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약학석사학위논문 전립선암항원이형질도입된 항원제시세포를기반으로한백신의 항암효과연구 Studies on the Antitumor Effects of Antigen- Presenting Cell-based Vaccine Transduced with Prostate Cancer Antigen 2017 년 8 월 서울대학교융합과학기술대학원 분자의학및바이오제약학과면역학전공 박명환 1
전립선암항원이형질도입된항원제시세포를기반으로한백신의항암효과연구 Studies on the Antitumor Effects of Antigen- Presenting Cell-based Vaccine Transduced with Prostate Cancer Antigen 지도교수강창율 이논문을면역학석사학위논문으로제출함 2017 년 4 월 서울대학교융합과학기술대학원 분자의학및바이오제약학과면역학전공 박명환 박명환의석사학위논문을인준함 2017 년 6 월 위원장 ( 인 ) 부위원장 ( 인 ) 위원 ( 인 ) 2
국문초록 본연구에서는전립선암치료를목적으로하는항암면역치 료백신에관한연구를수행하였다. 항암면역치료는기존의항 암치료방법에비해부작용이적고우수한효과를낼수있다는 장점이있어더부각되고있다. Dendritic cell, B cell, Monocyte 와같은 Antigen presenting cell 은암항원을적재하여체내에서 항암면역반응을유도할수있다는특징이있기때문에, 항암면 역치료백신을개발하는데사용되어왔다. Dendritic cell 은강한 면역원성을갖고있어, 주로항암면역치료백신개발에이용되 어왔으나, 체내에존재하는수가적어얻기어렵고, 생산비용이 크다는단점이있다. B cell 과 Monocyte 는 Dendritic cell 에비해 면역원성은낮으나, 체내에풍부하게존재하고얻기쉬운장점이 있어본연구실에서는이를기반으로한항암면역치료백신을연구 해왔다. 본연구실에서는 B cell 과 monocyte 의낮은면역원성을 보완하기위해 NKT cell 의 ligand 인 alpha-galactosylceramide 를 3
이용하여면역반응을증진시키고, adenovirus 를이용해 tumor antigen 을 B cell 과 Monocyte 에효과적으로도입하여다양한암 종에서의항암면역치료백신연구를수행했다. 이번연구에서는본연구실에서개발한 B cell 과 Monocyte 를 이용하는항암면역치료백신을이용하여전립선암을치료하기 위한항암면역백신개발을수행하였다. 인간전립선암에서많 이발현되는항원인 human prostatic acid phosphatase(hpap) 를 발현하는변형된 adenovirus 를제작하여항암면역치료백신을제 작하고이백신의항암효과를확인하였다. 우선제작한 adenovirus 가 hpap 을발현하는지확인하는실험을진행하였고 mouse 와 human 의 B cell 과 monocyte 에 adenovirus 를감염시켰 을때 hpap 의 mrna expression 이발현되는것을통해제작된 adenovirus 가 B cell 과 monocyte 에감염되고감염됨으로써원하 는암항원이발현되는것을확인하였다. 그후에이백신이암 항원특이적인 cytotoxic T cell 반응을유도할수있는지알아보 기위해서 in vivo CTL assay 를진행하였다. 그결과 vaccination 4
한 group 에서만항원특이적인 lysis 가유도되는것을볼수있었 다. 또한 hpap 을발현하는 tumor cell line 을활용하여 mouse 에 이식하고 vaccination 한후암의성장을관찰했을때효과적으로 암의성장을억제하는것을확인할수있었다. 마지막으로이백 신이 human 에서도효과가있는지알아보기위해서 human peripheral blood mononuclear cell(pbmc) 을사용해 ELISPOT 을 진행하였다. 그결과백신과 co-culture 한 PBMC group 에서 IFN-γ + 한 spot 의수가 naïve group 에비해더증가된것을볼수 있었고이것으로 human PBMC 에서도백신에의해 T cell response 가유도되는것을볼수있었다. 이번연구를통해서 hpap 를발현하는전립선암환자에본 연구에서개발한 NKT 세포 ligand 를적재하고 hpap 을발현하는 B cell 과 monocyte 를기반으로하는백신을투여한다면효과적 인항원특이적인면역반응을유도하여효과적인항암효과를보 일것으로기대해볼수있다. 주요어 : B cell, Monocyte, Prostatic acid phosphatase(pap), 5
Natural killer T cell(nkt cell), Alpha-galactosylceramide(αGC), Adenovirus, Immunotherapy. 학번 : 2015-26004 6
Contents 1. Introduction 10 2. materials and Methods 15 2.1. Mice 2.2. Cell lines 2.3. hpap 을발현하는 adenovirus 제작 2.4. E.coli 배양조건 2.5. Human B cell 과 monocyte 에제작한 adenovirus transfection 2.6. Mouse B cell 과 monocyte 를기반으로하는 vaccine 제작 2.7. In vivo cytoyoxic T cell response analysis 2.8. Human PAP peptide Library 2.9. Antitumor effect study 2.10. Media 7
2.11. Statistics 3. Results 23 3.1. Human prostatic acid phosphatase 를발현하는변형된 adenovirus 제작 3.2. Adenovirus 로항원이전달된 B cell 과 monocyte 에서의 hpap 발현확인 3.3. 항원제시세포에 loading 된 αgc 에의한 NKT cell 과 NK cell 의활성화확인 3.4. Adenovirus 로항원이전달된백신에의해유도되는항원특 이적인 cytotoxic T cell 반응 3.5. Mouse model 에서백신에의해유도되는항암효과 3.6. Human PBMC 에서백신에의해유도되는면역반응 4. Figures 32 4.1. Human prostatic acid phosphatase 를발현하는 adenovirus 제작 8
4.2. 제작된 adenovirus 에감염된 Human 과 mouse 의 B cell monocyte 에서 hpap mrna 발현확인 4.3. Alpha-galactosylceramide(αGC) 에의한 NKT cell 과 NK cell 활성화 4.4. B cell 과 monocyte 를기반으로만들어진백신에의해일어나 는항원특이적인 Cytotoxic T cell 반응 4.5. 백신접종후 mouse model 에서유발되는항암효과 4.6. 백신에의해유발되는 human T cell 면역반응 5. Discussion 44 6. References 52 Abstract 60 9
1. Introduction 오늘날암환자가계속하여증가되는경향에맞게항암치료방 법또한다양하게제시되고있다. 사람들에게일반적으로알려진 암치료방법은 chemotherapy, radiotherapy, surgery 이지만 chemotherapy 나 radiotherapy 의경우설사, 빈혈, 탈모, 감염등 여러가지부작용을일으킨다는보고가많이있다 [1]. 이에반해 최근 cancer immunotherapy 는기존의치료방법에비해더적은 부작용과더높은효율로이를대체할치료방법으로각광받고있 다. Cancer immunotherapy 중항암면역치료백신의경우암항원에 대해특이적인 cytotoxic 한반응을유도하여정상세포를공격하 는부작용을줄이면서암세포만죽일수있는치료방법이다 [2]. 현재여러가지방법으로백신의연구가진행되고있으며많은백 신들이임상시험단계에서효과를검증하고있다. 많은백신들중 각광받은것은 dendritic cell 을기반으로한백신이다. Dendritic cell 을기반으로한백신은효과적으로암항원에대해특이적인 10
면역반응을일으킨다는사실이알려져있다 [3,4]. 하지만환자로 부터 dendritic cell 은혈액에존재하는양이적기때문에얻기가 매우어려운것뿐만아니라전구체에서분화시키는단계가많은 비용과오랜시간이요구되기때문에임상에서사용하기어렵다는 단점을가지고있다 [5,6]. 그래서본실험실에서는 dendritic cell 이외의 antigen-presenting cell 인 B cell 과 monocyte 을기반으로 한백신을개발하여사용하였다. B cell 과 monocyte 는 dendritic cell 에비해서혈액에많이존재하기때문에얻기가수월하고 dendritic cell 과는달리 in vitro 에서의활성화및분화단계가필 요하지않다는장점이있다 [7,8]. 하지만 B cell 과 monocyte 를기 반으로한백신은 dendritic cell 을기반으로한백신에비해면역 원성이약하기때문에세포백신으로사용되기에적합하지않다는 한계점이있다. 그래서본연구실에서는 natural killer T cell(nkt cell) 의 ligand 인 alpha-galactosylceramide(αgc) 를 B cell 과 monocyte 에적재하여 NKT cell 을자극해 B cell 과 monocyte 를 활성화시킴으로써면역반응을향상시켜위의한계점을극복하였 11
다. 또한 NKT cell 자극으로생성되는다양한 cytokine 으로인해 일어나는다양한면역반응으로백신의부가적인효과를노릴수 있었다 [9,10]. B cell 과 monocyte 의경우항원이전달되어야면역반응을일으 킬수있다. 그래서 B cell 과 monocyte 에효과적으로항원을전달 하고자 adenovirus 를사용하였다 [11]. 본연구에사용된 adenovirus 는기존의 adenovirus vector 인 adenovirus serotype5 가항원전달효율이낮음을보완하고자 serotype5 의 fiber knob 을 serotype35 의 fiber knob 로바꾼변형된형태이다 [12,13]. 이 adenovirus 가기존의 adenovirus 에비해 mouse 와 human 의 B cell 과 monocyte 로의항원전달효율이더우수함을 확인할수있었고본연구실의논문에서또한이와같은사실을 보고한바가있다 [14]. 전립선암은주로남성에게많이발병하며외국에서주요한암 종중하나이다. 영국에서는매년약 32,000 명이상이전립선암 진단을받고있고그중 10,000 명이상이사망에이르게되는치 12
료가어려운암종으로분류된다. 최근에우리나라에서도발병률 이높아지고있는경향을보이며그에따라서사망률도증가하는 추세를보인다. 전립선암에서발현되는암항원은여러가지가 있는데그중에서 prostatic acid phosphatase(pap), prostatespecific membrane antigen(psma), prostate-specific antigen(psa) 이주요한항원으로알려져있다 [15,16]. 이중에서 PAP 은전립선에서생성되는효소이다. 평소에는그양이많지않 지만전립선암이발병되었을경우그발현이매우크게증가되기 때문에전립선암의진단에도사용되고있다. 이러한특징때문에 PAP 은항암백신의이상적인후보군으로생각되고있다 [17,19]. PAP 을표적항원으로사용하여 FDA 승인된백신으로는 Sipuleucel-T(Provenge) 가있으며이밖에다른여러백신들또 한임상실험중에있다 [18,19,20,21]. 본연구에서는 adenovirus 에위에서언급한인간전립선암항 원인 human PAP(hPAP) 을발현하도록제작하였고제작한 adenovirus 를사용하여 mouse 와 human 의 B cell 과 monocyte 에 13
항원전달시켜 hpap 을발현하도록만들었다. 그리고항원을전달 받은 B cell 과 monocyte 에 αgc 를적재하여백신을만들었다. 이백신의효과를알아보기위하여우선백신접종후암항원 특이적인 cytotoxic T cell 반응이일어남을확인하였고 hpap 을 발현하는 B16F10 cell line(b16f10-hpap) 을이식한 mouse model 에서백신을접종한 group 과접종하지않은 group 과의암 의크기차이로 mouse 에서백신의효과가있음을확인하였다. 그 리고마지막으로이백신이사람에게도효과를보일수있는지 human interferon-γ + (IFN-γ + ) ELISPOT 을사용해그효능을측정 했다. 백신과 co-culture 한 human PBMC group 에서 naïve group 에비해 IFN-γ + 한 spot 의수가더많은것으로보아이백신에 의해서사람의 PBMC 에서도 T cell 반응이유도되는것을볼수 있었다. 14
2. Materials and Methods 1. Mice 실험을위해 6 주령의 Female C57BL/6 mouse 를 Charles River Laboratories (Seoul, Korea) 로부터구매하였다. 모든마우스는서 울대학교약학대학실험동물사육시설에서사육되었으며, 모든실 험은서울대학교동물실험위원회의규정과가이드라인에따라수 행되었다. 2. Cell lines 전립선암모델에서실험하기위해 C57BL/6 마우스유래의 T cell lymphoma cell line 인 EL4 와 melanoma cell line 인 B16F10 에 hpap 유전자를도입하여제작된 EL4-hPAP, B16F10-hPAP 을사용하였다. 그리고 adenovirus 감염후 hpap 의발현을확인 하기위해서 human B cell lymphoma 로부터유래된 CCRF-SB cell line 을사용하였다. 그리고 adenovirus 생산을위해서 HEK 15
293R cell 을사용하였다. 3. hpap 을발현하는 adenovirus 제작 PCR 에는 npfu Forte(Enzynomics) 가사용되었고필요한 PCR primer 는 Cosmo gene tech 에서제작하였다 (Primer: AAT TCG GTA CCA TGA GAG CTG CAC C, GCT ACC TCG AGC TAA TCT GTA CTG TCC T). Restriction enzyme 으로 Kpn I(Enzynomics) 과 Xho I(Enzynomics) 을사용하였다. Sequencing 과 sequencing primer 제작또한 Cosmo gene tech 에서진행하였 다 (Primer: CAG GAT TAC ATG GCC AGG, CTA ATC TGT ACT GTC CTC AG, AAC GAG GGC AGT TCC, TGA ACC GTC AGA TCG CCT). Plasmid DNA extraction 에는 Plasmid mini extraction kit(bioneer) 와 Plasmid Maxi kit(qiagen) 을사용하였 다. Transformation 에는숙주대장균으로 DH5α(Biofact) 가사용 되었다. Inoculation 과 spreading 은 E.coli 배양조건과같이진행되 16
었다. Adenovirus purification kit(clontech) 로정제를하였고실 험에사용하기위해서 kit 정제한 adenovirus 로더많은양의 adenovirus 를생산하여 Fast Protein Liquid Chromatography(FPLC) 로정제하였다. FPLC 로정제된 adenovirus 를사용하여 Plaque Forming Unit(PFU) assay 를진행 하였다. 구해진 PFU 값을이용하여실험에사용하였다. 4. E. coli 배양조건 Inoculation 은 120 에서 autoclave 된 LB broth(affymetrix) 를사용하였고 Shaking incubator 에서 200rpm, 37 조건으로 15 시간동안배양하였다. Transformation 후 spreading 에는 120 에 서 autoclave 된 LB agar(bd) 를 90Φ petri dish(spl) 에굳혀서사 용하였고 incubator 에서 37 조건으로 15 시간동안배양하였다. 5. Human B cell 과 monocyte 에제작한 adenovirus 감염 17
실험실에있는저장된 human PBMC 를사용하였다. B cell 은 anti-cd19 microbead(miltenyi biotech) 를사용하여 MACS 로분 리하였고 monocyte 는 anti-cd14 microbead(miltenyi biotech) 를 사용하여분리하였다. B cell 과 Monocyte 는각각 1 10 6 cell 씩 사용하였고 virus 는 10000 virus particle(vp)/cell 의농도로 37 에서 15 시간동안 incubation 하였다. 6. Mouse B cell 과 monocyte 를기반으로하는백신제작 C57BL/6 mouse 를 sacrifice 하여비장을적출하고균질화한후 적혈구를제거하였다. 얻어진비장세포에 anti-b220, anti- CD11b(miltenyi biotech) 을처리하고 MACS 를이용하여 B cell 과 monocyte 를함께분리하였다. 분리한 B cell 과 monocyte 를합쳐 서 1 10 7 cell 씩 12-well 에깔아준후 100MOI(multiplicity of infection) 의비율로제작한 adenovirus 를첨가하였다. αgc 는 1ug/ml 의농도로첨가한후 37 에서 15 시간동안 incubation 하 였다. 18
7. In vivo Cytotoxic T lymphocyte analysis Day 0 에 C57BL/6 mouse 를 sacrifice 하여위의방법으로 mouse B cell 과 monocyte 를기반으로한백신을제작하였고백 신 group 을두개로나눠서한쪽에는 adenovirus 과 αgc 를첨가 하였고다른 group 에는 adenovirus 는없이 αgc 만첨가하였다. 15 시간동안 37 incubator 에서 incubation 시킨후에 Day 1 에 cell 을 harvest 하여 counting 을하였다. 4 10 6 cells/ml 의농도 로 RPMI 1640 에풀어서 500ul 씩각 group 당 3 마리씩 C57BL/6 mouse 의꼬리에정맥주사하였다. Day 8 에 C57BL/6 mice 를 sacrifice 하여비장을적출하여균질화하였다. 얻은비장세포를 peptide 를처리한 group 과처리하지않은 group 으로나누어두 group 모두 1 시간 30 분동안 37 CO2 incubator 에서 incubation 하였다. Peptide 처리를끝내고 washing 후 15 분간 CFSE label 을하였다. CFSE labeling 이끝나면만들어진 Target 을 peptide 를처리한 group 과처리하지않은 group 각각 5:5 의 19
비율로섞어 2 10 7 cells/ml 의비율로 dpbs 에풀고 500ul 씩 C57BL/6 mouse 의꼬리에정맥주사로주입했다. 다음날 target 을주사한 mouse 를 sacrifice 하여비장세포를얻었고비장세포 에서적혈구을제거한후 Flow cytometry 로분석했다. 항원특이 적인 lysis 정도는다음과같이계산된다. r(ratio)=(%cfse Low /%CFSE High ), %Lysis=[1-(r unprimed /r primed )] X 100 즉, CFSE High 세포의비율이낮을수록항원특이적인 lysis 가 높게일어난것을의미한다. 8. Human PAP peptide Library 이전실험실에서합성했던 library 를동일하게사용하였다 [22]. Library 의구성으로는 hpap 을구성하는 1 번 386 번 amino acid 중각각 7 개가중복되도록하여연속된 9-mer 로제작되었고총 188 개중 hydrophobicity 가높은 1 개의 peptide 를제외하여 187 개를합성하여 mixture 로사용하였다. 20
9. 항암효과측정 Human prostatic acid phosphatase(hpap) 를발현하는 B16F10-hPAP 암세포를 Day 0 에 C57BL/6 mouse 에 2 10 5 cells 을피하주사했다. 그리고 Day 3 부터 6 일간격으로백신을암 세포를이식한 C57BL/6 mouse 의꼬리에 2 10 6 cells 씩정맥 주사로주입했다. 그리고 Day 4 부터 tumor 의 volume 을 Digital Vernier Calipers 로측정하였다. 10. Media hpap 을발현하는 EL4-hPAP 는 RPMI 1640(Gibco) 배지에 FBS(Gibco) 10%, 200ng/ml 로 첨가하여배양하였다. B16F10- hpap 는 DMEM(Gibco) 배지에 FBS(Gibco) 10%, 200ng/ml 로첨 가하여배양하였다. HEK 293R cell 은 DMEM 배지에 FBS 10% 를 첨가하여배양하였다. Adenovirus transfection 에사용된배지는 Complete Media(CM) 배지로 RPMI 1640 배지에 FBS 10%, 21
Penicillin/Streptomycin(Lonza) 1%, Sodium pyruvate(gibco), NEAA(Non-Essential Amino Acid, Gibco), HEPES(4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, Gibco), β- mercaptoethanol(gibco) 을적정배수로희석하여사용하였다. 11. Statistics 결과는 means±s.e.m. 으로표현하였고통계적유의성은 Graph Pad Prism software (La Jolla, CA, USA) 를사용하여분석하였다. A 두그룹간의차이를비교할때는 two-tailed Student`s t-test 를사용하였다. P-values < 0.05 를 95% 신뢰구간에서유의적인 것으로간주하였다. 3. Results 22
3.1. Human prostatic acid phosphatase 를발현하는변 된 adenovirus 제작 본연구실에있는 pcdna3.1_hpap 으로부터 hpap full sequence DNA 를 PCR 을통해얻었다. Insert(hPAP) 와 vector(pshuttle-tet10) 에 restriction enzyme 처리후 gel electrophoresis 를사용해서 size 를비교했다 (Fig. 1B). 원하는 DNA 가있음을확인하고 vector 과 insert 를 ligation 시켰다. Ligation 이완료된 plasmid DNA 를 competent cell(dh5α) 에 transformation 시키고 Plasmid mini prep kit 를사용하여 plasmid DNA 를얻었다. 이 plasmid DNA 에제한효소를처리하여 gel electrophoresis 를통해 size 확인을하였으며업체에 sequencing 을맡겨서 hpap sequence 가정상적으로들어있음을 확인하였다. hpap 이들어있는 pshuttle vector 에제한효소 (Pme I) 을처리하여 linear 한형태로만들어 adenovirus vector 에 23
homologous recombination 을통해서 hpap sequence 를 adenovirus vector 에삽입하였다. 완성된 adenovirus vector 에제 한효소 (Pac I) 을처리하고 gel electrophoresis 를통하여 4kb~5kb 정도의 band 가관찰됨으로 adenovirus vector 가잘완성된것을 확인하였다 (Fig. 1C). 그리고완성된 adenovirus vector 를업체에 sequencing 을맡겨최종확인을하였다. 이완성된 adenovirus vector 를제한효소 (Pac I) 처리후 HEK 293R cell 에 lipofectamine2000 을사용하여 transfection 시켰다. 그후 Cytopathic effect(cpe) 가 관찰되었을때 cell 을 harvest 하였고 freezing & thawing 을통해서 crude lysate 를만들었다. 이 lysate 를 HEK 293R cell 에 2 nd transfection 시킨후 CPE 가관찰되었을 때 cell 을 harvest 하여 adenovirus purification kit 를사용하여 virus 를정제했다. Kit 정제된 virus 를사용하여 CS10 Flask 1 개 분량의 HEK 293R cell 에서 virus 를생산하였고 FPLC 정제를완 료했다 (Fig. 1A). 정제가완료된 adenovirus 를사용하여이 adenovirus 가 target gene 을발현하는지알아보았다. CCRF-SB 24
cell 에 adenovirus 를 10000vp/cell 의비율로감염시켰고 mrna 를 추출하여 cdna 를합성했다. 이 cdna 를 hpap 을발현하는 tumor cell line 으로부터 mrna 를얻어합성한 cdna 그리고 wild type 의 CCRF-SB cell 로부터 mrna 를얻어합성한 cdna 와 gel electrophoresis 를통해 band 의크기비교를했다. 그결과 adenovirus 에 transfection 된 CCRF-SB 에서 hpap 의 mrna 가 합성됨을볼수있었다 (Fig. 1D). 3.2. Adenovirus 로항원이전달된 B cell 과 monocyte 에 서의 hpap 발현확인 위의방법 (Fig. 1A) 과같이생산된 hpap 을발현하는 adenovirus 가백신의원료로쓰일 B cell 과 monocyte 에감염되어 hpap 을발현하는지실험했다. Mouse B cell 과 monocyte 에제작한 adenovirus 를감염시켰을때전달하고자하는 hpap 이잘발현되 는지알아보기위해 Mouse 비장세포에서 B cell 과 monocyte 를 25
각각분리해서감염시킨후에 mrna 를추출하여 cell 에서일정하 게발현된다고알려진 mouse HPRT 와상대적인발현양을 qpcr 을통해비교했다 (Fig. 2A, 2B). Mouse B cell 과 monocyte 에서는 adenovirus 감염후 hpap 이발현됨을확인했다. 그렇다면나중에 백신이쓰일 Human 에서도 B cell 과 monocyte 에제작한 adenovirus 를감염시켰을때 hpap 을발현하는지를알아보기위 해서 human Peripheral blood mononuclear cell(pbmc) 에서 B cell 과 monocyte 를각각분리하여감염시킨후 human HPRT 와 상대적인발현양을 qpcr 을통해비교했다 (Fig. 2C, 2D). 그결과 Human 에서도 adenovirus 에의해 hpap 이발현될뿐만아니라발 현양또한 mouse 에비해서월등히향상된것을확인했다. 3.3. 항원제시세포에 loading 된 αgc 에의한 NKT cell 과 NK cell 의활성화확인 다음으로백신에서 B cell 과 monocyte 에 loading 되는 αgc 가 26
NKT cell 과 NK cell 를활성화시키는지확인했다. Mouse 에백신 접종을마치고 NKT cell 은 10 시간, NK cell 은 24 시간후에각각 mouse 의비장세포로부터얻어서 Flow cytometry 로분석하였다 (Fig. 3A). NKT cell 과 NK cell 모두 normal group 에비해서백신 접종된 group 에서 IFN-γ 의발현이증가된것을볼수있었다 (Fig. 3B). 이결과로볼때 αgc 가 NKT cell 과 NK cell 을 activation 시 키는것을볼수있다. 3.4. Adenovirus 로항원이전달된백신에의해유도되는 항원특이적인 cytotoxic T cell 반응 위에서제작된 adenovirus 가 hpap 을발현하는것을확인하 였고 αgc 에의한 NKT cell 과 NK cell 의활성화도확인했다. 그렇 다면제작한백신이항원특이적인치료효과가있는지알아보기 위해서 in vivo 에서암항원인 hpap 에대해특이적인 cytotoxic T cell 반응을측정했다. Mouse B cell 과 monocyte 로제작한백 27
신을 C57BL/6 mouse 의꼬리에정맥주사하였다. Day 7 에 C57BL/6 mouse 의비장세포를사용하여 target cell 을만들었다. Target cell 은 hpap peptide library 가적재되있는 group 과적재 되지않은 group 으로나누었고 peptide 가적재된 group 은 CFSE 의농도가높은 CFSE high group 이되도록하였고 peptide 가적재 되지않은 group 은 CFSE 의농도가낮은 CFSE Low group 으로하 였다. 그리고이두 group 을섞어 CFSE high 한 cell 과 CFSE Low 한 cell 의비율이 5:5 가되도록만든후에 C57BL/6 mouse 의꼬리에 정맥주사했다. 하루뒤에접종한 mouse 의비장세포에서 CFSE high 한 cell 과 CFSE Low 한 cell 의비율을 Flow cytometry 로 분석하였다 (Fig. 4A, 4B). 그결과, adenovirus 로암항원을전달 해준백신을처리한 group 에서 CFSE High 한 cell 들이많이줄어든 것을볼수있었고 (Fig. 4C). Normal group 이나암항원을전달해 주지않은백신을처리한 group 은 CFSE High 한 cell 들이많이줄어 들지않은양상을볼수있었다. 이결과를볼때 adenovirus 로 암항원을전달받은백신에의해서 hpap 에대한특이적인 28
cytotoxic T cell 반응이일어났고이 T cell 에의해 target cell lysis 가일어났음을알수있다. 3.5. Mouse model 에서백신에의해유도되는항암효과 위에서백신에의한암항원특이적인반응이일어남을확 인하였다. 그렇다면이백신이 mouse 에미리심어진 tumor 에서 도항암효과를보이는지알아보았다. 사용한 tumor 는실험실에 예전에만들어져있었던 B16F10-hPAP tumor cell line 를사용 했다. 실제로이 tumor cell line 이 target 암항원인 hpap 을발 현하는지알아보기위해서 B16F10 wild type 과 hpap mrna 발현을비교했고이전에같이만들어져있었던 hpap 을발현하 는 EL4-hPAP tumor cell line 도같이비교했다 (Fig. 5A). 그결 과 wild type 에비해만들어진 cell line 에서 hpap mrna 발현 의양이높은것을볼수있었다. Day 0 에 B16F10-hPAP tumor cell 을 C57BL/6 mouse 에 이식하고 Day 3 에 adenovirus 를사용해항원을전달한 group 과 29
전달하지않은 group 으로나누어백신을만들어각각 group 에 맞게백신을접종했다. 그리고 6 일간격으로백신접종을진행 했다. Day 4 부터 tumor size 를측정하였고 tumor volume 을계 산하여비교했다 (Fig. 5B). Tumor volume 을비교한결과 normal group 과암항원을전달받은백신을접종한 group 간에 는통계적으로유의미하게크기차이가나는것을볼수있다. 또한암항원을전달하지않은백신을접종한 group 과암항원 을전달받은백신을접종한 group 간에는통계적으로유의미하진 않지만차이가발생한것을볼수있다 (Fig. 5C). 이결과를볼 때제작한백신이 mouse 에이식되어있는 tumor 에도효과적으 로작용하는것을알수있다. 3.6. Human PBMC 에서백신에의해유도되는면역반응 위의실험에서암항원을전달받은백신이 mouse 에서 hpap 을 발현하는 B16F10 tumor cell 을상대로효과가있음을확인했다. 그렇다면이백신이최종목표인 human 에서도효과가있는지알 30
아보기위해서 human PMBC 를사용하여 Elispot 을통해 T cell 반응이일어나는지보았다. Fig. 6A 와같은 schedule 로실험을진 행했다. 같은사람의 B cell 과 monocyte 로제작한백신을 coculture 한 T cell 과 normal T cell 간에 spot 수의차이를육안으로 도볼수있었다 (Fig. 6B). 이것을 Elispot counter 를사용하여 counting 한후결과를비교했을때 normal group 과백신과 coculture 한 group 에서통계적으로유의미하게 spot 수의차이가나 는것을볼수있었다 (Fig. 6C). 이결과를볼때백신이 human 에 서도 T cell 반응을일으킬수있고이로인해항암효과가일어 날수있음을간접적으로알수있었다. 31
4. Figures Figure 1. Human prostatic acid phosphatase 를발현하는 adenovirus 제작 A 와같은 scheme 으로 hpap 을발현하는 adenovirus 를제작하고 생산하였다. 만드는과정에서 Insert(hPAP) 와 vector(pshuttletet10) 의 DNA size 를 gel electrophoresis 로확인하였다 (B). 완성 된 adenovirus vector 에 restriction enzyme(pac I) 을처리하여 32
vector 가제대로합성됬을때나오는 4kb~5kb 의 band 를확인하 였다 (C). Adenovirus 를완성시킨후에 CCRF-SB cell line 에감염 시켜 cdna 를추출하여 hpap 을발현하는 cell line 인 B16F10- hpap, EL4-hPAP 에서추출한 cdna 와 gel electrophoresis 를사 용해비교하고 adenovirus 에의해 hpap 이발현되는것을확인하 였다 (D). 33
Figure 2. 제작된 adenovirus 에감염된 Human 과 mouse 의 B cell monocyte 에서 hpap mrna 발현확인 Figure 1 에서제작한 adenovirus 를사용하여 mouse 의 B cell 과 monocyte 에각각 2500vp/cell, 5000vp/cell, 10000vp/cell 의비 율로감염시켰고 hpap mrna 발현을 mouse HPRT mrna 발현 과 qpcr 을통해상대적으로비교하였다 (A, B). Human 의 B cell 과 34
monocyte 에각각 5000vp/cell, 10000vp/cell 의비율로감염시켰 고 hpap mrna 발현을 human HPRT mrna 발현과 qpcr 을통 해상대적으로비교하였다 (C, D). 35
Figure 3. Alpha-galactosylceramide(αGC) 에의한 NKT cell 과 NK cell 활성화 A 와같은 scheme 으로백신에 loading 한 αgc 에의해서 NKT cell 이활성화되고그결과로 NK cell 도활성화되는지확인하였다. 백 신을접종한 group 의 mouse NKT cell 에서접종하지않은 naïve group 의 NKT cell 에비해 IFN-γ 을발현하는세포의비율이증가 36
되는것으로 NKT cell 의활성화를확인하였고그후에 NK cell 에 서또한 IFN-γ 을발현하는세포의비율이증가되는것으로 NK cell 도활성화된것을확인하였다 (B). 37
Figure 4. B cell 과 monocyte 를기반으로만들어진백신에의해일 어나는항원특이적인 Cytotoxic T cell 반응 C57BL/6 mouse 에 A 와같은 scheme 으로실험을진행하였다. mouse 에백신접종을한뒤일주일후에 C57BL/6 mouse 를 sacrifice 하여비장세포를얻었고이비장세포를이용하여 target cell 을 CFSE High 한 group 과 CFSE Low 한 group 으로나누어 38
만들어 5:5 의비율로섞었다. 섞어준 target cell 을백신접종을했 던 mouse 와하지않았던 mouse 에정맥주사하고다음날주사한 mouse 를 sacrifice 하여비장세포를얻어 FACS 로분석하였다 (B). B 의 FACS 분석에서 CFSE High 한 group 과 CFSE Low 한 group 을이 용하여아래와같은계산식으로항원특이적인 lysis 비율을계산하 여비교하였다 (C). r(ratio)=(%cfse Low /%CFSE High ), %Lysis=[1-(r unprimed /r primed )] X 100 39
Figure 5. 백신접종후 mouse model 에서유발되는항암효과 기존에실험실에존재하는 hpap 을발현하도록만든 cell line 인 B16F10-hPAP 과 EL4-hPAP 이 hpap 을발현하는지 hpap mrna 발현을각각의 wild type 의 cell line 에서얻은 mrna 와 각각비교하였다 (A). B 의 scheme 으로 C57BL/6 mouse 를사용하 여실험을진행하였다. B16F10-hPAP 을 mouse 에피하주사하고 3 일뒤에첫번째백신을투여했다. 그리고 6 일간격으로같은양의 40
백신을투여했다. Tumor 를주사한 4 일뒤부터 tumor size 를이틀 간격으로측정했다. 백신을투여하지않은 group, adenovirus 로 항원을전달하지않은백신을투여한 group 그리고완전하게만 든백신을투여한 group, 이렇게세 group 으로나누어각각 tumor volume 을측정하고비교하였다 (C). 41
Figure 6. 백신에의해유발되는 human T cell 면역반응 A 의 scheme 와같이실험을진행했다. 백신을만들어서 PBMC 와 co-culture 했다. 6 일뒤에 PBMC 에서 T cell 을제거하고남은항원 제시세포에 hpap 의 peptide library 를 loading 하여 Day 8 에넣어 줄항원세시세포를만들었다. Day 8 에 culture 하고있는 PBMC 에 서 CD8 T cell 과 CD4 T cell 을각각분리하고어제만들어 incubation 해둔항원제시세포와 20:1 의비율로 Elispot plate 에서 co-culture 했다. Day 10 에 development 하여 well 의 spot 을 42
counting 하여 Naïve PBMC group 과백신과 co-culture 한 group 의 spot 의수를비교했다 (B, C). 43
5. Discussion 최근에사망원인중 1 위는암으로인한사망이다. 이러한이 유로암에대한치료에많은관심을쏟고있는추세이다. 기존의 암치료방법으로알려진 radiotherapy, surgery, chemotherapy 등은여러가지부작용이발생한다는단점들이있다. 이러한방법 들과는다르게더적고약한부작용을가지고있으면서도더높은 치료효율을보이고있는 immunotherapy 가기존의치료방법을 대체할방법으로각광받고있다. Cancer immunotherapy 는암이 생겼을때발생하는암항원을인식하고암항원특이적으로 cytotoxic 한반응을유도하여암세포만골라서죽이기때문에정 상세포를공격하는부작용을줄일수있는방법이다. Dendritic cell(dc) 은인체내의항원제시세포중항원제시 효과가가장큰세포로 T cell 에강한 co-stimulation 을유도하고 암항원을제시함으로써암항원특이적인면역반응을효율적으 44
로유도할수있는세포이다. 하지만혈액과 lymphoid tissue 에서 양이적어환자에게서분리하기어렵고, Dendritic cell 의전구체에 서활성화되도록분화시키는단계가비용과시간이많이요구되어 임상에서사용되는데어려움이있다는단점이있다. 그래서본실 험실에서는 DC 를대체할수있는항원제시세포인 B cell 과 monocyte 를이용하여세포백신을제작하는방법을고안했다. Adenovirus 를사용하여암항원을항원제시세포전달하여 DC 에 비해서 B cell 과 monocyte 가 antigen uptake 가낮다는단점을극 복하였고 NKT cell ligand 중하나인 alphagalactosylceramide(αgc) 을항원제시세포에적재하여 NKT cell 을활성화시켜더많은면역반응을일으킴으로써 B cell 과 monocyte 가 DC 에비해서 co-stimulation 능력이떨어진다는점 을보완하였다. 이번연구에서는최근발생하는암중에서빈도가높다고알 려진전립선암 [23, 24] 을 target 으로하는백신을만들어치료에 쓰일수있는지그효능을검증했다. 널리알려진전립선암항원 45
중하나인 human prostatic acid phosphatase(hpap) 을 target 항 원으로선정하여 hpap 을발현하는 adenovirus 를제작하였다. 이 adenovirus 는기존의 adenovirus serotype 5 와는다르게사람의 lymphocyte 에발현된다고알려진 CD46 을통해서더효과적으로 감염되도록만든변형된형태이다. 이 adenovirus 를통해 target 항원인 hpap 을백신의기반이되는 B cell 과 monocyte 에전달하 고 B cell 과 monocyte 의약한 co-stimulation 능력을보완하고자 αgc 를적재하여백신을제작하였다. 우선제작한 adenovirus 가제대로 target 항원인 hpap 을발 현하는것을확인했다 (Fig. 1D). 그리고백신의기반이되는 B cell 과 monocyte 에제작한 adenovirus 가항원을전달시키는것을 확인했다 (Fig. 2). 그리고백신을만들때항원제시세포에적재했 던 αgc 에의해서 NKT cell 이활성화되는것을 IFN-γ 을발현하는 NTK cell 의증가를통해볼수있었고 NKT cell 이활성화됨에따 라 NK cell 또한활성화되는것을 IFN-γ 을발현하는 NK cell 의 증가를통해볼수있다 (Fig. 3). 이렇게만들어진백신이제대로 46
작동하는것을확인하였고이백신이암항원특이적인면역반응 을유도하는지알아보았다. Mouse 에서백신이효과가있는지알 아보기위해먼저백신에의해유도되는암항원특이적인 T cell 의 cytotoxic 한반응을보기위한실험을진행했다. Adenovirus 를통 해서항원을전달한백신을투여받은 group 에서 naïve group 이 나항원을전달하지않은백신을투여한 group 에비해 lysis 비율 이통계적으로유의미하게차이가나는것을볼수있다 (Fig. 4). 백신이암항원에반응하는 T cell 반응을유도함을확인하였으므 로 mouse 에이식된 tumor 를대상으로백신이효과를보일수있 는지알아보았다. hpap 을발현하도록만든 B16F10-hPAP tumor cell line 의 hpap 발현을 mrna qpcr 을통해확인하였고 mouse 에 tumor cell 을이식한후에 3 일뒤백신접종을하고그후 6 일 간격으로 3 번더진행하였다. Tumor volume 을 4 일째부터 2 일간 격으로측정한결과 Naïve group 과항원을전달한백신을투여한 group 간에서만통계적으로유의미하게 tumor volume 의차이를 보였고항원을전달하지않은백신을투여한 group 과항원을전 47
달한백신을투여한 group 간에는차이는보였으나통계적으로유 의미하지는않았다 (Fig. 5). 마지막으로사람의전립선암에이백 신이효과를볼수있는지알아보기위해서 human PBMC 를사용 하여 Elispot 을통해 T cell 반응이일어나는지확인해보았다. 만 든백신과 PBMC 를 co-culture 한후에 7 일뒤에 CD8 T cell 과 CD4 T cell 을각각분리하여 hpap peptide library 가 loading 된 항원제시세포와함께 culture 하고 48 시간후에 development 했다. 백신과 co-culture 한 PBMC 에서얻은 T cell 을넣어준 well 에서 IFN-r + 한 spot 의수가 naïve PBMC 의 T cell 을넣어준 well 의 spot 과비교했을때 CD8 T cell 과 CD4 T cell 모두백신과 coculture 한 group 에서통계적으로유의미하게증가된것을볼수 있다 (Fig. 6). 실험결과를놓고봤을때 Figure 4 에서 hpap 에특이적인 lysis 가약 80% 정도되는반면 Figure 5 에서 tumor 치료효과는 그정도로나타나지못하는부분을볼수있다. 이것은실험실에 서만들었던 tumor cell line 이항원발현에문제가있다고생각된 48
다. 실제로실험후사용했었던 tumor cell line 의 stock 을가지고 subcloning 을한결과를볼때항원을높게발현하는 tumor cell 과낮게발현하는 tumor cell 이섞여있는점을발견할수있었고 항원을높게발현하는 tumor cell 은 T cell 에인식되어 killing 되지 만낮게발현하는 tumor cell 은 T cell 에인식되지않아죽지않고 계속자라서나중에 tumor 에서항원을높게발현하는 cell 의비율 이적어지게되고암이자라면서 T cell 에인식되지않는 tumor cell 만들어나게되니나중에투여한백신에의해서는효과가떨어 지게된것이라고생각된다. 그럼에도초기시점에서백신을투여 했을때 mouse 와 naïve mouse 와의 tumor volume 차이가많이나 는이유는 αgc 에의해활성화된 NKT cell 에의해활성화되는 NK cell 의작용과 hpap 을높게발현했던 tumor cell 들이항원특 이적인 T cell 반응에의해 killing 되었기때문이라고생각된다. 이결과들을토대로본연구의 target 항원인 hpap 을 adenovirus 로전달한 B cell, monocyte 을기반으로한백신이 hpap 을발현하는전립선암의치료에효과가있음을알수있었 49
다. PAP 을 target 항원으로사용하여임상진행중인백신의경우 에는아직효과가별로좋지않은결과를보이는것이많다. 본연 구에서도 PAP 을 target 항원으로사용한백신이효과가있지만 mouse 데이터나 human 데이터에서도효과가조금부족하다고생 각되는상황이다. 이렇게효과가부족한점을보충하기위해서 immune checkpoint 를 block 하거나 peptide 나 DNA 의전달효율 을증진시키는방법, 새로운항원발굴등다양한방법이연구되 고있다 [19, 25, 26]. 최근에는전립선암의항원들중에서 prostate-specific membrane antigen(psma) 를사용한백신연구 가많이진행되고있다 [27, 28, 29]. PAP 을 target 항원으로사용 한백신의경우효과는조금부족하지만임상에서적은 adverse event 가발생한다는보고가있고 PAP 이거의모든전립선암에서 발현되기때문에백신이쓰일수있는범위가넓다는장점이있다. 이와다르게 PSMA 는 antibody 가생성되고임상에서효과또한 좋은결과를보이고있지만심장이나뇌에서도 PSMA 가조금발 현된다는보고가있어백신의 target 으로사용했을때뇌나, 심장 50
에대한부작용측면에서도고려를해야할점이있다. 그래서 PAP 과 PSMA 에서 epitope mapping 을통해 epitope 이많은부분 을선별하고 PSMA 에서심장이나뇌에영향을끼칠수있는 domain 을제거해융합하여사용할계획을하고있다. 이융합된 항원을사용해백신에전달하여사용한다면 target 항원이 PAP 단독일때보다전립선암에대해더많은 epitope 을제시하여더 다양한전립선암의치료에쓰일수있을뿐만아니라효과도 PAP 단독으로사용했을때보다더향상될것이라고예상해본다. 51
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Abstract Studies on the Antitumor Effects of Antigen-Presenting Cell-based Vaccine Transduced with Prostate Cancer Antigen Myung-Hwan Park Dept. of Molecular Medicine and Biopharmaceutical Science Graduate School of Convergence Science and Technology Seoul National University In cancer therapy, many kinds of ways have been attempted, but it has many problems such as limitation of surgery and 60
toxicity of chemotherapy. Recently, Immunotherapy takes center stages, because it can activate patient`s immune system and then induces tumor cell-specific cytotoxicity. Especially, dendritic cell(dc)-based vaccines are already used in clinical trials. However, DC-based vaccines have some limitations. So, our laboratory has investigated B cell and monocyte-based vaccines that is one of antigen-presenting cells. B cell and monocyte offer an attractive source as an alternative for cellular vaccines for their abundance in blood and lymphoid tissues. It is also easy to expand B cell and monocyte ex vivo. But, B cell and monocyte also have a limitation in that they have weak immunogenicity. To overcome this limitation, our laboratory have used α-galactosylceramide(αgc) that is an natural killer T cell(nkt cell) ligand. αgc leads to activate NKT cell and then activated NKT cell lead to activation of T cell, B cell, and natural killer cell(nk cell). 61
In this study, I constructed an adenovirus that expressed human prostatic acid phosphatase(hpap). hpap is one of the prostate cancer antigens. When B cells and monocytes were infected by constructed adenovirus, I confirmed that infected B cells and monocytes expressed hpap mrna in both human and mouse. B cell and monocyte-based vaccine was transduced with constructed adenovirus and loaded with αgc. I confirmed that αgc loaded on antigen-presenting cells induced activation of NKT cells and NK cells. After verifying that this vaccine was working properly, I analyzed the antitumor effects of this vaccine. First, I confirmed that this vaccine elicited antigenspecific T cell response in vivo. Second, I investigated the antitumor effects in mouse model. B16F10 tumor cell line transduced with hpap was transplanted in C57BL/6 mice. After 3days, the mice were vaccinated. Thereafter, the mice were 62
vaccinated three more times at 6-day intervals. As a result of measuring the tumor volume, I observed that the tumor volume of vaccinated group was smaller than naïve group. Finally, I investigated that this vaccine induced T cell responses in human. Elispot was conducted to observe the effects of vaccine on T cells. As a result, the number of IFN-γ + spot was increased at vaccine treatment group. So, I confirmed that this vaccine was effective in the treatment of human prostate cancer. In conclusion, through this study, I confirmed that this vaccine induced PAP-specific immune response. This vaccine was effective in prostate cancer of mouse. In addition, it was able to have effects on prostate cancer of human. Key words: B cell, Monocyte, Prostatic acid phosphatase(pap), Natural killer T cell(nkt cell), Alpha-galactosylceramide(αGC), 63
Adenovirus, Immunotherapy. Student number: 2015-26004 64