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J Plant Biotechnol (2014) 41:100 106 DOI:http://dx.doi.org/10.5010/JPB.2014.41.2.100 ISSN 1598-6365 Research Article 희귀식물제주황기의미세번식 한무석 노설아 곽명철 문흥규 Micropropagation of a rare plant species, Astragalus membranaceus Bunge var. alpinus N. Mu Seok Han Seol Ah Noh Myung Cheol Kwak Heung Kyu Moon Received: 2 June 2014 / Revised: 14 June 2014 / Accepted: 26 June 2014 c Korean Society for Plant Biotechnology Abstract In order to develop an efficient in vitro micropropagation technique for a rare plant species, Astragalus membranaceus Bunge var. alpinus N., shoot proliferation and in vitro or in vivo rootings were conducted and hyperhydrated leaf generated from cultures was histologically observed. During shoot induction, no distinct effect on multiple shoot induction was found between BA and kinetin treatment. BA enhanced the number of internodes, whereas kinetin stimulated shoot elongation. Hyperhydrated leaf composed of bigger cells and retarded palisade parenchyma and showed irregular cell arrangement compared to normal leaf. Especially starch content in hyperhydrated leaf was significantly reduced. The best rooting rate was achieved by B5 medium among three different medium (B5, MS and WPM) and 0.1mg/L IBA treatment induced the highest rooting ratio (80%). No statistical difference was induced by explant types (apical bud or axillary bud) in terms of rooting ratio. In vivo cutting induced rooting rate up to 65% by 0.5% IBA/Talc powder treatment. Although in vivo rooting rate was less efficient compared to in vitro rooting, better survival rate was observed after soil acclimatization. Present study M. S. Han 국립산림품종관리센터 (Korea Forest Seed & Variety Center, Chungju Suanbo 380-941 Korea) S. A. Noh H. K. Moon ( ) 국립산림과학원 (Korea Forest Research Institute, Suwon 441-350 Korea) e-mail: hkmoon@forest.go.kr M. C. Kwak 경기도산림환경연구소 (Gyounggido Forestry Environment Research Center, Osan 447-290 Korea) suggested that above micropropagation techniques can be used for rapid multiplication as well as in vitro or in vivo conservation of the species. Keywords Shoot proliferation, In vitro or in vivo rooting, Hyperhydration, Histological comparison 서론 콩과에속하는제주황기 (Astragalus membranaceus Bunge var. alpinus N) 는다년생초본식물로한라산해발 1,600 m 이상의고산지대에드물게자라는제주특산식물가운데하나이다. 키는 10 ~ 30 cm 정도자라며꽃은 7 월에서 8 월까지황백색으로핀다. 9 월에익는열매는협과 ( 꼬투리로맺히는과실 ) 로잔털이있으며, 긴타원형인꼬투리에보통 2 개의종자가들어있다 (Lee 1993). 우리나라에는황기 (Astragalus membranaceus B.), 제주황기 (A. membranaceus var. alpinus N.) 등 6 종 3 변종이있으며, 황기와제주황기가약용으로쓰인다 (Toh CA 1971). 황기는면역촉진, 간장보호제, 발한억제제, 이뇨제, 신장염, 당뇨병, 백혈병, 암의치료제로전통적인의약품으로사용되어왔으며 (Erison et al. 2010), 여러종이의약용껌 (gum) 의생산과직물산업에사용되었다. 일부종은마초 (forage) 의생산에도이용되었으며, A. cicer 의마초의질은알팔파와비슷한것으로보고되었다 (Towsend 1970). 국내에서도황기는예로부터강장 ( 强壯 ), 익기 ( 益氣 ), 지한 ( 止汗 ), 소종 ( 消腫 ) 등에효능이있어한방에서뿌리를약재로사용하였으며 (Baek NI et al. 1996), 주로중부지역에서재배되고있다. 최근들어삼계탕등보양식의수요가많아지면서 1 년

J Plant Biotechnol (2014) 41:100 106 101 근을수확하기때문에종자의수요가급증하고있으나. 황기는습해에약하여강우가많은해에는대부분고사되기때문에종자채취가매우어렵다. 또한단명종자로채종후 1 년이상이경과하면종자의발아율이현저히감소하는단점도있다 (Kim YG et al. 2001a and references). 황기는두과식물중에서경실종자이므로기계적휴면을하여, 녹협기에는발아율이 90% 이상이나황협기에는 20% 정도로낮아지며, 등숙이진전되어종피가경화될수록발아율은낮아진다. 또한저장기간이길어지거나환경이나빠지면경화종자가증가하고활력이떨어지는것으로보고되었다 (Kim YG et al. 2011a, b). 황기는약용식물로널리재배되어왔기때문에일반적인번식및재배기술이확립되어있으나, 제주황기는한라산에서만분포하는특성으로인해아직까지뚜렷한증식방법조차구명되지못하고있다. 또한고산지대에서만자라기때문에산림생태계의훼손으로인해멸종위기에직면할수있는식물가운데하나로산림청에서지정보호하고있다 (Lee YM and Lee WY 1997). 따라서한라산에서만특이적으로자생하는특산식물인제주황기의기내증식방법의확립은산림유전자원의확보차원뿐만아니라자생지복원측면에서도중요한내용이다. 조직배양기술은소멸해가는유전자원의증식및보존방법으로유용한수단이되어왔으며 (Faisal et al. 2007; Kartonas and Papafotiou 2007), 국내에서도여러수종에서연구가발표되었다 (Youn et al. 1992; Moon et al. 1997, 1999, 2008; Han et al. 2004, 2010). 외국에서는몇종류의황기에대한조직배양결과가발표된바있으나 (Hou and Jia, 2004; Erisen et al., 2010) 아직까지제주황기의조직배양기술은확립되어있지않다. 본연구는자생지에서멸종위기에처해있는제주황기의자생지복원및유전자원의보존을목적으로기내번식방법을개발하고자하였다. 재료및방법 식물재료 국립산림과학원난아열대연구소로부터분양받은제주황기종자를시료로사용하였다. 종자는 4 C 에저온저장하였다가수돗물에 24 시간침지하여최아 ( 催芽 ) 를촉진시킨다음기내파종하였다. 종자의표면살균은무균상에서 70% 에탄올로 1 분, 2% 의차아염소산나트륨 (2% NaClO) 로 10 분동안침지시킨후멸균증류수로 4 ~5 회세척하였다. 소독된종자를 MS (Murashige and Skoog 1962) 기본배지에서발아시키고 4 ~5 주간의계대배양주기로 2 년이상유지하였다. 줄기증식 절편은액아마디를약 2 cm 길이로절단하여 MS 배지에 BA 및 kinetin 을각각농도별 (0, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 및 5.0 mg/ l) 로처리하여증식시험하였다 (Fig. 1). 배지는 150 30 mm 의유리시험관에 8 ml 씩분주하여 121 C 에서 20 분간고압멸균후사용하였다. 절편은처리당 10 점씩치상하여 3 반복하였다. 배양은 1 일 16 시간조명 (40 μm m -2 s -1 ), 25±2 C 로유지되는배양실에서실시하였다. 4 주간배양후신초가 0.5 cm 이상자란것을정상줄기로다경및길이를측정하였다. 이하의실험에서배지의준비와배양환경은동일하게실시하였다. 기내및기외발근유도 기내발근을위하여잎의발달이양호한건전한줄기를발근재료로사용하였다. 적정기내발근배지를구명하기위하여 B5 (Gamborg et al., 1968), MS 및 WPM (Lloyd G. and McCown B., 1981) 기본배지 (sucrose 3%, gelrite 0.3%) 를사용하였다. 다음발근적정배지로선정된 B5 배지에 IBA 를농도별 (0, 0.1, 0.2 및 0.5 mg/l) 처리하고정아지및액아지를절편으로발근에미치는 IBA 농도및절편체위치효과를조사하였다 (Fig. 3). 절편은 IBA 농도별및절편체위치별로 20 점씩 2 반복을두었다. 배양 4 주후성적조사를실시하여뿌리가 1 개이상나온것을발근된것으로간주하고뿌리수및길이를측정하였다. 발근식물체는수돗물로 agar 를조심스럽게제거하고인공배양토 (peatmoss: perlite: vermiculite = 1:1:1,v/v/v) 에이식하여순화실에서순화하였다. 한편기외발근유도는정아지가있는건전한줄기를절편으로시험하였다. 기외삽목은 Kwon 등 (1994) 의방법을다소변형하여 3 ~4 cm 길이의줄기절단하부에 IBA/Talc 를 0, 0.5, 1.0 및 2.0% 로분의 ( 粉衣 ) 처리한다음인공혼합상토 (peatmoss : perlite : vermiculite=1:1:1, v/v/v) 에이식하였다. 삽목후충분히관수하고 1 일 16 시간조명 (20μ mol m -2 s -1 ), 온도 25±2 C 로유지되는순화실에서 6 주간공중습도를높게유지하면서배양하였다. 6 주후발근율을조사하였다. 세포조직학적분석 기내줄기증식과정에서나타나는과수화 (hyperhydration) 를관찰하기위하여정상적인잎과과수화된잎의조직검경을통해세포구조를비교관찰하였다. 조직검경은 Yeung (1999) 의방법을따랐다. 조직의샘플고정은 2.5% glutaraldehyde 와 1.6% paraformaldehyde buffer, 0.05M phosphate buffer (ph 6.8) 에 4 C 에서 24 시간고정하였다. 다음알코올시리

102 J Plant Biotechnol (2014) 41:100 106 즈로탈수시키고 Technovit 7100 (Kulzer, Germany) 으로포매하였다. 절삭은 Reichert-Jung 2040 Autocut rotary microtome 의유리칼로 3 µm 두께로수행하였다. 이절편을 toluidine blue O 로염색하여 Leica DMR 광학현미경으로관찰하고 IM-50 software 를이용디지털카메라 (Leica DC 300F) 로촬영하였다. 최소 15 개의절편을비교하여조사하였다. 통계분석 본실험의모든데이터는통계프로그램 SPSS 12.0 을이용하여산출하였다. 각처리간유의성검정을위해서는 one-way ANOVA 를실시하였고, 유의성이있는경우 Duncan s multiple range test 로차후검증을실시하였다. 통계적유의성은 P < 0.05 로설정하여분석하였다. 결과및고찰 기내발아 MS 배지에치상된종자는배양후 5 일경부터발아하기시작하였고, 줄기신장이신속하게이루어졌으나 4 주후의발아율이 23% 로저조하였다 (data 미제시 ). Erisen 등 (2010) 은 A. cariensis 의기내배양에서종피 (seed coat) 무처리종자는 10% 정도발아되고종피를절단한종자는 100% 발아된다고하여종피의절단처리가발아의주요요인이라고하였다. 제주황기의저조한발아율은종피문제로인한기계적발아억제로추정되며, 차후발아율향상을위하여종피처리실험이수행되어야할것으로사료된다. 증식에미치는 BA 및 kinetin 효과 액아마디를절편으로 BA 와 kinetin 을각각농도별로처리하여배양한결과는 Figure 1 과같다. 제주황기는정아우세현상이뚜렷하여모든처리구에서절편당한개의줄기가유도되었고간혹 2 개의줄기로자라는것이관찰되었다. 따라서제주황기의기내증식은다경유도를통한증식보다는마디절편으로나누어증식함이효과적인것으로나타났다. 전반적으로 BA 는줄기마디수의형성을촉진한반면 kinetin 은줄기의신장을촉진하는경향을보였다 (Fig. 1). 기내배양에서싸이토키닌 (cytokinin) 은정아의생장을억제하여측아의발달을촉진하여다경유도를하는것으로알려져있으며, 특히 BA 는활성이높아다양한식물의기내증식에많이사용되어왔다 (George, 1993). 하지만제주황기에서는 BA 및 Kinetin 처리로다경줄기가유도되지않아식물종에따른차이를보여주었다. Fig. 1 Effect of cytokinins on shoot proliferation of Astragalus membranaceus Bunge var. alpinus N. Data were collected from the in vitro grown shoots after 4 weeks in culture. The column show mean±se from three separate measurements of twenty individual shoots 줄기의신장에있어 BA 처리는 2.1 ~ 2.5 cm 의생장을보인반면 kinetin 처리시에는 1.9 ~ 3.9 cm 의생장을보였다. 특히 0.5 mg/l kinetin 처리시 3.9cm 로서가장좋은생장을보였다 (Fig. 1). 생장조절제무처리시는 2.4 cm 로 BA 처리와비슷한생장을보였다. 절간마디수에있어서는 BA 처리시 3.2 ~ 3.9 개, kinetin 처리시 2.6 ~ 3.0 개가형성된반면에 MS 기본배지에서는 2.8 개의절간마디가생성되었다. Moon 등 (1999) 은미선나무의기내증식에서절간마디를이용하는방법이효율적임을시사한바있는데, 이러한결과는제주황기에서도적용가능한방법으로나타났다. 한편증식중인식물체의일부잎에서과수화 (hyperhydration) 가관찰되었다. 과수화된잎은정상적인잎에비하여두껍고휘어져있으며투명하였다. 세포조직학적관찰결과과수화된잎은모든세포의크기가크고책상조직의발달이부진하였다. 또한, 정상적인잎에비하여책상조직과해면조직그리고표피세포모두불규칙하고세포간극의크기가큰것으로관찰되었으며세포내의전분축적량은현저히감소되어있었다. 또한잎의주맥 (main vein) 이중심에서다소옆으로벗어난곳에위치하였다 (Fig. 2). 이러한과수화된식물은정상적인기내증식을저해하고특히발근이어려운것으로나타나제주황기의기내배양시고려해야될내용으로생각되었다. 과수화현상은여

J Plant Biotechnol (2014) 41:100 106 103 Fig. 3 Effect of various medium on in vitro rooting. Data are the mean±se from 3 separate measurements of twenty individual plants. Mean(±SE) separation within column by Duncan s multiple rage test at P=0.05 Fig. 2 Anatomical comparison of normal leaf (A) and hyperhydrated leaf (B) derived from in vitro shoot of Astragalus membranaceus Bunge var. alpinus N. Bars are 200μm 러식물에서발근, 순화및생산성저하의주원인이되며 (Olmos and Hellín 1998; Jausoro et al. 2010), 배지의조성, 용기, 배양환경등의외부적요인에의하여빈번히발생하는것으로알려져있다 (Debergh et al. 1992). George (1993) 는과수화의억제를위한방법으로 1) 통기가잘되는배양용기의사용, 2) 발근유도시배양병의하단을차게 (cooling) 유지시키는방법, 3) Agar 등경화제의농도와 sucrose 등탄소원의농도를높이는방법, 4) Agar, gelrite 등서로다른경화제를사용하는방법, 5) 반고체배지를사용하는것보다액체배지에서다공성 (porus) 지지물을사용하여줄기를배양시키는방법을제시하였다. 제주황기의기내배양에서관찰된과수화는빈도가 10% 미만으로크게문제시되지는않았으나발근유도시에는발근이억제되었기때문에고려해야될내용으로생각된다. 기내발근유도 적정배지선정을위한발근시험결과는 Figure 3 과같다. 4 주간의배양결과 MS 배지는 6.7% 로발근율이저조했으며, WPM 은 33% 의발근율을나타냈다. B5 에서는가장좋은 43% 의발근율을보였다. 특히 B5 배지에서는다른두배지보다발근이 1 주이상빠르게이루어지는장점도 Fig. 4 Explant bud position (A- apical bud explant ;B- axillary bud explant) for in vitro rooting 있었고뿌리수도많아서제주황기의적정발근배지로생각되었다. 뿌리의형성은줄기기부에캘러스형성없이직근의형태로유도되었고, 뿌리수는 2 ~7 개로개체간차이가있었다. 한편발근개체는세근의발달이이루어지지않았고절편에따라서는발근부위가적색을띠기도하였다. 콩과식물인가시아카시아 (Acacia nilotica (L.) Willd. ex Del) 의기내발근에서 B5 배지가사용된바있으며 (Samake et al. 2011), Chen 등 (2014) 은애기장대와토마토의뿌리형성에 B5 배지가효과적이라고하였다. B5 배지조성이 MS 나 WPM 와다른특징은비타민 Thiamine HCl 의함량이 10 배가량높다는것인데, 이러한함량변화가콩과식물인제주황기의발근에중요한영향을미쳤으리라추정된다.

104 J Plant Biotechnol (2014) 41:100 106 Fig. 5 Induction of in vitro root by different IBA treatment IBA 농도및절편체위치효과 IBA 농도및절편의위치에따른발근시험결과는 Figure 6 과같다. 발근율은 IBA 처리농도및절편체의위치에따라차이가있어 40 ~ 80% 까지발근율차이를보였다. 발근은 0.1 mg/l IBA 조건에서가장좋았으며, 이농도에서뿌리수및뿌리의생장이가장양호하였다. 다른농도에서는무처리와비교하여발근에통계적인유의차가없었으나뿌리수및뿌리의생장은 IBA 처리및절편위치에따라차이를보였다 (Fig. 5, 6). 따라서제주황기의기내발근은 0.1 mg/l IBA 처리가적정조건으로나타났다. 기내발근에영향하는오옥신의효과는다수의식물에서보고된바있으며, 여러종류의황기기내배양에서도관찰되었다. A. polemoniacus 는 MS 기본배지혹은 2.0 mg/l 처리에서 (Mirici 2004), A. cicer 은 1/2 MS+0.25 ~ 0.5 mg/l NAA 를 (Basalma et al. 2008), A. adsurgens 는 1/2 MS+0.2 ~ 1.0 mg/l NAA 처리가효과적인것으로보고하였다. Uranbey 등 (2003) 은 A. cicer 에서 1/2 MS+1.0 mg/l NAA 처리로 40% 의발근을보고하였고, A. cariensis 에서는 MS+0.5 mg/l IBA 가적정발근조건으로나타나식물에따른차이를보여주었다 (Erisen et al. 2010). 한편 Hou 와 Jia (2004) 는 A. melilotoides 의기내배양에서 IBA 가 NAA 보다발근에효과적이며, MS+ 14.78uM IBA 처리로 81% 의발근율을얻었다고하였다. 이러한결과들은황기의종류에따라적정배지및오옥신의처리조건이다름을보여주는것이다. 한편제주황기의기내발근은앞서언급했듯이과수화된줄기를피하고건전한줄기를사용하여 B5 배지에저농도 IBA 처리로효과적인기내발근이가능하다고생각된다. Fig. 6 Effect of shoot position and IBA on in vitro rooting of Astragalus membranaceus Bunge var. alpinus N. A-apical bud explant; B-axillary bud explant. Data are the mean±se from 3 separate measurements of twenty individual plants. Mean(±SE) separation within column by Duncan s multiple rage test at P=0.05 기외발근유도 정아가있는건전한줄기를재료로 IBA 농도별분의처리후기외삽목한결과는 Figure 7 과같다. 발근율은무처리에서 57%, 0.5% IBA 처리시 65% 까지발근되었으며, Fig. 7 Effect of different IBA levels influencing on ex vitro rooting. The same letters are not significantly different according to Duncan s multiple range test at P=0.05

J Plant Biotechnol (2014) 41:100 106 105 IBA 1% 에서 59%, 2% 에서 45% 의발근율을보였다. 무처리구와 IBA 0.5, 1.0% 처리간에는발근율에통계적인차이가없었으나 2% 처리시에는차이를보였다. 따라서제주황기의기외발근유도는 0.5 ~ 1.0% IBA 로분의처리함이좋을것으로판단된다. 이같은결과는기내발근에비해다소저조한발근율이지만차후토양이식후의생존율과생장이기내발근묘보다양호하게나타났다 (data 미제시 ). 따라서순화묘목까지의생산성을고려한다면제주황기는기외삽목법이더효율적인것으로나타났다. 이러한기외삽목기술은발근이까다로운여러활엽수종의발근유도에서효과적인것으로보고된바있으며 (Kwon et al. 1994), Debergh 와 Maene (1981) 는기내묘의기외발근은조직배양묘의생산비절감에매우중요하다고하였다 순화묘육성 정상적으로발근된식물체를혼합인공상토 (peatmoss:perlite: vermiculite = 1:1:1, v/v/v) 에이식하여온실에서 4 주간순화시킨결과기외발근묘는 90% 이상의높은활착을보인반면기내발근묘는 60% 미만으로활착되었다. 이러한차이는발근묘의이식과정에서뿌리가부러지거나상처를받았거나스트레스로인한고사로보인다. 따라서제주황기의기내배양증식은기내발근보다는기외발근의방법이차후의생존율제고에유리할것으로보인다. 기내발근묘의토양이식순화율제고는앞으로더연구되어야할내용이다. 적요 희귀식물제주황기의기내번식법확립을목적으로줄기증식및발근을시험하고배양과정에서나타나는잎의과수화현상을조직학적으로조사하여다음의결과를얻었다. 줄기유도시 BA 및 kinetin 의처리는다경유도효과가뚜렷하지않았으며대부분단일줄기로자랐다. 하지만 BA 처리는마디수의증가를, kinetin 처리는줄기의신장을각각촉진하는효과가있었다. 과수화 (hyperhydration) 된잎은정상잎에비하여세포의크기가크고책상조직의발달이부진하였으며, 세포의배열이불규칙하였다. 특히과수화잎의세포는세포내전분의축적이현저히감소하는것으로나타났다. 기내발근은세가지배지 (B5, MS, WPM) 가운데 B5 배지가양호하였으며, 0.1 mg/l IBA 처리시최고의발근율을보였다. 발근에미치는절편체위치효과 ( 정아지혹은액아지 ) 는통계적유의차가없는것으로나타났다. 기외삽목발근은 0.5% IBA 분말처리로 65% 까지발근되어기내발근보다저조하였으나, 차후생존율은더좋은것으로나타났다. 이상의결과는제주 황기의기내번식이가능함을시사하며, 이식물의기내및기외보존의방법으로사용될수있음을보여주었다. References Baek NI, Kim YS, Kyung JS, Park KH. 1996. Isolation of anti-hepatotoxic agent from the root of Astragalus membraceus. Kor J Phsrmacogn 27(2):111-116 Basalma D, Uranbey S, Gurlek D, Ozcan S (2008) TDZ-induced plant regeneration in Astragalus cicer L. Afr J Biotechnol 7(8):955-959 Chen X, Sheng L, Liu J, Haung H, Xu L (2014) A simple method suitable to study de nove root organogenesis. Frontier in Plant Science 5: 1-6 Debergh P, Aitken-Christie J, Cohen D, Grout B, von Arnold S, Zimmerman R, Ziv M (1992) Reconsideration of the term vitrification as used in micropropagation. Plant Cell Tiss Org Cult 30:135-140 Erisen S, Yorgancilar M, Atalay E, Babaoglu M (2010) Prolific shoot regeneration of Astragalus cariensis Boiss. Plant Cell Tiss Org Cult 100: 229-233 Faisal M, Ahmad N, Anis M (2007) An efficient micropropagation system for Tylophora indica. an endangered, medicinally important plant. Plant Biotechnol Rep 1:155-161 Gamborg OL., Miller RA., Ojimak. 1968. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp Cell Res 50:151-158 George EF (1993) Plant propagation by tissue culture. Part 1. The technology. pp 435~446. Exegetics Limited, England Han MS, Moon HK, Kang YJ, Kim WY, Kang BS, Byun KO (2004) Micropropagation of an endangered species, Stellera rosea Nakai by tissue culture. Korean J Plant Biotechnol 31:31-35 Han MS, Park SY, Moon HK, Kang YJ (2010) Micropropagation of a rare tree species, Empetrum nigrum var. japonicum K. Koch via axillary bud culture. J Korean For Soc 99:568-572 Hou SW., Jia JF (2004) High frequency plant regeneration from Astragalus melilotoides hypocotyls and stem explants via somatic embryogenesis and organogenesis. Plant Cell Tiss Org Cult 79: 95-100 Jausoro V, Llorente BE, Apóstolo NM (2010) Structure differences between hyperhydric and normal in vitro shoots of Handroanthus inpetiginosus (Mart. Ex DC) Mattos (Bignoniaceae). Plant Cell Tiss Organ Cult 101: 183-191 Karstonas E, Papafotiou M (2007) Mother plant age and seasonal influence on in vitro propagation of Quercus euboica Pap., an endemic, rare and endangered oak species of Greece. Plant Cell Tiss Org Cult 90:111-116 Kim YG, Bang JK, Yu HS, Park HW, Seong NS, Son SY. 2001b. Seed structure and effects of storage on germination of Astragalus membranaceus. Kor J Medicinal Crop Sci 9(4): 259-264 Kim YG, Yu HS, Park HW, Seong NS, Son SY. 2001a. Effects of

106 J Plant Biotechnol (2014) 41:100 106 environment and storage condition on germination of Astragalus membranaceus. Kor J Medicinal Crop Sci 9(4):265-268 Kwon YJ, Youn Y, Lee SK, Kim JS (1994) Effect of cultural conditions on clonal propagation of Betula costata plus trees by tissue culture. Korean J Breed 26:435-446 Lee TB (1993) Illustrated flora of Korea. Hyangmoonsa Press, Seoul, Korea pp 561 Lee YM, Lee WY. 1997. Illustrated rare and endangered species in Korea. Jungbu Forest Research Center, Korea Forest Research Institute, Seoul, Korea. Lloyd G., McCown B. 1981. Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot tip culture. Intl Plant Pro Soc Pro 30:421-427 Mirici S (2004) High frequency of adventitious shoot regeneration from leaf and leaf petiol of endemic Astragalus polemoniacus Bunge. Selcuk University. Agric Fac Publ 18(34):31-34 Moon HK, Suk GY, Kim SC (1997) Micropropagation of a rare species, Forsythia saxatillis N. through tissue culture. J Kor For Soc 86:430-434 Moon HK, Suk GY, Kwon YJ, Son SH (1999) Micropropagation of a rare species, Abeliophyllum disticchum Nakai. via axillary bud culture. Kor J Plant Tiss Cult 26:133-136 Moon HK, Kim YW (2008) In vitro propagation of a rare and endangered species, Echinosophora koreensis Nakai, by axillary bud culture. J Plant Biotechnol 35:229-234 Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15:473-497 Olmos E, Hellín E (1998) Utrastructural differences of hyperhydric and normal leaves from regenerated canation plants. Scientia Horticulturae 75: 91-101 Samake G, Folega F, Sennou H, Wang HF (2011) In vitro regeneration of Acacia nilotica (L.) Willd. Ex Del from nodes on B5 medium. J Agri Biotech Sustain Develop 3: 85-89 Toh CA. 1971. A cytotaxonomic study on the Astragalus membranaceus and Astragalus membranaceus var. alpinus. Kor J Plant Taxono 3(1, 2):57-61 Towsend CE (1970) Phenotypic diversity for agronomic characters in Astragalus cicer L. Crop Sci 10:691-692 Uranbey S., Cocu S., Sancak C., Parmaksiz I., Khawar KM., Mirici S., Ozcan S. (2003) Adventitious shoot regeneration in Astragalus cicer milkvetch. Biotechnol Biotechnol Equip 17:33-37 Yeoung EC (1999) The use of histology in the study of plant tissue culture system some practical comments. In Vitro Cell Dev Biol-Plant 35:137-143 Youn Y, Lee SK, Park JI (1992) In vitro propagation of a rare species-berchemia berchemiaefolia. Res Rep For Gen Res Inst Kor 28:63-67