발간등록번호 11-1543000-000944-01 고품질바이오매스생산을위한리그닌생합성조절기술개발 (Discovering how to reduce lignin biosynthesis without compromising the fitness of plants) 서울대학교 농림축산식품부
제출문 농림축산식품부장관귀하 이보고서를 고품질바이오매스생산을위한리그닌생합성조절기술개발에관한연 구 과제 ( 세부과제 고품질바이오매스생산을위한리그닌생합성조절기술개발에관한 연구 ) 의보고서로제출합니다. 2015 년 9 월 7 일 주관연구기관명 : 서울대학교 주관연구책임자 : 최성화 세부연구책임자 : 최성화 연 구 원 : 정유정 연 구 원 : 푸나마야머허르전 연 구 원 : 천지녕 연 구 원 : 클라우디아코르발란 연 구 원 : 박슬기 연 구 원 : 박영훈 연 구 원 : 여노래 연 구 원 : 김한성 위탁연구책임자 : 최영임 - 1 -
요약문 Ⅰ. 제목고품질바이오매스생산을위한리그닌생합성조절기술개발 Ⅱ. 연구성과목표대비실적가. 생장속도고도화형질전환포플러육성 - DWF4 유전자의발현조절기작규명논문발표 - DWF12 유전자의발현조절기작규명논문발표 - 바이오매스생산후보, 브라시노스테로이드 (brassinosteroid; BR) 생합성유전자인 DWF4 와 BR 신호전달요소인 DWF12/BIN2 가도입된포플러형질전환체개발 - 형질전환포플러나무의바이오매스생산량, 리그닌적합도및생화학적특성분석 - 바이오에너지용리그닌저감포플러신품종육성나. 리그닌함량조절신규 BR 유전자발굴및형질전환체개발 - 전사체학적분석을통해리그닌함량조절 BR 유전자의발굴및이를이용한형질전환체개발을통한기능분석 Ⅲ. 연구개발의목적및필요성바이오에너지를경제적으로생산하기위해서는원재료가되는바이오매스의품질과생산성이중요함. 목질계바이오에탄올생산에사용되는일반적인바이오매스는난분해성리그닌이약 30% 정도를차지, 이는전처리공정에서여러가지문제점을야기하기에이를줄이는방향으로생명공학이적용되고있음. 그러나, 리그닌이식물체방어나지지등중요한생물학적기능을수행하기에리그닌함량을일방적으로줄일경우식물의 fitness가저하되는문제점이있어이룰해결하기위해본과제에서바이오매스대상작물의 fitness는최대한유지, 리그닌함량을저감시키는리그닌생합성제어기술개발에목표를두었음. Ⅳ. 연구개발내용및범위식물의스테로이드호르몬인 BR은식물생장촉진및, 리그닌을포함하는 2차벽이발달하는물관생성 발달과관련됨. BR의생합성유전자인 DWF4 와 BR 신호전달음성조절유전자인 BIN2 의기능규명을바탕으로이를목본식물의모델시스템인포플러에도입, 육성, 생화학적이해를바탕으로내생 BR 증가를통한생장속도가속화및리그닌저감포플러우수품종을개발함. 또한, 마이크로어레이실험으로전사체학적분석을실시하여리그닌조절관련신규 BR 유용유전자를대량발굴및형질전환체개발을통해리그닌함량을조절하는새로운 BR 유전자를발굴하는전략으로식물 fitness는유지, 리그닌합성은줄일수있는식물체를육성함. 1. 생장속도고도화형질전환포플러개발 - 2 -
- BR 생합성유전자인 DWF4와 BR 신호전달요소인 DWF12가포플러에도입함 - 기개발된벡터를포함한포플러나무육성, 생화학적특성및리그닌적합도분석 - 바이오에너지용리그닌저감포플러나무개발 2. 리그닌생성을조절하는신규 BR 유전자벡터시스템발굴및품종화개발 - 마이크로어레이를통해리그닌합성조절 BR 유전자의발굴및기능분석 Ⅴ. 연구개발결과 1. DWF4 유전자의발현조절기작규명 2. DWF12 유전자의발현조절기작규명 3. 생장속도고도화및리그닌저감포플러형질전환체우수품종개발 - BR 생합성및신호전달음성조절유전자를포플러에도입, 과발현체에서내생 BR 함량증가를비롯, 리그닌함량이감소된우수포플러형질전환체개발함 4. 전사체학분석에의해식물생장발달과리그닌함량조절유전자발견및이와관련형질전환체개발 - 광수용체에결함이있는돌연변이와 BR 수용체결함돌연변이체와의마이크로어레이수행, 유전자발현비교분석결과퍼옥시다제를포함하는다수의유용유전자선별. - 퍼옥시다제간섭카세트를포함하는벡터를도입한형질전환체개발및분석을통해이들유전자가식물생장발달과리그닌함량조절기능에관여함시사. Ⅵ. 연구성과및성과활용계획 1. DWF4 유전자의발현조절에관한논문발표 (Plant J. 2011, 66(4):564-78) 2. DWF12 유전자의발현조절에관한논문발표 (J. Plant Biol. 2011, 54:126 134) 3. 생장속도고도화및리그닌저감포플러형질전환체우수품종개발결과를퉁해신품종육성및특허출원준비중. 4. 전사체학분석에의해식물생장발달과리그닌함량조절유전자발견및이와관련형질전환체개발 - 광수용체결함돌연변이와 BR 수용체결함돌연변이의전사체분석을통해퍼옥시다제를포함하는다수의유용유전자가선별을통해 Plant J. 2014. 77(5):737-47에발표. - 퍼옥시다제간섭카세트를포함하는벡터를도입한형질전환체개발및분석을통해이들유전자가식물생장발달과리그닌함량조절기능에관여함을특허출원함 5. 성과활용계획 : 본연구결과얻어진기술을포플러뿐아니라백합나무등생장속도가빠른기타경제수종에이식될경우고품질의펄프원재료확보로제지공정비용을절감할수있을것임. 또한, 알팔파나다른 forage crop에이기술을접목한다면우수한사료작물의개발등긍정적경제적효과를얻을수있을것임. - 3 -
영문요약서 (Summary) The sustainable production of quality biomass is essential in biofuel economy. However, the lignins consisting of approximately 30% of conventional biomass hinders availability of biomass for bioenergy production. Lignins are hard to degrade, so it takes complicated chemical processing including toxic compounds. If not alleviated, biomass-derived bioenergy ironically cause environmental burden. Thus, reducing the overall contents and complexity of lignins has been the subjects of research world wide. It is noteworthy that lignins are important components for plants, so simple drastic reduction of their contents cause plants not growing adequately. A strategy to reduce non-degradable lignin contents without compromising plant fitness is required. To address this, we first aimed to understand how the lignin genes are regulated. We performed Affymetrix microarray analysis using the RNAs isolated from four different plant seedlings including Ws-2 wild type, bri1-5, phyb-77, and bri1-5 phyb-77 double mutants. Bioinformatics analysis of the gene expression revealed that the expression of peroxidase (PRX) genes, which might be involved in lignin contents, are inhibited by brassinosteroids but stimulated by the light. To genetically prove this idea that PRX regulate lignin contents, we introduced these genes using RNA interference constructs into both Arabidopsis and poplar. Successful transgenic lines of Arabidopsis displayed the phenotypes of weak stem, resulting in falling down on the grounds. This phenotype suggests that the robustness of plants normally attributable to proper contents of the cell wall was significantly altered. In addition, the transgenic RNAi lines flowered earlier than their parental wild type possibly due to faster-growing pattern. Taken together, the major cell wall modifying enzymes have been identified through our comprehensive analysis of the transcriptomes. Our molecular genetic analysis of these genes strongly suggest that plant cell wall contents especially the lignins can be engineered using these genes. Throughout the period of this project, we have identified the new genes possibly playing important roles in cell wall biology, and revealed that the known brassinosteroid genes including DWF4 and BIN2 successfully altered the contents of lignin in poplar plants. - 4 -
CONTENTS Chapter 1. Overview on Research and Development Project 7 Chapter 2. Trends in Domestic and International Technical Development 8 Chapter 3. Contents and Results of Research and Development 10 Chapter 4. Achievement levels and Contributions in Related Fields 30 Chapter 5. Outcomes and Applications of Research and Development 32 Chapter 6. International Scientific References Obtained during Research and Development 33 Chapter 7 Research Facility and Equipments 34 Chapter 8 Laboratory safety management log 35 Chapter 9 References 36-5 -
목 차 제 1 장연구개발과제의개요 7 제 1절연구개발의목적 7 제 2절연구개발의필요성 7 제 3절연구개발범위 8 제 2 장국내외기술개발현황 8 제 1 절국내 외현황 8 제 3 장연구개발수행내용및결과 10 제 1 절연구개발수행내용및결과 10 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 30 제 1 절연도별연구개발목표및달성도 30 제 2 절관련분야의기술발전에의기여도 31 제 5 장연구개발성과및활용계획 32 제 1 절연구개발성과 32 제 2 절성과활용계획 32 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 33 제 7 장연구시설 장비현황 34 제 8 장연구실안전관리이행실적 35 제 9 장참고문헌 36-6 -
제 1 장연구개발과제의개요및성과목표제 1 절 : 연구개발의목적 - 바이오매스를이용한바이오에탄올활용기술은화석연료에의존하지않고액체연료를생산 사용할수있어대기중순탄소증가량을최소화할수있는장점을가짐. - 그린에너지테크놀러지의핵심분야는원료가되는바이오매스의안정적인대량생산과함께공정에투입되는에너지사용을최소화할수있는우수한바이오매스의확보를통한경제적인목질계바이오에탄올생산임. - 이러한목표를달성하기위해본연구에서는애기장대와포플러에서유전자를발굴, 포플러에도입, 셀룰로스에탄올생산에최적화된포플러나무개발가능성을제시하고자함. 제 2 절 : 연구개발의필요성및범위등을기술 - 화석연료의과다한사용으로인한온실가스증가는지구온난화문제를야기, 온실가스감축이나환경친화적인면에서셀룰로오스생산및이용이해답임. - 바이오매스로불리는리그노셀룰로스는세포학적측면에서보았을때식물의세포벽에존재하나이들세포벽분해효소는일부생물에국한해존재함. 산업적측면에서리그노셀룰로스에탄올이경쟁력을갖기위해우수한고품질바이오매스생산량증대가필수적임. 이를위해호르몬및광조건에의한메커니즘규명, 2) 리그닌을포함한세포벽형성과정이해, 3) 바이오에탄올생산목적에맞는맞춤형리그닌저감에너지작물기술개발이시급함. - 리그닌은비수용성폴리머구조로물관세포의 2차벽구성물질로사용, 수분의효율적이동및식물이직립성장할수있는견고한지지기반형성함. 또한물관조직이물리화학적및병충해의공격으로부터보호되도록방어역할수행함. - 리그닌은식물세포생리적기능면에서수분의효율적이동및식물지지기반형성, 병충해의공격으로부터방어역할을수행함. 그러나, 산업적이용면에서바이오에너지생산시리그닌제거의화학적전처리과정에막대한에너지와환경부담이발생함. - 따라서생명공학에있어최고의목표는대상작물의리그닌함량은저감및전체적인생산성은감소시키지않는, 작물개발이필요함. - 브라시노스테로이드 (BR) 는식물의스테로이드호르몬으로세포의길이생장촉진을비롯, 리그닌을포함하는 2차벽이발달하는물관생성및발달을촉진시킴. - 목본식물의모델시스템인포플러는한국뿐만아니라전세계적으로분포하고있으며펄프원료, 무한한 biomass 잠재력을가지고있어서유전, 육종분야에연구가광범위하게진행되고있음. 뿐만아니라환경정화능력이뛰어나바이오매스로활용할경우환경보존과바이오에너지획득이라는이점을동시에얻을수있음. - 바이오에너지를경제적으로생산하기위해서는원재료가되는바이오매스의품질과생산성이중요함. 목질계바이오에탄올생산에사용되는일반적인바이오매스는난분해성리그닌이약 30% 정도를차지함. 리그닌은전처리공정에서여러가지문제점을야기, 그절대적인양을줄이는방향으로생명공학이적용되고있음. 하지만리그닌은식물체의방어나지지등중요한생물학적기능을수행하기때문에리그닌함량을일방적으로줄일경우식물의 fitness 가저하되는문제점이있음. 이를해결하기위해본과제는양질의바이오매스가필요한만큼 - 7 -
생산하기위해바이오매스대상작물 fitness 는최대한유지, 리그닌함량은획기적으로저감시키는새로운개념의리그닌생합성제어핵심기술을개발하는데목표를둠. 제 3 절 : 연구개발범위 1. DWF4 유전자의발현조절에관한논문발표 (Plant J. 2011, 66(4):564-78) 2. DWF12 유전자의발현조절에관한논문발표 (J. Plant Biol. 2011, 54:126 134) 3. 생장속도고도화및리그닌저감포플러형질전환체우수품종개발방향제시 - BR 생합성유전자및신호전달음성조절유전자를포플러에도입, 과발현체에서내생브라시노스테로이드함량증가를비롯하여리그닌함량이감소된우수포플러형질전환체개발함 ( 특허출원준비중 ). 4. 전사체학분석에의해식물생장발달과리그닌함량조절유전자발견및이와관련형질전환체개발 - 광수용체에결함이있는돌연변이와 BR 수용체결함돌연변이체와의마이크로어레이수행, 유전자발현비교분석결과퍼옥시다제를포함하는다수의유용유전자가선별됨 (Plant J. 2014. 77(5):737-47). - 퍼옥시다제간섭카세트를포함하는벡터를도입한형질전환체개발및분석을통해이들유전자가식물생장발달과리그닌함량조절에관여함을시사함 ( 특허출원 1건 ) 제 2 장국내 외기술개발현황 바이오연료의세계시장규모는 2011년기준약 827억달러수준, 2021년에는약 2.2배성장한 1,853억달러규모로도달할전망임 ( 한국바이오안전성센터동향정보지 ) 국내 : 1988년이후목질계에탄올생산기술개발에치중, 목질바이오매스의당화에적합한효소탐색및전처리기술개발, 리그닌저감을포함하여바이오에탄올경제성을높이기위한연구가진행중이며기술부문에서는우수하나리그닌저감목재는수입에의존하고있는실정임. 3면이바다로둘러싸인우리나라의경우자원이풍부한해양환경을이용한바이오에너지생산기술및이를통한 CO 2 저감방안이제시되어연구가진행중임. 바이오매스생산에관련된유전자변형포플러의선두그룹은프랑스와벨기에이며리그닌함량조절연구는서구에서이미 20년이상투자되어온분야임. 리그닌유전자변형포플러의시험재배 : 2013년 PNAS에발표된논문에의하면, 벨기에 Zwijnaarde에서시험재배된리그닌유전자가변형된포플러에서당을보다효율적으로전환시킬수있음을밝힘. 일부포플러에서는수피아래붉은색이선명하여리그닌생합성억제가잘되며붉은색이진한가지들은에탄올을 160 % 더생산할수있으며, 목재 1g 당에탄올생산수율이 20% 를증가되는장점을가지고있음이보고됨 (Van Acker et al., 2013). 기존다년생 switch grass보다약 1/3 가량많은에탄올을생산하는형질전환된 switch grass 품종을 2011년 PNAS지에, Chunxiang 그룹이논문으로발표함. 펄프제조시리그닌제거를위해다량의독성화학약품이사용되어심각한수질오염을야기함. 따라서, 리그닌생합성대사관련효소와유전자기능이거의규명되었으며이들대사각단계별관련유전자발현억제를통한리그닌저감시도는쌍자엽식물을대상으로진행되 - 8 -
어왔음. 일본에서는 xyloglucanase 유전자를지속적으로발현, 셀룰로즈함량이증가된포플러를개발함 (Kaida et al., 2009). 중국에서는리그닌합성관련 laccase 유전자를포플러에도입, 총리그닌함량이증가된형질전환체를보고함 (Lu et al., 2013). 2008년침엽수에서도최초로형질전환체의리그닌함량과구성성분변화가능성을제시함. 스웨덴독일가문비나무에서 cinnamoyl CoA reductase (CCR) 유전자를 anti-sense로형질전환, 5년생에서측정결과형태적으로정상보다생장이느리고일반가문비나무보다리그닌함량은 8% 가감소된것으로보고되고있음. 미국텍사스 A&M AgriLife Research는목질계바이오에탄올생산시부산물로발생되는리그닌을지질로전환가능한미생물을개발, 전환된지질은바이오디젤생산에활용하고자하는연구가수행중임 ( 출처 : http://agnews.tamu.edu/showstory.php?id=1806). 벨기에겐트에위치한 Flanders Institute of Biotechnology (VIB) 의 Wout Boerjan 그룹에의해개발된 GM 포플러가 2009년벨기에정부의시험재배승인을얻음. 선택된 GM포플러품종은 2009년부터재배되었으며 2010년에처음수확실험을실시함. 이들 GM포플러에대한시험에서리그닌생산이낮았으며바이오에탄올을고수율로얻어짐. 건조된나무의중량당바이오에탄올을생산하는비율이리그닌함량에변화가없는기존포플러와비교하여 GM 포플러가 81% 나높았다고프랑스낭시에서개최된 Bioenergy Tree 국제컨퍼런스에서발표됨 (Vanholme et al., 2013). 최근에사탕수수나옥수수, 콩등일반재료가아닌새로운재료에대한연구가활발한데뉴질랜드에서는유가공후남는유청으로바이오메탄올을생산함. 네덜란드에서는식물씨앗에서자동차연료인바이오디젤을추출, 당밀이나바나나껍질을이용해바이오에탄올을만드는데에도성공함. 또한, 중남미의콜롬비아에서당밀과바나나껍질, 커피과육등을발효시켜바이오에탄올을생산하고있음. 백색부후균은과산화효소를이용, 리그닌을분해할수있는데미국클라크대학교의 David S. Hibbett와에너지성산하공동유전체연구소연구진들이 The Paleozoic Origin of Enzymatic Lignin Decomposition Reconstructed from 31 Fungal Genome 이라는제목으로 31개곰팡이유전체를비교분석을통해백색부후균이다루기어려운식물바이오고분자인리그닌을분해하는능력시스템에대해사이언스지에보고함. 이연구는바이오연료생산을증가시킬수있는곰팡이효소를사용또는개량할수있게한것으로최근에나온이슈중가장부각되는논문중의하나임 (Floudas et al., 2011) 남다코타주립대과학자들이잘발달된뿌리에탄소를저장할수있고바이오매스용작물의생물다양성에기여할수있는 cup plant라고불리는다년생토종식물을새로운바이오매스작물로활용할수있는가능성을검토하는연구를진행하고있음 ( 출처 : http://www.sify.com/news/scientists-exploring-cup-plant-as-potential-new-biomass-and-carbon-st oring-crop-news-international-kdupohhhged.html). 목질계바이오에너지개발의가장큰장애물은고품질의바이오매스를안정적으로대량확보하는것임은주지의사실임. 따라서, 본연구진성과물은국외연구수준과견줄만하며스트레스보완까지갖추어질경우환경보존과바이오에너지획득이라는이점을얻을수있음. 바이오매스생산용고속생장포플러시범라인을선보일수있을것임. - 9 -
제 3 장연구개발수행내용및결과 제 1 절 DWF12 유전자의기능 : 논문발표 DWF12는 BR 신호전달경로에서 negative regulator로작용하는유전자임. 본과제에서는이유전자를이용해특정조직에서 BR 신호를선택적으로차단하는기술을사용하고자함. 먼저이유전자의기능을보다심층적으로이해하기위해이유전자의기능을옥신과 ABA 호르몬과의상호작용이라는관점에서분석하였음. 연구결과 DWF12 유전자에기능획득돌연변이가유도시옥신신호전달이대조구에비해촉진되었으며이는 BR 생합성유전자 DWF4의발현정도와뿌리털의생성정도면에서확인하였음. 이연구결과는 2011년 3월호 Journal of Plant Biology에게재함. BIN2/DWF12/UCU1은 BR의신호전달경로에있는음성조절자로형질획득돌연변이인 bin2-d는 BR 특이적인난쟁이표현형을가짐 (Choe et al., 2002). BIN2는동물의 shaggy-like kinases/glycogen synthase kinases (GSKs) 와유사한아미노산서열을가지며 BR 신호전달에있어애기장대 AtSKs 유전자는스트레스저항성이나개화조절에관련기능을가짐. 또한동물에서 GSK3은미세소관의운동성이나 Wnt, Sonic Hedgehog, insulin, Notch, receprot tytosine Kinase와같은신호전달경그림 1 2, 4-D 증가가 BR 반응돌연변이에서 GUS 로를담당함. 활성을증가시킴. DWF4pro:GUS는 100nM 2,4-D 처리로식물체내에서발현확인 식물에서도 GSKs는다양한신호전달에관여하게되는데, 이는 bin2/dwf12-1d에서의돌연변이가특이한 BR 난쟁이표현형과형태를갖는다는것을통해서도확인할수있음. 식물체의약간구부러진기관같이독특한표현형을얻을수있는데, 이런구부러짐이옥신수송계와관련이있기에 (Choe et al., 2002), BIN2가옥신신호전달에관련이있을것이라고예상할수있음. 이전연구에서 BR이옥신과같이뿌리털 (Lateral root) 발달 (Bao et al., 2004) 과하배축성장을조절함이보고됨 (Nemhauser et al., 2004; Stavang et al., 2009). BIN2의옥신신호전달관련유무를확인하기위해 DWF4pro:GUS를함유하고있는 bin2/dwf12-1d와 bri1-5에옥신처리결과야생형은 2.7배, bin2/dwf12-1d는 1.8배, bri1-5는 2 배 GUS 신호가증가함이확인됨. 그러나옥신처리로인한전체적인 GUS 활성은 BL로인해 DWF4의발현이저해되지않는 bri1-5와 bin2/dwf12-1d돌연변이에서가장높았음 (Kim et al., 2006). 이를통해 BR 생합성유전자인 DWF4 발현에있어옥신과 BR의상관관계를알수있으며, BR가 DWF4의발현을억제시키면옥신이활성화됨을규명함 ( 그림 1). 이를통해옥신신호전달에서 BIN2 가뿌리털발달을촉진하는것으로예측되지만, 유전자형 - 10 -
에따라보이는 cm 당초기뿌리에서의뿌리털의개수 (NLRCM) 가조금씩다른것으로확인됨. 야생형에비해 bin2/dwf12-1d 돌연변이가 12% 더높은것으로보아 BIN2가뿌리털의발달에도움을주는것으로예측, 옥신이처리된식물의 NLRCM은모든유전자형에서옥신농도가높아지면증가됨 ( 그림 2C). 옥신처리된 bri1-5, WT, bin2/dwf12-1d가각각 316, 286, 226% 증가, 또한 bri1-5와 bin2/dwf12-1d 가상이한반응을보임에따라 BRI1과 BIN2가뿌리털발달에있어반대역할을수행함. 이결과를통해 BR 신호전달의음성조절자인 BIN2가옥신신호전달에서양성조절자로뿌리털발달신호를전달하는데사용됨. 그림 2 낮은옥신농도에서측근발달을촉진시키는 bin2/dwf12-1d 돌연변이 제 2 절 DWF4 유전자의발현조절 : 논문발표 DWF4는 BR 생합성에서핵심적인기능을수행하는유전자임. DWF4 가매개하는효소반응을경계로생합성중간대사산물의활성이확연히차이를보임. 즉, DWF4반응이전까지의중간대사산물은생물학적활성이매우낮은데비해그이후의산물은활성이 500배이상이나높아짐. DWF4 는생합성경로의속도결정단계를조절하는것임. 현재까지 BR 생합성을개시하는신호가잘알려지지않음. 하지만본연구를통해 DWF4 유전자의발현은옥신에의해강하게유도됨을확인할수있었음. 관련연구결과는 2011년 Plant Journal에게제됨. BR은생장촉진을유도하는스테로이드호르몬으로같은식물호르몬인옥신과생리학적작용이나관다발분화, 세포신장과분열이나에틸렌합성등에있어서로밀접한관련을맺고있음. 애기장대에서옥신과 BR은뿌리털과하배축신장에있어관계가있는데, 대부분연구는 BR이옥신을상위조절하는것으로보고되나몇몇부분에있어서는옥신이 BR 수준을조절하는것으로보고됨. 애기장대에서 BRX (BREVIS RADIX) 의기능상실돌연변이체는뿌리생장이저해되지만 BR들에의해회복되며, 이러한결과를토대로 BRX 는전사인자로서옥신에따라 BR생합성유전자인 CPD (CONSTITUTIVE PHOTOMORPHISM AND DWARFISM) 를조절하는것으로추정됨 (Rodrigues et al., 2009). 그림 3 DWFpro:GUS의 BL과옥신처리에의한발현조절그림 4 다른종류옥신처리시 DWF4pro:GUS의발현량변화 - 11 -
DWF4는 BR생합성의후기과정에관여하는효소를암호화하는유전자인데, DWF4의발현은식물체내의 BR의수준을높임 (Kim et al. 2006). 이런 DWF4의발현을조절하는인자들과그매커니즘을규명하기위해 2,4-D를처리하였고, 이는뿌리끝과뿌리털에서 DWF4 발현이급격한증가를보임 ( 그림 3). 이것이옥신-의존적유도인지확인반응에서도 GUS 발현이증가를확인함 ( 그림 3b). 또한 DWF4pro::GUS 발현이 2,4-D 특이적옥신반응인지확인하기위해다른종류의옥신인 IAA 또는 NAA 처리를통해옥신반응임을확인함 ( 그림 4). 이를통해축적된옥신이세포에서뿌리정단으로이동하지못하는것을확인함. DWF4pro:GUS의이동을확인하기위해시간차분석결과 GUS의움직임이옥신처리후 1 시간뒤부터관찰됨. 24시간후뿌리털정단까지염색됨 ( 그림 5a, 5b, 5c). 옥신조절을확인하기위해 DWF4 발현정도를 RT-PCR을통해확인한결과 ( 그림 5d), 옥신처리 1시간후확연히 DWF4의발현정도가증가함을볼수있었으며 12시간뒤에그림 5 시간단위로본 DWF4pro:GUS 염색정도발현이가장많이증가됨이확인. 옥신처리에의한 DWF4pro:GUS의발현에서 BR이필수적인지알기위해생합성돌연변이인 dwf7-1과신호전달돌연변이인 bri1-5, bzr1-d를통해확인결과, 옥신신호전달돌연변이에서 GUS가발현되지않음을통해옥신신호가 DWF4 발현에는필수조건이지만 BR 신호전달이나생합성경로에필수적이그림 6 BR과옥신돌연변이에서 DWF4pro:GUS의염색차이지않음 ( 그림 6). 호르몬의존적인 DWF4의전사활성을확인하기위해 DWF4가결합하는 BZR1, BES1, Aux/IAA와 ARF의 TGTCTC의프로모터 1kb를분석함 ( 그림 7a). BRRE는번역개시코돈에서 upstream으로 606-619 bp에서발견됨, BES1의주요위치인 E-box는 301-306 bp지역에위치하며 AuxRE TGTCTC은 305-310 bp에 DWF4의프로모터의반대편에위치하는것으로확인됨. 일반적인 AuxRE의경우 D1 요소인 TGTGCTC를찾았으며, 옥신반응요소들에서발견됨 ( 그림 7a와 7c). 또한 ChIp (Chromatin immunoprecipitation) 을통해 BZR1-HA가 DWF4프로모터에 BL 처리시결합하는것을확인하였으나옥신처리시에는확인하지못함. 이는 BRRE 요소가필수적인 Aux/IAA반응요소를함유하기때문인것으로보이며 ( 그림 7c), 35Spro:ARF7-HA의경우 ARF7-HA는옥신이처리되었을때성공적으로결합하나 BL에서는결합이제거되는것을볼수있음 ( 그림 7b). DWF4 프로모터는일반적인 Aux/IAA-RE를근위부에갖고있으며 - 12 -
그림 7 BR 유전자프로모터 ChIP 분석 IAA19-HA는이서열에결합하는것으로확인됨. 하지만 ARF7-HA가 DNA에서확인가능한정도의양으로공침 (co-precipitates) 하지는못함 ( 그림 7b, IAA19-HA F2/R3 and ARF7-HA F2/R3). DWF4의활성과이를통한 BR 생합성수준의변화에있어옥신의영향을확인하기위해옥신처리후에유식물체의체내 BR 함량을측정결과, C-22- 수산화화합물과 22-OH CR, 22-OH-3-one이각각증가를확인함 ( 그림 8). 이결과는애기장대뿌리에서옥신처리에의해유동-변화단계 (flux-determining step) 에서확연히증가한다는점을시사함. 그림 8 DWF4 활성과이를통한 BR 생합성수준의변화 제 3 절생장속도고도화형질전환포플러육성 가. 35Spro:AtDWF4, 35Spro:AtBIN2 기개발된포플러나무해부학적및이화학적특성분석 애기장대 BR 생합성및신호전달관련 유전자들의 homologs를포플러에서찾아 계통학적분석 ( 그림 9A와 9C) 한결과, 대부분의 BR 관련유전자들이포플러에서복제되어있음을확인함. 엑손-인트론의도식도 ( 그림 9B와 9D) 를확인함으로써기 그림 10 포플러형질전환벡터모식도 (A) 와과 능적유사성을유추할수있었음. 발현 여부 확인 포플러에서 BR 기능을알아보고자, 생 합성효소 DWF4와신호전달음성조절자 - 13 -
인 AtDWF12/BIN2 를포플러에도입하여과발현여부가확인된라인을중심으로해부학및이화학적특성을분석하고자함. 포플러의형질전환에사용한 pcambia1303 벡터는 GUS 유전자와 GFP를함유한과발현벡터임. 이벡터에 BR 생합성유전자인 DWF4 와음성조자 AtDWF12/BIN2 를클로닝하여과발현시킨포플러형질전환체에서대표적인라인을선별, 도입시킨유전자가잘발현되고있는지확인하기위해 PCR을통해전사여부확인함. 대조군라인 그림 9 애기장대와포플러에서 BR 신호전달 (A, B) 및생합성 (C, D) 관련유전자들의계통학적분석 (A, C) 과엑손-인트론도식화 (B, D) 그림 11 AtBIN2/DWARF12 과발현포플러형질전환체확인 A 도입유전자모식도. B 도입된 AtBIN2 RNA 발현수준확인. C qrt-pcr로포플러내 BR 생합성유전자발현량확인 인 BH ( 봉화 ) 와, DWF4-16. DWF12-27 라인의정단부분을잘라 genomic DNA 를추출, 포플러염색체안 - 14 -
에 pcambia1303 벡터를통해 35S프로모터와유전자와 GUS 유전자까지온전하게삽입되었는지확인하기위해각각의프라이머를제작하여 PCR로확인함. 그림 10B와같이염색체안에삽입이잘되어있음을확인함. 또한 RNA를추출한뒤 cdna를합성후 PCR을수행하여, 도입된 DWF4 와 DWF12 유전자의전사가잘이루어지고있음을확인함. 브라시노스테로이드생합성유전자인 DWF4와음성조절자인 AtDWF12/BIN2를포플러형질전환벡터인 pcambia1303에클로닝, 포플러에도입하여그림 10과같이 PCR을 DWF4와 DWF12 유전자의과발현여부가확인된라인을중심으로분석수행함. 그림 11 포플러형질전환체수고와가지수측정결과 A. DWF12-27 과발현체표현형분석 B. 포플러형질전환체수고 C. 가지수그림 13. 포플러형질전환체잎의엽록소함량및광합성효율 A. 잎표현형비교 B. SPAD meter로측정한형질전환체잎엽록소함량 C. 광합성효율 형질전환된포플러에서도입된 AtBIN2/DWARF12의전사발현을확인하였고, AtBIN2 과발현포플러내의 BR 생합성변화를관찰하기위하여계통학적분석결과를활용함 ( 그림 9). 애기장대생합성유전자와상동성이높은유전자 AtDWF4 경우 POPTR_0005s12550.2, POPTR_0007s12730.1 가선별, AtCYP85A1과 AtCYP85A2 의경우 11680.1과 13340.1이선별됨. 이들유전자가 DWF12-27과 DWF4 과발현체라인에서어떻게조절되고있는지확인하기위하여 qrt-pcr을수행결과, PtDWF4, PtCYP85A1, PtCYP85A2 에서모두증가됨 ( 그림 11). DWF12-27 라인은포플러의수고가현저하게짧은편임 ( 그 그림 14. DWF12-27 과발현체세포크기 A. 줄기횡단면 B. 엽병일부 C. 도관요소 D. 도관요소중가장긴섬유세포길이차이 - 15 -
림 12). 대조군인 BH에비해포플러에도입된 DWF12-27 과발현체에서애기장대와같이난쟁이표현형과함께잎크기가작은데반해엽록소함량이가장높게나타남. 반면, 광합성효율은 DWF12-27 과발현라인에서가장낮게측정됨 ( 그림 13). 그림 15 35Spro:AtBIN2 생화학적분석 A. 내생브라시노스테로이드함량 B와 C는리그닌함량 DWF12-27 과발현체에서세포수와엽록소함량간의관계를알아보기위해줄기의횡단면을 section 한결과각각의세포벽이대조군에비해얇고, 세포의크기가줄어든것을확인할수있었으며엽병의일부를주사현미경으로관찰한결과같은면적내의세포크기가현저히줄어듦 ( 그림 14). 형질전환포플러의내생 BR과리그닌함량분석 : 본연구에서는 35Spro:AtBIN2 포플러과발현체에서내생 BR 함량이야생형 (BH) 에비해 그림 16 애기장대 DWF4 유전자가과발현된포플러 A. 수고와표현형사진 B. gdna로 PCR하여도입된유전자확인 전반적으로증가된양상을보이는데반해리그닌함량은 35Spro:AtBIN2 포플러과발현체에서감소된경향을보임. 특히 S 리그닌함량이감소는것으로보아통계적으로유의하지는않지만리그닌합성을줄일수있는가능성을제시할수있음 ( 그림 15). 그림 17 포플러 DWF4 과발현체확인 A. 총 RNA 1ug을전기영동으로확인 B. 합성된 cdna로 semi qrt-pcr 확인 C. qrt-pcr로삽입유전자확인과포플러내 BR 생합성유전자발현량확인 이전의결과에서애기장대 DWF4 과발현포플러개체확보를위하여 PCR을통해 DWF4 유전자의과발현여부를확인하고최종적으로 #1-3 선별됨 ( 그림 16과 17). - 16 -
나. BR 수용체인 BRI1 과유사한 BAL 프로모터선발 : 관다발분화에관여하는 SERK 유전자형질전환체연구 BAK1과단백질서열이비슷한유전자가애기장대에 5개존재하는데 BAK1-like (BAL) 유전자임. 물관세포분화에있어서 BR이핵심적으로관여한다는사실과조직특이성을염두에두고생각해보았을때 BAL1및 BAL 유전자들은관다발과섬유조직의특정세포에서선택적으로발현하여 BR 신호를인지한후물관으로의분화정도를결정하는중요한역그림 18 재조합에사용된벡터할을수행할것임. BR 보조수용체인 BAK1과 A. pmdc163 B. pbgwfs7 C. pearleygate 벡터유사한유전자들인 SERK 유전자들은이미관다발형성에관여하고있는것으로밝혀진바있음 (Albrecht et al., 2008). 그래서본연구에서 SERK 유전자의조절을통해, 물관부분의리그닌합성을선택적으로조절, 식물의지지기능은손상시키지않으면서전체리그닌함량은낮추기위해서 SERK 유전자들의발현부위확인을통하여 SERK의물관형성에관련된기능적인연구를수행함따라서본연구에서는 BAK1과 BAL 유전자가관다발세포들의분화를결정하는데있어서수행하는기능을알아보기위해 probal:bal-gus 보고자 construct 을작성한후야생형애기장대에도입, 해당유전자의발현위치를리그닌합성이나물관세포의분화와관련하여심층적으로연구함. BAL 유전자는그생물학적기능이다양하여 SERK로불리우고있음. SERK는 Somatic Embryogenesis Receptor Kinase의약자로이유전자가 Somatic embryogenesis 동안발현양이증가했음에서불리어진이름임 (Hecht et al., 2001) BR의 co-receptor 는 BRI1과 BAK1 으로알려져있으며, BAK1 은또한 SERK3 로도불리며. 지금까지리그닌을포함하는 2차벽이발달하는물관을조절하는방법을고안하기위해, 여러형질전환체를통해리그닌을포함하는이차벽발그림 19 SERKs:GUS의형질전환체의 chi-square 의한도입유전자복제수확인달조절에대한연구를소개하였으며 BRL 유전자들을이용한연구뿐만아니라, 보조수용체인 BAK1 또한관다발형성에중요한역할을 - 17 -
하고있음. 야생형애기장대에 SERK1, SERK2, SERK3를유전자프로모터분석용벡터인 pbgwfs7과해당유전자발현위치와시기를확인할수있도록 GUS를보고자로갖는 pmdc163 벡터에, 그리고프로티오믹스에이용할수있는 pearleygate 벡터에클로닝함 ( 그림 18). 클로닝된벡터를식물체내에형질전환하여 2세대에걸쳐각각의 SERK와그벡터에대한동형접합라인을확보함 ( 그림 19와 20). SERK1 과발현체는키가야행형의 4/5 정도로약간작은표현형을보이고, silique 크기가작음. SERK2 역시키가조금작아지는표현형을보임 ( 그림 21). 그림 20 SERKs 과발현체의동형접합체선별 A. T2 세대 B. T3 세대 그림 21 SERK1형질전환체 ( 왼쪽 ) 와 SERK2 형질전환체 ( 가운데와오른쪽 ) 최종적으로동협접합체라인의단백질발현여부를위하여 SERK1pro:SERK1-Flag, SERK2pro:SERK2-Flag, SERK3pro:SERK3-Flag 형질전환식물체에서단백질을추출, western blot을실시한결과이들유전자에대한단백질이발현된것을최종확인함. 또한, 단백질안정성여부에대한실험을한결과 BR의보조수용체인 BAKs (SERK1, SERK2, SERK3) 형질전환체를대상으로 BL, BRZ (BRs 생화학억제제인 Brasinazole), BRZ+MG132, 조건에서조절되는각인자들의단백질발현수준을 western을통하여확인결과 26S 프로테아좀억제제인 MG132를그림 22 BR에의해조절되는 SERKs 단백질발현수준같이처리하였을때에는단백질이분해되지않고축적됨 ( 그림 22). - 18 -
유전자발현위치와시기를확인할수있도록 GUS 를보기위하여클로닝된벡터를식물체내에형질전환하여 2세대에걸쳐동형접합체라인을선별함. SERK1 유전자의발현 GUS 발현위치는그림와같이잎을포함한정단부분에서발현이강하게되었으며, SERK3는잎을포함하여뿌리에서도강하게발현이되었음 ( 그림 23). SERK 단백질들이어떠한단백질들과상호작용하여관다발형성에그림 23 SERKs 유전자의 GUS 발현위치관여하는지알아보기위하여 SERK1pro:SERK1-HA 형질전환식물체에서얻은단백질을대상으로 HA 아가로즈비드를이용, 면역침전반응을현재수행중임. 정제된단백질을대상으로대조군단백질과발현양상이변화된단백질이관찰을관찰하였으나아직새로운인자를발굴하지못하였음. 현재새로운인자발굴을위해여러가지방법으로시도하고있는중이며형질전환식물체양이중요하기에형질전환식물체의종자를확보하여실험이진행중임. 면역침전방법을통하여새로운인자를발굴할경우물관형성및리그닌합성에관련이있는새로운인자들의조절로, 물관에서의리그닌 fiber의양을선택적으로줄일수있는시도가가능해질것으로보임. 다. BRL 프로모터선발 ; BRL 유전자프로모터-보고자분석 애기장대에는 BR 신호를인지하는막수용체단백질인 BRI1과유사단백질, BRL1과 BRL3 는 BRI1의기능과동일하게 BR을인지하는수용체로서작용함 (Fàbregas et al., 2013). BRL1은애기장대전조직에서발현되나특별히관다발조직에서 2차생장을담당하는전형성층세포 (procambial cell) 에발현이집중되어있는반면, BRL3는애기장대뿌리조직의체관세포에서발현됨 (Caño-Delgado et al., 2004). 이것으로보아 BR은관다발에분포하는 BRL1과 BRL3 수용체에의해인지되어각각물관과체관세포로분화를유도하는것으로가정하고있지만아직체계적이고깊이있는연구가부족한상황이므로 BRL 프로모터의체계적인분석이필요함. BRL 유전자프로모터-보고자유전자재조합 DNA를얻기위하여 ABRC에서 BAC (bacterial artificial chromosome) clone (BRL1:F20N2, BRL3:MRP15) 을구입하여 Gateway 시스템을이용하여클로닝수행함. 각각의 BAC clone을주형으로 specific primer를이용하여 PCR을해서대상유전자를증폭하고, 증폭된유전자는 pentr/sd/d-topo vector (Invitrogen, USA) 과 ligation하여 E. coli cell (Top 10') 에형질전환하여 cell stock을확보하고염기서열을분석함. BRL 유전자프로모터 - 보고자유전자즉, 확보된 BRL1pro:BRL1 과 BRL3pro-BRL3 를 epitope - 19 -
이 HA, Flag, cmyc인 pearlygate 301, 302, 303 vector 에최종클로닝하여애기장대에형질전환함 ( 그림 24). 이들벡터는식물형질전환마커로바스타 (basta) 저항성유전자를가지고있으므로바스타를이용하여 T1 세대에서형질전환체를 15개체이상선별후선별된형질전환체에서종자를받아서 T2 세대에서 chi-square 테스트에의해 T-DNA가 1 copy 들어간형질전환체를획득함 ( 그림 25). 그림 24 BRL1pro-BRL1 과 BRL3pro-BRL3 형질전환용운반체제작 T3 세대에서동형접합체라인을선별한후 BRL1과 BRL3의단백질발현을여부를확인하여동형접합체최종라인을선별함. BRI1과유사한 BR 인식수용체인 BRLs (BRL1, BRL3) 형질전환체를대상으로 BL, BRZ (BRs 생합성억제제인 Brasinazole), BRZ+MG132, 조건에서조절되는각인자들의단백질발현수준을 western을통하여확인결과 26S 프로테아좀억제제인 MG132를같이처리하였을때에는단백질분해가억제되어축적됨 ( 그림 26). BRL1 PRO :BRL1과 BRL3 PRO :BRL3 형질전환식물체의동형접합체의표현형분석결과 5일된유식물체의경우야생형에비해길이생장이느리고, 하배축및뿌리길이가작은편임. 또한 3주된형질전환식물그림 25 chi-square 테스트에의한도입유전자복제수체의경우개화시기가느리고, BRL1 PRO :BRL1 식물체의줄기가약하게보그림 26 BR에의해조절되는이며, BRL3 PRO :BRL3 형질전환식물체의 BRL1과 BRL3 shoot 길이가 BRL1 PRO :BRL1 형질전환체와의단백질발현차이를보임 ( 그림 27). 이러한표현형의수준차이를바탕으로 BRL1 PRO :BRL1과 BRL3 PRO :BRL3 형질전환식물체의형태학 이화학적차이를분석중임. - 20 -
그림 27 BRL1 PRO :BRL1-Flag 와 BRL3 PRO :BRL3-Flag 동형접합체의표현형분석 A. 5일된형질전환유식물체표현형과하배축및뿌리길이 B. 3주된형질전환식물체의개화시기차이 C. 4주된형질전환식물체의표현형차이 제 4 절리그닌생성을조절하는신규 BR 유전자발굴 가. 전사체학분석에의해선별된 PEROXIDASE RNAi 형질전환체의형태학적 생화학적분석 BR 생합성억제제처리하에서하배축신장을보이는광수용체피토크롬 B에결함이있는 gul2 (phyb) 돌연변이와 BR 수용체결함돌연변이체와의마이크로어레이유전자발현비교분석진단함. 그결과 gul2 돌연변이에서유의미하게퍼옥시다제 (peroxidase; Prx) 유전자들의발현이상대적으로감소되어있음 ( 그림 28A). NCBI GenBank 와 Phytozome (www.phytozome.net) 에제시된애기장대 73종의퍼옥시다제유전자의아미노산서열을이용하여계통수를작성한결과선별된퍼옥시다제와상동성을가진퍼옥그림 28 마이크로어레이를통해브라시노스테로이드와시다제유전자를분석할수있었으며빛에공조절되는퍼옥시다제유전자선별 (A) 과 73종애 Prx35와 Prx73의상동성이높음을발견기장대퍼옥시다제아미노산서열계통수 (B). 됨 ( 그림 28B). 광수용체돌연변이 (phyb) 에서하향조절되지만브라시노스테로이드결함돌연변이 (bri1-5) 에서상향조절되는퍼옥시다제들을대상으로다음과같은 RNAi 형질전환식물체- 35Spro:Prx2 RNAi (ph7gwiwgii:prx02), 35Spro:Prx8 RNAi (pb7gwiwgii:prx08), 35Spro:Prx35 RNAi (pb7gwiwgii:prx35), 35Spro:Prx73 RNAi (pb7gwiwgii:prx73) -를제작함 ( 그림 29B). 상기제작된재조합 DNA를 Agrobacterium (GV3101) 에도입, 애기장대야생형에형질전환함. 형질전환후 mrna 전사시목적유전자가 hairpin RNAi 구조를형성하기위하여각퍼옥시다제유전자단편을 sense 방향과 antisense 방향으로삽입되게하고이들의중간부분에애기장대 intron이위치하도록한 pb7gwiwgii 와 ph7gwiwgii 벡터의이용은 RNAi 를이용한고효율유전자사일런싱 (gene silencing) 에유용하게적용될수있음 ( 그림 29A). pb7gwiwgii와 - 21 -
ph7gwiwgii는미생물내선발마커로스펙티노마이신, 식물형질전환마커로각각바스타와하이그로마이신저항성유전자를가지고있어 T1 세대에서이를이용하여선별함. T2 세대에서 chi-square 테스트에의해 T-DNA가 1 copy 들어간형질전환체를획득함. 이들을대상으로 T3 세대에서각유전자벡터의식물형질전환마커에서모두생존하는라인을우선선별하였음. 각각의유식물체로부터총 RNA를분리, RNAi 를이용한 gene silencing으로형질전환애기장대에도입된퍼옥시다제 (Prx02, Prx08, Prx35, Prx73) 유전자의발현억제라인선별을위하여각유전자들에해당되는특이적프라이머를사용, Real-time PCR을수행, 35Spro:Prxs RNAi 형질전체의순종라인을선별함. 선별된 T4 세대 35Spro:Prxs RNAi 형질 그림 29 식물체내에퍼옥시다제유전자발현을억제하기위해사용된형질전환벡터 (RNAi) 모식도. B는각각의퍼옥시다제재조합벡터 35Spro:Prx2 RNAi, 35Spro:Prx8 RNAi, 35Spro:Prx35 RNAi, 35Spro:Prx73 RNAi 의모식도. 전환체의 6일된 20개체의유식물을대상으로유식물단계에서성장및발달에있어서증가된비율을나타냄 ( 그림 30A). 하배축과뿌리길이를비교한결과야생형에비해 35Spro:Prx2 RNAi 는각각 78.7% 과 33.2%, 35Spro:Prx8 RNAi 는각각 31.8% 과 22%, 35Spro:Prx35 RNAi 는각각 61% 과 70.1%, 35Spro:Prx73 RNAi 는각각 70.8% 과 26.9% 증가됨 ( 그림 30B). 뿌리길이가야생형보다더길어지고, 하배축신장발달이빠르게일어나며이들을샘플링하여 qrt-pcr 을수행한결과야생형에비해각유전자들의전사발현이억제된것을확인됨 ( 그림 30C). 그림 30 6일된 35Spro:Prx2 RNAi, 35Spro:Prx8 RNAi, 35Spro:Prx35 RNAi, 35Spro:Prx73 RNAi 형질전환동형접합체라인을대상으로야생형에비해하배축과뿌리가신장된유식물체표현형 (15A) 및이들상대적길이분석 (15B), qrt-pcr을통해각퍼옥시다제유전자의전사발현억제수준 (15C) 을나타낸도면. 눈금막대 = 1 mm. 6일된각각의 35Spro:Prxs RNAi 유식물체를대상으로퍼옥시다제활성을 3회이상측정한결과이다. 퍼옥시다제활성은 guaiacol (sigma) 을기질로사용하여 Chance 와 Maehly (1955) 방법에따라측정함. 50 mm sodium acetate buffer (ph 7), 25 mm guaiacol, 25 mm H 2 O 2 를제 - 22 -
조하여 470 nm에서흡광도변화를측정함. 야생형에비해모든라인이감소되어있었음 ( 그림 31). 각퍼옥시다제유전자의전사발현이억제된형질전환체에서과산화수소축적정도를시각화하기위하여 2주된야생형과형질전환체를대상으로 DAB (3,3'-diaminobenzidine) 염색을수행하였다. 과산화수소 (hydrogen peroxide, H 2 O 2 ) 축적을분석하기위하여 thordal Christensen (1997) 방법을이용, 0.1% 3,3'-디아미노벤지딘 (3,3'-diaminobenzidine, DAB; Sigma) 으로각각염색하였다. DAB 염색후잎은 95% 에탄올에서 10분 그림 31 6일된 35Spro:Prx2 RNAi, 35Spro:Prx8 RNAi, 35Spro:Prx35 RNAi, 35Spro:Prx73 RNAi 형질전환동형접합체라인퍼옥시다제활성 그림 32 축척정도 H 2 O 2 를확인하기위해 2주된야생형과 35Spro:Prx2 RNAi, 35Spro:Prx8 RNAi, 35Spro:Prx35 RNAi, 35Spro:Prx73 RNAi 형질전환유식물체에 0.1% 3,3'-디아미노벤지딘 (DAP) 으로염색한결과 (A). B는상층부, C는자엽, D는뿌리부분을 DAP으로염색한결과. 동안끓이고, 50% 에탄올로두번세척, 엽록소를완전히제거함. 이샘플은 50% 글리세롤에고정시키고, 광학현미경하에서촬영함. DAB은 H 2 O 2 와퍼옥시다제가있을때식물체에의해빨리흡수, 중합되어갈색으로염색이되는데정상적인상태에서도야생형에비해 35Spro:Prx2 RNAi, 35Spro:Prx8 RNAi, 35Spro:Prx35 RNAi, 35Spro:Prx73 RNAi 형질전환체에서축적이증가됨 ( 그림 17A). 특히형질전환체자엽에서는 DAB 및 H 2 O 2 의반응특성인갈색점이분석되었으며잎과뿌리의 vein과 vascular bundles 에서높게축적됨. 야생형에비해형질전환체의떡잎정맥 (cotyledon vein) 의패턴이다르며 35Spro:Prx2 RNAi, 35Spro:Prx8 RNAi, 35Spro:Prx35 RNAi 형질전환체떡잎에서 vein 의발달이감소됨을보임 ( 그림 32B~32D). 퍼옥시다제는과산화수소를이용해각종기질을산화시키는반응을촉매하는효소이므로형질전환체의경우에야생형에비해생장발달이촉진될뿐아니라 RNAi 형질전환체에서퍼옥시다제의발현이억제되어있어 H 2 O 2 가야생형에비해과산화수소가상대적으로더많이축적되었을것으로사료됨. 35Spro:Prxs RNAi 형질전환체는야생형에비해꽃대올라오는시기가빠를뿐만아니라빠 - 23 -
른줄기성장을보임 ( 그림 33). 초기성장률이증가되었으며 30일된 35Spro:Prx2 RNAi 형질전환체분석결과, 야생형에비해 35Spro:Prx2 RNAi 형질전환식물체사이즈도증가, 키도 2배이상커질뿐만아니라전체적인근생엽의엽병, 엽장, 엽폭길이가증가됨 ( 그림 34A와 34B). 야생형과 35Spro:Prx2 RNAi 형질전환식물체의차이를보다자세하게관찰하기위하여 52개이상의식물체에서자엽을제외한 5번 그림 33 장일조건에서성장시킨야생형과 35Spro:Prxs RNAi 형질전환체에서꽃대 (bolting) 시간이다름 째잎의엽병, 엽장, 엽폭길이결과를그래프로도식화하였으며야생형에비해각각 2 배, 1.4 그림 34 30일된 35Spro:Prx2 RNAi 형질전환체의표현형을분석한그림. A와 B는야생형과 35Spro:Prx2 RNAi 형질전환체의표현형을확인한그림이며 C는자엽을제외한 5, 6, 7, 8번째잎, D, E, F는각각 5번째잎의엽병, 병장, 엽폭길이. 이미지눈금막대 = 2 cm. 배, 1.2 배증가됨 ( 그림 34D~F). 35Spro:Prx2 RNAi 형질전환체는전체적으로빠른성장을보임. 35Spro:Prx8 RNAi 형질전환체를분석한결과, 야생형에비해 35Spro:Prx8 RNAi 형질전환식 그림 35 30일된 35Spro:Prx8 RNAi 형질전환체의표현형을분석한그림. A와 B는야생형과 35Spro:Prx8 RNAi 형질전환체의표현형을확인한그림이며 C는자엽을제외한 5, 6, 7, 8번째잎, D, E, F는각각 5번째잎의엽병, 병장, 엽폭길이를나타낸그래프. 이미지눈금막대 = 2 cm. 물체의전반적인크기가증가되었으며키도 2배정도커질뿐만아니라전체적인로젯잎의엽병, 엽장, 엽폭이증가됨 ( 그림 35A와 35B). 야생형과 35Spro:Prx8 RNAi 형질전환식물체의차이 - 24 -
를보다자세하게관찰하기위하여 52개이상의식물체에서자엽을제외한 5번째잎의엽병, 엽장, 엽폭길이를그래프로도식화한결과야생형에비해각각 1.6배, 1.2배, 1.3배모두증가됨 ( 그림 35D~35F). 35Spro:Prx8 RNAi 형질전환체는전체적으로빠른성장을보임. 35Spro:Prx35 RNAi 형질전환체를분석한결과, 야생형에비해 35Spro:Prx35 RNAi 형질전환식물체사이즈도증가되었으며키도 3배이상커질뿐만아니라전체적으로근생엽의엽병, 엽장, 엽폭이증가됨 ( 그림 21A와 21B). 그러나흥미롭게도 35Spro:Prx35 RNAi 형질전환식물체가모두누워서자라는경향을보여줄기종단면을절단해본결과야생형보다줄기종단면직경이작음 ( 그림 25A와 D 왼쪽 ). 야생형과 35Spro:Prx35 RNAi 형질전환식물체의차이를보다자세하게관찰하기위하여 52개이상의식물체에서자엽을제외한 5번째잎의엽병, 엽장, 엽폭길이를측정한결과야생형에비해엽병의길이는비슷하였으나엽장, 엽폭길이는각각 1.3배씩모두증가됨 ( 그림 36D~36F). 그림 36 30일된 35Spro:Prx8 RNAi 형질전환체의표현형을분석한그림이다. A와 B는야생형과 35Spro:Prx8 RNAi 형질전환체의표현형을확인한그림이며 C는자엽을제외한 5, 6, 7, 8번째잎, D, E, F는각각 5번째잎의엽병, 병장, 엽폭길이를나타낸그래프. 눈금막대 = 2 cm. 35Spro:Prx35 RNAi 형질전환체는전체적으로빠른성장을보이는데 6주된야생형과 35Spro:Prx35 RNAi 형질전환식물체장각과 (silique) 사이즈를분석한결과형질전환체가 1.4배작은것이확인되었으며이는꽃잎모양및크기와도일치됨 ( 그림 37). 그림 37 6주된야생형과 35Spro:Prx35 RNAi 형질전환체의장각과크기 (A) 및꽃잎비교를보여주는도면. 눈금막대 = 1 cm. 초기성장률도증가되었으나 30일된 35Spro:Prx73 RNAi 형질전환체를분석한결과, 야생형에비해 35Spro:Prx73 RNAi 형질전환식물체사이즈도증가되었으며키도 2배정도커질뿐만아니라전체적인로젯잎의엽병, 엽장, 엽폭이증가됨 ( 그림 38A와 38B). 야생형과 35Spro:Prx73RNAi 형질전환식물체의차이를보다자세하게관찰하기위하여 52개이상의식물체에서자엽을제외한 5번째잎의엽병, 엽장, 엽폭길이를측정하여그래프로도식화한결과야생형에비해 1.6배, 1.3배, 1.3배모두증가됨 ( 그림 38D~38F). 35Spro:Prx73 RNAi 형질전환체 - 25 -
는전체적으로빠른성장을보이며, 꽃대가올라오는시기또한야생형보다빠름. 그림 38 4주된 35Spro:Prx73 RNAi 형질전환체의표현형을분석한그림. A와 B는야생형과 35Spro:Prx73 RNAi 형질전환체의표현형을확인한그림이며 C는자엽을제외한 5, 6, 7, 8번째잎, D, E, F는각각 5 번째잎의엽병, 병장, 엽폭길이. 눈금막대 = 2 cm. 이러한결과를종합해볼때, peroxidase 2, 8, 35, 73이애기장대생장발달에관여함을시사함. 6주된 35Spro:Prxs RNAi 형질전환체에서야생형에비해노화가촉진되었으며잎에서전반적으로잎의황화현상이나타났으나 35Spro:Prx35 RNAi #12-6은이러한현상이약화되어있음. 야생형과각형질전환체잎을대상으로엽록소함량은 Lichtenthaler (1987) 방법을이용, 엽록소를추출한후 663 nm와 648 nm에서파장을측정함. 3반복으로엽록소함량측정결과 35Spro:Prx35 RNAi #12-6 라인을제외하고는야생형에비해 30-50 % 그림 39 6.5주된야생형과 35Spro:Prx2 RNAi, 35Spro:Prx8 RNAi, 35Spro:Prx35 RNAi, 35Spro:Prx73 RNAi 형질전환체상대적인엽록소함량. 감소되어있었으며 peroxidase 2, 8, 73이노화조절에도관여하고있음을시사함 ( 그림 39). 모든도표에서별표는대조군과비교하여다음과같은확률로 t-테스트에의해통계적으로유의한차이를나타냄 (*p < 0.005). 퍼옥시다제는리그닌화및활성산소종대사에관여하며 6주된퍼옥시다제식물체에서이들유전자의대부분이발현되는것으로알려져있음. 또한발단단계나스트레스상태에서발현되는것으로보고되어있음. 식물세포벽의리그닌화는환경스트레스에대한반응으로증가되어식물생장감소및조직의구조적견고함과연관된다. 리그닌병원균감염에대한물리적방어작용을포함하여, 건조스트레스시세포내의증산작용을감소시키는등건조내성과관련이있어리그닌화를조절함으로써건조내성식물개발에좋은표본이됨. 또한저온, 광반응등의다양한비생물학적스트레스방어기작과도관련이있음 (Denness et al., 2011). 리그닌기반지지구조가약해질경우물관발달이둔화, 식물생장이전체적으로억제되는표현형을지니므로양질의바이오매스가필요한만큼생산하기위해서는리그닌합성을줄이면서식물 fitness 는정상적인범위로유지하는기술개발이핵심이며꼭필요함. - 26 -
형질 전환 식물체를 대상으로 줄기의 횡단면을 관찰하기 위하여 조직화학적 염색을 실시함. 줄기 절편화를 위하여, 줄기를 FAA 용액 (10 % (v/v) formaldehyde, 5 % (v/v) 아세트산 및 50 % (v/v) 에탄올)에서 고정한 후, 에탄올 시리즈 (50, 70, 80, 100 %, 각각 한 시간) 에 의하여 탈 수시킴. 그 후 불럭들을 Peel-A-Way disposable embedding 몰드 (Polysciences)에 셋팅함. Technovit 7100과 파라핀으로 생성 시켜 microtome (Microm)으로 절편들을 만든 후 리그닌 염 색은 Chapple (1992) 방법에 의해 염색하고 toluidine blue 염색을 실시하여 현미경으로 비교 분 석함. 톨루이딘 블루 (toluidine blue) 와 리그닌 염색 시약인 phloroglucinol-hcl 로 패턴을 분석 한 결과 관다발 조직이 전체적으로 관다발 패턴이 야생형과 상이함을 보여주고 있음. 야생형의 경우 줄기 관다발의 수가 일반적으로 6-8개로 알려져 있으나 35Spro:Prx35 RNAi 라인은 다섯 개로 관찰 되었으며 pith 비중이 줄어있고 배열 상태가 불규칙적임. 뿐만 아니라 물관 조직이 둔화 되어 있고 interfascicular fiber의 생성이 억제, 식물의 지지 기능이 약화되어 식물이 누워 서 자라는 표현형을 보여줌. 35Spro:Prx8 RNAi 라인도 관다발 (vascular bundle) 이 다섯 개로 관찰 되었으며 35Spro:Prx73 RNAi 라인의 경우 물관 조직의 발달이 둔화 되어 있음 (그림 25). 리그닌 함량 또한 전체적으로 야생형보다 감소됨. 애기장대의 BR 관련 돌연변이 줄기의 횡단 면을 해부학적으로 관찰해본 보면 돌연변이체는 물관 조직의 발달이 둔화된 반면 체관 조직의 발달은 상대적으로 큰 영향을 받지 않음. 이러한 표현형을 기초로 이들 퍼옥시데이즈 유전자들 이 리그닌 함성에 관여되는 신규 유전자로 리그닌 및 브라시노스테로이드와의 관계를 통하여 물관 세포 분화 및 형성에 대한 지속적인 연구와도 관련이 있을 것으로 사료됨. 그림 40 야생형과 35Spro:Prxs RNAi 형질 전환체 줄기 Toluidine 종단면 blue phlorogucinol-hcl로 및 염 색된 물관 세포에서 리 그닌 축적 정도 비교 A. 애기장대 야생형 B. 35Spro:Prx2 RNAi C. 35Spro:Prx8 RNAi D. 35Spro:Prx35 RNAi E. 35Spro:Prx73 RNAi A, B, C, D, E left: toluidine blue 염색 A, B, C, D, E right: phloroglucinol-hcl 염색 퍼옥시다제 형질전환체를 대상으로 Foster et al (2010) 방법에 의해 리그닌 함량과 리그닌 구성 분석을 시도할 것임. 식물 세포벽의 리그닌화는 다양한 환경 스트레스에 대한 반응성으로 증가되며 이는 식물 조직의 구조적 견고함과 연관되므로 이들 결과물이 사업화나 기술 이전에 중요한 역할을 할 것으로 사료됨. - 27 -
퍼옥시다제유전자및유전자발현제어기술의하나인 RNA 간섭 (RNA interference 혹은 RNAi) 법에의한퍼옥시다제 RNAi 카세트를포함하는벡터 (RNAi 벡터 ) 가도입된형질전환체를통하여발생초기하배축과뿌리가신장될뿐만아니라잎의크기가커지고엽병길이가길어지며꽃대가올라오는시기 (bolting time) 등전제적으로빠른성장을나타냄으로써개화촉진, 종자생성시기를앞당길수생산성과기능성이증가된작물을제공할것이다. 또한, 리그닌함량감소를통하여바이오연료작물개발에유용할것으로기대됨. 나. 포플러 PEROXIDASE_RNAi 형질전환체 : 퍼옥시데이즈억제라인확보및표현형분석 3차년도에서부터수행중인애기장대 peroxidase RNAi 형질전환라인들에대한확보및표현형분석을위해 1차적으로애기장대퍼옥시다제 4개의유전자들 (prx2, 8, 35, & 73) 중에서 prx2 RNAi 과 prx8 RNAi 형질전환체라인들에대한확보실험을국립산림과학원의도움으로진행함. 그림 41 뿌리유도배지에서재배중인식물 형질전환식물체뿌리유도단계체각각의형질전환식물체에서발생된줄기로부터뿌리를유도하기위해뿌리유도고형배지가있는유리시험관안으로식물체를옮겨키움. 뿌리유도단계는형질전환식물체들의다음단계그림 42 순화인토양으로순화및활착을위하여편의상하초기단계의형나의실험관에한개체를배양함 ( 그림 27). 질전환체들 형질전환식물체순화단계형질전환식물체들의뿌리유도를통하여자란 Prx2 RNAi 그리고 Prx8 RNAi 형질전환식물체라인들과대조구식물체 (BH) 들을토양에서키우기위하여그림 28 에서보는바와같이밀폐된배양기 ( 사전에멸균시킨토양 ) 에서약 2주간키움 :Prx2 RNAi 라인 ; 3 개체, - Prx8 RNAi 라인 ; 15 개체, - 대조구 (BH) ; 7 개체 그림 43 활착단계초기식물체들 형질전환식물체활착단계위의순화단계기간이경과된 Prx2 RNAi, Prx8 RNAi 그리고대조구 (BH) 식물체들의토양으로의원활한활착을위하여순화단계를시작한후 2주후에아래보이는바와같이각각의포트에한개체의식물들을옮긴후 2-3 주간공기노출을적절하게조절하면서배양한다. 처음에는투명비닐커버로씌워서배양 ( 그림 43), 2-3 주 그림 44 활착단계후배양중인형질전환체들 - 28 -
후식물체들의성장과정을관찰한뒤최종적으로커버를제거한후정상적인포플러배양조건에서키움 ( 그림 44). 다. 포플러 PEROXIDASE 과발현형질전환체라인확보 Class Ⅲ 퍼옥시다제 (EC 1.11.1.7) 는식물의발생, 분화, 생장, 목질화 (lignification), 코르크질화 (suberization), 옥신분해와인돌아세이트산산화, 세포벽단백질교차결합, 병원균침입에대한방어작용, 염에대한내성기작을포함하여노화와관련된다양한기능을담당함 (Hiraga et al., 2001). 퍼옥시다제활성억제라인을통하여이미리그닌화조절이감소됨을확인하여과발현체를제작하여리그닌함량이극대화된애기장대와포플러퍼옥시데이즈과발현체를제작하여이들의시험분석을그림 45 퍼옥시다제과발현체제작 (35Spro:Prx2OX, 통하여새로운기능분석과함께차별적 35Spro:Prx8OX, 35Spro:Prx73OX) 리그닌합성제어기술확보하고자함. 이를위하여먼저식물체의 binary vector로 pmdc83을선정하여퍼옥시데이즈 2, 8, 73 유전자를클로닝 ( 그림 45) 하고이를 Agrobacterium (GV3101) 형질전환체를이용하여 poplar 야생형 (BH) 에도입, 퍼옥시다제과발현포플러식물체에각각형질전환실험을세부연구과제책임자인국립산림과학원의최영임박사실험실에서진행중에있음. 애기장대에도이미형질전환을수행하여식물체선별마커인하이그로마이신배지에서선별하여흙에서표현형을관찰중이다. 현재퍼옥시데이즈 35 유전자는클로닝이진행중임. - 29 -
제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 제 1 절연도별연구개발목표및달성도 구분 ( 연도 ) 1차연도 (2010) 2차연도 (2011) 3차연도 (2012): 세부과제명 생장속도고도화형질전환포플러육성 리그닌함량조절및생장속도고도화 생장속도고도화형질전환포플러육성 리그닌함량조절및생장속도고도화 생장속도고도화형질전환포플러육성 리그닌함량조절및생장속도고도화 세부연구목표 BR 발현조절기작규명및신규유전자발현라인확보 전사체학접근방법에의해리그닌합성조절관련유전자확보 기개발된포플러나무분석및신규유전자발현라인확보 전사체학분석에의해선별된리그닌합성조절유전자애기장대에도입 기개발된포플러나무해부학 이화학적분석및신규유전자발현라인분석 전사체학분석에의해선별된리그닌합성조절유전자라인구축 달성도 (%) 100 100 100 100 100 연구개발수행내용 - DWF12 & DWF4 유전자발현조절기작규명에대한논문발표 - AtDWF12, AtDWF4 형질전환포플러과발현확인 - BAL 유전자프로모터-보고자유전자재조합 DNA 합성 - BRL 유전자프로모터-보고자유전자재조합 DNA 합성 - 마이크로어레이를통해리그닌합성조절관련유전자선별 - 기개발된 AtDWF12, AtDWF4 형질전환포플 100 러나무의형태학적특성분석 ( 수고, 가지수, 바이오매스, 엽록소함량 ) - BAL 유전자프로모터-보고자동형접합형질 100 전환체선별 - BRL 유전자프로모터-보고자동형접합형질 100 전환체선별 100 - 마이크로어레이를통해리그닌조절관련유전자벡터제작 100 100 100 100 - 해부학 이화학적특성분석 (SEM 및현미경촬영 ) - BAL 유전자프로모터-보고자동형접합형질전환체분석 - BRL 유전자프로모터-보고자동형접합형질전환체분석 - PEROXIDASE 간섭카세트의형질전환체의동형접합형질전환체선별 4차연도 (2014): 생장속도고도화형질전환포플러육성 리그닌함량조절및생장속도고도화 기개발된포플러나무해부학 이화학적분석 전사체학분석에의해선별된리그닌합성조절유전자기능분석 100 100 - 기개발된포플러나무해부학 이화학적비교분석 - PEROXIDASE 간섭카세트의형질전환체동형접합체의해부학 이화학적비교분석 - PEROXIDASE 과발현체제작 5차연도 (2015): 생장속도고도화형질전환포플러육성 리그닌함량조절및생장속도고도화 35Spro:AtDWF4, 35Spro:AtBIN2 등품종화전사체학분석에의해선별된리그닌합성조절유전자기능분석 100-35Spro:AtDWF4, 35Spro:AtBIN2 등품종화 - PEROXIDASE 간섭카세트의형질전환체동형 100 접합체의해부학 이화학적비교분석 - PEROXIDASE 과발현체제작 - 30 -
제 2 절연도별연구개발목표및달성도 학술적측면 - 식물생장발달과리그닌함량을조절하는퍼옥시다제유전자, 퍼옥시다제 RNA 간섭카세트를포함하는벡터, 및상기벡터가도입된형질전환체 (2014 년 4월특허출원 ) - 이들결과물은세계적리그닌생명공학의방향을선도할것임-빛과브라시노스테로이드식물호르몬과의공조절자로선별된유용유전자의경우리그닌조절을포함, 이들에대한신호전달기작규명시수준높은저널에게제될수있을것임. - 다양한분야의학문적연계시스템구축 기술적측면 - 식물세포벽의리그닌화는다양한환경스트레스에대한반응성으로증가되며이는식물조직의구조적견고함과연관되므로이들결과물이사업화나기술이전에중요한역할을할것으로사료됨. 따라서, 지속적인기술개발을통하여바이오에너지회사및제지회사와의연계를통해실용화될수있을것임. - 온실가스감축형소재개발로저탄소녹색성장정책의활성화기틀마련및바이오에너지개발기술기반확보를통한기술인프라확립 경제적측면 - 식물의 fitness는유지, 저리그닌함량으로조절하는본기술은지식재산뿐만아니라여러분야로응용될것임. 포플러나기타경제수종에이식될경우고품질의펄프원재료확보를통해제지공정비용을획기적으로절감할수있어새로운제지용수목이탄생될것임. - 리그닌함량이저하된작물은반추동물의소화효율과밀접한관계가있으며조사료용으로매우적합한특성을가짐. 따라서알팔파나다른 forage crop 등에이기술을접목한다면긍정적인경제적파급효과를얻을수있을것임. - 에너지원다변화를통해환경개선및국가에너지자원을다량확보할수있을것임. 추진성과로인하여바뀌게될미래생활상 - 세계는지속적으로펄프가필요하지만지구상에서기후변화와인구폭발및산림의질 양적쇠퇴로생산성이악화될전망으로이러한상황에생명공학은강력한대안이될수있음. - 새로이개발되는리그닌저함량유전자형질전환임목들은경제적으로많은양의펄프와섬유를생산할수있을것임. - 미래에는석유대신바이오매스에서얻은연료로자동차를움직이고, 바이오리파이너리를통해여러화학제품을생산케될것임. biorefinery란석유에서여러가지화학제품을얻듯이바이오매스정제를통해다양한화학제품을얻는과정임. - 31 -
제 5 장연구개발성과및성과활용계획제 1 절연구개발성과 1. DWF4 유전자의발현조절에관한논문발표 (Plant J. 2011, 66(4):564-78) 2. DWF12 유전자의발현조절에관한논문발표 (J. Plant Biol. 2011, 54:126 134) 3. 생장속도고도화및리그닌저감포플러형질전환체우수품종개발 - BR 생합성유전자및신호전달음성조절유전자를포플러에도입, 과발현체에서내생브라시노스테로이드함량증가를비롯하여리그닌함량이감소된우수포플러형질전환체개발함 ( 특허출원준비중 ). 4. 전사체학분석에의해식물생장발달과리그닌함량조절유전자발견및이와관련형질전환체개발 - 광수용체에결함이있는돌연변이와 BR 수용체결함돌연변이체의마이크로어레이수행, 유전자발현비교분석결과퍼옥시다제를포함하는다수의유용유전자가선별됨 (Plant J. 2014. 77(5):737-47). - 퍼옥시다제간섭카세트를포함하는벡터를도입한형질전환체개발및분석을통해이들유전자가식물생장발달과리그닌함량조절기능에관여함을시사 ( 특허출원 ) 제 2 절성과활용계획 가. 바이오벤처회사설립 - 본연구를통해개발된기술을상업화하기위해본연구진이소속된서울대차세대융합기술연구원내에 지플러스생명과학 이라는바이오벤처회사를설립함 - 바이오에너지용작물뿐아니라제지용작물개발을완료하여미국이나유럽으로진출하여본격적인사업화를추진할예정임 - RPS ( 신재생에너지공급의무화제도 ) 는일정규명이상의발전사업자에게총발전량의일정량이상을신재생에너지로공급하도록의무화한제도인데 2016년이후태양광과비태양광을통합하여운영하는방안이검토중이므로이들의도입과단계적확대방안에발맞추어새롭게추진될정책과기술에협력하여시장점유율이확대시킬수있도록할계획임. 나. 리그닌조절신규유전자를도입한우량포플러신품종육성및보급 - 신규리그닌조절유전자의기초연구를바탕, 포플러에도입, 우수품종육성및안정화를통한보급확대 - GMO 안전성평가후대량증식, 산업화연구진행가속화 - 매립지나기타유휴지에식재되어바이오에너지용바이오매스재료로활용다. 신규유전자지식재산화 - 본연구를통해얻어진기능성유전자를대상으로특허화및기술실용화추진 - 32 -
제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 - 폴란드와스웨덴연구진은배터리를개발하고자제지공정폐기물을이용, 그물질이리그닌임. Olle Inganas와 Grzegorz Milczarek은배터리를개발하기위해제지공정폐기물을이용하여리그닌유도체절연성이폴리피롤의전도성과결합해전하를효과적으로보유하는복합물질을만들수있다고사이언스에보고함 ( 출처 : http://211.144.68.84:9998/91keshi/public/file/41/335-6075/pdf/1468.full.pdf). - 백색부후균은과산화효소를이용, 리그닌을분해할수있는것으로알려져있는데미국에있는클라크대학교의연구진과에너지부산하공동유전체연구소의연구진들이 The Paleozoic Origin of Enzymatic Lignin Decomposition Reconstructed from 31 Fungal Genome 제목으로 31개곰팡이유전체를비교분석결과백색부후균이다루기어려운식물바이오고분자인리그닌을분해하는능력을어떻게발전시켰는지사이언스지에보고함. 이는바이오연료생산을증가시킬수있는곰팡이효소를사용 개량할수있는것으로최근이슈로가장부각되는논문임. - 벨기에서진행된저리그닌함량 GM 포플러시험재배결과 GM 포플러나무목질이당으로전환되는과정에서보다효율적임을보고함. 이나무에서얻어진당은바이오플라스틱이나바이오에탄올과같은바이오기반제품들을생산하는원료로사용될수있음. 또한, 포장시험에서리그닌생합성억제 GM 포플러의경우껍질밑부분의붉은색이강하고붉은색이강한 GM 포플러의에탄올생산수율이 160% 정도로높았음 ( 출처 : http://www.vib.be/en/news/pages/initial-field-test-results-gm-poplars-bioethanol-yield-almo st-doubled.aspx). - 생장이빠른포플러, 유칼립투스나옥수수대 사탕수수줄기와같은초목잔여물들은식량생산에필요한농경지를사용하지않아바이오연료생산의안정적인공급원이될수있음. 벨기에겐트대학교, 영국던디대학교와제임스허튼연구소, 미국위스콘신대학교의공동연구팀은바이오매스를에너지로변환시키는것을억제하는식물의 2차세포벽의주요구성물질인리그닌생합성경로내에서새로운유전자를발견함 ( 출처 : http://mirian.kisti.re.kr/futuremonitor/view.jsp?record_no=240616&cont_cd=gt). - 미시간주립대학및위스콘신대학연구팀은, 포플러나무의유전자를조작, 리그닌을쉽게분해함으로써, 목재를바이오연료로전환시키는노력과비용을절감하는데성공, 이를사이언스에게재함. 또한, 포플러나무에서쉽게분해되는결합을가지는단량체를만들수있는유전자를규명하고분리함. 브리티쉬콜롬비아대학교수 Shawn Mansfield 는이유전자를포플러나무에성공적으로도입함. 이나무는단량체를생산을포함, 리그닌고분자에사용함. 리그닌 backbone에약한결합이존재하도록하고, 포플러나무의천연리그닌을변형시켜더쉽게분해되도록함 ( 출처 : Wilkerson et al., 2014). - 리그닌은동일한식물당을추출, 추출된식물당을개선된바이오연료를만드는데이용하려는사람들에게중요한도전과제임. 리그닌도전과제를극복하기위한경제적인방안을찾기위한연구의일환으로, 미국 JBEI (Joint BioEnergy Institute) 연구진은리그닌을호흡함으로써근본적으로리그닌을분해하는열대우림에서식하는미생물촉매활성을특성화함. 연구진은 E. lignolyticus SCF1이 48시간이내에혐기성조건하에서리그닌 56% 를분해, 대조구에비교하여리그닌이변경된조건에서세포풍부함을증가시킴을 - 33 -
밝힘. 단백질유전정보학분석을통해연구진은리그닌이수정된성장조건과리그닌이수정되지않은성장조건사이에서상당히다른정도로풍부하게존재하는 229개단백질을규명함. 이중 127개단백질은리그닌존재하에서최소 2배까지세포를풍부하게한다고밝힘 ( 출처 : http://newscenter.lbl.gov/2013/11/13/lignin-feasting-microbe/) - 노스캐롤라니아주립대학연구진은바이오연료생산비용을낮추어줄간단하고효율적이며상대적으로저렴한리그닌제거방법을개발함. 이들은양성자성이온액체또는 PIL이라고불리는여러가지액체염들을만드는일부터시작함. 이 PIL들은아세트산같은산과염을섞어만들수있기때문에저렴하며, 전처리공정으로바이오매스와혼합된후열을가하고교반을함. PIL에용해되고남은셀룰로오스는고체상태로가공이용이해져바이오연료생산을위해혼합물에서쉽게거를수있는것으로보고됨 ( 출처 : http://dailyfusion.net/2014/01/new-lignin-removal-method-makes-biofuel-productio n-cheaper-25863/) - 조지아대학교연구자들이 CRISPR/Cas 유전자편집도구를이용, 나무종유전체를처음으로변형시킴. New Phytologist에실린결과에서식물유전자편집을신속정확하게할수있는계기마련함. 이연구진은포플러속의특정유전자를돌연변이시킴으로써자연발생적인중합체 (polymers) 농도를줄이는데리그닌으로생물연료생산에이용되는당과전분을견고한세포벽에축적시키거나, 또다른중합체는농축된탄닌으로, 잎과나무껍질에존재하는데이는반추동물먹이로는사용할수없음을보고함 ( 출처 : http://www.eurekalert.org/pub_releases/2015-06/uog-ure060415.php) 제 7 장연구시설 장비현황 연구시설 장비규격수량활용용도보유기관확보상태비고 Spectrophotometer (Nano-drop) 대 1 DNA, RNA정량 서울대학교 기확보 Gel Doc system 대 1 이미지촬영 서울대학교 기확보 Centrifuge 대 3 핵산분리 서울대학교 기확보 Tissue lyser 대 1 핵산분리 서울대학교 기확보 Incubator 대 2 시료배양 서울대학교 기확보 Autoclave 대 1 멸균 서울대학교 기확보 Deep freezer 대 1 시료보관 서울대학교 기확보 Cold chamber 대 2 시료보관 서울대학교 기확보 Heat block 대 2 핵산분리 서울대학교 기확보 PCR system 대 2 유전자증폭 서울대학교 기확보 유리온실 1 식물재배서울대학교기확보 growth chamber 1 식물재배및배양 서울대학교 기확보 clean bench 2 식물배양 서울대학교 기확보 growth room(23 도 ) room 1 식물재배및배양서울대학교기확보 - 34 -
제 8 장연구실안전관리이행실적 * 연구수행기간중소속기관의연구실안전관리관련규정에따른이행실적 ( 자체양식 ) 1. 연구활동종사자환경안전교육실시가. 신규교육및정기교육 - 석 / 박사신규교육 : 2015년 2월, 8월 ( 매학기당이틀간 14시간 ) - 석 / 박사정기교육 : 서울대학교환경안전원홈페이지와교직원홈페이지에사고사례및안전교육동영상공개 - 학부생신규교육 : 신입생오리엔테이션에서환경안전교육진행, 실험실안전동영상제공 - 학부생정기교육 : 연구개발인력교육원에서개발한연구실안전온라인컨텐츠를서울대온라인강좌기반시스템에접목하여실시나. 수시교육 : 수시 ( 기관의요청에의해실시 ) 다. 병원체및 LMO 실험실안전교육 - 내용 : 생물안전에관한이론교육 (3시간) 및실무교육병행 - 기간 : 2015년 2월 ~ 8월 ( 총20회 ) 라. 방사선안전교육 : - 내용 : 방사선안전이론교육 (6시간) 과방사선취급실습교육병행 - 기간 : 2015년 2월, 8월 ( 총 6회 ) 2. 실험실안전점검 - 실험특성에따라유형별로분류하여일상 정기점검, 특별안전점검, 정밀안전진단실시 [ 표1] 안전점검실험실수 (2014년) A 유형실험실 B 유형실험실 C 유형실험실 D 유형실험실합계 376 441 143 408 1,368 * 실험실분류기준 : A 형 : 미생물및동물 (LMO), 방사성동위원소물질등을사용하는실험실 B 형 : 화학약품등을사용하는실험실 C 형 : 기계 전기설비등을사용하는실험실 D 형 : 실험 실습을수행하지않는설계 컴퓨터관련등의실험실 3. 실험실안전사고대응및예방가. 실험실안전사고대응조직을설치하여대응및처리매뉴얼보완및사고대응훈련실시하여유사사고발생시대응능력향상나. 실험실안전사고에대한경각심을높이고유사사고를예방하기위하여사고사례를이메일을통해전파다. 실험실사고처리흐름도및비상연락스티커제작배포 4. 실험실환경개선사업실시 - 실험실안전사고예방과실험종사자보호를위해안정장비확충, 시설및설비, 노후 - 35 -
기자재교체등실험실환경개선유도 5. 실험폐기물관리강화 : - 실험실에서발생되는실험폐수관리를위해처리 의뢰 반출까지이력을추적관리하는실험폐수처리 의뢰프로그램구축, 실험폐기물발생저감을위해환경안전교육실시 6. 공기오염도조사실시 (2015년) - 내용 : 미세먼지, 휘발성유기화합물, 포름알데히드, 이산화탄소등 7가지항목 7. 연구활동종사자특수건강검진실시및보험가입 - 연구실안전환경조성에관한법률 제18조 4항에따라 산업안전보건법시행령 제29조및동법시행규칙별표 12의2 특수건강진단대상유해인자 및바이러스등에노출될위험성이있는연구활동종사자를모니터링하여특수건강검진실시 - 매년정기적으로보험가입및갱신처리를지속적으로이행함 - 보험가입현황 구분 2015. 6. 12. - 2016. 6. 12. 대학원생보조학부생연구원계석사 / 박사연구생연구원 8,837 7,415 3,442 173 218 20,085 8. 연구활동종사자보험가입추진계획 (2016년도) 가. 가입대상 : 과학기술분야연구개발활동에종사하는학부생, 대학원생, 연구생, 이공계연구소소속연구원 ( 보조연구원포함 ) 나. 보험계약기간 : 2016. 6. 12. - 2017. 6. 12. (1년계약 ) 다. 추진일정 - 보험가입대상자파악 : 2016. 4월중순 ~ 4월말 - 보험료산정및입찰추진 : 2016. 5월중 - 계약예정일 : 2016. 6월초 제 9 장 참고문헌 Albrecht C, Russinova E, Kemmerling B, Kwaaitaal M, de Vries SC (2008) Arabidopsis SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR KINASE proteins serve brassinosteroid-dependent and -independent signaling pathways. Plant Physiol. 148(1):611-9 Denness L, McKenna JF, Segonzac C, Wormit A, Madhou P, Bennett M, Mansfield J, Zipfel C, Hamann T (2011) Cell wall damage-induced lignin biosynthesis is regulated by a reactive oxygen species- and jasmonic acid-dependent process in Arabidopsis. Plant Physiol. 156: 1364 1374. - 36 -
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Kim B, Jeong YJ, Corvalán C, Fujioka S, Cho S, Park T, Choe S (2014) Darkness and gulliver2/phyb mutation decrease the abundance of phosphorylated BZR1 to activate brassinosteroid signaling in Arabidopsis. Plant J. 77(5):737-47. Kim HB, Kwon M, Ryu H, Fujioka S, Takatsuto S, Yoshida S, An CS, Lee I, Hwang I, Choe S (2006) The regulation of DWARF4 expression is likely a critical mechanism in maintaining the homeostasis of bioactive brassinosteroids in Arabidopsis. Plant Physiol. 140, 548 557. Lichtenthaler HK (1987) Chlorophylls and Carotenoids: Pigments of Photosynthetic Biomembranes. Methods in Enzymology. 148:350-382. Lu S, Li Q, Wei H, Chang MJ, Tunlaya-Anukit S, Kim H, Liu J, Song J, Sun YH, Yuan L, Yeh TF, Peszlen I, Ralph J, Sederoff RR, Chiang VL (2013) Ptr-miR397a is a negative regulator of laccase genes affecting lignin content in Populus trichocarpa. Proc Natl Acad Sci U S A. 110(26):10848-53. Maharjan PM, Schulz B, Choe S (2011) BIN2/DWF12 antagonistically transduces brassinosteroid and auxin signals in the roots of Arabidopsis. J Plant Biol 54: 126 134. Milczarek G, Inganäs O (2012) Renewable cathode materials from biopolymer/conjugated polymer interpenetrating networks. Science. 335(6075):1468-71. Nemhauser JL, Mockler TC, Chory J (2004) Interdependency of brassinosteroid and auxin signaling in Arabidopsis. PLoS Biol 2(9):E258 Stavang JA, Gallego-Bartolome J, Gomez MD, Yoshida S, Asami T, Olsen JE, Garcia-Martinez JL, Alabadi D, Blazquez MA (2009) Hormonal regulation of temperature-induced growth in Arabidopsis. Plant J 60(4):589 601. Thordal-Christensen H, Zhang Z, Wei Y, Collinge DB (1997) Subcellular localization of H2O2 in plants. H2O2 accumulation in papillae and hypersensitive response during the barley powdery mildew interaction. Plant J 11(6): 1187-1194. Van Acker R, Leple JC, Aerts D, Storme V, Goeminne G, Ivens B, Legee F, Lapierre C, Piens K, Van Montagu MC, Santoro N, Foster CE, Ralph J, Soetaert W, Pilate G, Boerjan W (2014) Improved saccharification and ethanol yield from field-grown transgenic poplar deficient in cinnamoyl-coa reductase. Proc Natl Acad Sci U S A 111:845-850 Van Acker R, Vanholme R, Storme V, Mortimer JC, Dupree P, Boerjan W (2013) Lignin biosynthesis perturbations affect secondary cell wall composition and saccharification yield in Arabidopsis thaliana. Biotechnol Biofuels 6: 46 Vanholme R, Cesarino I, Rataj K, Xiao Y, Sundin L, Goeminne G, Kim H, Cross J, Morreel K, Araujo P, Welsh L, Haustraete J, McClellan C, Vanholme B, Ralph J, Simpson GG, Halpin C, Boerjan W (2013) Caffeoyl shikimate esterase (CSE) is an enzyme in the lignin biosynthetic pathway in Arabidopsis. Science. 341(6150):1103-6. Wilkerson CG, Mansfield SD, Lu F, Withers S, Park JY, Karlen SD, Gonzales-Vigil Padmakshan ED, Unda F, Rencoret J, Ralph J (2014) Monolignol Ferulate Transferase Introduces Chemically Labile Linkages into the Lignin Backbone, Science. 344 (6179), 90-93 - 38 -
주 의 1. 이보고서는농림축산식품부에서시행한농림축산식품연구개발사업의연구보고서입니다. 2. 이보고서내용을발표할때에는반드시농림축산식품부에서시행한농림축산식품연구개발사업의연구결과임을밝혀야합니다. 3. 국가과학기술기밀유지에필요한내용은대외적으로발표또는공개하여서는아니됩니다. - 39 -