.2 알루미나칼럼 3.1.3 환저플라스크(100 ml) 3.1.4 부피플라스크(100 ml) 3.2 분석장비 3.2.1 가스크로마토그래프 25
3.2.2 불꽃이온화검출기(Flame Ionization Detector) 3.2.3 칼럼오븐 3.2.4 100% dimethylpolysiloxane 칼럼, 길이 50 m, 안지름 0.32 mm, 필름두께 0.17 μm) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 분석시작 전에 주입부 및 검출기 온도, 유량, 칼럼온도를 분석조건에 맞게 조 작하고, 가스크로마토그래프를 충분히 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 4.1.1 디에틸렌글리콜(Diethylene glycol, (2-hydroxyethoxy)ethan-2-ol) 분자식 : C 4 H 10 O 3, 분자량 : 106.12, CAS No. : 111-46-6 4.2 일반시약 4.2.1 메탄올(Methanol) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 5.1.1 디에틸렌글리콜 100 mg을 100 ml 부피플라스크에 넣는다. 5.1.2 메탄올을 표선까지 채운다. 5.1.3 위의 용액 5 ml을 취하여 1) 다시 100 ml부피플라스크에 넣는다. 5.1.4 메탄올을 표선까지 채운 다음, 필요 농도로 희석 2) 하여 사용한다. 5.2 시험용액의 조제 5.2.1 분말 또는 페이스트상의 시료는 1 g을 취하여 메탄올 10 ml를 가하여 녹 인다. 단, 액상시료는 5 ml를 취하여 40 에서 감압 농축하여 수분을 제거 한 후 잔사에 메탄올 10 ml를 가하여 녹인다. 5.2.2 위의 용액을 활성화된 알루미나칼럼에 가한다. 5.2.3 메탄올 30 ml로 용출한다. 5.2.4 용출액을 40 에서 약 1 ml로 감압 농축시킨다. 5.2.5 메탄올을 가하여 5 ml로 한 후 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 가스크로마토그래프 조건 26
항목 조건 주입부 온도 140 오븐 온도 40 칼럼 온도 40 (3분) 15 /분 300 (20분) 검출기 온도 250 캐리어 가스 및 유량 split flow 헬륨, 45 kpa 300 ml/min. 6.2 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 디에틸렌글리콜 함량(μg/g) = C (a/s) C : 시험용액 중의 디에틸렌글리콜 농도(μg/mL) a : 최종희석액(mL) S : 시료 채취량(g) 7. 참고문헌 7.1. Peter Korytar, Hans-Gerd Janssen, Eva Matisova, Udo A.Th. Brinkman : Practical fast gas chromatography: methods, instrumentation and applications, Trends in Analytical Chemistry, 21, 558-572, 2002. 27
8. 시험 주의사항 1) 정밀하게 용액을 취하기 위해서는 반드시 해당 용량의 홀 피펫을 사용하여야 한다. 2) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조 시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 28
Ⅲ.2.5.3.2 디에틸렌글리콜(제2법) 1. 시험방법의 원리 디에틸렌글리콜(Diethylene glycol, DEG)은 점조성이 있는 투명한 액체이며 알코올 의 일종으로 에탄올과 글리세린의 중간적 성질을 갖는다. 무취이며 약간의 단맛이 있고, 단맛이 식욕을 돋구기 때문에 포도주에 사용한 때도 있었다. 체내에 들어가 2 분자의 에틸렌글리콜이 되고, 이것이 다시 산화되어 옥살산을 생성하기 때문에, 신 장에 옥살산칼슘이 축적되는 경로로 만성독성을 나타낸다. 본 시험법은 메탄올로부터 시료를 추출하여 알루미나칼럼을 통해 부분 정제하여 가스크로마토그래프/질량검출기를 통해 분석하는 방법으로 표준물질과의 이온질량 비교로 정성 정량한다. 질량검출기 메탄올 추출 감압농축 알루미나칼럼 가스크로마토그래피 2. 안전 주의 사항 표준용액 조제 시 사용되는 디에틸렌글리콜은 호흡기를 통한 흡입 시 구역, 두통, 졸음, 현기증, 조정(기능) 손실이 유발될 수 있으며, 섭취 시 저체온 또는 발열과, 혈 압변화, 구역, 구토, 설사, 위통, 흉통, 호흡곤란, 불규칙 심장박동, 신장이상 등이 올 수 있으므로 취급에 주의를 기울여야 한다. 시료 추출 시 사용되는 메탄올의 경우 포름알데하이드 제조나 부동액으로 사용되 는 독성을 갖는 무색의 가연성 알코올로서, 생체 내에서알코올탈수소효소에 의해 포름알데하이드나 포름산이 되기 때문에 독성이 강하다. 30mL 이하를 섭취하더라 도 사망에 이르며, 만성독성으로는 실명을 초래하는 것으로 알려져 있으므로 환기 가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 3.1.1 감압농축기 3.1.2 알루미나칼럼 3.1.3 환저플라스크(100 ml) 3.1.4 부피플라스크(100 ml) 3.2 분석장비 3.2.1 가스크로마토그래프 29
3.2.2 질량검출기(Mass Selective Detector) 3.2.3 칼럼오븐 3.2.4 100% dimethylpolysiloxane 칼럼(길이 50 m, 안지름 0.32 mm, 필름두께 0.17 μm) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 분석시작 전에 주입부 온도, 유량 및 칼럼 온도를 분석조건에 맞게 조작하고, 가스크로마토그래프/질량검출기를 충분히 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 4.1.1 디에틸렌글리콜(Diethylene glycol, (2-hydroxyethoxy)ethan-2-ol) 분자식 : C 4 H 10 O 3, 분자량 : 106.12, CAS No. : 111-46-6 4.2 일반시약 3.2.1 메탄올(Methanol) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 5.1.1 디에틸렌글리콜 100 mg을 100 ml 부피플라스크에 넣는다. 5.1.2 메탄올을 표선까지 채운다. 5.1.3 위의 용액 5 ml를 취하여 1) 다시 100 ml부피플라스크에 넣는다. 5.1.4 메탄올을 표선까지 채운 다음, 필요 농도로 희석 2) 하여 사용한다. 5.2 시험용액의 조제 5.2.1 분말 또는 페이스트상의 시료는 1 g을 취하여 메탄올 10 ml을 가하여 녹 인다. 단, 액상시료는 5 ml을 40 에서 감압농축시켜 수분을 제거한 후 잔사에 메탄올 10 ml을 가하여 녹인다. 5.2.2 위의 용액을 활성화된 알루미나칼럼에 가한다. 5.2.3 메탄올 30 ml로 용출한다. 5.2.4 용출액을 40 에서 약 1 ml로 감압 농축시킨다. 5.2.5 메탄올을 가하여 5 ml로 한 후 시험용액으로 한다. 30
6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 가스크로마토그래프-질량검출기(GC/MS) 조건 항목 조건 주입부 온도 280 칼럼 온도 280 주입량 1 μl 이온질량 m/z 45, m/z 75 캐리어 가스 헬륨 0.75 kg/cm 2 Split ratio 30 : 1 6.2 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 디에틸렌글리콜 함량(μg/g) = C (a / S) C : 시험용액 중의 디에틸렌글리콜 농도(μg/mL) a : 최종희석액(mL) S : 시료 채취량(g) 7. 참고문헌 7.1. Xiaoping Xing, Xue Shi, Haitao Zhang, Weiyu Wang, Jiannong Ye : Determination of diethylene glycol in toothpaste by capillary electrophoresis with electrochemical detection, Microchimica Acta, 167, 297-302, 2009. 31
8. 시험 주의사항 1) 정밀하게 용액을 취하기 위해서는 반드시 해당 용량의 홀 피펫을 사용하여야 한다. 2) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 32
Ⅲ.2.5.4 시트리닌 Ⅲ.2.5.4.1 시트리닌(제1법) 1. 시험방법의 원리 시트리닌은 Penicillium cit-rinum이 생산하는 황색 색소이다. 처음에는 항생물질로 서 분리한 것이지만, 지금은 신장 독성을 야기하는 곰팡이 독의하나로 분류된다. 마 우스의 LD50은 35mg/kg(s.c.)이며, 강력한 신장장애를 일으키는 특이적 독성이 있다. 또한 신장독성이 있는 N-(3,5-dichlophenyl) succimide에서 래트를 전 처리한 후 시 트리닌을 투여하여 신장암의 발생을 확인했다. 종종 사료, 식품의 일부에서 검출된 다. 그 외에 P. viridicatum 등이 citrinin을 생산한다. Citrinin은 ochratoxin A와 더 불어, 대표적인 신장 장해를 발생시키는 물질이다. 신장에 있어서의 물의 재흡수능 을 저하시키는 것에 의해 뇨량을 증가시켜 급성 또는 만성의 네플로시스를 일으킨 다. 또한 신장암의 진행을 축진하는 작용을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 본 시험법은 에탄올을 이용하여 시료 중 시트리닌을 충분히 추출하여 액체크로마 토그래프를 통해 분석하는 방법으로 형광검출기를 이용하여 정성 및 정량분석을 한 다. 에탄올 추출 초음파처리 원심분리 감압농축 filtration 액체크로마토그래피 형광검출기 2. 안전 주의 사항 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴(Acetonitrile)은 흡입이나 섭취 시 구토, 구역, 혈압변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의 식불명 등의 증상이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비 를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 3.1.1 부피플라스크(100 ml) 3.1.2 여과용 멤브레인 필터 3.1.3 액체크로마토그래프용 유리병 3.2 분석장비 3.2.1 고속액체크로마토그래프 33
3.2.2 형광검출기(Fluorescence Detector, FLD) 3.2.3 칼럼오븐 3.2.4 옥타데실실릴화한한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상인 0.1% 삼불화초산용액 : 아세토니트릴(60 : 40)을 이용하여 용매를 분 당 1.0 ml로 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 4.1.1 시트리닌(Citrinin) 분자식 : C 13 H 14 O 5, 분자량 : 250.25, CAS No. : 518-75-2 4.2 일반시약 4.2.1 에탄올(Ethanol) 4.2.2 메탄올(Methanol) 4.2.3 아세토니트릴(Acetonitrile) 4.2.4 삼불화초산(Trifluoroacetic acid) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 5.1.1 표준물질을 10 mg을 정밀하게 달아 100 ml부피플라스크에 넣는다. 5.1.2 메탄올을 표선까지 채운다. 5.1.3 이를 메탄올로 희석 1) 하여 표준용액으로 한다. 5.2 시험용액의 조제 5.2.1 시료 2.5 g을 정밀하게 달아 원심관에 넣고 에탄올 20 ml를 첨가한다. 5.2.2 30분간 초음파 처리한다. 5.2.3 추출액을 원심분리(3,000 g, 10분)한 뒤 상등액을 취한다. 5.2.4 이를 감압농축 한다. 5.2.5 메탄올 1 ml에 녹여 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한다. 34
6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건 항목 조 건 주입량 검출기 파장 10 μl 여기파장 : 335 nm, 측정파장 : 502 nm 칼럼 온도 40 이동상 0.1% 삼불화초산용액 : 100% 아세토니트릴 (60 : 40) 유속 1.0 ml/분 6.2 표준물질 크로마토그램 6.3. 계산 시트리닌 함량(mg/kg) = C (a b) / S C : 시험용액 중 시트리닌의 농도(μg/mL) a : 시험용액의 전량(mL) b : 희석배수(적용될 경우) S : 시료 채취량(g) 7. 참고문헌 7.1. S. Schmidt, A. Brockmeyer, K. Knor, G. Thielert : Bestimmung von Citrinin in Getreide, Mycotoxin Research, 19(2), 129-133, 2003.s 35
8. 시험 주의사항 1) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 36
Ⅲ.2.5.4.2 시트리닌(제2법) 1. 시험방법의 원리 시트리닌은 Penicillium cit-rinum이 생산하는 황색 색소이다. 처음에는 항생물질로 서 분리한 것이지만, 지금은 신장 독성을 야기하는 곰팡이 독의하나로 분류된다. 마 우스의 LD50은 35mg/kg(s.c.)이며, 강력한 신장장애를 일으키는 특이적 독성이 있다. 또한 신장독성이 있는 N-(3,5-dichlophenyl) succimide에서 래트를 전 처리한 후 시 트리닌을 투여하여 신장암의 발생을 확인했다. 종종 사료, 식품의 일부에서 검출된 다. 그 외에 P. viridicatum 등이 citrinin을 생산한다. Citrinin은 ochratoxin A와 더 불어, 대표적인 신장 장해를 발생시키는 물질이다. 신장에 있어서의 물의 재흡수능 을 저하시키는 것에 의해 뇨량을 증가시켜 급성 또는 만성의 네플로시스를 일으킨 다. 또한 신장암의 진행을 축진하는 작용을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 본 시험법은 시료로부터 시트리닌을 추출한 후, 액체크로마토그래프/질량검출기/ 질량검출기 이용하여 정성 분석하는 방법이다. 에탄올 추출 초음파처리 원심분리 감압농축 filtration 액체크로마토그래피 형광검출기 2. 안전 주의 사항 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴(Acetonitrile)은 흡입이나 섭취 시 구토, 구역, 혈압변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의 식불명 등의 증상이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비 를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 3.1.1 부피플라스크(100 ml) 3.1.2 여과용 멤브레인 필터 3.1.3 액체크로마토그래프용 유리병 3.2 분석장비 3.2.1 고속액체크로마토그래프 3.2.2 질량검출기(Mass Selective Detector) 3.2.3 칼럼오븐 37
3.2.4 옥타데실실릴화한한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상을 충분히 흘려 액체크로마토그래프와 질량검출기를 안정화시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 4.1.1 시트리닌(Citrinin) 분자식 : C 13 H 14 O 5, 분자량 : 250.25, CAS No. : 518-75-2 4.2 일반시약 4.2.1 에탄올(Ethanol) 4.2.2 메탄올(Methanol) 4.2.3 아세토니트릴(Acetonitrile) 4.2.4 삼불화초산(Trifluoroacetic acid) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 5.1.1 표준품을 10 mg을 정밀하게 달아 100 ml 부피플라스크에 넣는다. 5.1.2 메탄올을 넣어 표선까지 채운다(100 μg/ml). 5.1.3 이를 메탄올로 희석 1) 하여 표준용액으로 한다(0.01 μg/ml). 5.2 시험용액의 조제 5.2.1 검체 2.5 g을 정밀하게 달아 원심관에 넣고 에탄올 20 ml를 첨가한다. 5.2.2 30분간 초음파 처리한다. 5.2.3 추출액을 원심분리(3,000 g, 10min)한 뒤 상등액을 취한다. 5.2.4 이를 감압농축한다. 5.2.5 메탄올 1 ml에 녹여 0.45 μm 멤브레인필터로 여과한다. 38
6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기 조건 항목 조건 주입량 5 μl 칼럼온도 40 이동상 A : 0.1% 개미산, B : 0.1% 개미산이 포함된 아세토니트릴 유속 0.3 ml/분 이온화 ESI, Positive 분석모드 MRM Capillary voltage 4.0 kv Corn voltage 25 V Source temperature 120 Desolvation temperature 350 Monitor ions(m/z) 251(precursor), 233(product) 표 2. 이동상 조건 시간 A용액(%) B용액(%) 0 80 20 3.00 40 60 4.00 40 60 4.01 80 20 6.2 표준물질 크로마토그램 39
7. 참고문헌 7.1. Martien C. Spanjer, Peter Rensen, Jos Scholten : LC-MS/MS multimethod for mycotoxins after single extraction and validation data for peanut, pistachio, wheat, maize, cornflake, raisin and fig, Food Additives and Contaminants, 25(4), 472-489, 2008. 8. 시험 주의사항 1) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 40
Ⅲ.2.5.5 초산에틸 1. 시험방법의 원리 초산에틸은 식물에서 널리 발견되는 에스테르로 묽은 농도일때는 파인애플과 비슷 한 과일향과 좋은 맛을 내기때문에 식품 첨가제로 사용되어지며, 향료나 흥분제 따 위로 쓴다. 이 화합물은 용재로 우수할 뿐만 아니라, 인체에도 해가 적어 매니큐어 를 만들 때 쓰이거나, 매니큐어 제거제로도 사용된다. 초산에틸은 아세트알데히드의 아세트산이 알루미늄 에톡사이드 촉매하에서 에틸알코올 및 부탄올 등의 알코올류 와 반응하여 에스테르와 물을 형성하게 된다. 본 시험법은 초산에틸이 휘발성인 것을 이용하여 건강기능식품 중 휘발성물질을 헤드스페이스 포집법으로 추출하여 GC 칼럼을 통하여 추출된 용매를 분리하는 방법 이다. 분리된 성분은 가스크로마토그래프 불꽃이온화 검출기를 이용하여 정량한다. 헤드스페이스 포집/추출 가스크로마토그래피 불꽃이온화검출기 2. 안전 주의 사항 톨루엔(Tolune)은 섭취 시 기도에 치명적일 수 있으며 호흡기계에 자극을 일으키 고 장기간 또는 반복노출 시 장기에 손상을 일으킨다. 또한 태아 혹은 생식능력에 손상을 일으킬 수도 있으므로 환기장치를 설치하고 보안경으로 눈 보호, 실험복 착 용 및 안전장갑 등의 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 3.1.1 GC용 유리병 (2 ml) 3.1.2 헤드스페이스샘플러용 스크류캡 유리병 (25 ml) 3.1.3 부피플라스크 (100 ml, 50 ml) 3.1.4 막자사발 3.1.5 가스타이트시린지 100, 50 μl 3.2 분석장비 3.2.1 가스크로마토그래프/불꽃이온화검출기 혹은 질량분석기 3.2.2 헤드스페이스샘플러 (HeadSpaceSampler) 3.2.3 Wax 칼럼 (0.25 mm i.d. 30m 0.25 μm film thickness), FFAP 칼럼 (0.25 mm i.d. 30m 0.25 μm film thickness) 혹은 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 가스크로마토그래프는 가스를 0.5 ml/min.으로 충분한 시간동안 흘려, 검출기 41
및 칼럼을 안정화시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 4.1.1 초산에틸 Ethyl acetate (EA) 분자식 : CH 3 COOC 2 H 5, 분자량 : 88.11, CAS No. : 141-78-6 O O 4.2 일반시약 4.2.1 톨루엔(Toluene, HPLC grade) 4.2.2 증류수(Distilled water, HPLC grade) 5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 5.1.1 초산에틸 1.00 ml을 취하여 100 ml 부피플라스크에 넣는다. 5.1.2 부피플라스크에 톨루엔을 넣어 표선까지 채운 다음, 표준원액 1) 으로 사용 한다. 5.1.3 5.1.2의 표준원액을 톨루엔으로 적절히 희석 2) 하여 1250, 2500, 5000 ppm 표준용액으로 사용한다 5.1.4 상기용액은 휘발성이 있으므로 휘발성을 최소화한 바이알에 넣는다. 5.2 검량선 작성용액의 조제 5.2.1 균질화 한 공시험용(초산에틸이 검출되지 않는)시료 5 g을 정밀히 취한다. 5.2.2 위의 시료를 25 ml 헤드스페이스샘플러용 유리병에 넣는다. 5.2.3 여기에 가스타이트 시린지를 이용하여 표준원액 1250, 2500, 5000 ppm인 표준용액 100 μl를 각각 넣은 후 다음의 시험조작에서 검량선 작성용액 으로 사용한다. 이 용액은 각각 1, 2, 5 ppm의 농도가 된다. 5.3 시험용액의 조제 5.3.1 균질화 한 시료 5 g을 정밀히 취한다. 5.3.2 위의 시료를 25 ml 헤드스페이스샘플러용 유리병에 넣은 후 시험용액으 로 사용한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 다음 표 1의 조건으로 사용하되 적용되는 기기나 칼럼에 따라 수정이 필요할 수 있다. 42
표 1. 가스크로마토그래프/헤드스페이스샘플러 조건(예) 구분 항목 조건 가스크로마토 그래프 고정상 칼럼온도 캐리어가스 및 유량 FFAP 칼럼(0.25 mm i.d. 30 m 0.25 μm) 초기조건 : 40 에서 5분 정체 승온 1단계 1) : 3 /분으로 50 후 5분 정체 승온 2단계 2) : 50 /분으로 150 후 3분 정체 질소 또는 헬륨, 0.5 ml/분 분할비율 40 : 1 주입량 100 μl 헤드스페이스 샘플러 주입기 온도 120 가열 온도 및 방법 80, 흔들면서 가열 가열 시간 10분 검출기 온도 250 분석시간 분석시간 20분 6.2. 결과 분석 6.2.1. 표준물질 크로마토그램 6.2.2 결과 해석 6.2.2.1 표준물질 크로마토그램 및 스펙트럼 위의 조건으로 얻어진 크로마토그램 상의 피이크는 어느 측정조건에서도 43
표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 6.2.2.2 정성시험 위의 조건으로 얻어진 크로마토그램 상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피이크의 머무름 시간과 일치하여야 한다. 6.2.2.3 정량시험 검량선 작성 혼합액을 가스크로마토그래프에 주입함으로서 용매들의 검출 기 반응을 측정하여 각 성분에 대한 면적을 구하고 검량선을 작성하여 시료 중 초산에틸의 잔류량을 구한다. 6.3 계산 6.3.1 초산에틸 (μg/g) = A x (B/C) x D A : 시험용액 중 초산에칠 농도(μg/mL) B : 시험용액 전량(mL) C : 시료 채취량(g) D : 표준품 순도(%) 7. 참고문헌 7.1. Nishith Vora and Prodromos Daoutidis : Analys,is and Nonlinear Control of an Ethyl Acetate Reactive Distillation Column, Proceedings of the Americaln Control Conference, 2113-2117, 1998. 7.2. SB PURANIK, VARUN R PAWAR, N LALITHA, PN SANJAY PAI AND GK RAO : RESIDUAL SOLVENT ANALYSIS IN HYDROCHLORIDE SALTS OF ACTIVE PHARMACEUTICAL INGREDIENTS, Pak Journal Pharmacy Science. Vol.22, No.4, 410-414, 2009 8. 시험 주의사항 1) 다음과 같이 정밀하게 용액을 취하기 위해서는 반드시 해당 용량의 홀 피펫을 사용하여야 한다. (1.00mL/100mL 10,000ppm) 2) 표준원액으로 여러 농도의 표준용액을 제조시 부피플라스크를 이용하여 목적 하는 농도가 되도록 단계별로 희석하여 조작 오차를 방지하도록 한다. 44
Ⅲ.3 개별 성분별 시험법 Ⅲ.3.1 비타민 Ⅲ.3.1.1 비타민 A Ⅲ.3.1.1.1. 비타민 A(제1법) 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 시료 중에 존재하는 비타민A를 비누화시킨 후 벤젠으로 추출하여 감 압 건조시키고 잔류물을 클로로포름으로 희석을 시킨 것으로 삼염화안티몬(Antimony trichloride)과 정색반응 1) 을 시켜 청색으로 변색된 정도에 따라 대조액과 비교하여 분광 광도계를 통하여 파장 620 nm에서 흡광도를 측정하는 방법이다. 비누화 진탕 및 감압건조 분광광도계 2. 안전 주의 사항 시험 중 수산화나트륨(Sodium hydroxide)은 삼키면 유해하며 호흡기도, 피부, 눈, 점막에 화상을 입힐 수 있고 물과 접촉 시 반응 할 수 보안경으로 눈 보호, 실험복 착용 및 안전장갑 등의 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 클로로포름은 신경을 마비시키는 작용을 하므로 마취제로서 사용되지만 과량복용 이나 주사 시 심장을 멈춰 죽음에 이르게 하며, 장기간 복용이나 노출은 간, 폐, 신 장에 해를 주므로 환기가 잘되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여 야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 3.1.1 증류플라스크 3.1.2 분액깔대기 3.1.3 질소가스 3.1.4 감압농축기 3.2 분석장비 3.2.1 분광광도계 3.3 분석장비의 준비 45
두 개의 셀에 클로로포름 0.6 ml과 정색용액 3 ml을 가하여 분광광도계의 영점을 맞춘다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 4.1.1 Retinyl Palmitate(all trans Retinol palmitate; Vitamin A palmitate) 분자식 : C 36 H 60 O 2, 분자량 : 524.86, CAS No. : 201-228-5 4.1.2 Retinyl Acetate(Retinol acetate; Vitamin A acetate) 분자식 : C 22 H 32 O 2, 분자량 : 328.49, CAS No. : 127-47-9 4.2 일반시약 4.2.1 에테르(Ether) 4.2.2 벤젠(Benzene) 4.2.3 에탄올(Ethanol) 4.2.4 빙초산(Glacial acetic acid) 4.2.5 클로로포름(Chloroform) 4.2.6 무수초산(Acetic anhydride) 4.2.7 삼염화안티몬(Antimony trichloride) 4.2.8 황산(Sulfuric acid) 4.2.9 증류수(Distilled water) 4.2.10 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 4.2.11 산화크롬(Chromium oxide) 4.2.12 무수황산나트륨(Sodium sulfate anhydride) 4.2.13 수산화칼륨(Potassium hydroxide) 4.2.14 아연(Zinc) 4.2.15 피로갈롤(pyrogallol) 5. 시험과정 5.1 시약 제조 5.1.1 무알데히드에탄올 에탄올 1 L에 50% 수산화칼륨용액 5 ml 및 아연분말 5 g을 가해 약 2시간 46
환류냉각기를 달아 가온한 후 증류한다. 단, 처음 및 마지막 증류액 각각 10%를 버린다. 5.1.2 초산 빙초산 1 L에 대해서 산화크롬 10 g을 가해 2회 증류한다. 116 이상의 증류액을 취한다. 5.1.3 클로로포름 클로로포름 1 L를 황산 20~30 ml씩으로 황산층이 착색되지 않을 때까지 수 회 씻는다. 수세하여 황산을 제거하고, 15~20% 수산화나트륨용액 20~ 30 ml로 2~3회 씻은 후 수세한다. 여기에 탄산칼륨을 가하여 혼합한 후 냉암소에 약 12시간 이상 방치하고 탈수 2) 시켜 증류한다. 정제한 클로로포 름은 갈색병에 넣어 냉동에 보존한다. 보존 중 흡습하지 않도록 주의한다. 이 클로로포름은 적어도 1주간은 사용이 가능하다. 5.1.4 정색용액 3) 삼염화안티몬 20 g을 상기의 클로로포름 100 ml에 녹여 하룻밤 방치한 후 무수초산 2 ml를 가해 콜크마개나 폴리에틸렌마개를 하여 차광하여 상온으로 보존한다. 이 용액은 흡습성이 강하고 변질이 쉬우므로 조제 후 1주간 내에 사용한다. 5.1.5 표준비타민 A 비타민 A유[1 g 중 비타민 A 10,000국제단위(IU) 함유]를 사용한다. 5.2 표준용액 제조 5.2.1 표준비타민 A를 약 100~150단위로 정밀히 측정한다. 5.2.2 측정한 표준비타민 A를 증류플라스크에 취한다. 5.2.3 피로갈롤100 mg, 하이드로퀴논 100 mg을 가한다. 5.2.4 최소한 3 ml 또는 동량의 50% 수산화칼륨용액 및 그 8배량의 무알데히 드에탄올을 가한다. 5.2.5 비등 수욕 상에서 플라스크를 흔들어주면서 30분간 비누화한다. 5.2.6 비누화한 후 냉각시키고 벤젠 100 ml을 가한다. 5.2.7 15초간 격렬히 흔든다. 침전이 있으면 그것이 침전될 때까지 방치한다. 5.2.8 위의 용액 250~300 ml 분액깔대기에 옮긴다. 이 때 침전물이 발생한 경 우 침전물을 씻어 옮길 필요는 없다. 5.2.9 분액깔때기에 1 N 수산화칼륨액 100 ml을 가하여 15초간 흔들어준 후 방치 한다. 5.2.10 혼탁된 물층은 버리고 벤젠층에 0.5 N 수산화칼륨액 40 ml을 가하여 격 렬히 진탕한다. 5.2.11 벤젠층을 증류수 40 ml로 최소한 4회 가하여 15초간 격렬하게 진탕 혼 합하여 수세를 반복한다. 이 때 수세액에 페놀프탈레인시액으로 알칼리 의 반응이 나타내지 않을 때까지 수세한다. 47
5.2.12 분액깔대기를 정치하여 벤젠층과 물층을 완전히 분리한다. 5.2.13 벤젠층에 산화방지제로서 소량의 디부틸히드록시톨루엔을 가한다. 5.2.14 위의 용액의 벤젠층 50 ml을 100 ml 증류플라스크에 정확히 취한다. 5.2.15 45 수욕 상에서 짧은 시간 내에 감압 농축시킨다. 5.2.16 불활성 가스로 증류플라스크 내부를 건조시킨다. 5.2.17 잔류물에 직접 클로로포름으로 녹여서 1 ml 중 비타민A가 2, 4, 6, 10 μ g을 함유하는 용액을 조제한다. 5.3 시험용액 제조 5.3.1 시료 약 100~150 unit에 상당하는 양 4) 을 취한다. 5.3.2 표준용액 제조 방법 [5.2.2] ~ [5.2.16]까지의 방법과 동일하다. 5.3.3 상기 방법 결과 나온 잔류물에 클로로포름을 가하여 10~20 unit/ml이 되게 희석한다. 5.4 시험조작 5.4.1 시험용액 0.3 ml과 클로로포름 0.3 ml을 정확히 셀에 취한다. 5.4.2 정색용액 3 ml 5) 을 가한다. 5.4.3 대조셀에 클로로포름 0.6 ml을 정확히 취한 후 정색용액 3 ml을 가한다. 5.4.4 파장 620 nm에서 흡광도를 측정 6) 한다. 5.4.5 표준용액도 [5.4.1] ~ [5.4.4] 방법대로 하여 검량선을 작성한다. 6. 분석 및 계산 비타민 A 함량(μg/100g) = A B (100/C) 2 A : 시험용액 중 비타민 A 농도(μg/mL) B : 시험용액의 전량(mL) C : 시료 채취량(g) 7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 2002. 7.2 위생시험법 주해, 일본 약학회, 2005. 8. 시험 주의사항 1) 비색법 중에서는 감도가 높은 방법이지만, 수분의 존재로는 반응액이 혼탁해져 정량이 방해되기 때문에, 수분제거에 충분한 주의를 요한다. 2) 탈수시간은 20시간을 넘지 않도록 한다. 탈수의 확인은 1~2개의 청색 실리카 겔을 넣어 곧바로 방치해서 변색하지 않는 것을 확인한다. 3) 특이한 냄새를 갖는 액체로, 공기 중 수분과 반응해서 HCl을 발생하고, 염화안 티모닐(SbOCl)을 생성한다. 취급은 주의해서 빨리 행하고, 유리기구나 광도계 cell에 묻은 SbOCl은 희염산으로 세척해서 제거 하든가, 구연산 또는 주석산, 48
또는 주석산칼륨나트륨용액으로 씻어 제거한다. 4) 시료는 통상 10 g 이하이지만, 5 g 이하가 바람직하다. 5) SbCl 3 시액의 사용량은 반응액조 크기에 따라 3~10 ml을 사용한다. 이 경우 피험액의 사용액량도 0.3~1.0 ml을 사용하고 있다. 또, 피험액과 표준용액은 동일조건에서 반응시킨다. 6) 반응액의 발색최대흡광도는, 통상 SbCl 3 시액을 가한후부터 4 5초후라고 되어 있다. 그러나, 발색시액 혼화 후 5초에서 흡광도를 읽는다는 것은 매우 곤란하 다. 최대흡광도에 도달한 후 20초 정도까지는 흡광도의 감소가 완만하므로 실 제 위의 시간범위 내에 일정 시간을 정해 (예를들면 15초후) 흡광도를 읽는다. 49
Ⅲ.3.1.1.2 비타민 A(제2법) 1. 시험방법의 원리 본 시험법은 비타민 A가 자외선하에서 강한 형광을 발하는 특성을 이용하여, 시 료 중 비타민 A를 에탄올과 피로갈롤에탄올용액을 이용하여 비누화시키고 석유에 테르를 이용하여 추출 후 갑압건조시켜 이소프로판올로 녹인 것을 옥타데실실릴화한 칼럼을 통하여 비타민 A를 분리하는 방법으로 형광검출기로 정량한다. 비누화 추출 및 감압농축 HPLC FLD 2. 안전 주의 사항 석유 에테르(petroleum ether)는 호흡기도 자극, 피부 자극, 눈 자극, 중추 신경 계 통 억제의 건강 위험성이 있고 물리적 위험으로는 가연성이 매우 높은 액체 또는 증기이므로 증발 연소를 야기할 수도 있고 물질의 흐름 또는 혼합에 의하여 정전기 가 발생할 수도 있어 환기가 잘 되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안 전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 3.1.1 용매용 일회용 실린지 3.1.2 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터 3.1.3 액체크로마토그래프용 유리병 3.1.4 증류플라스크(100 ml) 3.1.5 분액깔대기 3.1.6 감압농축기 3.2 분석장비 3.2.1 고속액체크로마토그래프 3.2.2 형광검출기(Fluorescence Detector, FLD) 3.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상은 에탄올과 물을 95 : 5의 비율로 혼합하여 분당 1 ml씩 흘려 기기와 칼럼을 안정화 시킨다. 50
4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 4.1.1 Retinyl Acetate(Retinol acetate; Vitamin A acetate) 분자식 : C 22 H 32 O 2, 분자량 : 328.49, CAS No. : 127-47-9 4.2 일반시약 4.2.1 에탄올(Ethanol) 4.2.2 증류수(Distilled water) 4.2.3 수산화칼륨(Potassium hydroxide) 4.2.4 석유에테르(Petroleum ether) 4.2.5 무수황산나트륨(Sodium sulfate anhydride) 4.2.6 이소프로판올(Isopropanol) 4.2.7 피로갈롤(Pyrogallol) 5. 시험과정 5.1 시약 제조 5.1.1 무알데히드에탄올 에탄올 1 L에 50% 수산화칼륨용액 5 ml 및 아연분말 5 g을 가해 약 2시간 환류 후 증류한다. 단, 처음 및 마지막 증류액 각각 10%는 버린다. 5.1.2 무수황산나트륨 무수황산나트륨을 2시간 이상 120 에서 가열한 후 데시케이터 방냉한 후 보관한다. 5.2 표준용액 제조 5.2.1 비타민 A 아세테이트 결정을 비누화 시켜 비타민 A 알코올로 하여 국제 단위(IU) 또는 μg단위로 환산한다. 5.2.2 이소프로판올로 희석하여 각각 1 ml 중 5, 25, 50 IU가 함유되도록 한다. 사용 시 마다 제조한다. 5.3 시험용액 제조 5.3.1 비타민 A 약 20~30 IU(6~9 μg) 1) 에 상당하는 시료를 정밀히 취하여 증류 플라스크에 넣는다. 5.3.2 에탄올 30 ml, 피로갈롤에탄올용액(1 10) 1 ml, 90% 수산화칼륨용액 3 ml을 넣고 수욕 중에 30분간 비누화 시킨다. 5.3.3 신속히 냉각하여 물 30 ml을 가하여 200 ml 분액깔대기에 옮긴다. 5.3.4 증류플라스크를 물 10 ml로 씻어 분액깔대기에 합친다. 5.3.5 증류플라스크를 석유에테르 30 ml로 씻은 후 분액깔대기에 합한다. 51
5.3.6 물층은 석유에테르 30 ml씩 2회 추출한다. 5.3.7 위의 용액을 물 10 ml 1회, 이어 50 ml씩으로 씻는다. 이 때 수세액에 페놀프탈레인시액으로 알칼리의 반응이 나타내지 않을 때까지 수세한다. 5.3.8 분액깔대기에서 물층을 충분히 분리한 석유에테르층을 취하여 무수황산나 트륨으로 탈수하여 증류플라스크에 옮긴다. 5.3.9 황산나트륨을 석유에테르 10 ml씩으로 2회 씻은 후 [5.3.8]의 증류플라스 크에 가한다. 5.3.10 석유에테르층을 40~50 에서 감압 농축한다. 5.3.11 위의 잔류물을 이소프로판올으로 녹여 1.0 ml 2) 로 한 것을 시험용액으로 한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항 목 조 건 주입량 20 μl 칼럼온도 35 이동상 에탄올 : 물 (95 : 5) 검출기 파장 유량 여기파장 340 nm, 측정파장 460 nm 0.5 ml/분 6.2 표준물질 크로마토그램 52
6.3 계산 6.3.1 비타민 A 함량(IU * /g) = A x ((B x C)/D) A : 시험용액 중 비타민 A의 농도(IU/mL) B : 시험용액의 전량(mL) C : 시험용액의 희석배수 D : 시료 채취량(g) * : 비타민 A의 단위환산 : 1 μg = 3.33 IU 7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 2002 7.2 위생시험법 주해, 일본 약학회, 2005 8. 시험 주의사항 1) 유지류는 그대로 시료로 하지만, 그 외는 chloroform methanol 혼합액 등으 로 지질을 추출해서 시료로 한다. 2) 비타민 A 함량이 적은 시료에서는 불검화물 추출잔류물을 녹일 때 isopropanol의 량(VmL)을 0.5mL 0.2mL과 같이 적게하면 좋다. 53
Ⅲ.3.1.2 베타카로틴 1. 시험방법의 원리 베타카로틴은 알파카로틴의 이성체로 천연 카로티노이드의 한 종류이며 9개의 isoprene units으로 구성되어 있다. 비타민 A의 전구체인 베타카로틴은 장과 간 에서 레티놀로 전환되며, 이는 다시 비타민 A의 형태로 전환되어 비타민 A의 활성을 가진다. 비타민 A는 정상적인 시각 기능을 유지하는데 중요한 역할을 한 다. 또한 베타카로틴은 항산화제로써 신체 보호의 기능을 한다. 베타카로틴은 당근과 시금치와 같은 녹황색 채소와 해조류에 많이 함유되어 있 다. 현재 베타카로틴 제품은 조류추출카로틴함유제품, 녹엽식물추출카로틴함유제 품, 당근추출카로틴함유제품으로, 합성베타카로틴을 원료로 사용하여서는 아니 되고, 각각 수중에서 증식하는 식용조류, 식용녹엽식물, 당근으로부터 베타카로 틴을 추출하여 식용에 적합하도록 제조 가공한 것을 말한다. 본 시험법은 검화과정을 거쳐 시료로부터 베타카로틴을 추출한 후 고속액체크로 마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대흡수파장 인 450 nm에서 검출하여 정량한다. 베타카로틴 추출 검화 / 냉각 감압 건조 고속액체크로마토그래피 자외부흡광광도검출기 2. 안전 주의 사항 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴(Acetonitrile)은 흡입이나 섭취 시 구 토, 구역, 혈압변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의식불명 등의 증 상이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 또 다른 이동상인. 메탄올의 경우 포름알데하이드 제조나 부동액으로 사용되는 독성을 갖는 무색의 가연성 알코올로서, 생체 내에서 알코올탈수소효소에 의해 포 름알데하이드나 포름산이 되기 때문에 독성이 강하다. 30mL 이하를 섭취하더라도 사망에 이르며, 만성독성으로는 실명을 초래하는 것으로 알려져 있으므로 환기가 잘되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 3.1.1 환류냉각기 54
3.1.2 수욕조 3.1.3 갈색분액깔대기(250 ml) 3.1.4 냉각관 3.1.5 여과용 멤브레인 필터 3.1.6 감압건조기 3.1.7 액체크로마토그래프용 유리병 3.1.8 용매용 일회용 실린지 3.1.9 갈색플라스크(100 ml 또는 250 ml) 3.1.10 부피플라스크(200 ml) 3.2 분석장비 3.2.1 고속액체크로마토그래프 3.2.2 자외부흡광광도검출기 3.2.3 칼럼오븐 3.2.4 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이동상인 아세토니트릴 : 메탄올(85 : 15)과 디클로로메탄을 사용하여 용매를 분 당 1.0 ml를 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 4.1.1 베타 카로틴(β-carotene) 분자식 : C 40 H 56, 분자량 : 536.87, CAS No. : 7235-40-7 4.2 일반시약 4.2.1 메탄올(Methanol) 4.2.2 아세토니트릴(Acetonitrile) 4.2.3 이소프로판올(2-propanol) 4.2.4 디클로로메탄(Dichloromethane) 4.2.5 에탄올(Ethanol) 4.2.6 피로갈롤(Pyrogallol) 4.2.7 수산화칼륨(Potassium hydroxide) 4.2.8 석유에테르(Petroleum ether) 55
5. 시험과정 5.1 표준용액의 조제 5.1.1 베타카로틴을 10 mg을 정밀히 취하여 200 ml 부피플라스크에 넣는다. 5.1.2 이소프로판올을 이용하여 완전히 녹인다(50 μg/ml). 5.1.3 이소프로판올로 적당히 희석한다(예. 25, 12.5, 6.25 μg/ml). 5.1.4 0.45 μm 멤브레인필터로 여과하여 표준용액으로 한다. 5.2 시험용액의 조제 5.2.1 베타카로틴이 5~10 μg 함유되도록 시료를 취한다. 5.2.2 에탄올 30 ml, 10% 피로갈롤에탄올용액 1 ml를 가하여 잘 섞은 후 수산 화칼륨용액(9 10) 3 ml를 가한다. 5.2.3 환류냉각기를 부착하여 비등수욕 중에서 30분간 비누화 1) 시킨다. 단, 검체가 유지를 함유하지 않는 경우 비누화과정을 생략할 수 있다. 5.2.4 이를 신속히 냉각하여 실온으로 한 후 분액깔대기로 옮긴다. 5.2.5 냉각관 수기를 증류수 30 ml로 씻어낸 후, 씻은 액은 분액깔대기에 합하여 잘 혼합한다. 5.2.6 방치하여 층 분리를 완전히 시킨 후 물층은 별도의 갈색분액깔대기에 옮 긴다. 5.2.7 물층은 석유에테르 30 ml로 추출 2) 한다(2회 반복). 5.2.8 모든 석유에테르 추출액을 합하여 증류수 10 ml 1회, 이어 50 ml(페놀프 탈레인시액으로 정색되지 않을 때까지) 씻는다. 5.2.9 물층을 완전히 분리한 후, 석유에테르층을 취하여 무수황산나트륨을 가해 탈 수하고 석유에테르층을 갈색플라스크에 옮긴다. 5.2.10 이어 위에서 사용한 황산나트륨을 석유에틸에테르 10 ml씩으로 2회 씻고, 씻은 액을 [5.2.9]의 갈색 플라스크에 더한다. 5.2.11 석유에테르 추출액을 모두 합하여 40~50 에서 감압 건조한다. 5.2.12 잔류물을 이소프로판올로 녹여 1 ml로 한 것을 시험용액으로 한다. 56
6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 액체크로마토그래프 조건 항목 조건 주입량 20 μl 검출기 파장 450 nm 칼럼 온도 40 이동상 A용매 : 아세토니트릴 : 메탄올 (85 : 15), B 용매 : 디클로로메탄 용매 조건 A용매(70%), B용매(30%) 유속 1.0 ml/분 6.2 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 베타카로틴(mg/g) = C (a b)/s 1/1,000 C : 시험용액 중의 베타카로틴 농도(μg/mL) a : 시험용액의 양(mL) b : 희석배수(적용될 경우) S : 시료 채취량(g) 1/1,000 : 단위 환산 계수 57
7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 2002 7.2 위생시험법 주해, 일본 약학회, 2005 7.3 Dinesh Talwar, Tom KK Ha, Josephine Cooney, Christine Brownlee, Denis St JO 'Reilly : A routine method for the simultaneous measurement of retinol, a-tocopherol and five carotenoids in human plasma by reverse phase HPLC, Clinica Chimica Acta, 270, 85-100, 1998. 8. 시험 주의사항 1) 검화시 목적하는 온도가 되었을 때부터 정확히 시간을 지켜야 한다. 2) 석유에테르 추출 시 에멀전이 되어 분리가 안 되는 경우를 방지하기 위하여 초기에는 약하게 흔들어서 에테르 증기를 완전히 뺀 다음 격렬하 게 흔들어서 추출한다. 58
Ⅲ.3.1.3. 비타민 D 1. 시험방법의 원리 비타민 D는 측쇄구조가 다른 D2(ergocalciferol)형 과 D3(cholecalciferol)형이 있고, 사람을 포함한 포유류에 있어서 양자는 동일하게 대사활성화 되어 같은 생리효력을 나타낸다.(이하 D2 와 D3를 총칭하는 의미로 D를 사용한다.) 비타민 D는 간장에서 24-hydroxy vitamin D로 대체된 후, 신장에서 활성형 1,25-hydroxy vitamin D로 된 다. 활성형 비타민 D는 구루병, 골연화증, 골다공증 등의 골질환의 치료에 유효할 뿐만 아니라, 골수성 백혈병 세포를 정당한 marcrophage로 분화유도하거나, 건선치 료에 유효하다는 것이 밝혀져 주목을 받고 있다. WHO에서 결정 D3의 0.025 μg이 1 IU(국제단위)라고 정하고 있다. 본 시험법은 시료 중 비타민 D를 에탄올과 피로 갈롤에탄올용액을 이용하여 비누화시키고 벤젠용액을 이용하여 추출 후 갑압건조 시켜 아세토니트릴 : 메탄올(1 : 1)용액으로 녹인 것을 옥타데실실릴화한 칼럼에서 비 타민 D를 분리 농축시킨 후 실리카겔 칼럼을 이용하여 비타민 D를 분리하는 방법 으로 자외부흡광광도검출기를 이용하여 최대흡수파장인 254 nm에서 분리하여 정 량한다. 진탕 혼합 감압 농축 HPLC 자외부흡광광도검출기 2. 안전 주의 사항 시험 중 이동상으로 사용되는 아세토니트릴은 흡입이나 섭취시 구토, 구역질, 혈압 변화, 불규칙적인 심장박동, 두통, 호흡곤란, 경련, 의식불명 등의 증상이 나타날 수 있으므로 환기가 잘 되는 시설과 안전장비를 갖추고 취급에 주의를 기울여야 한다. 헥산은 상기도를 약간 자극하고 중추신경계를 억제한다. 만성폭로하면 말초신경장 해를 초래한다. 2,000ppm 농도에 10분 폭로될 때에는 아무런 작용이 없으나 5,000ppm에서는 현기증이 생긴다. 구역, 두통, 눈과 목의 자극증상이 1,400~1,500ppm 농도에서 생기며 탈지작용이 있 으므로 오래 동안 폭로되면 피부를 자극하게 된다. 피부에 닿으면 바로 물로 씻어 내고 사용할 때에는 충분히 환기를 해야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 3.1.1 용매용 일회용 실린지 3.1.2 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터 59
3.1.3 액체크로마토그래프용 유리병 3.1.4 증류플라스크(100 ml) 3.1.5 분액깔대기 3.1.6 감압농축기 3.1.7 여과지(FH Type, pore size 0.5 μm) 3.2 분석장비 3.2.1 고속액체크로마토그래프 3.2.2 자외부흡광광도검출기 3.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 7.5 mm, 길이300 mm, 충진재 Octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것 3.2.4 순상형 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 Silica gel) 또는 이와 동등한 것 3.3 분석장비의 준비 이 시험법에 사용되는 이동상은 2가지가 있다. 하나는 아세토니트릴과 메탄올을 1 : 1비율로 혼합한 용매인데 이것은 비타민 D를 칼럼안에 농축시키기 위해 비타민 D와 섞이지 않는 용매, 즉 분취용 이동상으로 쓰인다. 다른 또 하나의 용매는 0.4% 이소프로판올 헥산용액이다. 이것은 칼럼 안에 농축되어있는 비 타민 D와 섞이는 용매, 즉 분석용 이동상으로 쓰인다. 처음에는 일단 칼럼에 농축을 비타민 D를 농축시켜야 하기 때문에 분취용 이동상인 아세토니트릴과 메탄올을 1 : 1비율로 섞은 용매를 분당 2.0 ml씩 흐르게 하여 기기와 칼럼 을 안정화시킨다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 4.1.1 Ergocalciferol(Calciferol; Ercalciol; Ergocalciferol; Ergosterol irradiated; Irradiated ergosterol; Vitamin D 2 ) 분자식 : C 28 H 44 O, 분자량 : 396.65, CAS No. : 50-14-6 4.1.2 Cholecalciferol((+)-Vitamin D 3 ; 7-Dehydrocholesterol activated; Calciol; Activated 7-dehydrocholesterol; Cholecalciferol) 60
분자식 : C 27 H 44 O, 분자량 : 384.64, CAS No. : 67-97-0 4.2 일반시약 4.2.1 에탄올(Ethanol) 4.2.2 벤젠(Benzene) 4.2.3 아세토니트릴(Acetonitrile) 4.2.4 헥산(n-Hexane) 4.2.5 메탄올(Methanol) 4.2.6 피로갈롤(Pyrogallol) 5. 시험과정 5.1 시약 제조 5.1.1 무알데히드에탄올 에탄올 1 L에 50% 수산화칼륨용액 5 ml 및 아연분말 5 g을 가해 약 2시간 환류 후 증류한다. 단, 처음 및 마지막 증류액 각각 10%는 버린다. 5.2 표준용액 제조 5.2.1 비타민 D 2 또는 D 3 를 무알데히드에탄올에 녹인 후 적절하게 희석하여 표준용액으로 사용한다. 5.3 시험용액 제조 5.3.1 시료가 고체인 경우 초고속마쇄기로 잘게 마쇄한다. 5.3.2 비타민 D 2 IU(0.05 μg) 이상 함유한 시료를 증류플라스크에 정밀히 취 한다. 5.3.3 피로갈롤 : 에탄올(1 10)용액 40 ml을 가하여 약하게 진탕 혼합한다. 5.3.4 90% 수산화칼륨 10 ml을 가하고 1) 환류냉각기에 부착하여 수욕중에서 30 분간 가열 비누화 2) 한다. 5.3.5 냉각 후 벤젠 100 ml을 가하여 15초간 강하게 진탕 혼합한다. 침전이 생 기면 이것이 가라앉을 때까지 방치한다. 5.3.6 250 ml 분액깔대기에 옮기고 1 N 수산화칼륨 100 ml을 가하여 15초간 강하게 진탕 혼합한다. 5.3.7 방치하여 층분리를 한후 혼탁한 물층은 버린다. 5.3.8 벤젠층에 0.5 N 수산화칼륨 40 ml을 넣어 진탕 혼합한다. 61
5.3.9 벤젠층에 적어도 4회 매회 15초씩 물 40 ml로 세척한다. 세척액이 페놀프 탈레인시액으로 알칼리반응을 나타내지 않을 때까지 세척한다. 5.3.10 분액깔대기를 수 분간 방치하여 물 한방울까지 분리하여 물층을 제거한다. 5.3.11 벤젠용액 80 ml을 농축플라스크에 취하여 40 이하에서 용매를 감압농축 한다. 5.3.12 잔류물에 벤젠 5 ml을 가하여 녹이고 이 액 4.5 ml을 환저플라스크에 취하여 감압농축한다. 5.3.13 잔류물에 아세토니트릴 : 메탄올(1 : 1)용액 500 μl를 정확하게 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다. 5.4 정량시험 5.4.1 1단계 분취용 고속액체크로마토그래피 시험용액 200 μl를 정확히 취해 제1단계 고속액체크로마토그래피에 주입 하여 분획포집기로 비타민D 획분을 분취한다(비타민D 표준용액의 크로마 토그램으로 비타민D가 검출기에 도달하는 시간을 측정하여 피크가 검출기 에 도달하는 전후 30초 동안 분액을 받을 수 있도록 예비실험으로 분석조 건을 준비한다). 5.4.2 제2단계(분석용) 고속액체크로마토그래피 제1단계에서 얻은 비타민D 획분의 용매를 감압농축하여 잔류물에 0.4 % 이소프로판올 헥산 200 μl를 정확히 가하여 녹인다. 이 용액 100 μl를 정확히 취하여 제2단계 고속액체크로마토그래피에 주입하여 얻어진 크로 마토그램에 나타난 비타민D의 피크의 높이 또는 면적을 측정한다. 6. 분석 및 계산 6.1 기기분석 조건 표 1. 제 1단계(분취용) 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항목 조건 칼럼온도 35 이동상 아세토니트릴 : 메탄올 = (1 : 1) 검출기 파장 유량 254 nm 2.0 ml/분 62
표 2. 제 2단계(분석용) 고속액체크로마토그래프 조건(예) 항목 조건 칼럼온도 35 이동상 검출기 파장 유량 0.4% 이소프로판올 헥산용액 254 nm 1.6 ml/분 6.2 표준물질 크로마토그램 6.3 계산 6.3.1 계산식 비타민 D(IU/100g) = P sa P st S a 시료 채취량(g) 100 S P st P sa a : 비타민 D 표준용액의 농도(IU/mL) : 비타민 D 표준용액의 피크의 높이 또는 면적 : 시료에 대한 피크의 높이 또는 면적 : 시험용액의 전량(mL) 63
7. 참고문헌 7.1 식품공전 시험법 해설서. 식품의약품 안전청, 2002. 7.2 위생시험법 주해, 일본 약학회, 2005. 8. 시험 주의사항 1) 지질함량에 따라 적당히 증감한다. 대개 지질 1g이 수산화칼륨 1g 상당한다. 2) 비타민 D 는 가열 검화시 일부분 가역적으로 열 이성화되어 previtamin D로 전환하는 것으로 알려져 있다. 이러한 열 이성화 반응은 습도에만 의존하는 가 역반응으로, 습도가 일정하면 거의 대부분 일정한 비율로 진행한다. 따라서 본 법에서는 비타민 D표준용액에 대해서도 시료와 동일한 조건하에서 가열 검화 한다. 이것에 따라 시료, 표준품 모두 같은 비율로 previtamin D로 이성화하기 때문에, 피크높이를 비교하는 것만으로 previtamin D로 이성화된 부분이 상쇄 된다. 64
Ⅲ.3.1.4 비타민 E Ⅲ.3.1.4.1 비타민 E(제1법) 1. 시험방법의 원리 비타민 E는 tocopherol이라고도 불리우는 지용성비타민이다. 토코페롤에는 크로만 핵에 붙어 메틸기의 수와 위치의 차이에 따라 α,β,γ,δ 4종류가 있고, 각각 식물섬유 등에 존재하고 있다. 천연에 존재하는 비타민 E 작용물질에는 토코페롤과는 측쇄구 조가 다른 tocotrienol이 있고, 이것도 또 α,β,γ,δ이성체가 존재하고 있다. 천연에 존 재하는 토코페롤은 d형이지만, 합성품은 dl형으로, dl-α-tocopherol이 가장 일반적으 로 사용되고 있고, 식품첨가물의 산화방지제로서도 사용이 허용되고 있다. 비타민 E 는 생체 내에서 산화방지작용을 나타낸다. 특히 생체막의 인지질에 함유된 불포화 지방산 부분의 산화를 방지하여 생체막을 안정화하고, 이를 통해 노화방지에 공헌 하고 있는 것으로 주목을 받고 있다. 사람에서는 명백한 결핍증은 없지만, 용혈, 빈 혈, 리포스틴 형 색소침착, 크레아틴뇨증 등이 비타민 E 결핍에 의해 기인하는 것으 로 알려져 있다. 비타민 E의 국제단위(IU)는, dl-α-tocopheryl acetate, d-α-tocopheryl acetate, dl-α -tocopherol, d-α-tocopherol 각 1 mg이 각각, 1, 1.36, 1.1, 1.49 IU로 정해져 있다. 본 시험법은 비타민 E를 염화제이철과 반응시켜 생성된 Fe 2+ 에 α,α -dipyridyl을 반응시 키면 착염이 형성되면서 나타내는 홍색을 비색정량하는 원리를 이용하여 시료 중 비타민 E를 에탄올과 피로갈롤에탄올용액을 이용하여 비누화시키고 석유에테르용액 을 이용하여 추출 후 갑압건조시켜 에탄올로 녹인 후 염화 제이철에탄올용액과 디 피리딜에탄올용액으로 정색반응을 시킨 후 대조액을 에탄올로 하여 분광광도계를 이용하여 파장 520 nm에서 흡광도를 측정한다. 비누화 추출 및 감압농축 분광광도계 2. 안전 주의 사항 석유 에테르(petroleum ether)는 호흡기도 자극, 피부 자극, 눈 자극, 중추 신경 계 통 억제의 건강 위험성이 있고 물리적 위험으로는 가연성이 매우 높은 액체 또는 증기이므로 증발 연소를 야기할 수도 있고 물질의 흐름 또는 혼합에 의하여 정전기 65
가 발생할 수도 있어 환기가 잘 되는 곳에서 실험복 착용 및 호흡 보호구 등의 안 전장치를 착용하고 취급에 주의를 기울여야 한다. 3. 장비와 재료 3.1 실험실 장비 및 소모품 3.1.1 증류플라스크(100 ml) 3.1.2 분액깔대기(Sperate funnel) 3.1.3 감압농축기(Vacuum evaporator) 3.2 분석장비 3.2.1 분광광도계 3.3 분석장비의 준비 분광광도계의 0점을 맞추기 위해 에탄올을 두개의 셀에 담아 0점을 맞춘다. 4. 표준물질 및 일반시약 4.1 표준물질 4.1.1 α-tocopherol((±)-α-tocopherol; DL-all-rac-α-Tocopherol; Vitamin E) 분자식 : C 29 H 50 O 2, 분자량 : 430.71, CAS No. : 10191-41-0 4.2 일반시약 4.2.1 에탄올(Ethanol) 4.2.2 피로갈롤(Pyrogallol) 4.2.3 증류수(Distilled water) 4.2.4 수산화칼륨(Potassium hydroxide) 4.2.5 석유에테르(Petroleum ether) 4.2.6 무수황산나트륨(Sodium sulfate anhydride) 5. 시험과정 5.1 시약 제조 5.1.1 정색용액 : 0.5%, α, α'-디피리딜에탄올용액 1) 5.1.2 염화제이철에탄올용액 염화제이철 0.2 g을 에탄올 2) 에 녹여 100 ml로 한다. 5.1.3 석유에테르 석유에테르에 1/10량의 황산을 가하고 황산층이 착색되지 않을 때까지 세 척하고 1회 수세한 다음, 순차로 10% NaOH 용액 및 물로 수세한다. 세정 66