(51) Int. Cl. C07H 21/04 (2006.01) (19)대한민국특허청(KR) (12) 등록특허공보(B1) (45) 공고일자 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2006년03월10일 10-0558851 2006년03월02일 (21) 출원번호 10-2004-0001161 (65) 공개번호 10-2005-0072992 (22) 출원일자 2004년01월08일 (43) 공개일자 2005년07월13일 (73) 특허권자 학교법인연세대학교 서울 서대문구 신촌동 134번지 (72) 발명자 김수기 강원도원주시명륜2동구곡동보렉스아파트903-103 박승규 경기도수원시장안구율전동백설주공아파트573-604 박수정 강원도원주시단구동세경5차아파트504-409 조현철 강원도원주시우산동102-16 (74) 대리인 백남훈 이학수 심사관 : 김기연 (54) 면역조절능력이 증가된 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드변형체 요약 본 발명은 면역조절능력이 증가된 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 변형체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 면역조절능 력을 갖는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(Oligodeoxynucleotide, ODN)의 3' 말단에 데옥시리보티민(dT) 연속서열을 결합시킴으로써 비장세포, 대식세포, 말초혈액 단핵세포 등의 면역활성을 향상시켜 B형간염 등의 질병에 대한 예방 및 치 료용 백신 보조제로서 유용하게 사용될 수 있는 CpG ODN 변형체 및 이의 용도에 관한 것이다. 대표도 도 1 색인어 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(Oligodeoxynucleotide, ODN), 데옥시리보티민(dT), 백신 보조제 - 1 -
명세서 도면의 간단한 설명 도 1은 본 발명에 따른 CpG ODN이 Balb/c 마우스 대식세포(A)와 비장세포(B)의 증식을 유도하는지 in vitro에서 확인한 것이다. 도 2a는 본 발명에 따른 CpG ODN이 Balb/c 마우스 복강 대식세포의 Th1형 사이토카인 mrna 발현을 유도하는지 in vitro에서 확인한 것이고, 도 2b는 본 발명에 따른 CpG ODN이 Balb/c 마우스 복강 대식세포의 Th1형 사이토카인 mrna 발현을 유도하는지 in vivo에서 확인한 것이다[M: 마커; 1 : CpG ODN 비처리군; 2 : 0.6 μg/ml KSK-1 처리; 3 : 0.6 μg/ml KSK-2 처리; 4 : 0.6 μg/ml KSK-7 처리; 5 : 0.6 μg/ml KSK-12 처리; 6 : 0.6 μg/ml KSK-13 처리; 7 : 0.1 μg/ml LPS 처리]. 도 3a는 본 발명에 따른 CpG ODN이 Balb/c 마우스 비장세포의 Th1형 사이토카인 mrna 발현을 유도하는지 in vitro에 서 확인한 것이고, 도 3b는 본 발명에 따른 CpG ODN이 마우스 비장세포의 Th1형 사이토카인 mrna 발현을 유도하는지 in vivo에서 확인 한 것이다[M: 마커; 1 : 0.6 μg/ml CpG ODN 비처리군; 2 : 0.6 μg/ml KSK-1 처리; 3 : 0.6 μg/ml KSK-2 처리; 4 : 0.6 μg/ ml KSK-7 처리; 5 : 0.6 μg/ml KSK-12 처리; 6 : 0.6 μg/ml KSK-13 처리; 7 : 0.1 μg/ml LPS 처리]. 도 4a는 본 발명에 따른 CpG ODN이 마우스 복강 대식세포의 신호전달분자인 B7.2 분자 발현을 유도하는지 확인한 것이 고, 도 4b는 본 발명에 따른 CpG ODN이 마우스 복강 대식세포의 신호전달분자인 1형주조직적합체 발현을 유도하는지 확인 한 것이다. 도 5a는 본 발명에 따른 CpG ODN이 마우스 비장세포의 신호전달분자인 B7.2 분자 발현을 유도하는지 확인한 것이고, 도 5b는 본 발명에 따른 CpG ODN이 마우스 비장세포의 신호전달분자인 1형주조직적합체 발현을 유도하는지 확인한 것 이다. 도 6a는 본 발명에 따른 CpG ODN을 마우스의 비장세포에 처리함으로써 그 속에 포함되어 있는 자연살해세포의 세포독성 이 증진되어 자연살해세포에 민감한 YAC-1 세포를 용해시키는 정도를 나타낸 것이고, 도 6b는 본 발명에 따른 CpG ODN을 인간 말초혈액 단핵세포에 처리함으로써 그 속에 포함되어 있는 자연살해세포의 세 포독성이 증진되어 자연살해세포에 민감한 K562 세포를 용해시키는 정도를 나타낸 것이다. 발명의 상세한 설명 발명의 목적 발명이 속하는 기술 및 그 분야의 종래기술 본 발명은 면역조절능력이 증가된 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 변형체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 면역조절능 력을 갖는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(Oligodeoxynucleotide, ODN)의 3' 말단에 데옥시리보티민(dT) 연속서열을 결합시킴으로써 비장세포, 대식세포, 말초혈액 단핵세포 등의 면역활성을 향상시켜 B형 감염 등의 질병에 대한 예방 및 치 료용 백신 보조제로서 유용하게 사용될 수 있는 CpG ODN 변형체 및 이의 용도에 관한 것이다. 척추동물은 자신의 DNA 서열에서 CpG 디뉴클레오티드의 발현을 억제하거나 발현된 CpG 디뉴클레오티드의 사이토신을 메틸화하였다[Krieg, Ann. Rev. Immunol., 2002, 20, 709; McClelland & Ivarie, Nucleic Acids Res. 1982, 23, 78]. 반면, 미생물의 DNA에서는 CpG 디뉴클레오티드는 정상적인 비율로 발현되고 메틸화되어 있지 않기 때문에 척추동물에 서는 이 차이를 이용하여 미생물의 감염을 인지할 수 있다. - 2 -
이러한 미생물의 DNA는 형태 인식 수용체(pattern recognition receptor) 중 하나인 톨양수용체(toll-like receptor 9, TLR9)를 경유하여 이를 발현하는 수지상세포나 B 세포에서 인식을 하게 되고 궁극적으로 숙주의 고유면역체계(innate immune system)를 활성화시킨다. 고유면역체계는 미생물이나 기생충 등의 감염에 대한 중요한 방어기작을 갖고 있을 뿐 만 아니라 암세포를 제거할 수 있는 기작도 갖추고 있기 때문에, CpG ODN을 적절하게 디자인함으로써 면역계의 항암성 을 유발할 수 있는 항암성 면역보조제를 개발할 수 있다. CpG ODN을 이용한 면역체계의 활성화에 관한 연구는 최근 수년간 집중적으로 이루어졌다. CpG ODN은 CpG 디뉴클레오 티드를 중심으로 5' 말단과 3' 말단에 최소한 4 개 이상의 염기 서열을 갖는데, 이 염기 서열에 따라 CpG ODN의 면역 활성 의 특징이 결정되어진다. 이를 크게 K형 ODN과 D형 ODN으로 구분하는데, K형 ODN은 단핵구와 B 세포를 자극하여 증 식하게 하거나 면역글로불린 M 또는 IL-6를 분비하게 한다[Klinman 등, Microbes Infect., 2002, 897-901]. D형 ODN 은 단핵구를 활성화하여 성숙한 수지상세포로 분화하게 하거나 자연살해세포를 자극하여 IL-6를 분비하게 한다[Klinman 등, Eur. J. Immunol., 2002, 32, 2617-22; Gursel 등, J. Leukoc. Biol., 71, 813-20, 2002]. 또한, D형 ODN은 B220 + 수지상세포가 IFN-α를 생산하게 하고 TLR9 + B220 + 수지상세포가 IL-12를 생산하도록 한다. 이러한 결과를 보았을 때 CpG ODN이 면역세포를 자극하여 면역증진효과를 나타내는 과정에는 여러 경로가 존재하는 것으로 판단되고 있다 [Hemmi 등, J Immunol., 2003, 170, 3059-3064; Kerkman 등, J Immunol., 2003, 170, 4465-4474]. 많은 연구팀에서 다양한 형태의 CpG ODN을 디자인하여 면역 활성 능력을 시험하였다. 이는 주로 감염에 대한 면역 활성 능력의 활성화 정도와 항암 면역 활성화 정도에 관한 것이다. CpG ODN을 이용한 항암 면역에 관한 연구는 세포성 면역과 체액성 면역으로 구분할 수 있으며 세포성 면역은 다음의 두 가지 방법으로 수행되고 있다. 첫째는 수지상세포의 활성화를 경유하는 면역증진법이다. 암세포는 숙주의 면역 감시 체계를 회피하기 위해 항원제시 (antigen presentation) 능력을 낮춘다. 그러면 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)는 이를 인지하지 못하여 암세포를 제 거하지 못한다. 이를 극복하기 위해 암 항원의 면역원성이 강한 부분의 펩티드(peptide)를 숙주에 면역시키는데 이때 CpG ODN을 면역보조제로 함께 사용하는 방법이다. 이 방법을 사용함으로써 항원제시능력이 뛰어난 수지상세포는 암 항원의 펩티드를 받아들이고 CpG ODN에 의해 활성화됨으로써 세포독성 T 세포를 활성화시킬 수 있다. 활성화된 세포독성 T 세 포는 효율적으로 암세포를 제거할 수 있다. 이 방법으로 생쥐에서 RMA[Stern 등, J. Immunol., 2002, 168, 6099-6105] 를 제거하는 결과를 얻을 수 있었다. 이러한 면역반응에는 IFN-γ 등이 중요하게 작용하였다. 수지상세포의 활성화를 경유 하는 경우는 아니지만 ODN 2006이 B 세포에 직접 작용하여 B 세포의 항원 제시 기능과 T 세포와 상호작용을 할 수 있는 보조자극인자의 발현을 증진시킴으로써 수지상세포의 작용과 같은 원리로 항암 면역을 활성화시킬 수도 있다 [Jahrsdorfer 등, J. Leukoc. Biol., 2001, 69, 81-88]. 둘째는 자연살해세포의 활성화를 경유하는 면역증진법이다. 암 항원을 외부에서 주입함으로써 수지상세포가 활성화되어 세포독성 T 세포를 활성화시킬 수 있지만 세포독성 T 세포가 세포독성을 나타내기 위해서는 암세포의 표면에 1형주조직 적합체(MHC class I molecule) 상에 암 항원이 제시됨을 필수로 한다. 그러나, 많은 경우 암세포 표면에 암 항원 제시의 수준이 세포독성 T 세포가 세포독성을 나타내기에 충분하지 못하기 때문에 수지상 세포의 활성화를 통한 암세포 제거 방 법은 효율적이지 못한 경우가 있다. 이 경우 세포 표면의 암 항원 제시와 무관하게 세포독성을 나타낼 수 있는 자연살해세 포의 활성화는 이의 한계를 극복할 수 있는 방법이 된다. 또한, 활성화된 자연살해세포는 단핵구 또는 대식세포를 활성화 시켜 항원비의존성 항암 면역 체계를 활성화시킨다. 이 방법으로 생쥐에서 ODN 1584는 B16.F1 흑색종을, ODN 1826은 EL4 임파종을 경감시켰다[Ballas 등, J. Immunol., 2001, 167, 4878-4886]. 또한, 생쥐에 C26 대장암을 유발하고 ODN 1826을 암 부위에 직접 주사하였을 때 암 조직을 경감시켰는데, 이 경우는 자연살해세포의 작용과 더불어 다른 면역작용 도 필요한 경우이다[Heckelsmiller 등, J Immunol., 2002, 169, 3892-3899]. 생쥐에서 유발된 38C13 B 세포 임파종은 CpG ODN 단독으로 처리했을 때 유발되는 면역반응으로 제거할 수 없지만 38C13 임파종 세포의 특이항원에 대한 단클론 항체를 같이 처리할 경우 자연살해세포가 항체의존성 세포독성(antibody-dependent cell cytotoxicity)을 발휘하여 38C13 임파종을 제거할 수 있다[Woodridge 등, Blood, 1997, 89, 2994-2998]. 체액성 면역은 항원 또는 이에 상응하는 물질과 함께 CpG ODN을 면역증진제로 사용함으로써 유도할 수 있다. Trastuzumab과 rituximab은 각각 HER-2 단백질을 과발현하는 암세포와 비호킨스 B 세포 임파종에 대해 효과를 나타내 는 상품화된 단일클론항체인데, 최근 CpG ODN과 조합하였을 때 항암성 면역반응을 증진시키는지 임상연구에 들어갔으 며 이 결과는 수 년 후에 보고될 수 있을 것으로 예상된다[Jahrsdorfer 등, Sem. Oncol., 2003, 30, 476-482]. CpG ODN은 CpG 디뉴클레오티드를 포함한 5' 말단과 3' 말단의 염기 서열에 의해 그 면역활성능력을 나타내지만 CpG ODN 자체는 생체에 존재하는 DNA 분자와 구조상 차이가 없는 천연구조이기 때문에 세포독성을 나타내지 않는 장점이 있 - 3 -
다. 그러나, 천연구조라는 점 때문에 생체 내에서 쉽게 분해되어 면역 활성 능력의 반감기가 짧은 단점을 갖고 있다. 이를 극복하기 위해 일회 투여량을 늘리는 방법이 있지만 경제적으로 적당한 방법이 아니다. 따라서, CpG ODN을 합성할 때 DNA 분자의 골격인 포스포디에스터 결합을 포스포로티오에이트 결합으로 변형할 경우 CpG ODN의 면역 활성 효과가 10 100 배 증가한다[Sester 등, J. Immunol., 2000, 165, 4165-4173]. 그러나, 이 방법은 천연구조가 아님으로 인하여 나타나는 세포독성, 골격 변형에 의해 본래의 CpG ODN의 면역 활성 능력의 변화와 면역세포의 수용 속도의 변화를 유발 할 수 있기 때문에, 모든 CpG ODN에 적용할 수 있는 방법인지는 아직 확인되지 않은 상태이다. CpG ODN은 종 특이성이 있기 때문에 실험동물을 이용한 연구에서 좋은 면역 활성 효과가 있는 CpG ODN이 인간에게 대 등한 효과를 나타내는 경우는 아직 보고가 없다. 또한, CpG ODN의 작용기작은 아직 알려져 있지 않기 때문에 면역 활성 능력이 뛰어난 CpG ODN의 개발에 많은 어려움이 있다. 이에 따라 아직 임상 실험 단계에까지 이른 CpG ODN은 아직 없 으며 기존의 CpG ODN보다 면역자극능력이 우수하던지 상대적으로 부작용이 없는 CpG ODN의 개발이 필요하다. 발명이 이루고자 하는 기술적 과제 이에, 본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 연구한 결과, 면역조절능력을 갖는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (Oligodeoxynucleotide, ODN)의 3' 말단에 데옥시리보티민(dT) 연속서열을 결합시킴으로써 비장세포, 대식세포, 말초혈 액 단핵세포 등의 면역활성을 향상시켜 B형 감염 등의 질병에 대한 예방 및 치료 백신 보조제로서 유용하게 사용될 수 있 는 CpG ODN 변형체를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서, 본 발명은 면역조절능력을 갖는 CpG ODN 변형체를 제공하는데 그 목적이 있다. 또한, 본 발명은 상기 CpG ODN 변형체를 유효성분으로 함유하는 백신 보조제를 제공하는데 또 다른 목적이 있다. 발명의 구성 및 작용 본 발명은 면역활성을 나타내며, CpG 모티프를 갖는 포스포다이에스터 올리고데옥시뉴클레오티드 (Oligodeoxynucleotide, ODN)에 있어서, ODN의 3' 말단에 데옥시리보티민(dT) 연속서열이 결합된 ODN 변형체를 그 특 징으로 한다. 또한, 본 발명은 상기 dt 연속서열이 결합된 CpG ODN을 백신 보조제로 사용하는 용도를 제공한다. 이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다. 본 발명은 면역조절능력을 갖는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드의 3'말단에 데옥시리보티민(dT) 연속서열을 결합시킴으 로써 비장세포, 대식세포, 말초혈액 단핵세포 등의 면역활성을 향상시켜 B형 간염 등의 질병에 대한 예방 및 치료 백신 보 조제로서 유용하게 사용될 수 있는 CpG ODN 변형체 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 명세서에서 'ODN'이라 함은 면역반응을 활성화할 수 있는 11 26 뉴클레오티드 길이의 올리고데옥시뉴클레오티드를 의미하며, 특히 'CpG ODN'은 면역조절능력을 나타내는 CpG 모티프(5' purine purine CpG pyrimidine pyrimidine 3')를 갖는 올리고데옥시뉴클레오티드를 말한다. 'dt 연속서열'이란 데옥시리보치민이 최소한 4개 이상 연속적으로 포스포디에 스터 결합으로 CpG ODN에 연결된 형태를 지칭한다. 본 발명에서 사용한 CpG ODN은 메타바이온사(독일)에 의뢰하여 합성하였는데, 염기간의 모든 포스포디에스터 결합은 포 스포로티오에이트 결합으로 대치하였다. 고성능액체크로마토그래피와 NAP 정제 과정을 거쳐서 순도를 최대로 유지한 후 동결건조된 상태로 공급받았다. 본 발명에서 사용한 CpG ODN의 염기 서열은 다음 표 1과 같다. [표 1] 명칭 서열번호 (코드명) 염기서열 (5'to 3') 1982 1 (KSK-1) TCCAGGACTTCTCTCAGGTT 1826 2 (KSK-2) TCCATGACGTTCCTGACGTT 2006fG6run 3 (KSK-7) TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGGGGG 2006 4 (KSK-12) TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT - 4 -
2006f 5 (KSK-13) TCGTCGTTTTCGTCGTCGTTTT ODN의 골격이 천연의 포스포디에스터 결합을 할 경우 생체 내의 핵산분해효소의 공격을 받아 쉽게 분해될 수 있다. 항암 면역 활성 능력이 있는 CpG ODN이 생체 내에서 적절한 면역학적 효과를 나타내기 위해서는 그 투여량을 늘리든지 핵산 분해효소의 공격을 피할 수 있는 구조를 갖고 있어야 한다. 본 발명에서 제공된 CpG ODN은 골격 구조를 포스포로티오에 이트 결합을 함으로써 핵산분해효소의 공격을 피하고 생체 내에서의 반감기를 연장하였다. 그러나, 포스포로티오에이트 결합 자체에 의한 비특이적 면역반응의 유발로 인해 안전성에 많은 문제점을 갖고 있다. 이에 대해 본 발명자들이 포스포 로티오에이트 결합을 갖는 50 μg의 ODN을 알루미늄 히드록시드로 처리하여 CHO 세포에서 유래한 gde2t와 함께 쥐에 주사해본 결과, 주사 부위에서 육종(granuloma) 및 괴상증 등의 이상 소견이 발견되지 않아 안정성을 확인할 수 있었다. 본 발명에서 제공하는 CpG ODN은 단핵구를 활성화하여 사이토카인을 분비하고 궁극적으로 항암 면역을 활성화시킨다. 이 항암 활성 능력은 U-937, RAW264.7, THP-1 등의 임파종 세포주를 이용하여 일차적으로 검색하여 선택된 항암 면역 활성화 CpG ODN 후보 중의 하나였다. 세포주는 실질적으로 본 발명이 제공하고자 하는 CpG ODN이 목표로 하는 일차 세 포(primary cell)와 다른 면역 반응을 나타낼 수 있으므로, 이를 확인하기 위해 다시 마우스 비장세포와 마우스 복강 대식 세포를 얼마나 활성화시키는지 확인하였다. 그 결과, TNF-α, IL-6, IL-12 및 IFN-γ mrna 발현이 다른 CpG ODN에 비 해 가장 많이 증가하고 대식세포 표면의 II형 주조직적합체(MHC class II)와 B7.2 단백질의 발현이 증가하는 양상을 나타 내었다. 이에 따라 최종적으로 마우스의 비장세포와 사람의 말초혈액 단핵구(peripheral blood mononuclear cell)에 포함 되어 있는 자연살해세포의 활성을 보았을 때 항암 면역 활성화 능력이 우수함을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 의해 제조된 CpG ODN은 백신 보조제로 유용하게 사용될 수 있으며, 특히 B형 간염 등의 질병들에 대한 예방 및 치료 백신의 보조제로 이용될 수 있다. 이때 면역반응을 유도하고자 하는 항원과 상기 ODN은 kg당 50 5,000 μg의 양으로 2 4주 간격으로 2 3번 투입되는 것이 바람직하다. 또한, 항원에 대한 ODN의 비율은 5:1 4:1인 것이 바람직하다. 항원들은 인체에 사용될 수 있는 백신 보조제인 알루미늄 하이드록사이드와 함께 혹은 단독으로 면역할 수 있 고 근육주사 또는 피하주사의 방법으로 투여될 수 있다. 이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 실시예 1: dt 연속서열이 3'말단에 결합된 CpG ODN의 제조 본 발명에서 사용한 CpG ODN은 메타바이온사(독일)에 의뢰하여 합성하였는데, 염기간의 모든 포스포디에스터 결합은 포 스포로티오에이트 결합으로 대치하였다. 고성능액체크로마토그래피와 NAP 정제 과정을 거쳐서 순도를 최대로 유지한 후 동결건조된 상태로 공급받았다. 본 발명에서 사용한 CpG ODN의 염기 서열은 상기 표 1과 같다. 실시예 2: 마우스 비장세포와 대식세포의 증식에 CpG ODN이 미치는 영향 본 실험은 세포주를 이용한 면역 활성화 실험을 통해 항암 면역 활성화 능력이 있을 것으로 기대되는 CpG ODN들과 이미 면역 활성 능력이 보고되어 있는 CpG ODN들을 각각 마우스의 비장 세포와 복강 대식세포에 처리하였을 때 이들 세포의 증식을 유도하는지 확인하기 위해 다음과 같이 실험하였다. Balb/c 마우스의 복강에 1.5 ml의 3% 티오글리콜레이트(thiocholate) 주사하였다. 3일 후 마우스 복강을 2% 우태아혈청 이 포함된 인산염완충액으로 세척하여 모았다. HBSS 완충액으로 2번 세척한 다음 10%의 우태아혈청이 포함된 DMEM 배 지에 마우스 복강 대식세포를 준비하였다. Balb/c 마우스에서 비장을 적출하여 단세포 단위로 해체한 다음 2,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 버리고 침전물에 0.84% 암모늄클로라이드를 가하여 적혈구를 용해시킨 후, RPMI 1640으로 두 번 세척하여 비장세포를 준비하 였다. - 5 -
준비된 비장세포와 대식세포에서 5 10 4 개의 세포를 취하여 KSK-1, KSK-2, KSK-7, KSK-12 및 KSK-13을 각각 0.6 μg/ml씩 그리고 LPS를 0.1 μg/ml씩 24, 48, 72 시간동안 처리한 후, 이를 다시 [ 3 H]티미딘이 존재하는 RPMI 1640 배지에 6 시간동안 배양하였다. 활성화된 비장세포는 증식을 하면서 [ 3 H]티미딘을 배지에서 취하게 된다. 배지를 버리고 비장세 포를 [ 3 H]티미딘이 없는 배지로 세척한 후 방사능측정기를 하용하여 비장세포가 취한 [ 3 H]티미딘의 양을 측정하였다. 도 1의 (A)에서는 대식세포의 증식을 유도하기 위해 CpG ODN을 72 시간동안 처리해야 했다. 이 중 KSK-13은 마우스의 면역 활성을 가장 잘 유도하는 것으로 알려져 있는 KSK-2를 포함한 다른 CpG ODN들에 비해 높은 증식 유도 능력을 나타 냈으며, 대조군(비처리군)이나 비 CpG ODN인 KSK-1에 비해 통계적으로 유의한 증식 유도 능력을 나타내었다. 또한, 도 1의 (B)에서와 같이, 마우스 비장세포에 대한 증식 유도 효과는 대식세포에 대한 다른 CpG ODN의 효과에 비해 눈에 띄는 결과였다. 비장세포의 증식을 유도하기 위해서는 CpG ODN을 48 시간동안 처리해야 했다. 72 시간 CpG ODN 을 처리했을 때는 증식의 정도가 감소되었다. KSK-13의 비장세포 증식 유도 능력은 마우스에 효과적인 KSK-2와 비교했 을 때 평균값은 약간 낮았지만 통계적으로는 차이가 유의하지는 않았다. 실시예 3: 마우스 복강 대식세포의 Th1형 사이토카인 mrna 발현에 CpG ODN이 미치는 효과 본 실험은 마우스 복강 대식세포의 증식을 유도하는 것으로 확인한 KSK-13이 이들 세포에서 항암 면역과 관련하는 사이 토카인의 분비를 얼마나 유도하는지 알아보기 위해 다음과 같은 실험을 하였다. 마우스의 복강 대식세포는 상기 실시예 2와 같은 방법으로 준비하였다. 1 10 6 개의 대식세포를 0.6 μg/ml CpG ODN으로 12시간 동안 처리하였다. 처리된 세포로부터 TRIzol 시약(Life Technology사, 미국)을 사용하여 total RNA를 분리하고 흡광도를 측정하여 total RNA의 농도를 결정하였다. 이 중 1 μg을 원본 RNA(template RNA)로 하고 MMLV 역전사효소 (Promega사, 미국)를 사용하여 cdna를 합성하였다. 합성된 cdna를 원본 DNA로 하여 다음 표 2의 PCR 조건에 따라 TNF-α, IL-6, IL-12 그리고 IFN-γ PCR을 수행하였다. [표 2] TNF-α IL-6 IL-12 IFN-γ 조건 95 5분 1 cycle 95 5분 1 cycle 95 5분 1 cycle 95 5분 1 cycle 95 50초 53 50초 72 90초 30 cycle 95 50초 55 60초 72 90초 35 cycle 95 60초 65 60초 68 120초 30 cycle 95 50초 60 50초 72 90초 33 cycle 72 8분 1 cycle 72 8분 1 cycle 68 8분 1 cycle 72 8분 1 cycle PCR 산물을 1% 아가로스 젤 전기영동을 수행하여 각 조건의 반응에서 각각의 사이토카인 mrna의 발현을 비교하였다. 일정발현 단백질(constitutively expressed protein)인 베타-액틴 PCR을 수행했을 때 모든 경우에 있어서 일정한 양의 PCR 산물들이 증폭됨을 확인하고 본 실시예에서 나타나는 각 사이토카인 PCR 산물의 진하기 차이는 cdna 준비 과정에 서 일어나는 차이가 아님을 확인하였다. in vitro에서, 마우스의 면역 세포를 잘 활성화시키는 KSK-2와 함께 KSK-13은 TNF-α, IL-6, IL-12 mrna의 발현을 증 가시켰다[도 2a]. 이런 차이는 in vivo에서 더욱 차이가 나는데, 이는 KSK-13이 생체 조건에서 더욱 그 효과를 발휘한다 는 증거가 된다[도 2b]. 실시예 4: 마우스 비장세포의 Th1형 사이토카인 mrna 발현에 CpG ODN이 미치는 효과 본 실험은 마우스 비장세포의 증식을 유도하는 것으로 확인한 KSK-13이 이들 세포에서 항암 면역과 관련하는 사이토카 인의 분비를 얼마나 유도하는지 알아보기 위해 다음과 같은 실험을 하였다. - 6 -
마우스의 비장세포는 상기 실시예 2와 같은 방법으로 준비하였다. 1 10 6 개의 비장세포를 0.6 μg/ml CpG ODN으로 12 시간 동안 처리하였다. 처리된 세포로부터 TRIzol 시약(Life Technology사, 미국)을 사용하여 total RNA를 분리하고 흡 광도를 측정하여 total RNA의 농도를 결정하였다. 이 중 1 μg을 원본 RNA(template RNA)로 하고 MMLV 역전사효소 (Promega사, 미국)를 사용하여 cdna를 합성하였다. 합성된 cdna를 원본 DNA로 하여 상기 표 2의 PCR 조건에 따라 TNF-α, IL-6, IL-12 그리고 IFN-γ PCR을 수행하였다. PCR 산물을 1% 아가로스 젤 전기영동을 수행하여 각 조건의 반 응에서 각각의 사이토카인 mrna의 발현을 비교하였다. 일정발현 단백질(constitutively expressed protein)인 베타-액틴 PCR을 수행했을 때 모든 경우에 있어서 일정한 양의 PCR 산물들이 증폭됨을 확인하고 본 실시예에서 나타나는 각 사이토카인 PCR 산물의 진하기 차이는 cdna 준비 과정에 서 일어나는 차이가 아님을 확인하였다. in vitro에서, 마우스의 면역 세포를 잘 활성화시키는 KSK-2와 함께 KSK-13은 TNF-α, IL-6, IL-12 mrna의 발현을 증 가시켰다[도 3a]. 이런 차이는 in vivo에서 더욱 차이가 나는데, 이는 KSK-13이 생체 조건에서 더욱 그 효과를 발휘한다 는 증거가 된다[도 3b]. 실시예 5: 마우스 복강 대식세포의 신호전달분자의 발현에 미치는 CpG ODN의 효과 본 실험은 시험관 수준에서 마우스 복강 대식세포를 활성화시키는 것으로 확인한 KSK-13이 생체 수준에서 복강 대식세 포를 활성화시키는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 하였다. CpG ODN을 3% 티오글리콜레이트와 함께 Balb/c 마우스의 복강에 주사하였다. 48 시간 후, 상기 실시예 2에서와 같은 방 법으로 복강 대식세포를 분리하였다. 세포를 FITC가 표지된 항 B7.2 단클론항체 혹은 항 MHC 글래스 II 단클론항체로 표 지하고 세포분석기로 분석하였다. 도 4에서 대조군은 비처리군을 뜻하며 KSK-1, KSK-2, KSK-7, KSK-12, KSK-13 각 각 0.6 μg/ml을 처리했음을 뜻하며 LPS는 0.1 μg/ml LPS를 처리했음을 뜻한다. B7.2 분자는 대식세포가 활성화될 때 발현량이 증가하는 보조자극분자이다. 비처리군의 경우 복강 대식세포의 B7.2 분자 의 발현은 기준 범위 내에서 2.9%를 나타내었으나, 본 발명에서 제시하는 KSK-13은 14.2%를 나타내었다. 이 수치는 전 형적인 마우스 CpG ODN인 KSK-2의 16.3%나, 인간 CpG ODN인 KSK-12의 17.3%와 근접한 활성화 비율이며 비 CpG ODN인 KSK-1의 5.1%와는 확실히 차이가 나는 수치이다[도 4a]. II형 MHC 분자는 대식세포가 항원제시를 할 때 핵심적인 역할을 하는 분자이며 B7.2 분자와 더불어 대식세포가 활성화되 면 발현량이 증가하였다. 비처리군의 경우 복강 대식세포의 II형 MHC 분자의 발현은 기준 범위 내에서 26.5%를 나타내었 으나, 본 발명에서 제시하는 KSK-13은 33.7%를 나타내었다. 이 수치는 전형적인 마우스 CpG ODN인 KSK-2의 35.8% 와 인간 CpG ODN인 KSK-12의 30.2%와 유사한 활성화 비율이며 비 CpG ODN인 KSK-1의 25.0%와는 확실히 차이가 나는 수치이다[도 4b]. 이 실험 결과를 보았을 때 KSK-13은 마우스 생체 수준에서 복강 대식세포를 활성화함을 확인할 수 있었다. II형 MHC 분 자와 B7.2 분자의 발현 증가는 복강 대식세포가 항원제시 능력을 활성화시켰다는 것을 뜻하기 때문에 KSK-13의 면역증 강제로서의 효력을 입증하는 결과이다. 실시예 6: 마우스 비장세포의 신호전달분자의 발현에 미치는 CpG ODN의 효과 본 실험은 시험관 수준에서 마우스 비장세포를 활성화시키는 것으로 확인한 KSK-13이 생체 수준에서 비장세포를 활성화 시키는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 하였다. CpG ODN을 Balb/c 마우스의 복강에 주사하였다. 48 시간 후, 상기 실시예 2와 같은 방법으로 비장세포를 분리하였다. 세 포를 FITC가 표지된 항 B7.2 단클론항체 혹은 항 MHC class II 단클론항체로 표지하고 세포분석기로 분석하였다. 비처리군의 경우 비장세포의 B7.2 분자의 발현은 기준 범위 내에서 2.8%를 나타내었으나, 본 발명에서 제시하는 KSK-13 은 8.6%를 나타내었다. 이 수치는 전형적인 마우스 CpG ODN인 KSK-2의 12.13%보다는 낮은 수치이지만 인간 CpG ODN인 KSK-12의 6.85%보다는 높은 수치였으며 비 CpG ODN인 KSK-1의 3.31%와는 확실히 차이가 나는 수치이다[도 5a]. - 7 -
또한, 비처리군의 경우 비장세포의 II형 MHC 분자의 발현은 기준 범위 내에서 15.5%를 나타내었으나, 본 발명에서 제시 하는 KSK-13은 22.8%를 나타내었다. 이 수치는 전형적인 마우스 CpG ODN인 KSK-2의 23.6%와 비슷하고 인간 CpG ODN인 KSK-12의 18.6%보다는 높은 활성화 비율이며 비 CpG ODN인 KSK-1의 17.5%와는 확실히 차이가 나는 수치이 다[도 5b]. 이 실험 결과를 보았을 때 KSK-13은 마우스 생체 수준에서 비장세포를 활성화함을 확인할 수 있었다. II형 MHC 분자와 B7.2 분자의 발현 증가는 비장세포 중의 B 세포 등의 항원제시 능력을 활성화시켰다는 것을 뜻하기 때문에 KSK-13의 면 역증강제로서의 효력을 입증하는 결과이다. 실시예 7: 마우스에 B형간염 표면항원을 면역시킬 때 CpG ODN의 효과 본 실험은 마우스 비장세포와 복강 대식세포를 활성화시키는 것으로 확인한 KSK-13이 마우스에 B형간염 표면항원을 면 역시킬 때 백신 보조제로서의 효능을 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 하였다. 열세개의 실험군을 구성하고 각 실험군당 7 마리의 Balb/c 마우스를 할당하였다. 각 실험군의 마우스는 2.5 μg의 B형간염 표면항원과 다음 표 2에 열거한 백신 보조제를 섞어 하복부에 피하주사하였다. 일주일 간격으로 두 번, 같은 방법으로 주 사하고 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액을 사용하여 간접면역효소발색법으로 항B형간염 표면항원 항체의 역가를 측정하 여 다음 표 3에 나타내었다. [표 3] 실험군 보조제 Anti-HbsAgAb(IgG) 1 No antigen 0 2 No adjuvant 200 3 Alum 200 4 KSK-1 800 5 KSK-2 12,800 6 KSK-7 800 7 KSK-12 12,800 8 KSK-13 12,800 9 KSK-2 + alum 3,200 10 KSK-12 + alum 12,800 11 KSK-13 + alum 51,200 12 CFA* 12,800 13 CFA + alum 3,200 B형 간염 표면항원만 단독으로 면역했을 경우 역가가 800이었지만 KSK-1, KSK-12 그리고 KSK-13을 백신 보조제로 사 용하였을 때는 12,800으로 16배 증가하였다. 현재 임상에서 사용하고 있는 알룸(alum)과 함께 사용하였을 때는 KSK-13 의 효과는 KSK-12 보다 4배 높았고 KSK-2 보다 64배 높았다. KSK-13의 백신 보조제 효과는 CFA(Complete Freund's Adjuvant)를 사용한 경우와 같은 역가를 나타내었다. 이 결과를 보았을 때, KSK-13은 백신 보조제로서 효과적임을 알 수 있었다. 실시예 8: 마우스 비장세포의 항암 능력에 미치는 CpG ODN의 효과 본 실험은 마우스 비장세포와 복강 대식세포를 활성화시키는 것으로 확인된 KSK-13이 비장세포에 포함된 자연살해세포 의 암세포 제거 능력을 활성화시킴을 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 하였다. Balb/c 마우스의 복강에 인산염등장액(대조군) 또는 10 μg의 KSK-2, KSK-12 또는 KSK-13을 주사한지 18 시간 후, 마 우스로부터 비장을 적출하여 비장세포를 준비하였다. 비장세포를 2 시간동안 배양 용기에 배양하여 흡착성 세포가 배양용 - 8 -
기에 흡착하도록 한 후, 흡착하지 않은 세포를 새로운 배양 용기로 옮겼다. 세포를 추가로 1.0 μg/ml의 같은 종류의 CpG ODN으로 2 시간동안 처리한 후, 5 10 3 개의 51 Cr 표지된 YAC-1 세포와 그림에서 보는 비율로 같이 배양하였다. 상층 액을 취하여 감마(gamma) 계수기를 사용하여 용출된 51 Cr의 양을 측정하였다. 도 6a는 마우스의 비장세포에 있는 자연살해세포가 KSK-13을 처리함으로써 세포독성이 증진되어 자연살해세포에 민감 한 YAC-1 세포를 용해시키는 정도를 나타낸 것이다. 비흡착성 비장세포(작용 세포, E)와 YAC-1 세포(목적 세포, T)의 세포수의 비를 100:1, 50:1, 25:1 그리고 12:1로 혼합하여 배양하였다. 대조군의 경우, 목적 세포의 수에 대한 작용 세포의 수를 12 배에서 100 배까지 증가시켰지만 목적 세포의 용해는 유의하게 일어나지 않았다. 반면, KSK-13의 경우 작용 세 포의 수의 비율이 늘어나면서 목적 세포의 용해가 약 3.5%까지 증가하였다. 이 수치는 전형적인 마우스 CpG ODN인 KSK-2 보다는 낮은 수치이지만 인간 CpG ODN인 KSK-12 보다는 높은 수치를 나타낸다. 도 6b는 인간 말초혈액 단핵세포가 KSK-13을 처리함으로써 세포독성이 증진되어 자연살해세포에 민감한 K562 세포를 용해시키는 정도를 나타낸 것이다. 인간 말초혈액 단핵세포는 다음의 방법으로 분리하였다. 건강한 자원자의 혈액을 헤파 린 처리된 시험관에 취하여 1,200 g에서 10분 동안 원심분리한 후 경계층 부분을 새로운 튜브에 회수하였다. 같은 부피 의 분리완충액(0.5% 우혈청알부민과 1 mm EDTA가 포함된 인산완충식염수)으로 희석하였다. 같은 부피의 히스토팩- 1077(Histopaque-1077, Sigma사)을 새로운 튜브에 넣고 그 위에 희석된 혈액을 조심스럽게 얹은 후 1,200 g에서 30 분 동안 원심분리하였다. 경계층의 말초혈액 단핵세포를 취하여 새로운 튜브에 넣고 분리완충액으로 재현탁하여 210 g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버렸다. 이 과정을 세 번 반복했다. 준비된 말초혈액 단핵세포(작용 세포, E)와 K562 세포(목적 세포, T)의 세포수의 비를 50:1, 25:1 그리고 12:1로 혼합하 여 배양하였다. 대조군과 KSK-13의 경우, 25:1의 비율로 혼합하여 배양했을 때 KSK-13을 처리한 말초혈액 단핵세포 안 에 포함되어 있는 자연살해세포의 세포독성은 이미 65%이 이르렀으나, 대조군의 경우는 약 9% 정도밖에 되지 않았다. 혼 합비율을 50:1로 했을 때 25:1의 경우와 큰 차이가 없는 이유는 이미 25:1의 비율에서 충분한 세포독성 유발 효과를 나타 냈기 때문인 것으로 판단된다. 그리고, A와 B의 결과를 보았을 때 KSK-13의 면역활성 효율은 마우스뿐만 아니라 인간에 게 더욱 효과적임을 나타내는 결과이다. 실시예 9: 독성시험 ICR 마우스 6 마리에 본 발명의 KSK-13을 0.5 mg 씩 근육주사(대둔근(Gluteus maximus) 또는 삼각근(Deltoid muscle) ) 방법으로 투여하였다. 한 마리의 마우스에서는 2주 간격으로 2번, 다른 한 마리의 마우스에는 2주 간격으로 2회 투여 후, 1개월의 간격을 둔 다음 다시 2주 간격으로 3회 투여를 실시하였다. 처음 면역화 후 6개월간 질병 유무(clinical sign), 체중, 체온 등 외관(physical examination), 혈액세포의 이상 (haematology), 배설물의 이상(urinalysis)을 관찰하였으나 모두 정상치의 값을 나타냈다. 제조예 1: 백신 제조 주사용수에 B형 간염 표면 항원 1 mg, 본 발명의 dt가 수식된 올리고데옥시뉴클레오티드 10 mg, 알루미늄 하이드록사이 드 1 mg, 치메로살 0.01 w/v%, 완충제로서 인산이수소칼륨과 인산수소나트륨 적량, 염화나트륨 적량, 그리고 산도 조정 을 위해 염산을 적량 가하여 백신을 제조하였다. 발명의 효과 이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 dt 연속서열이 3' 말단에 결합된 변형된 포스포다이에스터 CpG ODN은 높은 Th-1 면역반응 유도활성을 보이며, 생체 내에서 독성을 나타내지 않아 안정성이 뛰어나므로 효과적인 백신 보조제로 사 용될 수 있다. (57) 청구의 범위 청구항 1. - 9 -
CpG 모티프를 갖는 포스포다이에스터 올리고데옥시뉴클레오티드에 있어서, 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 것을 특 징으로 하는 올리고데옥시뉴클레오티드. 청구항 2. 삭제 청구항 3. 제 1 항에 있어서, 상기 올리고데옥시뉴클레오티드는 비장세포, 대식세포 또는 말초혈액 단핵세포의 면역활성을 증진시키 는 것을 특징으로 하는 올리고데옥시뉴클레오티드. 청구항 4. 삭제 청구항 5. 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 올리고데옥시뉴클레오티드를 유효성분으로 하는 백신 보조제. 청구항 6. 제 5 항에 있어서, 다른 항원과 함께 추가적으로 사용되는 것을 특징으로 하는 백신 보조제. 청구항 7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 백신은 B형 간염 예방 또는 치료를 위한 것임을 특징으로 하는 백신 보조제. 청구항 8. 제 1 항에 있어서, 상기 올리고데옥시뉴클레오티드의 포스포다이에스터 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트 결합으 로 치환된 것을 특징으로 하는 올리고데옥시뉴클레오티드. 도면 - 10 -
도면1 도면2a 도면2b - 11 -
도면3a 도면3b 도면4a - 12 -
도면4b 도면5a 도면5b - 13 -
도면6a 도면6b 서열목록 서열목록 전자파일 첨부 - 14 -