(51) Int. Cl. (19) 대한민국특허청(KR) (12) 등록특허공보(B1) A61K 39/395 (2006.01) A61K 39/42 (2006.01) A61K 38/17 (2006.01) (21) 출원번호 10-2005-7000602 (22) 출원일자(국제출원일자) 2003년07월15일 심사청구일자 2008년07월07일 (85) 번역문제출일자 2005년01월12일 (65) 공개번호 10-2005-0027107 (43) 공개일자 2005년03월17일 (86) 국제출원번호 PCT/US2003/021925 (87) 국제공개번호 WO 2004/006847 국제공개일자 (30) 우선권주장 2004년01월22일 60/396,263 2002년07월15일 미국(US) (56) 선행기술조사문헌 WO2000002587 A1* *는 심사관에 의하여 인용된 문헌 (45) 공고일자 2011년10월12일 (11) 등록번호 10-1073306 (24) 등록일자 2011년10월06일 (73) 특허권자 더 보드 오브 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 텍 사스 시스템 미국 78701 텍사스주 오스틴 웨스트 7번 스트리트 201 (72) 발명자 쏘어프 필립 이. 미국 텍사스 75205 달라스 비벌리 드라이브 4321 소어리즈 멜리나 엠. 미국 텍사스 75082 리챠드슨 그린필드 드라이브 4121 란 소피아 미국 일리노이 62561 리버톤 다우슨 써클 26에이 (74) 대리인 서장찬, 박병석, 최재철 전체 청구항 수 : 총 51 항 심사관 : 박정민 (54) 음이온성 인지질 및 아미노인지질에 결합하는 항체 및 바이러스 감염을 치료하는데 있어서 이의 용도 (57) 요 약 종양 혈관구조 및 바이러스 도입 및 확산에 있어서 음이온성 인지질 및 아미노인지질의 역활, 및 암 및 바이러스 감염 치료시 이러한 발견을 이용한 조성물 및 방법에 관한 놀라운 발견이 기재되어 있다. 또한 암, 바이러스 감 염 및 관련 질병의 안전하고 효과적인 치료에 사용하기 위한 음이온성 인지질 및 아미노인지질에 결합하여 이를 억제하는 유리한 항체, 면역접합체 및 듀라마이신계 조성물 및 배합물이 기재되어 있다. 대 표 도 - 1 -
특허청구의 범위 청구항 1 뉴클레오사이드, 뉴클레오사이드 역전사효소 억제제, 비-뉴클레오사이드 역전사효소 억제제, 프로테아제 억제제, 아만타딘, 리만타딘, 자나미비르 및 오셀타미비르로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항-바이러스제에 작 동적으로 부착된 아미노인지질에 결합하는 정제된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항-바이러스 면 역접합체를 포함하는 조성물. 청구항 2 아미노인지질에 결합하는 제1의 정제된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항-바이러스 면역접합체; 및 뉴클 레오사이드, 뉴클레오사이드 역전사효소 억제제, 비-뉴클레오사이드 역전사효소 억제제, 프로테아제 억제제, 아 만타딘, 리만타딘, 자나미비르 및 오셀타미비르로 이루어진 그룹 중에서 선택된 제2의, 명백한 항-바이러스제를 포함하는 조성물. 청구항 3 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체가 포스파티딜에탄올아민에 결합하는 조성물. 청구항 4 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체가 포스파티딜세린에 결합하는 조성물. 청구항 5 제4항에 있어서, 항체가 포스파티딜세린에 결합하고 포스파티딜세린에 대한 결합에 있어 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545로 기탁됨)와 효과적으로 경쟁하는 조성물. 청구항 6 제5항에 있어서, 항체가 포스파티드산, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤 및 카디올리핀에 추가로 결합 하고 각각의 포스파티드산, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤 및 카디올리핀에 대한 결합에 있어 모노클 로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545로 기탁됨)와 효과적으로 경쟁하는 조성물. 청구항 7 제5항에 있어서, 항체가 포스파티딜에탄올아민에 추가로 결합하는 조성물. 청구항 8 제5항에 있어서, 항체가 표 4에 설정된 것으로서 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545로 기탁됨)와 동일한 인지 질 결합 프로파일을 갖는 조성물. 청구항 9 제5항에 있어서, 항체가 표 3에 설정된 포스파티딜세린에 대한 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545로 기탁됨)의 친화성과 동일한 포스파티딜세린에 대한 친화성을 갖는 조성물. 청구항 10 제5항에 있어서, 항체가 표 4에 설정된 것으로서 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545로 기탁됨)와 동일한 인지 질 결합 프로파일을 갖고, 표 3에 설정된 것으로서, 포스파티딜세린에 대한 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545 로서 기탁됨)의 친화성과 동일한 포스파티딜세린에 대한 친화성을 갖는 조성물. 청구항 11 제5항에 있어서, 항체가, 동물을 활성화된 내피 세포로 면역화시키고 면역화된 동물로부터 포스파티딜세린에 결 합하고 포스파티딜세린에 대한 결합에 있어 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545로서 기탁됨)와 효과적으로 경쟁 - 2 -
하는 항체를 선택함을 포함하는 방법에 의해 제조되는 조성물. 청구항 12 제4항에 있어서, 항체가 다음 ELISA 프로토콜에 의해 측정된 것으로서 포스파티딜세린에 결합하는 조성물: - 포스파티딜세린(PS) 스톡 용액을 n-헥산에 10μg/μl로 희석시키고 잘 혼합하고, 50μl를 각각의 웰에 가하고 이 를 1시간 동안 증발시킴으로써 96웰 플레이트를 포스파티딜세린(PS)으로 피복시키는 단계, - PBS 속에 용해시킨 10% 소 혈청인 차단 완충액 200μl를 각각의 웰에 가하고, 뚜껑을 덮고 실온에서 2시간 또 는 4 에서 밤새 유지시키는 단계, - 플레이트를 PBS로 3회 세척하는 단계, - 시험 샘플을 상기 차단 완충액 속에 희석시킨 제1 항체에 가하고 37 에서 2시간 동안 항온처리하는 단계, - PBS로 3회 세척하는 단계, -100μl/웰의 제2 항체(염소, 항-마우스 IgG-HRP 또는 기타 적절한 제2 항체)를 가하고 37 에서 1시간 동안 항 온처리하는 단계, - 플레이트를 PBS로 3회 세척하는 단계, - 100μl의 전개 용액(여기서, 전개 용액은 10ml의 0.2M Na 2 PO 4, 10ml의 0.1M 시트르산 및 o-페닐렌디아민의 10mg 짜리 정제 1개 및 10μl의 과산화수소이다)을 각각의 웰에 가하여 ELISA를 전개시키고, 10분 동안 전개시킨 후, 100μl의 정지 용액(여기서, 정지 용액은 0.18M H 2 SO 4 이다)을 각각의 웰에 가하고 490nm에서 광학 밀도를 판 독하는 단계. 청구항 13 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 조성물. 청구항 14 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체가 scfv, Fv, Fab', Fab, 디아보디, 선형 항체 또는 항체의 F(ab') 2 항원-결합 단편 또는 CDR, 1가 단편, 카멜화(camelized)되거나 단일 도메인 항체인 조성물. 청구항 15 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체가 사람, 사람화된, 부분-사람, 키메라, 이특이적, 재조합 또는 가공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 조성물. 청구항 16 제4항에 있어서, 항체가 서열 2 또는 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열 영역을 포함하는 제1의 가 변 영역, 또는 서열 2 또는 서열 4의 아미노산 서열의 변이체 또는 돌연변이화된 형태를 포함하고, 여기서, 당 해 변이체 또는 돌연변이화된 형태가 포스파티딜세린에 대한 결합을 유지하는 조성물. 청구항 17 제16항에 있어서, 항체가 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서 열 4의 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 조성물. 청구항 18 제4항에 있어서, 항체가 서열 2의 아미노산 31번 내지 35번(CDR H1), 50번 내지 56번(CDR H2) 및 95번 내지 102번(CDR H3) 위치로부터의 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는 서열 4 의 아미노산 24번 내지 34번(CDR L1), 50번 내지 56번(CDR L2) 및 89번 내지 97번(CDR L3) 위치로부터의 CDR의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 조성물. 청구항 19-3 -
제18항에 있어서, 항체가 서열 2의 아미노산 31번 내지 35번(CDR H1), 50번 내지 56번(CDR H2) 및 95번 내지 102번(CDR H3) 위치로부터의 CDR의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 4의 아미노산 24번 내지 34번(CDR L1), 50번 내지 56번(CDR L2) 및 89번 내지 97번(CDR L3) 위치로부터의 CDR의 아미노산 잔기를 포함 하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 조성물. 청구항 20 제4항에 있어서, 항체가 ATCC PTA 4545로 기탁된 모노클로날 항체 3G4인 조성물. 청구항 21 제1항 또는 제2항에 있어서, 조성물중 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 은밀화(stealthed)되거나 페길화 (PEGylated)된 리포좀 조성물로 피복된 조성물. 청구항 22 제21항에 있어서, 은밀화되거나 페길화된 리포좀이 하나 이상의 치료제를 함유하는 조성물. 청구항 23 제1항 또는 제2항에 있어서, 조성물이 추가의 치료제를 추가로 포함하는 조성물. 청구항 24 제23항에 있어서, 추가의 치료제가 항-바이러스제인 조성물. 청구항 25 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-바이러스제가 뉴클레오사이드, 역전사효소 억제제 또는 프로테아제 억제제인 조 성물. 청구항 26 제25항에 있어서, 항-바이러스제가 시도포비르 또는 AZT인 조성물. 청구항 27 제25항에 있어서, 항-바이러스제가 리바비린인 조성물. 청구항 28 제1항 또는 제2항에 따른 조성물을 포함하는, 바이러스 감염 또는 질병을 치료하거나 예방하기 위한 약제학적 조성물. 청구항 29 아미노인지질에 결합하는 정제된 항체, 또는 당해 항체의 항원-결합 단편 또는 항-바이러스 면역접합체를 포함 하는, 바이러스 감염 또는 질병을 치료하거나 예방하기 위한 약제학적 조성물. 청구항 30 아미노인지질에 결합하는 정제된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항-바이러스 면역접합체를 포함하는, 바 이러스 복제를 억제하기 위한 약제학적 조성물. 청구항 31 아미노인지질에 결합하는 정제된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항-바이러스 면역접합체를 포함하는, 바 이러스 확산을 억제하기 위한 약제학적 조성물. 청구항 32 제29항에 있어서, 사이토메갈로바이러스(CMV), 호흡계 신시티얼 바이러스(RSV), 간염 바이러스, 인플루엔자, 사 - 4 -
람 면역결핍성 바이러스(HIV), 헤르페스, 파라믹소바이러스 또는 아레나바이러스 감염을 치료하거나 예방하기 위한 약제학적 조성물. 청구항 33 제29항에 있어서, 간염, 인플루엔자, AIDS, 바이러스성 폐렴 또는 호흡기병 또는 라사열(Lassa fever)을 치료하 거나 예방하기 위한 약제학적 조성물. 청구항 34 제29항에 있어서, 항체가 포스파티딜에탄올아민에 결합하는 약제학적 조성물. 청구항 35 제29항에 있어서, 항체가 포스파티딜세린에 결합하는 약제학적 조성물. 청구항 36 제35항에 있어서, 항체가 포스파티딜세린에 결합하고 포스파티딜세린에 대한 결합에 있어 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545로서 기탁됨)와 효과적으로 경쟁하는 약제학적 조성물. 청구항 37 제35항에 있어서, 항체가 다음 ELISA 프로토콜에 의해 측정된 것으로서, 포스파티딜세린에 결합하는 약제학적 조성물: - 포스파티딜세린(PS) 스톡 용액을 n-헥산에 10μg/μl로 희석시키고 잘 혼합하고, 50μl를 각각의 웰에 가하고 이 를 1시간 동안 증발시킴으로써 96웰 플레이트를 포스파티딜세린(PS)으로 피복시키는 단계, - PBS 속에 용해시킨 10% 소 혈청인 차단 완충액 200μl를 각각의 웰에 가하고, 뚜껑을 덮고 실온에서 2시간 또 는 4 에서 밤새 유지시키는 단계, - 플레이트를 PBS로 3회 세척하는 단계, - 시험 샘플을 상기 차단 완충액 속에 희석시킨 제1 항체에 가하고 37 에서 2시간 동안 항온처리하는 단계, - PBS로 3회 세척하는 단계, -100μl/웰의 제2 항체(염소, 항-마우스 IgG-HRP 또는 기타 적절한 제2 항체)를 가하고 37 에서 1시간 동안 항 온처리하는 단계, - 플레이트를 PBS로 3회 세척하는 단계, - 100μl의 전개 용액(여기서, 전개 용액은 10ml의 0.2M Na 2 PO 4, 10ml의 0.1M 시트르산 및 o-페닐렌디아민의 10mg 짜리 정제 1개 및 10μl의 과산화수소이다)을 각각의 웰에 가하여 ELISA를 전개시키고, 10분 동안 전개시킨 후, 100μl의 정지 용액(여기서, 정지 용액은 0.18M H 2 SO 4 이다)을 각각의 웰에 가하고 490nm에서 광학 밀도를 판 독하는 단계. 청구항 38 제29항에 있어서, 항체가 scfv, Fv, Fab', Fab, 디아보디, 선형 항체 또는 항체의 F(ab') 2 항원-결합 단편 또는 CDR, 1가 단편, 카멜화되거나 단일 도메인 항체인 약제학적 조성물. 청구항 39 제29항에 있어서, 항체가 사람, 사람화된, 부분-사람, 키메라, 이특이적, 재조합 또는 가공된 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 약제학적 조성물. 청구항 40 제35항에 있어서, 항체가 서열 2 또는 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열 영역을 포함하는 제1의 가 변 영역, 또는 서열 2 또는 서열 4의 아미노산 서열의 변이체 또는 돌연변이화된 형태를 포함하고, 여기서, 당 - 5 -
해 변이체 또는 돌연변이화된 형태가 포스파티딜세린에 대한 결합을 유지하는 약제학적 조성물. 청구항 41 제40항에 있어서, 항체가 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서 열 4의 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 약제학적 조성물. 청구항 42 제35항에 있어서, 항체가 서열 2의 아미노산 31번 내지 35번(CDR H1), 50번 내지 56번(CDR H2) 및 95번 내지 102번(CDR H3) 위치로부터의 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는 서열 4 의 아미노산 24번 내지 34번(CDR L1), 50번 내지 56번(CDR L2) 및 89번 내지 97번(CDR L3) 위치로부터의 CDR의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 약제학적 조성물. 청구항 43 제42항에 있어서, 항체가 서열 2의 아미노산 31번 내지 35번(CDR H1), 50번 내지 56번(CDR H2) 및 95번 내지 102번(CDR H3) 위치로부터의 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는 서열 4 의 아미노산 24번 내지 34번(CDR L1), 50번 내지 56번(CDR L2) 및 89번 내지 97번(CDR L3) 위치로부터의 CDR의 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 약제학적 조성물. 청구항 44 제29항에 있어서, 항체가 ATCC PTA 4545로 기탁된 모노클로날 항체 3G4인 약제학적 조성물. 청구항 45 제29항에 있어서, 약제학적 조성물중 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 은밀화되거나 페길화된 리포좀 조성물로 피복된 약제학적 조성물. 청구항 46 제45항에 있어서, 은밀화되거나 페길화된 리포좀이 하나 이상의 치료제를 함유하는 약제학적 조성물. 청구항 47 제29항에 있어서, 약제학적 조성물이 추가의 치료제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물. 청구항 48 제47항에 있어서, 추가의 치료제가 항-바이러스제인 약제학적 조성물. 청구항 49 제48항에 있어서, 항-바이러스제가 뉴클레오사이드, 역전사효소 억제제 또는 프로테아제 억제제인 약제학적 조 성물. 청구항 50 제49항에 있어서, 항-바이러스제가 시도포비르 또는 AZT인 약제학적 조성물. 청구항 51 제49항에 있어서, 항-바이러스제가 리바비린인 약제학적 조성물. 청구항 52 삭제 청구항 53 삭제 - 6 -
청구항 54 삭제 청구항 55 삭제 청구항 56 삭제 청구항 57 삭제 청구항 58 삭제 청구항 59 삭제 청구항 60 삭제 청구항 61 삭제 청구항 62 삭제 청구항 63 삭제 청구항 64 삭제 청구항 65 삭제 청구항 66 삭제 청구항 67 삭제 청구항 68 삭제 청구항 69 삭제 - 7 -
청구항 70 삭제 청구항 71 삭제 청구항 72 삭제 청구항 73 삭제 청구항 74 삭제 청구항 75 삭제 청구항 76 삭제 청구항 77 삭제 청구항 78 삭제 청구항 79 삭제 청구항 80 삭제 청구항 81 삭제 청구항 82 삭제 청구항 83 삭제 청구항 84 삭제 청구항 85 삭제 - 8 -
청구항 86 삭제 청구항 87 삭제 청구항 88 삭제 청구항 89 삭제 청구항 90 삭제 청구항 91 삭제 청구항 92 삭제 청구항 93 삭제 [0001] [0002] 명 세 서 발명의 배경 본원은 명세서, 청구의 범위, 도면 및 서열을 포함하는 이의 특허원의 기재내용이 포기없이 본원에 참조로 상세 히 인용된, 2002년 7월 15일자로 출원된 동시-계류중인 미국 가특허원 제60/396,263호에 대한 우선권을 주장한 다. [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] 기 술 분 야 본 발명은 아미노인지질 및 음이온성 인지질 생물학, 종양 혈관 및 바이러스 감염 분야에 관한 것이다. 본 발 명은 종양 혈관구조 표적화 및 암 치료용, 바이러스 도입 및 확산 억제용, 및 바이러스 감염 치료용의 놀라운 신규 조성물, 방법 및 배합물을 제공한다. 본 발명은 또한 암, 바이러스 감염 및 관련 질병의 치료시 사용하기 위한 아미노인지질 및 음이온성 인지질에 결합하여 이들을 억제시키는 다수의 바람직한 항체, 면역접합체 및 듀 라마이신계 조성물을 제공한다. 관련 기술의 설명 화학치료요법제에 대한 종양 세포 내성은 임상 종양학에서 현저한 문제를 나타낸다. 종양 치료에 촛점이 맞추 어진 다른 주요 문제는 "전체 세포 사멸", 즉, 조절가능하지 않게 성장하고 치료요법에 의해 제거될 수 있는 어 떠한 종양 덩이도 대체하는 능력을 갖는 소위 "클론원성(clonogenic)" 악성 세포 모두를 사멸시키는 것에 대한 요구이다. 당해 분야에서의 특정의 발전에도 불구하고, 많은 우세한 형태의 사람 암이 여전히 효과적인 화학치 료요법적 중재에 내성인 주요 이유가 2가지 있다. 전체 세포 사멸을 달성하는 치료를 개발하기 위한 목표에 기인하여, 특정 유형의 종양이 다른 종양보다도 치료 요법에 있어 더욱 개량되어져 왔다. 예를 들어, 연 조직 종양, 예를 들어, 림프종, 및 혈액과 혈액 형성 기관 의 종양, 예를 들어, 백혈병은 일반적으로 암종과 같은 고형 종양보다 화학치료요법에 대해 더욱 반응성이다. 화학치료요법에 대한 연 조직 및 혈액계 종양의 민감성에 있어 하나의 이유는 화학치료요법적 중재에 대한 림프 종 및 백혈병 세포의 더욱 큰 접근성이다. 단순하게 말해서, 대부분의 화학치료요법제는 연 조직 종양 및 혈액 - 9 -
계 종양의 경우보다 고형 종양 덩이의 세포 모두에 도달하기가 더욱 어렵고, 따라서, 전체 세포 사멸을 달성하 기가 더욱 어렵다. 화학치료요법제의 투여량의 증가는, 일반적으로 통상의 항종양제의 효능을 제한하는, 독성 부작용을 가장 흔하게 초래한다. [0008] [0009] [0010] [0011] [0012] [0013] [0014] [0015] 다른 종양 치료 전략은 항-종양 세포 항체를 사용하여 독소를 종양 세포로 전달하는 "면역독소"의 사용이다. 그러나, 화학치료요법적 시도와 공통적으로, 면역독소 치료요법은 또한 고형 종양에 적용하는 경우 현저한 단점 을 지닌다. 예를 들어, 항원-음성 세포 또는 항원-결핍 세포는 생존하여 종양을 재소생시켜 추가의 전이를 유 도한다. 항체계 치료요법에 대한 고형 종양 내성에 있어 추가의 이유는, 종양 덩이가 일반적으로 항체 및 면역 독소와 같은 거대분자제에 침투할 수 없다는 것이다. 종양내에서 물리학적 확산 거리 및 세포간 압력 (interstitial pressure) 둘 다는 이러한 유형의 치료요법을 현저히 제한시킨다. 개선된 치료 전략은 고형 종양의 혈관구조를 표적화하는 것이다. 종양 세포 자체보다는 오히려, 종양의 혈관을 표적화하는 것이, 내성 종양 세포의 발달을 초래하지 않는 경향이 있고, 표적화된 세포가 용이하게 접근가능하 다는 점에서 특히 유리하다. 또한, 혈관의 파괴는, 많은 종양 세포가 이들의 산소 및 영양분을 혈관 하나에 의 존하기 때문에, 항-종양 효과의 증폭을 가져온다. 예시적인 혈관 표적화제(VTA)는 항-세포제와 종양 혈관구조 의 마커에 대한 독소의 표적화된 전달을 기술하고 있는 미국 특허 제5,855,866호, 제5,965,132호, 제6,261,535 호, 제6,051,230호 및 제6,451,312호에 기술되어 있다. 혈관 표적화 시도의 다른 효과적인 버젼은 종양 혈관구조 또는 기질내에서 발현되거나 흡수된 마커에 대한 응고 인자를 표적화하는 것이다[참조: Huang et al., 1997; 미국 특허 제6,093,399호, 제6,004,555호, 제5,877,289 호 및 제6,036,955호]. 독소보다는 오히려 혈액응고제의 종양 혈관구조로의 전달은 또한 감소된 면역원성과 심 지어 독성 부작용의 보다 낮은 위험의 장점을 지닌다. 미국 특허 제5,877,289호에 기술된 것으로써, 이러한 종 양 특이적인 "응고리간드(coaguligand)"에서 사용하기 위한 바람직한 응고 인자는 사람 응고-유발 단백질인, 조 직 인자(TF), 혈액 응고의 주요 억제제의 절단된 버젼(a truncated version)이다. 최근에, 아미노인지질 포스파티딜세린(PS)과 포스파티딜에탄올아민(PE)이 종양 혈관구조의 특이적 마커로서 확 인되었다[참조: Ran et al., 1998]. 이러한 사실은 종양 혈관에 항-세포제, 독소 및 응고 인자를 전달하기 위 한 신규의 항-PS 및 항-PE 면역접합체의 개발을 이끌었다(참조: 미국 특허 제6,312,694호). 또한, PS 및 PE에 대한 접합되지 않은 항체가 치료제에 부착하지 않고 항암 효과를 발휘하는 것이 발견되었으며, 이는 종양 혈관 표적화 및 치료에 대한 아미노인지질 "노출된 항체(naked antibody)"로 알려지게 되었다(참조: 미국 특허 제 6,406,693호). 비록 앞서의 면역접합체 및 아미노인지질 혈관 표적화 방법이 종양 치료에 있어 현저한 진보를 나타낸다고는 하 나, 특정의 말초 종양 세포는 이러한 치료요법에 의해 유발된 광범위한 종양 파괴에서 생존할 수 있다. 따라서, 미리존재하는 혈관 및/또는 순환하는 내피 줄기 세포로부터의 새로운 혈관구조의 발달을 억제하는, 항- 혈관형성 전략은 미국 특허 제5,855,866호, 제6,093,399호, 제6,312,694호 및 제6,406,693호의 응고리간드 및 아미노인지질 표적화 방법인 VTA와 함께 사용하기 위해 고려되고 있다. 혈관형성은 배아발생, 상처 치료 및 월경과 같은 생리학적 과정에 있어 중요한 역활을 하지만, 또한 종양 성장, 관절염, 건선 및 당뇨병성 망막증과 같은 특정의 생리학적 현상에 관여한다(참조: Ferrara, 1995). 종양 치료 에 적용되는 것으로서, 항-혈관형성 전략은 일반적으로 고형 종양의 주변부에서 싹(budding) 혈관의 증식을 억 제하는 것에 기초한다. 이러한 치료요법은 미세전이의 위험을 감소시키고 더욱 통상적인 개입(예: 수술 또는 화학요법)후 고형 종양의 추가의 성장을 억제하는데 주로 적용된다. 미국 특허 제6,342,219호, 제6,524,583호, 제6,342,221호 및 제6,416,758호는 혈관형성의 주요 자극제인, 혈관 내피 성장 인자-A(VEGF, 이전에 혈관 침투 인자, VPF로 알려짐)에 결합하는 항체 및 면역접합체를 기술하고 있 다. 이들 항체는 2개의 주요 VEGF 수용체중 단지 하나에 결합하는 VEGF를 억제하는 중요한 장점을 갖는다. VEGFR1이 아닌, VEGFR2에 대한 VEGF의 결합을 차단함으로써, 이들 항체는 예를 들면, 대식세포, 파골세포 및 연 골세포 작용에 있어 VEGFR1을 통해 중재된 유리한 효과를 유지하면서, 개선된 안정성 측면을 지닌다. 비록 앞서의 방법들이 종양 치료 분야를 발전시켜왔다고 해도, 추가의 또는 다른 혈관 표적화 치료요법의 개발 이 여전히 고려되고 있다. 종양 혈관형성의 새로운 마커의 확인은 치료학적 선택권의 수를 확장시키는데 요구 된다. 항암 특성을 갖는 새로운 노출된 항체의 개발은, 이러한 개발이 단일-제제 치료요법 및 다른 약물의 전 달용 혈관 표적화제로서 둘다 사용될 동일한 표적화 잔기를 허용하기 때문에 특히 중요한 발전일 수 있다. 동 일한 분자내에서 항-혈관형성 및 항-혈관 특성 둘 다, 예를 들면, 종양 파괴 특성을 갖는 치료제는 매우 가치가 - 10 -
있을 수 있다. 더욱 더 중요한 발전은 다른 시스템에서 항암 특성 및 치료효과를 지닌 치료제 부류를 확인하는 것이 될 것이다. 당해 시대의 가장 중요한 의학적 도전인 암과 바이러스 감염 둘다를 치료할 수 있는 제제의 개발은 현저하고 중요한 획기적 발전이 될 것이다. [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] 발명의 요약 본 발명은 안전하고 효과적인 종양 혈관 표적화, 항-혈관형성 및 종양 파괴용의 신규 방법 및 조성물을 제공함 으로써 선행기술의 상기한 요구 및 다른 요구에 부응하는 것이며, 이러한 방법 및 조성물은 또한 바이러스 도입 및 확산을 억제하고 바이러스 감염 및 질병을 치료하는데 매우 효과적이다. 본 발명은 부분적으로, 종양 혈관 구조에서 음이온성 인지질의 발현 및 역활과 바이러스 도입 및 확산에 있어 아미노인지질 및 음이온성 인지질의 관련성에 대한 놀랄만한 발견에 기초한다. 본 발명은 또한 아미노인지질 및 음이온성 인지질에 결합하는 특히 유리한 항체 및 면역접합체와, 포스파티딜에탄올아민에 결합하는 새로운 부류의 펩타이드계 유도체를 제공한다. 개요: 첫번째 종합적인 양태에서, 본 발명은 포스파티딜이노시톨(PI), 포스파티드산(PA) 및 포스파티딜글리세롤 (PG)(및 포스파티딜세린, PS)과 같은 음이온성 인지질이 종양 혈관구조의 접근가능하고 안정되게 표적화가능한 마커라는 예상치않은 발견에 기초한 종양 혈관 표적화, 종양 영상화 및 치료용 신규 방법을 제공하는 것이다. 당해 양태는 PA, PI, PG 및 기타 음이온성 인지질 성분들에 대한 항체가 고형 종양의 혈관구조에 특이적으로 국 재화한다는 예상치 않은 발견에 기인한다. 당해 양태내 추가의 측면은 PA, PI 및 PG(또한 PS)와 같은 음이온성 인지질에 대한 노출된 항체가 종양 혈관 혈 관형성을 특이적으로 억제하고, 독소 또는 응고제와 같이 효과기 분자(effector molecule)에 대한 접합의 부재 하에 생체내에서 종양 혈관구조 파괴 및 종양 괴사를 유발한다는 예상치못한 발견으로부터 개발되었다. 따라서, 본 발명은 음이온성 인지질에 결합하는 단일 성분 항체계 치료요법을 사용한 혈관 표적화, 항-혈관형성 및 종양 치료의 안전하고 효과적인 방법을 제공한다. 본 발명의 근본적인 놀라운 특징은, 종양 혈관 내피 세포의 표면에 대한 음이온성 인지질의 전위가 세포 손상 및 세포자살 메카니즘(apoptotic mechanism) 또는 다른 세포-사멸 메카니즘과는 독립적으로, 적어도 현저한 부 분에서 발생한다는 것이다. 따라서, 종양 혈관구조내 음이온성 인지질 발현은 세포 사멸 및 파괴의 결과 또는 이에 대한 개시(trigger)의 결과가 아니라, 형태학적으로 완전한 혈관 내피 세포에서 발생한다. 이러한 사실은, 종양 혈관구조내 음이온성 인지질 발현이 일시적인 것이 아니라, 오히려 치료학적 개입을 위한 표적물 을 제공하기에 충분하도록 안정하다는 것을 의미한다. 음이온성 인지질이 종양 혈관구조내에서 안정하게 유발된다는 발견의 제공으로, 본 발명은 또한 음이온성 인지 질에 대한 항체의 면역접합체를 사용하여 종양 혈관구조 영상화 및 파괴를 위한 광범위한 신규 방법 및 조성물 을 제공한다. 이들 면역접합체들은 독소 및 응고제와 같은 치료제에 작동적으로 부착된 음이온성 인지질에 대 한 항체를 포함하며, 종양 혈관 내피 세포막의 표면에 대한 진단 및 치료요법의 특이적인 전달에 있어 유용하다. 당해 치료제는 종양 혈관 내피 세포막과 친밀하게 접촉하여 전달되어, 표적 세포내로의 신속한 도입 또는 효과기 세포, 응고 케스케이드의 성분 등과의 신속한 연합을 허용한다. 두번째 종합적인 양태에서, 본 발명은 아미노인지질 및 음이온성 인지질(및 관련 면역접합체 및 조성물)에 결합 하는 다수의 바람직한 항체를 제공하며, 당해 항체는 당해 분야에 공지된 것들을 능가하는 장점을 제공하는 구 조 및 특성을 지닌다. 이들 소위 "제2 세대(second generation)" 또는 개선된 항체는 바람직하게는 항-혈관형 성, 항-암 및 항-바이러스 및 본원에 기술된 다른 치료 방법에서 사용될 것이다. 본 발명에 의해 제공된 아미노인지질 및 음이온성 인지질에 결합하는 새로운 부류의 항체는 당해 분야의 아미노 인지질 및 음이온성 인지질에 대한 항체와 일반적으로 연관되어 있는 병리학적 특성없이 치료학적 항체를 제공 함으로써 선행기술의 각종 단점들을 극복한다. 본 발명은 부분적으로, 새로운 면역화를 사용하고, 종양 혈관 내피 세포내 인지질의 거동에 대한 발명자 고유의 관찰로부터 개발된 기술을 스크리닝하며 질병과 연관한 항-인 지질 항체로부터 생성된 항체를 떼어놓음으로써 개발되었다. 이러한 항체들은 고유의 특성 및 개선된 안전성을 지닐뿐 아니라, 비교 연구에서 존재하는 항체와 동일하거나 이보다 더욱 효과적이다. 본 발명의 이러한 측면의 조성물 및 방법은 제공된 항체의 특이적 범주를 사용한 면역접합체와 배합물의 사용에 또한 연장된다. 본 발명에 앞서, 아미노인지질 및 음이온성 인지질에 결합하고 본원에 기술된 신규 항체의 특성을 갖는 항체는 알려져 있지 않았다. 그러나, 본원에 기술된 발명의 측면에서, 당해 기술은 본 발명에 이르러 새로운 후보 항 체를 생성하는 방법론과 이러한 항체를 시험함으로서 후보물질의 풀(pool)로부터 유용한 항체를 추가로 동정하 는 기술을 제공한다. 따라서, 본 발명의 측면에서, 선행기술의 항체와 연관된 주목할만한 단점과 부작용이 없 - 11 -
는, 유리한 특성과 아미노인지질 및 음이온성 인지질 결합 프로파일을 지닌 광범위한 항체를 제조할 수 있다. 즉, 이러한 항체는 혈관형성의 억제 및 암과 바이러스 감염의 치료를 포함한 다양한 양태에서 사용될 수 있다. [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] 본원에 제공된 신규 면역화 및 스크리닝 기술외에, 아미노인지질과 음이온성 인지질에 결합하고 다수의 유리한 특성을 갖는 항체가, 본 발명에 이르러, 모노클로날 항체 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5, 9D2 또는 3G4를 사용한 경쟁 및/또는 작용 검정에 의해 확인될 수 있다. 모노클로날 항체 9D2 및 3G4가 더욱 바람직하며, 모노클로날 항체 3G4(ATCC 4545)가 현재 가장 바람직하다. 외부 항체중 어느것, 바람직하게는 3G4와 경쟁하는 추가의 항체 를 확인하기 위한, 현재 바람직한 검정은 ELISA를 기초로한 경쟁 검정이며, 이들 다수는 본원에 기술되어 있고, 이의 작업 실시예가 기술되어 있다. 세번째의 종합적인 양태에서, 본 발명은 아미노인지질, 포스파티딜에탄올아민(PE)에 결합하는 세포-비침투성 펩 타이드계 유도체의 새로운 부류를 제공한다. 이러한 "PE-결합 펩타이드 유도체"는 적어도 제1의 PE-결합 펩타 이드, 바람직하게는 듀라마이신을 포함하며, 이러한 펩타이드는 PE-결합 펩타이드, 바람직하게는 듀라마이신을 변형시킴에 의해 실질적으로 세포 비침투성이거나 실질적으로 공극을 형성하지 않는 PE-결합 작제물을 형성함으 로써 실질적으로 비특이적인 독성을 방지하도록 변형된다. "실질적으로 세포 비침투성"인 PE-결합 작제물 또는 듀라마이신의 생성은 바람직하게는 적어도 제1 세포 비침투 성 그룹에 PE-결합 펩타이드 또는 듀라마이신이 부착함에 의해 달성된다. 다수의 예시적인 듀라마이신 유도체 의 합성은 본원에 기술되어 있다. "세포 비침투성 그룹 또는 그룹들"은 소 분자의 불활성 담체일 수 있거나, 자체가 종양 혈관구조에 대해 표적화하는 것과 같이 수득되는 작제물에 추가의 표적화 작용을 부여하는 표적화 제일 수 있다. 따라서, PE-결합 펩타이드는 불활성 담체에 연결된 단독의 표적화제일 수 있거나, 각각 작제물 에 대해 표적화 작용을 부여하는 2개의 제제중 하나일 수 있다. 따라서, PE-결합 펩타이드, 바람직하게 듀라마 이신은 효과기에 작동적으로 부착함으로써, PE-결합 펩타이드 또는 듀라마이신은 표적화 작용을 제공하고 부착 된 제제는 표적 세포로 전달되면 실질적인 치료 효과를 지닌다. 바람직한 예는 PE-결합 펩타이드이거나 뉴클레 오사이드와 같은 항-바이러스제에 연결된 듀라마이신이다. PE는 필수적으로 정상 조건하에서 정상 세포의 표면으로부터 부재하기 때문에, 본 발명의 실질적으로 세포 비침 투성인 PE-결합 특성은 이상 세포 또는 종양 혈관 내피 세포, 증식 세포 및/또는 바이러스로 감염된 세포와 같 은 질병과 관련된 세포의 표면에서 PE에 선택적으로 결합하는 작용이 있다. 이러한 이상 표적 세포에 결합하면, PE-결합 작제물 또는 유도체는 이러한 세포에서 PE 작용을 억제하거나 차단함으로써 종양 및/또는 바 이러스 질병의 치료시 총체적인 치료학적 잇점을 가져온다. 바이러스 도입 및 확산을 억제하는데 있어서 실질 적으로 세포 비침투성인 PE-결합 펩타이드의 성공적인 사용은 본원에 기술되어 있다. PE-결합 펩타이드가 시도 포비르와 같은 항-바이러스제에 부착되는 양태에서, 증진되고 안전한 항-바이러스 치료가 제공된다. 네번째의 종합적인 양태에서, 본 발명은 또한 바이러스 감염 및 질병을 치료하는데 사용하기 위한 바이러스 복 제, 감염 및 확산을 억제하는 새로운 부류의 조성물 및 방법을 제공한다. 이들 방법은 PS, PE, PI, PA 및 PG, 특히 PS 및 PE와 같은 아미노인지질 및 음이온성 인지질에 결합하는 항체 및 펩타이드가 안전하고 효과적인 항- 바이러스제일 수 있다는 놀라운 식견에 기초한다. 이러한 식견이 정확한 것으로 입증되지는 않았지만, 본 발명 은 바이러스 확산을 저지하는데 있어서 아미노인지질 및 음이온성 인지질에 결합하는 항체 및 펩타이드의 예상 치못한 효과적인 사용을 나타내는 데이타를 제공하며, 이는, 이들 제제가 광범위한 바이러스 감염 및 관련 질병 의 치료에 광범위하게 적용가능함을 의미한다. 이러한 발견들은 또한 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 특히 PS 및 PE에 대한 항체를 항-바이러스제에 작동 적으로 부착시키는 새로운 범주의 면역접합체, 조성물, 키트 및 사용 방법을 포함한다. 듀라마이신, 펩타이드 유도체와 같은 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체는 또한 항-바이러스제에 연결될 수 있다. 즉, 이들 제제 각각은 바이러스 감염된 세포에 대해 유일하게 표적화하는 새로운 항-바이러스 약물을 제공한다. 따라서, 이상 혈관형성, 암 및 바이러스 감염 및 질병의 치료에 효과적인 신규의 안정한 치료제의 개발은 당해 분야의 획기적인 발견이다. 비록 유일하게 효과적이라 해도, 본 발명의 각종 방법 및 조성물은 또한 다른 치료요법 및 제제와 함께 유리하 게 사용되어 배합 치료 방법, 및 본 발명의 관련 조성물, 약제 및 키트를 제공할 수 있다. 따라서, 다섯번째 종합적인 양태에서, 본 발명은 또한 본원에 더욱 상세히 설명된 바와 같이, 놀랍게도 함께 잘 작용하도록 선택 되고 발견된, 예를 들면, 암 치료용의 특정의 배합 조성물, 방법 및 키트를 제공한다. 제2 세대 항체: 고려된 특성을 갖는 항체 세대에 있어 잘 작용하는 것으로 발견된 특정의 방법은 본원의 실시예 - 12 -
IV에 기술되어 있고 첨부된 청구의 범위에 구체화되어 있다. 이들 방법들은 모노클로날 항체 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5, 9D2 및 3G4, 특히 3G4(ATCC 4545)에 의해 예시되는 바와 같은 본 발명의 유리한 항체의 생성을 허용 한다. [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] 따라서, 본 발명은 하나 이상의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 결합하고, 아미노인지 질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 대한 결합에 있어, 모노클로날 항체 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5, 9D2 또는 3G4, 바람직하게는 9D2 또는 3G4(ATCC 4545) 및 가장 바람직하게는 3G4와 효과적으로 경쟁하는 정제된 항체, 항원-결합 단편 및 이의 면역접합체를 제공한다. 전체 명세서를 통해 사용된 것으로써, 용어 "a" 및 "an"은, 상한선이 이후에 특정되는 경우를 제외하고는, 언급 된 성분 또는 단계의 "적어도 하나", "적어도 첫번째", "하나 이상" 또는 "다수"를 의미하는 의미로 사용된다. 따라서, 본원에 사용된 것으로서, "항체"는 "적어도 첫번째 항체"를 의미한다. 배합물의 작동가능한 한계 및 매개변수, 및 특정한 단일 제제의 양은 본 기술내용의 측면에서 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있을 것이다. 특정의 양태에서, 항체는 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 대한 결합에 있어, 모노클로 날 항체 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5, 9D2 또는 3G4, 및 가장 바람직하게는 3G4 (ATCC 4545)와 효과적으로 경쟁 하거나 표 4에 설정된 것으로서, 모노클로날 항체 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5, 9D2 또는 3G4, 바람직하게는 9D2 또는 3G4, 가장 바람직하게는 3G4의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질 결합 프로파일을 지니고; 질병이 있는 환자로부터 기원하지 않고 실험관내에서 응고 반응을 현저히 억제하지 않거나, 생체내에서 현저한 혈전을 유발하지 않거나 루프스 응고 활성을 지닐 것이다. 바람직하게는, 이러한 항체는 또한 문헌에서의 IgG와 같은 항체와 비교시 조절된 연구에서 유리한 범위 또는 정 도의 작용 특성 또는 구조적 특성에 있어서의 증진을 입증하며, 보다 높은 친화성을 지니거나 활성화된 내피세 포, 내피 세포 증식 또는 혈관 형성의 증가된 억제, 증진된 종양 혈관 국재화, 항암 및/또는 항-바이러스 효과 를 입증한다. 따라서, 본 발명의 특정 측면은 위에서 기술하고, 다른 부분에서 기재하며 고유의 유리한 특성을 갖는 항체의, 본 발명자 기원의 놀랄만한 세대를 기초로 한다. 본원에서 바람직한 항체의 패널 및 다수의 특히 바람직한 항 체가 제공되었으며, 본 발명은 또한 정의된 에피토프-특이성의 항체 부류를 포함하며, 여기서, 이러한 항체 또 는 이의 항원-결합 단편은 항원 결합에 있어 모노클로날 항체 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5, 9D2 또는 3G4, 바람 직하게는 9D2 또는 3G4, 및 가장 바람직하게는 3G4(ATCC 4545)와 효과적으로 경쟁함으로써, 모노클로날 항체 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5, 9D2 또는 3G4, 바람직하게는 9D2 또는 3G4, 및 가장 바람직하게는 3G4(ATCC 454 5)와 필수적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 청구된 것으로서 본 발명은 본 명세서 및 용이하게 입수가능한 기술 참조 문헌, 노-하우 및 출발 물질에 따라 가능하다. 그럼에도 불구하고, 본 출원인인 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템을 대신하여, 3G4 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주의 샘플을 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시 티 블러바드 10801 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 기탁물로 제출하였다. 당해 샘플은 미국 캘리포 니아주 92780 투스틴 프랭클린 애비뉴 14272 소재의 아비드 바이오서비시즈, 인크(Avid Bioservices, Inc.)가 2002년 7월 8일로 시작하는 주 동안에 제출하였고, 2002년 7월 10일 및 7월 12일자로 수령되었으며, 수령시 생 존한 것으로 밝혀져서, 2002년 7월 30일자로 ATCC 수탁 번호 PTA 제4545호를 부여받았다. 당해 기탁물은 특허 과정의 목적 및 이의 법규(부다페스트 조약)에 있어 미생물 기탁의 국제적 승인을 위한 부 다페스트의 조약하에 이루어졌다. 당해 하이브리도마는 미국 특허의 허여시 관련된 청구와 함께 부다페스트 조 약하에 ATCC로부터 입수가능하게 될 것이다. 기탁된 하이브리도마의 유용성은 특허법에 따라 특정 정부의 권한 하에 승인된 권리의 위배시 본 발명을 실시하는 허가증으로서 구성되지는 않는다. 본원에 기술되고 당해 분야에 공지된 항체, 바람직한 항체 및 기술의 패널 측면에서, 당해 분야의 숙련가들에게 본 발명에 이르러 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 결합하며 유리한 특성을 지닌 새로운 부류의 항체가 제 공된다. 이들 항체는 모노클로날 항체 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5, 9D2 또는 3G4와 "유사"하거나 이에 "기 초"한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 "9D2계 또는 9D2-유사 항체"이며, 가장 바람직하게는, 본 발명의 항 체는 "3G4계 또는 3G4-유사 항체"이다. "유사" 항체의 다음 기술은 단순성을 위한 3G4 항체(ATCC 4545)의 측면 에서 제공되나, 1B9, 1B12, 3B10, 2G7, 7C5 및 9D2 항체 각각에 적용되는 것으로서 본원에 참조로 구체적으로 인용된다. - 13 -
[0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] 3G4-유사 항체는 모노클로날 항체 3G4(ATCC 4545)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하거나 모노클로날 항체 3G4(ATCC 4545)와 필수적으로 동일한 에피토프에서 적어도 첫번째의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람 직하게는 PS에 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다. 바람직하게는, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 은 모노클로날 항체 3G4(ATCC 4545)와 동일한 에피토프에 결합할 것이다. 용어 모노클로날 항체 3G4(ATCC 4545)와 "거의, 실질적으로 또는 필수적으로 동일하거나, 이와 동일한 에피토프 에 결합하는"은, 항체가 모노클로날 항체 3G4(ATCC 4545)와 "교차-반응"함을 의미한다. "교차-반응 항체"는 모 노클로날 항체 3G4(ATCC 4545)와 실질적으로 또는 필수적으로 동일하거나, 동일한, 에피토프, 에피토프 부위 또 는 일반적인 아미노인지질 또는 음이온성 인지질 에피토프에 대해 인지하거나, 결합하거나 면역특이성을 가짐으 로써 모노클로날 항체 3G4(ATCC 4545)가 결합하는 적어도 하나의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 하나 이 상의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 또는 모든 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 결합하기 위해 모노 클로날 항체 3G4(ATCC 4545)와 효과적으로 경쟁할 수 있는 것이다. "3G4-교차-반응성 항체"는 "3G4-유사 항체" 및 "3G4-계 항체"로 간결하게 칭해지며, 이러한 용어들은 본원에서 상호교환적으로 사용되고 조성물, 용도 및 방법에 적용된다. 모노클로날 항체 3G4(ATCC 4545)와 거의, 실질적으로, 필수적으로 또는 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상 의 항체의 확인은, 본 발명에 이르러, 이의 유리한 특성과 함께, 3G4가 제공하는 직접적인 기술 문제이다. 교 차-반응성 항체의 확인이 참조 항체와 비교하여 측정되므로, 참조 항체(3G4) 및 시험 항체가 결합하는 에피토프 를 실질적으로 측정하는 것은 모노클로날 항체 3G4와 동일하거나 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체 를 확인하기 위해 어떠한 방식으로든 요구되지 않는다. 그러나, 3G4에 의해 결합된 에피토프에 있어서의 고려 할 만한 정보는 본원에 포함되며 에피토프 맵핑(mapping)도 추가로 수행할 수 있다. 교차-반응성 항체의 확인은 항체 경쟁이 평가될 수 있는 다양한 면역학적 스크리닝 검정중 어느 하나를 사용하 여 용이하게 측정할 수 있다. 이러한 검정들 모두는 당해 분야에서 통상적이며 또한 본원에 상세히 기술되어 있다. 미국 특허 제6,342,219호 및 제6,342,221호 각각은 3G4와 같은 제공된 항체와 동일하거나 실질적으로 또 는 필수적으로 동일한 에피토프에 결합하거나 항원에 결합하기 위해 제공된 항체와 효과적으로 경쟁하는 항체를 제조하는 방법에 관한 본 발명의 교시를 심지어 추가로 보충함을 포함하는 목적을 위해 본원에 참조로 상세히 인용된다. 예를 들어, 시험할 시험 항체를 상이한 동물 공급원으로부터 입수하거나, 심지어 상이한 동형인 경우, 대조군 (3G4)와 시험 항체를 혼합(또는 예비-흡착)시키고 아미노인지질 또는 음이온성 인지질 항원 조성물, 바람직하게 는 PS에 적용시키는 단순한 경쟁 검정을 사용할 수 있다. "아미노인지질 또는 음이온성 인지질 항원 조성물"은 표 4에 기술된 바와 같은, 본원에 기술된 3G4-결합 항원을 함유하는 어떠한 조성물을 의미한다. 즉, ELISA 및 웨스턴 블롯팅에 기초한 프로토콜이 이러한 단순한 경쟁 연구에 사용하기에 적합하다. 특정 양태에서는, 대조군 항체(3G4)를 변화량의 시험 항체(예를 들면, 1:10 또는 1:100)과 항원 조성물에 적용 하기 전 일정 기간동안 예비혼합시킬 수 있다. 다른 양태에서, 대조군 및 변화량의 시험 항체는 항원 조성물에 노출시키는 동안 단순 혼합할 수 있다. 어떠한 상황에서도, 종 또는 동형 2차 항체를 사용함으로써, 결합된 대 조군 항체만을 검출할 것이고, 이의 결합은 실질적으로 동일한 에피토프를 인지하는 시험 항체의 존재에 의해 감소될 것이다. 대조군 항체와 어떠한 시험 항체(종 또는 동형에 관계없이)간의 항체 경쟁 연구 수행시, 우선 대조군(3G4)을 예 를 들면, 후속적인 확인이 가능한 바이오틴 또는 효소(또는 심지어 방사활성) 표지와 같은 검출가능한 표지로 표지시킬 수 있다. 이러한 경우, 표지된 대조군 항체는 시험할 시험 항체와 다양한 비율(예를 들면, 1:10, 1:100 또는 1:1000) 및 (임의로 적합한 기간후)로 예비 혼합하거나 항온처리한 후, 표지된 대조군 항체의 반응 성을 검정하고, 당해 검정 값을 강력하게 경쟁하는 시험 항체가 항온처리에 포함되지 않은 대조군 값과 비교할 수 있다. 당해 검정은 다시 항체 하이브리드화에 기초한 면역학적 검정의 범위중 어느 하나 일 수 있으며, 대조군 항체는 이들의 표지, 예를 들면, 바이오티닐화된 항체의 경우 스트렙타비딘을 사용하거나 효소적 표지[3,3'5,5'-테트라 메틸벤지딘(TMB) 기질과 퍼옥시다제 효소와 같은]와 관련하여 색소원성 기질을 사용하거나 또는 방사활성 표지 를 단순 검출함에 의해 검출할 수 있다. 대조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 결합에 대해 효과적 으로 경쟁할 것이므로 결합된 표지에 있어서의 감소로 입증되는 바와 같이 대조군 항체 결합을 현저히 감소시킬 것이다. - 14 -
[0050] [0051] [0052] [0053] [0054] [0055] [0056] [0057] [0058] 전혀 관련되지 않은 항체의 부재하에서 (표지된) 대조군 항체의 반응성은 대조군 최고값일 수 있다. 경쟁이 표 지된 항체의 결합을 발생시키거나 이를 감소시키는 경우, 대조군 최저값은 표지된 (3G4) 항체를 정확하게 동일 한 유형(3G4)의 표지되지 않은 항체와 항온처리함으로써 수득할 수 있다. 시험 검정에서, 시험 항체의 존재하 에서 표지된 항체 반응성의 현저한 감소는 동일한 에피토프, 즉, 표지된(3G4) 항체와 "교차-반응"하는 에피토프 를 인지하는 시험 항체의 지표이다. 현저한 감소는 "재현가능한", 즉, 결합에 있어서의 감소가 일정하게 관측된다. 본원에서 "현저한 감소"는 약 1:10 내지 약 1:1000의 어떠한 비에서도 적어도 약 70%, 약 75% 또는 약 80%의 재현가능한 감소(ELISA에 있어서 하나 이상의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 대한 3G4 결합에 있어)로 정의한다. 더욱 엄격한 교차-차단 활성을 갖는 항체는 약 1:10 내지 약 1:1000의 어떠한 비에서도 적어도 약 82%, 약 85%, 약 88%, 약 90%, 약 92% 까지의 재현가능한 환원(ELISA 또는 다른 적합한 검정에서 하나 이상의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 대한 3G4 결합)을 나타낼 것이다. 본 발명을 실시하는데 필요한 수단없이 도, 약 97% 또는 약 96% 정도까지의 하나 이상의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 대한 3G4 결합에 있어서 의 재현가능한 감소를 나타내는 것과 같은 완전하거나 거의 완전한 교차-차단이 특정하게 배제되지는 않는다. 제2 세대 항체 전체와 관련하여, 경쟁은, 제2 세대 항체가 포스파티딜세린에 대한 결합에 대해 효과적으로 경쟁 하는, 적어도 포스파티딜세린에 결합하는 항체를 참조하여; 제2 세대 항체가 포스파티드산에 대한 결합에 대해 효과적으로 경쟁하는, 포스파티드산에 적어도 결합하는 항체를 참조하여; 제2 세대 항체가 포스파티딜이노시톨 에 대한 결합에 대해 효과적으로 경쟁하는, 포스파티딜이노시톨에 적어도 결합하는 항체를 참조하여; 제2 세대 항체가 포스파티딜글리세롤에 대한 결합에 대해 효과적으로 경쟁하는, 포스파티딜글리세롤에 적어도 결합하는 항체를 참조하여; 제2 세대 항체가 카디올리핀에 대한 결합에 대해 효과적으로 경쟁하는, 카디올리핀에 적어도 결합하는 항체를 참조하여; 및 임의로 제2 세대 항체가 포스파티딜에탄올아민에 대한 결합에 대해 효과적으로 경쟁하는, 포스파티딜에탄올아민에 적어도 결합하는 항체를 참조하여 측정할 수 있다. 특정 양태에서, 제2 세대 항체는, 제2 세대 항체가 제1 및 제2 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 대한 결합 에 대해 효과적으로 경쟁하고, 적어도 제1 및 제2 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 결합하는 항체를 참조 하여; 제2 세대 항체가 제1, 제2 및 제3의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 대한 결합에 대해 효과적으로 경쟁하고 적어도 제1, 제2 및 제3 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 결합하는 항체를 참조로; 제2 세대 항 체가 제1, 제2, 제3 및 제4 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 대한 결합에 대해 효과적으로 경쟁하고 적어 도 제1, 제2, 제3 및 제4 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 결합하는 항체를 참조로; 또는 제2 세대 항체가 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 대한 결합에 대해 효과적으로 경쟁하고 적어 도 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 결합하는 항체를 참조로 측정할 수 있다. 추가의 양태에서, 제2 세대 항체는 하나 이상의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질에 대해 현저한 결합을 나타 내며, 콜린을 함유하는 중성의 인지질에 대한 검출가능한 항체가 없고 본 발명의 모노클로날 항체, 바람직하게 는 3G4(ATCC 4545)와 효과적으로 경쟁하는 항체로 특성화될 수 있다. 특정 양태에서, 항체는 음이온성 인지질 PS, PA, PI, PG 및 CL에 대한 현저한 결합을 나타내며; PS=PA=PI=PG>CL>>PE(여기서, >는 결합에 있어 2배 이상의 차이를 나타내며 >>는 이러한 인지질에 대한 결합에 있어 10배 이상의 차이를 나타낸다)의 인지질 결합 프로파일을 가지며; 포스파티딜콜린 또는 스핑고마이엘린에 대해 검출가능한 결합을 나타내지 않고; 음이온성 인지질 PS, PA, PI, PG 및 CL 각각에 대한 결합을 위해 모노 클로날 항체 3G4(ATCC 4545)와 효과적으로 경쟁한다. 바람직하게는, 제2 세대 항체는 앞서의 특성을 지닐 것이며 또한 활성화되거나, 분열하거나, 손상되거나, 세포 사멸되거나 바이러스 감염된 세포의 세포 표면에 존재하는 하나 이상의 음이온성 인지질에 대해 현저한 결합을 나타낸다. 더욱 바람직하게는, 항체는 또한 정지기 세포를 현저히 변경하지 않으면서 분열하는 내피 세포의 증 식을 현저히 억제하고 더욱 바람직하게는 현저한 루프스 항응고 활성을 지니지 않는다. 기능적으로, 제2 세대 항체는 바람직하게는 혈관형성을 억제할 것이고, 바람직하게는 생체내에서 항종양 효과 및 항바이러스 효과를 지니며, 더욱 바람직하게는 동물 또는 환자에게 현저한 혈전 합병증을 유발하지 않을 것 이다. 따라서, 바람직한 항체는 항혈관형성제, 항종양 혈관제, 항종양제 및 항바이러스제의 배합된 특성을 지 닌다. 본 발명은 모노클로날 항체 3G4에 의해 예시되거나, 하이브리도마 ATCC 4545 또는 이러한 모노클로날 항체의 항 원-결합 단편에 의해 생성된다. 모노클로날 항체3G4(ATCC 4545)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 모 - 15 -
노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마가 본 발명의 다른 측면이다. [0059] [0060] [0061] [0062] [0063] [0064] 본 발명에 따른 조성물, 면역접합체, 약제, 배합물, 콕테일(cocktail), 키트, 제1 및 제2의 의약적 용도 및 모 든 방법의 하기 기술에 있어서, 용어 "항체" 및 "면역접합체", 또는 이의 항원-결합 영역은, 달리 제시하거나 과학 용어로부터 명백하지 않는한, 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체의 범위 및 특정 3G4 교차 반 응성 항체를 의미한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "항체" 및 "면역글로불린'은 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 포함하는 모든 면 역학적 결합제를 광범위하게 언급한다. 중쇄내 불변 영역의 유형에 따라, 항체는 5개의 주요 부류중 하나로 분 리한다: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. 수개의 이들 항체는 또한 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등과 같은 아부류 또 는 동형으로 추가로 분리된다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 칭한다. 상이한 부류의 면역글로불린의 소단위 구조 및 3차원 구조는 잘 공지되어 있다. 일반적으로, 항원 결합 영역외의 항체가 본 발명에 사용되는 경우, IgG 및/또는 IgM이 바람직한데, 이는, 이들 이 생리학적 상황에서 가장 일반적인 항체이고 이들이 실험실 세팅에서 가장 용이하게 제조되기 때문이다. 포 유동물 항체의 "경쇄"는 이들의 불변 영역의 아미노산 서열을 기초로 하여, 2개의 명확하게 구별되는 유형인, 카파(κ) 및 람다(λ)중 하나로 지정된다. 필수적으로 본 발명의 항체중에 κ 또는 λ 경쇄를 사용하는 것은 바람직하지 않다. 모노클로날 항체(MAb) 또는 이의 유도체의 사용이 더욱 바람직하다. MAb는 특정의 장점, 예를 들면, 재생성 및 대량 생산의 장점을 갖는 것으로 인지되어 있어, 이들을 임상 치료에 적합하도록 한다. 따라서, 본 발명은 쥐, 사람, 원숭이, 랫트, 햄스터, 래빗 및 심지어 개구리 또는 닭 기원의 모노클로날 항체를 제공한다. 쥐, 사람 또는 사람화된 모노클로날 항체가 일반적으로 바람직할 것이다. 당해 분야의 숙련가에게 이해될 것으로써, 용어 "항체"에 의해 포함되는 면역학적 결합 시약은 이량체, 삼량체 및 다량체 항체; 비특이적인 항체; 키메라 항체; 사람 및 사람화된 항체; 재조합, 가공된 및 카멜화된 (camelized) 항체, 및 이의 단편을 포함하는, 모든 종, 및 이의 항원 결합 단편으로부터의 모든 항체에 연장된 다. 따라서, 용어 "항체"는 항원 결합 영역을 갖는 모든 항체-유사 분자를 말하며, 당해 용어는 Fab', Fab, F(ab') 2, 단일 영역 항체(DAB), Fv, scfv(일본쇄 Fv), 선형 항체, 다이아바디(diabody), 카멜화된 항체 등과 같 은 항체 단편을 포함한다. 각종 항체계 작제물 및 단편을 제조하고 사용하기 위한 기술은 당해 분야에 잘 공지 되어 있다[참조: Kabat et al., 1991, 본원에 참조로 상세히 인용됨). 특히, 다이아바디는 또한, 각각 본원에 참조로 상세히 인용된 제EP 404,097호 및 제WO 93/11161호에 추가로 기술되어 있는 반면; 선형 항체는 또한 본 원에 참조로 상세히 인용된 문헌[참조: Zapata et al. (1995)]에 또한 기술되어 있다. [0065] [0066] [0067] [0068] 특정 양태에서, 본 발명의 조성물은 서열 2 또는 서열 4의 아미노산 서열에 대해 서열 동질성이 약 75% 이상, 더욱 바람직하게는 약 80% 이상, 더욱 바람직하게는 약 85% 이상, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상 및 가장 바람 직하게는 95% 이상인 아미노산 서열 영역을 포함하는 적어도 제1의 변이 영역을 포함하는 적어도 제1 항-아미노 인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체를 포함하며; 여기서, 상기 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항 체는, 3G4 항체에 의해 예시되는 바와 같이, 본 발명의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체의 생물 학적 특성을 적어도 실질적으로 유지한다. 본 발명의 이러한 및 다른 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 서열과 관련한 상동성 또는 동질성은 본원에, 서열을 정렬시키고 갭을 도입한 후, 필요에 따라 최대 서열 상동성%를 달성한 후, 서열 2 또는 서열 4 의 서열에 대해, 또는 본 발명의 다른 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체의 서열에 대해 동일한 후 보 서열내 아미노산 잔기의 퍼센트로서 정의한다. 서열 비교에 사용된 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지 질 항체의 실질적으로 동일하거나, 심지어 더욱 효과적인 생물학적 특성의 유지가 특히 중요하다. 이러한 비교 는 예를 들면, 본원에 상세히 기술된 하나 이상의 각종 검정을 사용하여 용이하게 수행한다. 특정의 바람직한 양태에서, 본 발명의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체는 서열 1 또는 서열 3의 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열 영역을 포함하는 가변 영역에 의해 예시되는 바와 같이, 서열 2 또는 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열 영역을 포함하는 적어도 제1의 가변 영역을 포함한다. 이러한 서열은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 CDR1-3(상보성 결정 영역)을 포함하는 3G4 ScFv의 Vh 및 Vκ의 서열이다. 다른 바람직한 양태에서는, 원래의 항-아미노인지질와 같은 항-음이온성 인지질 항체 또는 3G4(ATCC 4545)과 비 - 16 -
교시 증가되거나 우수한 특성을 갖는 제2 세대 항체가 제공된다. [0069] [0070] [0071] [0072] [0073] [0074] [0075] [0076] [0077] [0078] [0079] [0080] [0081] [0082] 특정 양태에서, 사용된 항체는 "사람화된", 부분-사람 또는 사람 항체일 것이다. "사람화된" 항체는 일반적으 로 마우스, 랫트, 또는 사람 불변 및/또는 가변 영역 도메인("부분 사람 키메라 항체")를 지닌 기타 비사람 종 으로부터의 키메라 모노클로날 항체이다. 본 발명에 사용하기 위한 각종의 사람화된 모노클로날 항체는, 마우 스, 랫트 또는 기타 비사람 모노클로날 항체의 적어도 제1 항원 결합 영역, 또는 상보성 결정 영역(CDR)이 사람 항체 불변 영역 또는 "구조(framework)"에 작동적으로 부착되거나 "이식(grafted)"된다. 본원에서 사용하기 위한 "사람화된" 모노클로날 항체는 또한, 하나 이상의 선택된 아미노산이 사람 항체내에서 더욱 일반적으로 관측된 아미노산으로 교환되어 있는 비-사람종으로부터의 모노클로날 항체일 수 있다. 이것은 통상의 재조합 기술, 특히 부위-특이적인 돌연변이유발의 사용을 통해 용이하게 달성할 수 있다. "사람화된"이 아닌 전체의 사람 항체를 또한 제조하여 본 발명에 사용할 수 있다. 이러한 사람 항체는 항원이 존재하고 항체-생산 세포를 포함하는 사람 대상체로부터 혼합된 말초 혈액 림프구의 집단을 단순히 수득하고, 이를 면역학적 유효량의 아미노인지질 또는 음이온성 인지질 샘플과 혼합시킴에 의해 시험관내에서 당해 세포 집단을 자극시킴으로서 건강한 대상체로부터 수득할 수 있다. 사람 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체를 생성하는 세포는, 일단 수득되면, 하이브리도마 및/또는 재조합 항체 생산에 사용된다. 사람 모노클로날 항체 생산을 위한 추가의 기술은 사람 항체 라이브러리와 면역학적 유효량의 아미노인지질 또 는 음이온성 인지질 샘플을 포함하는 형질전환 동물, 바람직하게는, 형질전환 마우스를 포함한다. 이는 또한 하이브리도마 및/또는 재조합 항체 생산시 추가로 조작하기 위한 사람 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지 질 항체-생산 세포를 생성하며, 말초 혈액 세포보다는 비장 세포가 형질전환 동물 또는 마우스로부터 용이하게 수득될 수 있어 유리하다. 본 발명에 따른 항체는, 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545)과 실질적으로 교차-반응하거나 경쟁하는 항체를 선택함으로써 용이하게 제조할 수 있다. 적합한 제조 과정 및 방법은 (a) 후보 항체-생산 세포를 제조하는 단계; 및 (b) 후보 항체-생산 세포로부터 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545)와 실질적으로 교차-반응하거나 경쟁하는 항체를 선택하는 단계를 포함한다. 적합한 항체-생산 세포를 제조하고 이로부터 항체를 수득하는 한가지 방법은 대상 환자 자체내에서 수행할 수 있다. 즉, 환자에게 면역학적 유효량의 면역원성 아미노인지질 또는 음이온성 인지질 샘플을 단순 제공함으로 써 적절한 항체가 생성될 것이다. 따라서, 항체는 여전히 항체-생산 세포로부터 "수득"되지만, 숙주로부터 분 리되어 연속해서 환자에게 제공되어야 할 필요는 없으며, 종양 혈관구조에 일시적으로 국재화하여 이의 생물학 적 항-종양 효과를 발휘할 수 있어야 한다. 그러나 이러한 양태는 현재 바람직하지 않다. 적합한 항체-생산 세포가 또한 수득될 수 있으며, 항체는, 말초 혈액 림프구를 실험관내에서 아미노인지질 또는 음이온성 인지질로 자극시킴에 의해 연속적으로 분리되고/되거나 정제될 수 있다. 다른 방법은 적어도 제1의 면역원성 아미노인지질 또는 음이온성 인지질 성분을 포함하는 면역 조성물을 동물에 게 투여하고, 면역화시키고 면역화된 동물로부터 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545)와 실질적으로 교차-반응 하거나 경쟁하는 항체를 선택함을 포함한다. 이러한 방법들은 일반적으로: (a) 면역학적 유효량의 면역원성 아미노인지질 또는 음이온성 인지질을 포함하는 조성물의 적어도 1회의 투여량, 및 임의로 1회 이상의 투여량을 동물에게 투여함으로써 당해 동물을 면역화시키는 단계; 및 (b) 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545)와 실질적으로 교차-반응하거나 경쟁하는 항체를 생산하는 항체-생산 세포와 같은, 면역화된 동물로부터 적합한 항체-생산 세포를 수득하는 단계를 포함한다. 본원에 사용된 것으로서, 바람직한 "면역학적 유효량의 면역원성 아미노인지질 또는 음이온성 인지질을 포함하 는 조성물"은 활성화된 내피 세포를 포함하는 조성물이다. "활성화된 내피 세포"는 바람직하게는, 세포 생존성 을 실질적으로 유지시키고 내피 세포의 표면에서 하나 이상의 음이온성 인지질의 발현을 자극하는데 유효한 시 간동안, 적어도 제1 조건하에 내피 세포를 두거나, 내피 세포를 활성화시키고/시키거나 종양 환경을 모사하는 적어도 제1 인자와 접촉시킴에 의해 제조한다. 활성화된 내피 세포를 제조하는데 효과적인 "조건"의 예는 저산소 및/또는 산성 환경이다. 활성화된 내피 세포 를 제조하는데 효과적인 "인자"의 예는 유효 농도의 H 2 O 2, 트롬빈, IL-1α, IL-1β, 인터페론 또는 TNFα와 같은 - 17 -
염증성 사이토킨 및, 일반적으로 종양 환경을 모사하는 조건 및/또는 인자들의 조합이다. [0083] [0084] [0085] [0086] [0087] [0088] [0089] [0090] [0091] [0092] [0093] [0094] [0095] [0096] [0097] [0098] [0099] 면역화 과정의 특성, 또는 면역화된 동물의 유형에 상관없이, 적합한 항체-생산 세포가 면역화된 동물로부터 수 득되어, 바람직하게는 수동으로 추가로 조작된다. 본원에 사용된 것으로서, "면역화된 동물"은 달리 제시하지 않는한, 비-사람 동물이다. 어떠한 항체-생산 세포도 사용될 수 있지만, 가장 바람직하게는, 비장 세포가 항체 -생산 세포 공급원으로서 수득된다. 항체-생산 세포는: (a) 적합한 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체-생산 세포와 불멸 세포를 융합시켜 본 발명에 따라 서 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 제조하는 단계; 및 (b) 하이브리도마로부터 본 발명에 따라 적합한 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체를 수득하는 단 계를 포함하는 제조 방법에서 사용될 수 있다. "적합한" 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체-생산 세포, 하이브리도마 및 항체는 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545)와 실질적으로 교차-반응하거 나 경쟁하는 항체를 생산하거나, 이러한 항체로 존재하는 것들이다. 따라서, 하이브리도마계 모노클로날 항체 제조 방법은 (a) 면역학적 유효량의 면역원성 아미노인지질 또는 음이온성 인지질을 포함하는 조성물, 바람직하게는 활성화 된 내피 세포를 포함하는 조성물을 동물에게 적어도 1회 투여량, 및 임의로 1회 이상의 투여량으로 투여함으로 써 면역화시키는 단계; (b) 면역화된 동물로부터 모노클로날 항체-생산 하이브리도마의 수집물을 제조하는 단계; (c) 수집물로부터 본 발명에 따른 적어도 제1의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 모노클로날 항체, 임 의로 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545)와 실질적으로 교차-반응하거나 경쟁하는 항-아미노인지질 또는 항-음 이온성 인지질 항체를 생산하는 적어도 제1의 하이브리도마를 생산하는 적어도 제1의 하이브리도마를 선택하는 단계; 및 (d) 적어도 제1의 항체-생산 하이브리도마를 배양하여 적어도 제1의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 모노클로날 항체를 제공하는 단계; 및 바람직하게는 (e) 배양된 적어도 제1의 하이브리도마로부터 적어도 제1의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 모노클로 날 항체를 수득하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545)와 실질적으로 교차-반응하는 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항 체를 확인하는데 있어서, 선택 단계는 (a) 아미노인지질 또는 음이온성 인지질 샘플, 바람직하게는 PS 샘플을 유효량의 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545) 및 후보 항체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 대한 3G4 항체의 결합을 실질적으로 감소시키는 후 보 항체의 능력을 측정하는 단계[여기서, 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS 샘플에 대한 3G4 항체의 결합을 실질적으로 감소시키는 후보 항체의 능력은 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545)와 실질적으 로 동일한 에피토프에 결합하는 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체의 지표이다]를 포함할 수 있다. 선택 단계는 추가로 (a) 제1 아미노인지질 또는 음이온성 인지질 샘플, 바람직하게는 PS를 유효 결합량의 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545)와 접촉시키고 아미노인지질 또는 양이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 결합하는 3G4의 양을 측정하는 단계; (b) 제2 아미노인지질 또는 음이온성 인지질 샘플, 바람직하게는 PS를, 유효 경쟁량의 후보 항체와 조합하여 유 효 결합량의 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545)와 접촉시키고 후보 항체의 존재하에 아미노인지질 또는 음이 온성 인지질에 결합하는 3G4의 양을 측정하는 단계; 및 (c) 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS에 결합하는 3G4의 양을 바람직하게는 적어도 약 80% 까지 감소시키는 후보 항체를 선택함으로써 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545)와 실질적으로 동일한 에피토프 에 결합하는 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. - 18 -
[0100] 삭제 [0101] [0102] 비-사람 동물이 면역화에 사용되므로, 이러한 하이브리도마로부터 수득된 모노클로날 항체는 흔히 비-사람 제조 원을 지닐 것이다. 이러한 항체는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있고 또한 본원에 기술된 것으로서, 임의 로 사람화 방법, 이식 또는 돌연변이에 적용시킬 수 있다. 달리는, 사람 항체 유전자 라이브러리를 포함하는, 마우스와 같은 형질전환 동물을 사용할 수 있다. 따라서, 이러한 동물의 면역화는 적합한 사람 항체를 직접 생 성시킬 것이다. 사람 또는 비-사람 항체를 생산하는 것에 상관없이, 적합한 항체-생산 세포, 가장 바람직하게는 하이브리도마를 생산한 후, 모노클로날 항체-암호화 핵산을 클로닝하여 "재조합" 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. PCR TM 의 사용을 포함하는, 특정한 재조합 클로닝 기술을 사용하여 항체-암호화 핵산 서열의 합성을 개시할 수 있다. 따 라서, 추가의 적절한 모노클로날 항체 제조 방법은 다음과 같은 항체-생산 세포를 사용함을 포함하는 방법을 포 함한다: [0103] [0104] [0105] [0106] [0107] [0108] [0109] [0110] [0111] [0112] (a) 적합한 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체-생산 세포, 바람직하게는 하이브리도마로부터 제1의 적합한 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체-암호화 핵산 분자 또는 분절을 수득하는 단계; 및 (b) 재조합 숙주 세포내에 핵산 분자 또는 분절을 발현시켜 본 발명에 따르는 재조합 항-아미노인지질 또는 항- 음이온성 인지질 모노클로날 항체를 수득하는 단계. 그러나, 재조합 모노클로날 항체의 제조에 이상적으로 적합한 기타 강력한 재조합 기술을 이용할 수 있다. 이 러한 재조합 기술은 다음을 포함하는 파지미드 라이브러리(phagemid library)계 모노클로날 항체 제조방법을 포 함한다: (a) 면역학적 유효량의 면역원성 아미노인지질 또는 음이온성 인지질을 포함하는 조성물, 바람직하게는 활성화 내피 세포를 포함하는 조성물의 하나 이상의 투여량 및 임의로 1 초과의 투여량을 동물에게 투여하는 단계; (b) 면역화된 동물의 항체-생산 세포, 바람직하게는 비장으로부터 분리된, RNA를 발현하는 조합성 면역글로불린 파지미드 라이브러리를 제조하는 단계; (c) 하나 이상의 제1 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 임의로 모노클로날 항체 3G4 (ATCC 454 5)와 실질적으로 교차-반응하거나 경쟁하는 것을 발현하는 적어도 제1의 클론을 파지미드 라이브러리로부터 선 택하는 단계; (d) 적어도 제1의 선택된 클론으로부터 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체-암호화 핵산을 수득하고 재조합 숙주 세포내의 핵산을 발현시켜 적어도 제1의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체를 제공하 는 단계; 및 바람직하게는 (e) 적어도 제1의 선택된 클론으로부터 수득된 핵산에 의해 발현된 적어도 제1의 항-아미노인지질 또는 항-음이 온성 인지질 항체를 수득하는 단계. 다시, 이러한 파지미드(phagemid) 라이브러리계 기술에서, 사람 항체 유전자 라이브러리를 지닌 형질전환 동물 을 사용할 수 있으며, 이에 따라 재조합 사람 모노클로날 항체가 수득된다. 제1의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 핵산 분절의 제조 방식에 상관없이, 추가의 적합한 항체 핵산 분절을 표준 분자 생물학 기술에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 어떠한 변이체, 돌연변이체 또는 제2 세 대 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 핵산 분절도 본 발명에 사용하기에 적합하다는 사실을 확인 하기 위해, 핵산 분절을 시험하여 본 발명에 따라서 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체의 발현을 확인할 것이다. 바람직하게는, 변이체, 돌연변이체 또는 제2의 생산 핵산 분절을 또한 시험하여, 표준, 더욱 바람직하게는 표준의 엄격한 하이브리드화 조건하에서의 하이브리드화를 확인할 것이다. 예시적인 적합한 하이 브리드화 조건은 약 50 에서의 약 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 약 0.5M NaPO 4, 약 1mM EDTA중 하이브리드 화 및 약 42 에서 약 1% SDS를 사용한 세척을 포함한다. [0113] 각종 재조합 모노클로날 항체로서, 사람 또는 비-사람 기원이 용이하게 제조될 수 있는지에 상관없이, 동물 또 는 환자에게서 생물학적 유효량의 적어도 제1의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체를 발현하는 적 어도 제1의 핵산 분절을 동물 또는 환자에게 제공함에 의해 본 발명의 어떠한 치료 방법도 발휘될 수 있다. " - 19 -
항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질, 3G4-유사 또는 3G4계 항체를 발현하는 핵산 분절"은 일반적으로 적 어도 발현 작제물의 형태일 수 있고 바이러스 또는 재조합 숙주 세포내 포함된 발현 작제물의 형태일 수 있다. 본 발명의 바람직한 유전자 치료요법 벡터는 일반적으로 재조합 레트로바이러스, 헤르페스 단성 바이러스(HSV), 아데노바이러스, 아데노-연합 바이러스(AAV), 사이토메갈로바이러스(CMV)내 포함된 것과 같은 바이러스 벡터일 것이다. [0114] [0115] [0116] [0117] [0118] [0119] [0120] [0121] 세포 비침투성 듀라마이신 유도체: 본 발명은 또한 변형되어 실질적으로 세포 비침투성 PE-결합 작제물을 형성 하는 적어도 제1의 PE-결합 펩타이드를 포함하는 실질적인 세포 비침투성 포스파티딜에탄올아민(PE)-결합 펩타 이드 작제물 및 유도체를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은 변형되어 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 작제물을 형성하는 적어도 제1 PE-결합 펩 타이드를 포함하는, 적어도 제1의 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 작제물의 생물학적 또는 치료학적 유효량을 약제학적으로 허용되는 담체속에 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 따라서, 실질적인 세포 비침투성 PE- 결합 작제물은 약제학적, 약리학적 및 치료학적, 예를 들면 의학적으로 사용하기 위한, 바람직하게는 바이러스 감염 치료에 사용하기 위한 작제물이다. 특정 양태에서, 본 발명은 바이오틴에 연결된 신나마이신외에 실질적 인 세포 비침투성 PE-결합 작제물을 제공한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체는 실질적인 세포 비침투성 듀 라마이신 펩타이드 유도체 및 이의 약제학적 조성물이다. 듀라마이신 펩타이드는 통상적으로 변형되어 적어도 제1의 세포 비침투성 그룹에 작동적으로 부착함에 의해 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체를 형성한다. 세포 비침투성 그룹의 작동적 부착은 서열 9의 2번 아미노산 위치에서의 라이신 잔기를 통해 이루어질 수 있다. 세포 비침투성 그룹은 생리학적 ph에서 양성 또는 음성 전하를 가지거나 극성일 수 있다. 예시적인 그룹은 설 페이트, 설포네이트, 포스페이트, 카복실, 페놀성, 4급 암모늄 이온 및 아민 그룹을 포함한다. 바이오틴에 연 결된 듀라마이신을 포함하는 약제학적 조성물이 본 발명의 특정 예이다. 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신은 또한 당, 올리고- 또는 다당류, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백 질 또는 다가알코올 그룹에 작동적으로 부착될 수 있다. 특정의 세포 비침투성 듀라마이신은 뉴트라비딘, 스트 렙타비딘, 알부민과 같은 불활성 담체 단백질, 또는 불활성 면역글로불린 담체 단백질에 작동적으로 부착된 것 들이며, 이중 듀라마이신이 사람 IgG(HIgG)에 부착된 것이 특히 바람직하다. 세포 비침투성 듀라마이신의 다른 예는 표적화제, 바람직하게는 종양 세포, 종양 혈관구조 또는 종양 기질 또는 바이러스 감염된 세포에 결합하는 것들이다. 종양 세포, 종양 혈관구조 또는 종양 기질의 성분에 결합하는 표적화제의 예는 본원에 참조로 상세 히 인용된 미국 특허 제6,093,399호, 제6,004,555호, 제5,877,289호 및 제6,036,955호에 교시되어 있다. 종양 치료: 본 발명은 또한 적어도 제1의 정제된 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 또는 이의 항 원-결합 단편 또는 면역접합체와 임의로 모노클로날 항체 3G4 (ATCC PTA 4545)와 동일한 에피토프에 필수적으로 결합하는 것, 또는 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체, 바람직하게는 실질적인 세포 비침투성 듀 라마이신 유도체를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 바람직하게는 정맥내 투여와 같은 비경구 투 여용, 또는 리포좀 또는 에어로졸과 같은 투여용으로 제형화된 것들을 포함하는, 약제학적으로 허용되는 조성물 이다. 본 발명은 3G4-교차-반응성의 3G4 유사 또는 3G4계 항체를 포함하는 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 및 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체의 다수 방법 및 용도를 제공한다. 모든 방법들과 관련하 여, 용어 "하나(a 또는 an)"은 특별히 기술한 경우를 제외하고는 인용된 방법의 "하나 이상", "적어도 제1의", "하나 이상" 또는 "다수"의 단계를 의미하는데 사용된다. 이는 특히 치료 방법에 있어서의 투여 단계와 관련되 어 있다. 즉, 본 발명에서 사용된 상이한 투여량 뿐만 아니라, 상이한 다수의 투여량, 예를 들면, 주입 또는 흡입이 다수의 주입 또는 흡입에 까지 및 이를 포함하여 사용될 수 있다. 배합 치료요법이 사용될 수 있고, 항 -아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 또는 면역접합체 또는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체 의 투여 전, 투여 후 또는 투여 동안 투여될 수 있다. 중요한 생물학적 영향을 갖는 각종의 유용한 시험관내 방법 및 용도가 제공된다. 첫번째로 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS 또는 PE를 포함하는 조성물을 적어도 제1의 항-아미노인지질 또는 항-음이온 성 인지질 항체, 또는 이의 항원 결합 단편과, 임의로 모노클로날 항체 3G4 (ATCC PTA 4545)와 실질적으로 동일 한 에피토프에 결합하는 항체와, 또는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체와 효과적으로 접촉시킴을 일 반적으로 포함하는, 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 바람직하게는 PS 또는 PE를 결합시키는 방법 및 이러 - 20 -
한 결합에 있어서의 용도를 제공한다. "접촉"은 결합된 복합체가 형성되도록 하고, 형성된 어떠한 복합체도 검 출되도록 하는데 효과적인 조건하에 수행된다. 검출 방법 및 용도는 생물학적 샘플과 관련하여, 예를 들면, 세 포사멸, 종양 및 바이러스 감염된 세포 진단시 사용될 수 있으며, 이를 기초로한 진단 키트도 또한 제공된다. [0122] [0123] [0124] [0125] [0126] [0127] [0128] [0129] [0130] 본 발명의 항체, 항원 결합 단편 및 면역접합체를 바람직하게 사용하는 증식 억제 방법 및 용도도 제공된다. 내피 세포 증식 및/또는 이주를 억제하는 방법은 일반적으로 내피 세포의 집단을 포함하는 세포 또는 조직의 집 단을, 생물학적 유효량의 적어도 제1의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체와, 임의로 모노클로날 항체 3G4 (ATCC PTA 4545)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 것, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 내피 세포 증식 및/또는 이주를 억제하는데 효과적인 조건하에 접촉시킴을 포함한다. 상기 방법 및 용도는 시험관내 및 생체내에서 수행할 수 있으며, 생체내에서 수행하는 경우, 조직 또는 세포는 동물내에 위치하며 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체는 동물에게 투여된다. 둘다의 경우에서, 당 해 방법 및 용도는 잠재적인 혈관형성 혈관 또는 이의 집단을 포함하는 조직 또는 이의 집단을, 생물학적 유효 량의 적어도 제1의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체와, 임의로 모노클로날 항체 3G4 (ATCC PTA 4545)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 것, 또는 이의 항원-결합 단편과 혈관형성을 억제하는데 효과 적인 조건하에서 접촉시킴을 포함하여, 혈관형성을 억제하는 방법 및 용도가 된다. 잠정적인 혈관형성 혈관의 집단이 생체외에서 유지되는 경우, 본 발명은 약물 전달 프로그램에서 이용된다. 시 험관내 스크리닝 검정에서, 확실한 양성 및 음성 대조군을 사용하는 것은, 혈관형성을 억제하거나 촉진시키는 약물의 개발, 및 혈관형성 과정에서 추가의 정보의 기술에서 제1 단계로 유용한다. 잠재적인 혈관형성 혈관의 집단이 동물 또는 환자내에 위치하는 경우, 항-혈관형성 조성물을 치료요법의 형태로서 동물에게 투여한다. 항-혈관형성 및 항-혈관 치료요법은 바람직하지 않고, 부적절하며, 비정상적이고, 과도하고/하거나 생리학적 혈 관신생으로 특징화되는 어떠한 질병 또는 장애가 있거나 이러한 질병 또는 장애로 진행될 위험에 있는 동물 및 환자의 측면에서 제공된다. 비정상적인 혈관형성은 광범위한 질병 및 장애에서 발생하므로, 제공된 항-혈관형 성 치료요법이, 일단 어떠한 허용되는 모델 시스템에서 효과적인 것으로 밝혀지면, 이를 혈관형성과 관련된 질 병 및 장애 전체 범위를 치료하는데 사용할 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 방법 및 용도는 특히, 어떠한 형태의 혈관화 종양; 노화 관련 황반 변성을 포함하는 황반 변성; 류마 티스 관절염을 포함하는 관절염; 죽상경화증 및 죽상경화판; 당뇨병성 망막병증 및 기타 망막병증; 그레이브스 병(Grave's disease)을 포함하는 갑상샘 과다형성; 혈관종; 신생혈관 녹내장 및 건선에 걸렸거나 이러한 질병으 로 진행될 위험이 있는 동물 및 환자에게 사용하도록 의도된다. 본 발명의 방법 및 용도는 또한 동정맥 기형(AVM), 수막종, 및 혈관성형술에 이은 재협착을 포함하는 혈관 재협 착을 지니거나 이러한 상태로 진행될 위험이 있는 동물 및 환자를 치료하도록 의도된다. 치료 방법 및 용도의 다른 의도된 표적은 혈관섬유종, 피부염, 자궁내막증, 혈우병 관절, 비대 흉터, 염증 질병 및 장애, 화농육아종, 피부경화증, 윤활막염, 트라코마 및 혈관 유착이 있거나 이러한 상태로 진행될 위험이 있는 동물 및 환자의 치료 방법 및 용도의 표적물로 의도된다. 본원에 참조로 상세하게 인용된 미국 특허 제5,712,291호에 기술된 바와 같이, 상기 치료 그룹 각각은 본 발명 에 의해 치료될 상태 유형의 완전한 수단은 없다. 미국 특허 제5,712,291호는 항-혈관형성 치료요법에 의해 효 과적으로 치료될 수 있는 다수의 다른 상태를 확인하기 위한 목적; 일단 혈관형성 억제 화합물의 정의된 범주가 기술되고 청구되면[본 경우에는, 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 임의로 모노클로날 항체 3G4 (ATCC PTA 4545)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 것], 모든 혈관형성 질병이 단일화된 개념을 나타냄 을 보여주기 위한 목적; 및 모든 혈관형성 질병의 치료가 단지 하나의 모델 시스템으로부터의 데이타에 의해 가 능함을 보여주는 목적을 포함하는, 특정의 특수 목적을 위해 참조로 본원에서 인용된다. 혈관형성 및 혈관 질병의 치료외에, 본 발명의 중요하고 통합된 측면은 암이 있거나 암으로 진행될 위험이 있는 동물 및 환자를 치료하기 위한 조성물 및 방법이다. 모든 암 치료 방법 및 용도는 적어도 제1의 정제된 항-아 미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역접합체, 임의로 모노클로날 항 체 3G4 (ATCC PTA 4545)와 필수적으로 동일한 에피토프에 결합하는 것, 또는 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체, 바람직하게는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체의 투여 또는 사용을 포함한다. 이 러한 작제물은 치료학적 유효량으로 암에 걸린 동물 또는 환자에게 투여된다. 본 발명의 암 치료 방법, 심지어 항체를 사용하는 방법은 단독으로 항-혈관 및/또는 항-혈관형성 효과를 발휘하 지 않는다. 본 발명의 암 치료 방법 및 용도는 혈관화 고형 종양, 일차 암으로부터의 전이 종양 또는 전이를 - 21 -
지니거나 이렇게 질행될 위험이 있는 동물 및 환자를 포함하는 모든 형태의 암을 치료하는데 적합하다. [0131] [0132] [0133] [0134] [0135] [0136] [0137] [0138] [0139] [0140] [0141] 접합되지 않거나, "노출된 항체(naked antibody)" 및 이의 단편과, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 치료제에 작동적으로 부착된 면역접합체 둘다가 본 발명의 항-암 측면에서 사용될 수 있다. 따라서, 달리 특정하게 기술 하거나 과학적 용어로 명백하지 않는 한, 본원에 사용된 것으로서 용어 "항체 및 이의 단편"은 다른 제제, 특히 치료제 또는 진단제에 부착되지 않는 "접합되지 않거나 노출된" 항체 또는 단편을 의미한다. 이러한 정의는 예 로써 항체, 또는 항체와 다른 유효인자의 배합물의 생물학적 반감기, 친화도, 친화성 또는 기타 특성을 향상시 키기 위한 변형과 같은, 항체의 변형을 배제하지는 않는다. 암 치료용의 면역접합체를 기초로 하는 방법에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항-암 효과를 직접적으로 또는 간접적으로 지닐 수 있는 어떠한 하나 이상의 범위의 생물학적 치료제 및/또는 소위 제2의 항암제(제1의 항-혈관형성제인 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 자체)에 작동적으로 부착된다. 따라서, 본 발명은 또한 종양에 선택된 치료제 또는 진단제를 전달하기 위한 방법 및 용도를 제공한다. 이러한 양태는 진단제 또는 치료제가 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 임의 로 모노클로날 항체 3G4 (ATCC PTA 4545)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합된 것에 작동적으로 부착된 적어 도 제1의 면역접합체를 포함하는 조성물의 생물학적 유효량을 종양을 지닌 동물 또는 환자에게 투여함을 포함한 다. 따라서, 본 발명의 조성물, 및 방법 및 용도는 적어도 제1의 생물학적, 치료 또는 진단제에 작동적으로 부착된, 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 임의로 모노클로날 항체 3G4 (ATCC PTA 4545)와 실질적으로 동 일한 에피토프에 결합한 것을 포함하는 조성물을 포함한다. 항체는 바람직하게는 방사치료요법제, 항-혈관형성 제, 세포사멸-유도제, 항-튜불린 약물, 항-세포성, 세포독성제 또는 사이토킨(또는, 하기 논의한 바와 같은 항- 바이러스 약물)에 연결된다. 부착용의 특정의 바람직한 제제는 예를 들면, 접합체가 화학치료요법용 대리 마커로 사용되도록 하는 생체내 진 단제이다. 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 또는 3G4계 치료 접합제에서 사용하기 위한 바람직한 제제는 항 체의 효과를 보완하거나 증진시키는 것들 및/또는 특정 종양 유형 또는 환자에 대해 선택된 것들이다. "항체의 효과를 보완하거나 증진시키는 치료제"는 방사치료요법제, 혈관 침투 증진제, 특정의 사이토킨, 항-혈관형성제, 세포사멸 유도제, 및 항-튜불린 약물을 포함하며, 이들중 하나 이상이 함께 사용될 수 있다. 현재 바람직한 제제는 세포독성제, 겔로닌; TNFα, IL-12 및 LEC(간-발현된 케모킨)과 같은 사이토킨; 표 E에서 와 같이, 항-혈관형성 효과를 지닌 항암제; 표 F에서와 같이 세포사멸을 유도하는 항암제 및 콤브레타스타틴 게 열로부터의 항-튜불린 약물이다. 특히 바람직한 제제는 도세탁셀이다. 본 발명의 암 치료 조성물 및 방법은 또한 다른 치료 및 진단제와 함께 사용될 수 있다. 치료제와의 배합에 있 어 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 또는 3G4계 항체의 측면에서 "배합된" 용도는 배합 조성물, 약제, 콕테일, 키트, 방법을 포함하며, 여기서, 치료제는 전구약물의 형태이다. 배합된 암 치료 방법은, 적어도 제1의 정제된 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 또는 이의 항원- 결합 단편 또는 면역접합체, 임의로 모노클로날 항체 3G4 (ATCC PTA 4545)와 필수적으로 동일한 에피토프에 결 합하는 것들, 또는 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체, 바람직하게는 실질적인 세포 비침투성 듀 라마이신 유도체가 적어도 제2의 치료제 또는 항암제의 치료학적 유효량과 함께 암을 지닌 동물 또는 환자에게 투여되는 방법이다. 본 발명은 또한 생물학적 유효량의 적어도 제1의 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 임의로 모노 클로날 항체 3G4 (ATCC PTA 4545)와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 것들, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 면역접합체, 또는 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체, 바람직하게는 실질적인 세포 비침투 성 듀라마이신 유도체; 및 생물학적 유효량의 적어도 제2의 생물학적 제제, 성분 또는 시스템, 바람직하게는 적 어도 제2의 치료제 또는 항암제를, 임의로 적어도 제1의 조성물 또는 용기내에 포함하는 조성물, 약제학적 조성 물, 치료 키트 및 의학적 콕테일을 제공한다. "적어도 제2의 생물학적 제제, 성분 또는 시스템"은 종종 치료제 또는 진단제, 성분 또는 시스템을 포함할 수 있다. 예를 들어, 적어도 제2의 생물학적 제제, 성분 또는 시스템은 항체를 변형시키고/시키거나 다른 제제를 항체에 부착시키기 위한 성분들을 포함할 수 있다. 특정의 바람직한 제2의 생물학적 제제, 성분 또는 시스템은 - 22 -
전구약물 자체를 제조하기 위한 성분 및 본 발명의 항체를 이러한 전구약물 또는 ADEPT 양태에서 작용하도록 개 조한 성분들을 포함하는 전구약물의 제조 및 사용을 위한 전구약물 또는 성분들이다. [0142] [0143] [0144] [0145] [0146] [0147] [0148] [0149] [0150] [0151] [0152] 치료할 질병이 암인 경우, "적어도 제2의 치료제 또는 항암제"는 치료학적 키트 또는 콕테일에 포함될 것이다. 용어 "적어도 제2의 항암제"는 제1의 항암제인, 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 3G4 작제물, 또는 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체, 바람직하게는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도 체를 참조하여 선택한다. 즉, 본 발명의 항체는 화학치료요법제, 방사치료요법제, 사이토킨, 항-혈관형성제, 세포사멸 유도제 또는 항암 면역독소 또는 응고리간드(coaguligand)와 결합될 수 있다. "화학치료요법제"는 또 한 유전자, 벡터, 안티센스 작제물 및 리보자임을 포함한다. 현재 바람직한 제2의 항암제는 표 E에서와 같은 항-혈관형성 효과를 갖는 항암제; 표 F에서와 같이 세포사멸을 유도하는 항암제; 및 콤브레타스타틴 게열로부터의 항-튜불린 약물이다. 특히 바람직한 제제는 도세탁셀이다. 본 발명의 조성물, 키트 및/또는 의약의 측면에서, 배합된 유효량의 치료제는 단일 용기 또는 용기 수단내에 포 함되거나 별개의 용기들 또는 용기 수단들내에 포함될 수 있다. 콕테일은 일반적으로 배합용으로 함께 혼합될 것이다. 정맥내 투여용으로 제형화된 제제가 종종 바람직하다. 영상화 성분들이 또한 포함될 수 있다. 키트 는 또한 포함된 적어도 제1의 항체 및 하나 이상의 다른 생물학적 제제를 사용하기 위한 지침서를 포함할 수 있 다. 일반적으로 말해서, 적어도 제2의 항암제는 단일의 약제학적 조성물 또는 2개의 약제학적 조성물이 함께 근접하 게 투여되는 것과 같이, 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 3G4계 치료제 또는 실질적인 세포 비 침투성 듀라마이신 유도체와 실질적으로 동시에 동물 또는 환자에게 투여될 수 있다. 달리는, 적어도 제2의 항암제를 동물 또는 환자에게 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 3G4계 치 료제 또는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체의 투여에 연속된 싯점에 투여할 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, "연속된 싯점"은, 적어도 제2의 항암제가 동물 또는 환자에게 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인 지질 항체, 3G4계 치료제 또는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체의 투여와는 별개의 시간에 투여되도 록 "시간차를 두는것(staggered)"을 의미한다. 2개의 제제는 이들이 각각의 치료 효과를 발휘하도록 효과적으 로 떨어진 시간에 투여하는데, 예를 들어, 이들은 "생물학적으로 효과적인 시간 간격"에서 투여된다. 적어도 제2의 항암제는, 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 3G4계 치료제 또는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체 투여전 생물학적으로 효과적인 시간에, 또는 이러한 치료제 투여 후 생물학적으로 효과적인 시간에 동물 또는 환자에게 투여될 수 있다. 종양 영상화는 또한 바람직하게는 검출가능하게 표지된 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 또는 3G4계 항체 작제물을 사용하여 수행할 수 있다. 본 발명에 따른 영상화는 예비-세포사멸성 및 세포사멸성 세포 를 검출할 수 있으므로, 대리 마커로서 치료요법후 사용될 수 있다. 달리는, 형성된 영상이 사용되는 치료제의 결합 부위의 지표일 것이므로, 영상화를 치료전에 수행할 수 있다. 따라서, 암 치료는 (a) 종양을 지닌 동물 또는 환자에게 종양 결합제 또는 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 또는 3G4계 항체에 작동적으로 부착된 진단제를 포함하는, 적어도 제1의 검출가능하게 표지된 종양 결합제, 바람직하 게는 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 또는 3G4계 항체 작제물의 진단학적 최소량을 종양을 지닌 동물 또는 환자에게 투여함으로써 종양의 검출가능한 영상을 형성시킴에 의해 종양의 영상을 형성시키는 단계; 및 (b) 연속적으로 동일한 동물 또는 환자에게 치료학적 최적량의 적어도 제1의 노출된 항-아미노인지질 또는 항- 음이온성 인지질 항체 또는 3G4 항체 또는 이러한 항체를 사용한 치료제-항체 작제물을 투여함으로서 항종양 효 과를 유발시키는 단계에 의해 수행될 수 있다. 따라서, (a) 종양 결합제 또는 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 또는 3G4계 항체에 작동적으로 부착된 검 출가능한 제제를 포함하는, 검출가능하게 표지된 종양 결합제, 바람직하게는 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 또는 3G4계 항체 작제물의 진단 유효량을 포함하는 제1의 약제학적 조성물; 및 (b) 하나 이상의 노출된 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 또는 3G4 항체 또는 이러한 항체를 사 용하는 치료제-항체 작제물을 포함하는 제2의 약제학적 조성물을 일반적으로 포함하는 영상화 및 치료 제형 또 는 의약이 제공된다. - 23 -
[0153] [0154] [0155] [0156] [0157] [0158] [0159] [0160] [0161] 바이러스 감염 치료: 본 발명의 특히 중요하고 놀라운 발전은 바이러스 감염을 치료 또는 예방하기 위한 조성물, 배합물, 키트, 방법, 용도 및 의약에 관한 것이다. 본 발명의 항-바이러스 치료 방법은 본 발명의 선 행 및 추가의 치료제중 하나 이상의 투여 또는 용도에 관한 것이다. 제1의 예에서, 본 발명의 항-바이러스 조성물 및 치료 방법은, 조성물 및 암 치료 측면에서 위에서 기술한 바와 같은, 적어도 제1의 정제된 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 임의로 모노클로날 항체 3G4 (ATCC PTA 4545)와 필수적으로 동일한 에피토프에 결합하는 것, 또는 실질적인 세포 비침 투성 PE-결합 펩타이드 유도체, 바람직하게는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체의 투여 또는 용도에 관한 것이다. 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체중에서, 사용하기에 바람직한 것은 HIgG에 연결 된 듀라미아신 또는 바이오틴에 연결된 듀라마이신과 같은 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체일 것이다. 본 발명의 항체와 펩타이드 및 바이러스 감염 사이의 놀라운 관계를 제공하면서, 본 발명은 또한 바이러스 감염 을 치료하는데 사용하기 위한 신규 범위의 치료제를 제공한다. 특히, 본 발명은 적어도 제1의 항-바이러스제에 작동적으로 연결된 아미노인지질 또는 음이온성 인지질, 특히 PS 및 PE에 대한 항체를 제공한다. 본 발명은 또 한 적어도 제1의 항-바이러스제에 작동적으로 연결된 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체, 바람직 하게는 듀라마이신 펩타이드 유도체를 제공한다. 본 발명의 항체 및 펩타이드에 부착시키기 위한 적합한 항-바 이러스제는 표 G에 설정된 것들을 포함한다. 따라서, 본 발명의 총체적인 항-바이러스 조성물 및 치료 방법은 바이러스 감염된 동물 또는 환자에게 치료학적 유효량의 적어도 제1의 정제된 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 항-바이러스 면역접합체, 임의로 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545)와 필수적으로 동일한 에피토프에 결합한 것, 또는 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체, 바람직하게는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체, 또는 이의 항-바이러스 면역접합체를 포함하는 조성물을 투여하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 항-바이러스 치료 방법 및 용도는 동물 및 환자, 및 심지어 식물에서 모든 바이러스를 치료하는데 적 합하다. 본 발명의 치료제는 바이러스 도입을 억제할 수 있으나, 바람직하게는 감염된 숙주 세포로부터의 바이 러스 복제, 배출(egress) 및 확산을 억제한다. 본 발명은 표 H에 나열된 척추동물, 특히 사람에 감염되는 모든 바이러스, 및 특히 사람에게서 병원성인 바이러스를 치료하는데 적합한다. 본 발명에 의해 치료될 수 있는 바 이러스 감염 및 관련 질병은 사이토메갈로바이러스(CMV), 호흡계 신시티얼 바이러스(RSV) 및 아레나바이러스 감 염, 및 또한 간염 바이러스, 인플루엔자, 폐렴, 라사열(Lassa fever) 및 AIDS의 치료에 의해 예시되는 바와 같 이, 표 J에 설정된 바이러스 감염 및 질병을 포함한다. 본 발명의 항-바이러스 치료 조성물 및 방법은 또한 다른 치료제 및 진단제와 배합하여 사용할 수 있다. 이러 한 "배합된" 용도는 배합된 조성물, 약제, 콕테일, 키트 및 치료 방법에서 별개의 항-바이러스제와 배합된다. 전술한 암 및 항-바이러스 치료 방법 및 용도는 흔히 약제학적으로 효과적인 조성물을 동물 또는 환자에계 경피, 근육내, 정맥내 주사 등과 같이 전신계적으로 투여함을 포함할 것이다. 바이러스 감염, 특히 호흡기 바 이러스 감염을 치료하기 위해서는, 에어로졸을 사용하여 달성될 수 있는 것으로서 폐로의 전달이 바람직하다. 그러나, 치료제가 종양 또는 바이러스 감염 부위에 국재화되도록 하는 어떠한 투여 경로도 허용될 것이다. 따 라서, 다른 적합한 전달 경로는 경구, 직장내, 비내, 국소 및 질내 투여를 포함한다. 관절염의 치료를 위한 용 도 및 방법을 위해서는, 예를 들면, 본원에서 참조로 상세히 인용된 미국 특허 제5,753,230호에서 기타 면역학 적 제제에 대해 기술된 바와 같은, 윤활막내 투여가 사용될 수 있다. 눈과 관련된 상태를 위해서는, 안과 제형 및 투여가 고려된다. 본원에 사용된 것으로서, "투여"는 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체 또는 3G4계 치료제, 또는 실 질적인 세포 비침투성 인지질 항체 또는 3G4계 치료제, 또는 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체, 바람직하게는 듀라마이신 유도체를 치료 효과가 발휘되기에 효과적인 양 및 시간 동안 제공하거나 전달하는 것 을 의미한다. 단백질성 치료요법제의 수동적 투여가 부분적으로는 이의 단순성 및 반복성을 위해 일반적으로 바람직하다. 그러나, 용어 "투여"는 치료제가 전달되는 어떠한 및 모든 수단을 언급하는데 사용된다. 따라서, "투여"는 효 과적인 방식으로 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 3G4계 또는 듀라마이신 유도체 치료요법제을 생산하는 세포를 제공하는 것을 포함한다. 이러한 양태에서는, 세포를 선택적으로 침투성인 막, 구조물 또는 이식가능한 장치, 일반적으로 제거함으로서 치료를 중단할 수 있는 장치내에 제형화하거나 패키징시키는 것이 - 24 -
바람직할 수 있다. 외인성 투여가 여전히 일반적으로 바람직한데, 이는 당해 투여량이 밀접하게 모니터되거나 조절되도록 하는 비-침습적인 방법을 나타내기 때문일 것이다. [0162] [0163] [0164] [0165] [0166] [0167] [0168] [0169] [0170] [0171] 본 발명의 치료 방법 및 용도는 또한 생체내에서 이를 발현시키기에 효과적인 방식으로 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 3G4계 또는 듀라마이신 유도체 치료요법제를 암호화하는 핵산을 제공하는 것에 연장 된다. 노출된 DNA 전달, 재조합 유전자 및 벡터, 환자의 세포의 생체외 조작을 포함한 세포계 전달 등과 같은 어떠한 유전자 치료요법 기술도 사용될 수 있다. 리포좀 및 은밀화된 리포좀(stealthed liposome)이 일부 양태 에서 사용하기에 바람직할 것이다. 본 발명의 약제학적 조성물 및 치료 방법은 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항체, 임의로 모노클로날 항체 3G4(ATCC PTA 4545), 또는 이러한 항체의 항원-결합 단편 또는 면역접합체, 또는 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체, 바람직하게는 실질적인 세포 비침투성 듀라마이신 유도체의 "치료학적 유효량"을 사 용한다. "치료학적 효과" 및 연속된 "치료학적 유효량"은 암 치료 대 항-바이러스 치료에 있어서 상이한 매개 변수로 측정한다. 암 치료에서, 제제의 양은 종양 세포, 종양 또는 종양내 혈관 내피 세포의 적어도 일부분을 특이적으로 사멸시 키고; 종양 세포, 종양 또는 종양내 혈관 내피 세포의 적어도 일부분에서 세포사멸을 특이적으로 유도하고; 종 양 또는 종양내 혈관의 적어도 일부분에서 응고를 특이적으로 촉진시키고; 종양의 혈액 수송 관의 적어도 일부 를 특이적으로 폐쇄시키거나 파괴하고; 종양의 적어도 일부에서 괴사를 특이적으로 유도시키고/시키거나 동물 또는 환자에게 투여시 종양 회귀 또는 완화를 유도하는데 효과적이다. 바이러스 감염 및 관련 질병을 치료하는데 있어서, 제제의 양은 바이러스 도입, 및 바람직하게는 바이러스 복제, 배출 및 감염된 숙주 세포로부터의 확산과 같은 진행중인 바이러스 감염에 있어 하나 이상의 요건을 억제 하는데 효과적이다. 또한, 제제의 양은 바이러스 복제, 확산 및 진행중인 감염에 상응하는 방식으로 바이러스 감염된 세포의 적어도 일부를 죽이거나 제거할 수 있다. 총괄하여, 제제의 양은 동물 또는 환자에게 투여시 바 이러스 감염을 감소시키거나, 현저히 감소시키거나 전멸시키는데 효과적이다. 본원에 사용된 것으로서 용어 "우선적으로는" 및 "특이적으로"는, 항-아미노인지질 또는 항-음이온성 인지질 항 체, 3G4계 치료제, 또는 실질적인 세포 비침투성 PE-결합 펩타이드 유도체, 바람직하게는 듀라마이신 유도체가 질병 부위에 실질적으로 한정된 항암 또는 항-바이러스 효과를 달성하고 실질적으로 동물 또는 대상체의 정상인 건강한 조직에서의 응고, 파괴 및/또는 조직 괴사를 유발하지 않음을 의미한다. 따라서, 건강한 세포 및 조직 의 구조 및 작용은 본 발명의 실시에 의해 실질적으로 손상되지 않고 유지된다. 도면의 간단한 설명 하기 도면들은 본 명세서의 일부를 구성하며 본 발명의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명 은 본원에 나타낸 특정 양태의 상세한 설명과 함께 하나 이상의 이들 도면을 참조하여 더욱 잘 이해될 수 있다. 본 특허의 미국 파일은 칼라로 제작된 하나 이상의 도면을 포함한다. 칼라 도면을 갖는 당해 특허의 사본은 미 국 특허 상표청에 요청하고 필요한 비용을 지불하면 제공될 것이다. 도 1은 마우스에서 L540 사람 호지킨 림프종, 3LL 쥐 폐 암종 및 B16 쥐 흑색종 종양의 혈관 내피 세포에 대한 항-PS 항체(3SB)의 국재화를 도시한 것이다. 종양을 지닌 SCID 마우스에게 20μg의 항-PS(3SB) 또는 항-CL(D11) 마우스 IgM을 정맥내 주사하였다. 혈액 순환을 1시간 후 염수로 관류시켰다. 마우스를 1시간 후 참수시키고 종양 및 기관을 수거하여 신속히 동결시켰다. 마우스 IgM을 항-마우스 IgM-퍼옥시다제 접합체를 사용하여 동결 된 단면상에서 검출하였다. 항-PS 항체는 모든 종양에서의 혈관에 대해 특이적으로 국재화하였다(화살표로 표 시). 대조군인, 항-CO IgM을 주사한 마우스에서는 국재화가 관측되지 않았다. 도 2A 및 도 2B는 플라스틱에 흡착된 인지질에 대한 9D2 항체 및 아넥신 V의 결합을 도시한다. 인지질은 미세 역가 플레이트의 플라스틱에 흡착되었다. 10% 혈청으로 차단시킨 후, 9D2 항체(도 2A) 또는 아넥신 V(도 2B)를 10% 혈청의 존재하에서 6.66nM 내지 0.005nM 범위의 농도로 가하였다. 플레이트를 세척하고 결합된 9D2 항체 및 아넥신 V를 염소 항-랫트 IgM-HRP 및 래빗 항-아넥신 V IgG에 이어 항-래빗-HRP를 각각 사용하여 검출하였다. 도 3은 경쟁하는 인지질 리포좀과 함께 H 2 O 2 -처리된 내피 세포상에서 음이온성 인지질에 대한 9D2 항체 및 아넥 신 V의 결합을 억제하는 것을 도시한 것이다. 9D2 항체 및 아넥신 V(6.66nM)를 10% 혈청을 함유하는 각종의 인 지질 리포좀(200μg/ml) DPBS 완충액과 함께 예비 항온처리한다. 결합된 9D2 항체 및 아넥신 V를 염소 항-랫트 - 25 -