(72) 발명자 최종순 대전광역시유성구과학로 , 생명과학연구부 1 동 ( 어은동, 한국기초과학지원연구원 ) 김승일 대전광역시유성구과학로 , 생명과학연구부 1 동 ( 어은동, 한국기초과학지원연구원 ) 박창균 대전광역시유성구과학로 ,

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아민 순
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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 31/155 ( ) A61K 31/065 ( ) A61K 31/045 ( ) A61P 3/10 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2011 년 08 월 11 일 심사청구일자 (56) 선행기술조사문헌 DIABETES, 2009 KR A 2011 년 08 월 11 일 (45) 공고일자 2013년02월21일 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2013년02월15일 (73) 특허권자 한국기초과학지원연구원 대전광역시유성구과학로 ( 어은동 ) (72) 발명자 김건화 대전광역시유성구과학로 , 생명과학연구부 1 동 ( 어은동, 한국기초과학지원연구원 ) 김수현 대전광역시유성구과학로 , 생명과학연구부 1 동 ( 어은동, 한국기초과학지원연구원 ) ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 이희숙, 김석만, 김경화전체청구항수 : 총 6 항심사관 : 박제현 (54) 발명의명칭 CYP4A 저해제를유효성분으로함유하는당뇨병의치료또는예방용약학적조성물 (57) 요약 본발명은당뇨병또는지방간의예방또는치료용약학적조성물에관한것으로서, 보다상세하게는 CYP4A(cytochrome P450A) 저해제를유효성분으로함유하는당뇨병또는지방간의예방또는치료용약학적조성물에관한것이다. 본발명에따르면 CYP4A 저해제는소포체스트레스를억제하고, 혈중인슐린농도를감소시키며, 간세포의세포사멸을억제함으로써당뇨병또는지방간의예방또는치료에효과를나타낸다. 대표도 - 도

2 (72) 발명자 최종순 대전광역시유성구과학로 , 생명과학연구부 1 동 ( 어은동, 한국기초과학지원연구원 ) 김승일 대전광역시유성구과학로 , 생명과학연구부 1 동 ( 어은동, 한국기초과학지원연구원 ) 박창균 대전광역시유성구과학로 , 생명과학연구부 1 동 ( 어은동, 한국기초과학지원연구원 ) - 2 -

3 특허청구의범위청구항 1 CYP4A(cytochrome P450 4A) 저해제인 N-히드록시-N'-(4-부틸-2-메틸페닐 )-포름아미딘을유효성분으로함유하는당뇨병의치료또는예방용약학적조성물. 청구항 2 삭제청구항 3 제 1항에있어서, 상기당뇨병은제2형당뇨병인것을특징으로하는약학적조성물. 청구항 4 제 1항에있어서, 상기당뇨병은비만으로부터유래된것을특징으로하는약학적조성물. 청구항 5 제 1항에있어서, 상기 CYP4A 저해제는소포체스트레스를억제하는것을특징으로하는약학적조성물. 청구항 6 제 1항에있어서, 상기 CYP4A 저해제는혈중인슐린농도를감소시키는것을특징으로하는약학적조성물. 청구항 7 제 1항에있어서, 상기 CYP4A 저해제는간세포의세포사멸 (apoptosis) 을억제시키는것을특징으로하는약학적조성물. 명세서 [0001] 기술분야 본발명은당뇨병의치료또는예방용약학적조성물에관한것으로서, 보다상세하게는 CYP4A(cytochrome P450 4A) 저해제를유효성분으로함유하는당뇨병또는지방간의치료또는예방용약학적조성물에관한것이다. [0002] [0003] [0004] 배경기술상승된혈당수준에의해특징되는제2형진성당뇨병 (T2DM) 은가장만연하고심각한대사질환으로서전세계인구의 6.4% 에영향을미치고있으며, 당뇨환자들의 90% 이상을차지한다. 한편, 비만은 T2DM, 비알코올성지방간염 (NASH) 및심혈관질환의발생에대해근간이되는주요한병리이다. 인슐린내성은세포가인슐린을적절하게이용하지못하는상태이며, T2DM에서비만은근육, 지방조직및간에서인슐린내성에대한중심위험인자이다. 인슐린내성의근간메커니즘은불명확하지만, 소포체 (ER) 스트레스가비만인개인에서인슐린내성의발생에대한새로운메커니즘인것으로제안되어왔다. ER 스트레스는 Ca 2+ 항상성의파괴, 단백질 / 지질생합성의과부하, 및산화적스트레스에의해일어나며, 이는비폴딩된 (unfolded) 단백질반응경로로언급되는 IRE1, ATF6-3 -

4 및 PERK 와같은진화적으로보존되어온메커니즘을촉발시킨다. 최근, ER 스트레스및 UPR 경로가당뇨병의병 인론에서한역할을하는것으로나타났다. 그러나, UPR 경로를직접조절하는정확한메커니즘은잘이해되지 않고있다. [0005] [0006] 포유동물의간에서시토크롬 P450 효소군 (CYP450s) 은광범위한종류의외래화학물질및내생의화합물들의산화대사를촉매하는주로 ER 막에편재화된 NADPH 모노옥시다아제들로서작용한다. 비만및당뇨병의상태하에서 CYP450s의발현양상 (profiles) 은간조직에서동적인것으로보고된다. CYP2E1은특히 ER 샤페론단백질의발현을감소시키고, 이의산화촉진제의촉매활성화를통한 ER 단백질손상및스트레스를유도하는것으로나타난다. 따라서, CYP450s이 UPR 시그널링및간인슐린내성을조절하는신규성분들로서 ER 스트레스및 T2DM의발생에관련될수있는가능성이있다. 발명의내용 [0007] 해결하려는과제본발명에서해결하고자하는과제는소포체스트레스와관련된 CYP450s의효소군들중 CYP4A의발현조절이당뇨병의치료또는예방에유효하다는것을확인하고, 상기질환들의치료또는예방용약학적조성물로서의 CYP4A의저해제를제공하고자하는것이다. [0008] 과제의해결수단상기와같은과제를해결하기위하여, 본발명은 CYP4A(cytochrome P450 4A) 저해제인 N-히드록시-N'-(4-부틸- 2-메틸페닐 )-포름아미딘을유효성분으로함유하는당뇨병또는지방간의치료또는예방용약학적조성물을제공한다. 상기당뇨병은제 2 형당뇨병이다. [0009] 삭제 [0010] 삭제 [0011] [0012] [0013] [0014] 상기당뇨병은비만으로부터유래될수있다. 상기 CYP4A 저해제는소포체스트레스를억제한다. 상기 CYP4A 저해제는혈중인슐린농도를감소시킨다. 상기 CYP4A 저해제는간세포의세포사멸 (apoptosis) 을억제시킨다. [0015] 발명의효과 본발명에따르면 CYP4A 저해제는소포체스트레스를억제하고, 혈중인슐린농도를감소시키며, 간세포의세 포사멸을억제함으로써당뇨병의예방또는치료에효과를나타낸다. [0016] 도면의간단한설명 도 1 은 10 주령 C57BL/6J 또는 db/db 마우스들의간조직으로부터막단백질을분리하고, 푸리에변환이온사이 클로트론공명 (FT-ICR) 질량분석법을이용하여단백질을확인하는과정을모식적으로나타낸것이다. 도 2는 C57BL/6J 및 db/db간의 CYP450 단백질의상대적발현프로파일 (db/db/c57bl6j) 을나타낸것으로서, C57BL/6J 또는 db/db 중어느하나에서배타적으로발현된단백질을마우스계통명으로나타내었다. 도 3은 C57BL/6J 및 db/db 마우스로부터의간조직의웨스턴블롯팅에의해 ER 스트레스마커및분자샤페론의발현을결정하였다. ER-국소화된단백질예컨대 ATF6, IRE1, PERK, PRP72 및 BiP를간조직들의마이크로솜성분획으로부터분석하였다

5 도 4는 XBP1의스플라이싱및 CHOP의전사를 C57BL/6J 및 db/db 마우스의간조직으로부터의 RT-PCR에의해결정하였다. 도 5는 HET0016의화학구조이다. 도 6은 C57BL/6J 및 db/db 마우스의마우스 Cyp4a mrnas의실시간 RT-PCR의결과이다. 도 7은 C57BL/6J 및 db/db 마우스에서 Cyp4a, Cyp2e1 및 POR의웨스턴블롯분석의결과이다. 도 8은 Cyp4a의효소활성분석의결과이다. 도 9는 1g/kg 글루코오스를 2주동안 5mg/kg/ 일의 HET0016 또는 DMSO로처리된 C57BL/6J 및 db/db 마우스에게복강내투여하고, 표시된시점에서혈당계로혈당수준을측정하여 IPGTT를수행한결과를나타낸것이다. 데이터는평균 ±SEM으로나타내었다. 도 10은 HET0016 또는 DMSO로처리된 C57BL/6J 및 db/db 마우스로부터간절제물을준비하고헤마톡실린-에오신염색을수행한결과이다. 도 11은지질과산화의척도인 MDA 형성을 HET0016 또는 DMSO로처리된 C57BL/6J 및 db/db 마우스의간조직들로부터 TBARS 분석측정에의하여평가하였다. 데이터는평균 ±SEM으로나타내었다. P값들을스튜던트 t-시험 (Student's t-test) 로결정하였다. *P<0.05 대 DMSO로처리된 db/db 대조구마우스를나타낸다. 도 12는 HET0016 또는 DMSO로처리된금식시킨 db/db 마우스로부터의간조직들의웨스턴블롯에의하여 ER 스트레스마커, 예컨대 PERK, 포스포-eIF2α, CHOP, 포스포-JNK의발현을측정한것이다. ER-국소화된단백질들, 예컨대 Cyp4a 및 PERK를간조직의마이크로솜단편으로부터분석하였다. HET0016(5mg/kg/ 일 ) 을 2주동안 8주령의 db/db 마우스들에게복강내주사로투여하였다. 도 13은생체내인슐린시그널링을인슐린수용체 (IR) 및 Akt의인산화의조사및 HET0016 또는 DMSO 처리된금식시킨 db/db 마우스의간조직들에서절달된카스파제-3 및카스파제-9, Bax 및 Bcl-2의발현에의한아폽토시스를조사한결과이다. 도 14는도 12 및도 13에기재된실험조건들하에서 ER 스트레스, 인슐린시그널링및아폽토시스마커들의정량화결과이다. 데이터는평균 ±SEM으로나타내었다. *P<0.05, **P<0.001 대 DMSO로처리된 db/db 대조구마우스. 도 15는 6시간금식한혈당수준을대조구 db/db 및 HET0016 처리된 db/db 마우스에서측정하였다. 도 16은 HET0016 또는 DMSO 처리된 C57BL/6J 및 db/db 마우스로부터혈청을수득하고, 효소-결합면역흡착분석에의해인슐린수준을측정한결과이다. 도 17은 HepG2 간암세포를 4μM HET0016 없이또는이와함께 4μg /ml 투니카마이신으로처리한결과를나타낸다. ER 스트레스마커인 PERK의발현은세포용해물및나타낸일차항체들을사용하여웨스턴블롯에의해결정하였다. 도 18은 HepG2 간암세포를 4μM HET0016 없이또는이와함께 4μg /ml 투니카마이신으로처리한결과를나타낸다. ER 스트레스마커인 p-jnk의발현은세포용해물및나타낸일차항체들을사용하여웨스턴블롯에의해결정하였다. 도 19는 2주동안 5mg/kg/ 일 HET0016 또는 DMSO로처리된 C57BL/6J 마우스에게 1g/kg 글루코오스를복강내주사하고, 나타낸시점에서혈당계로혈당수준을측정한결과를나타내었다. 데이터는평균 ±SEM으로서나타내었다. 도 20은 HET0016 또는 DMSO로처리된 C57BL/6J 마우스로부터혈청을수득하고, 효소-결합면역흡착분석에의해인슐린수준을측정한결과이다. 도 21은 HET0016 또는 DMSO로처리된 C57BL/6J 마우스로부터간절제물들을준비하고, 헤마톡실린-에오신염색을수행한결과이다. 도 22는 HET0016 또는 DMSO로처리된 C57BL/6J 마우스로부터간절제물들을준비하고, 중성지방을측정한결과이다

6 [0017] 발명을실시하기위한구체적인내용 이하, 본발명을상세하게설명한다. [0018] [0019] 본발명은 CYP4A(cytochrome P450 4A) 의저해가소포체스트레스유도된간인슐린내성및아폽토시스 (apoptosis) 에대한유력한 (potent) 치료타겟임을확인하였고, 이에상기효소의저해제를비만으로부터유래한당뇨병과지방간의예방또는치료용약학적조성물로사용할수있음을제안한다. 구체적으로, ER 스트레스는당뇨병의발생에연루되며, ER 스트레스를조절하는메커니즘들의기초들을이해하는것이본발명에서매우중요하다. 따라서, 본명세서에서 CYP4A의특이적저해제인 N-히드록시-N'-(4-부틸- 2-메틸페닐 )-포름아미딘(HET0016) 또는그유도체를이용한 CYP4A의생화학및생리학적특성화를검토함으로써당뇨병에서의차도및 ER 스트레스-유도된간인슐린내성및아폽토시스에있어서 CYP4A의중요성을밝히고자하였다. 본발명자들의발견은 CYP4A 활성의감소가당뇨병과지방간에대한유력한치료타겟일수있음을암시한다. [0020] [0021] [0022] [0023] 따라서, 본발명은 CYP4A(cytochrome P450 4A) 저해제를유효성분으로함유하는당뇨병또는지방간의치료또는예방용약학적조성물을제공한다. 상기 CYP4A 저해제는 N-히드록시-N'-(4-부틸-2-메틸페닐 )-포름아미딘(HET0016) 또는이의유도체일수있다. 상기당뇨병은바람직하게는제2형당뇨병으로서, 비만으로부터유래될수있다. 상기 CYP4A 저해제는소포체스트레스를억제하고, 혈중인슐린농도를감소시키며, 간세포의세포사멸 (apoptosis) 을억제시키는메카니즘으로작용한다. [0024] [0025] [0026] 상기약학적조성물에는약학적으로허용가능한담체를더포함할수있다. 본발명의약학적조성물에포함되는약학적으로허용되는담체는제제시에통상적으로이용되는것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산마그네슘및미네랄오일등을포함하나, 이에한정되는것은아니다. 본발명의약학적조성물은상기성분들이외에윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제등을추가로포함할수있다. 적합한약학적으로허용되는담체는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995) 에상세히기재되어있다. 본발명의약학적조성물은비경구로투여할수있고, 피부를통한국소투여 ( 경피투여 ) 또는피하주입이바람직하며, 피하주입이가장바람직하다. 본발명의약학적조성물의적합한투여량은제제화방법, 투여방식, 환자의연령, 체중, 성, 병적상태, 음식, 투여시간, 투여경로, 배설속도및반응감응성과같은요인들에의해다양하게처방될수있다. 한편, 본발명의약학적조성물의경구투여량은바람직하게는 1일당 mg/kg( 체중 ) 이다. [0027] 이하에서는, 본발명을첨부된도면을기초로하여더욱구체적으로설명한다. [0028] 먼저, 본발명자들은정상의간및 2형당뇨병간에서다르게발현된모든 CYP 단백질들을확인하고자시도하였다. 이를달성하기위하여, 비만-유도된 T2DM이발생된 10주령 C57BL/6J 대조구및 db/db 마우스로부터간조직들을분리하였다. 그후막단백질들을분리하고, 푸리에변환이온사이클로트론공명 (FT-ICR) 질량분광법 ( 도 1) 에의해확인하였다. 그결과, 본발명자들은정상의간및 db/db 마우스의간에서동적발현패턴들을나타내는총 54개 CYP 단백질들을확인하였다 ( 도 2). CYP2E1 및 CYP4A는상보적으로간지방증에서지방퍼옥시다아제들의마이크로솜성 (microsomal) 촉매들로서주요역할을하고, POR(NADPH 시토크롬 P450 환원제 ) 은모든 CYP450s에대한유일한전자공여체이기때문에본발명자들은 CYP2E1, CYP4A 및 POR의발현패턴들만을나타내 - 6 -

7 었다. 흥미롭게도, 대조구들에비해 db/db 마우스에서마우스 Cyp4a 이소폼 (isoforms) 인 Cyp4a10, 12 및 14는상향-조절되었지만, Cyp2e1의발현은약간감소되는한편, POR의발현은유사함을확인하였다 ( 도 2). 프로테오믹스 (proteomics) 결과들을입증하기위하여, 실시간 RT-PCR 및웨스턴블롯분석을수행하였다. 질량분광법에서관찰된바와같이, Cyp4a 이소폼들은당뇨성간에서고도로발현되었으며 ( 도 6 및도 7), 마이크로솜성 Cyp4a의효소적활성도상승되었다 ( 도 8). 그러나, Cyp2e1 및 POR의발현은상향-조절되지않아 ( 도 7), CYP2E1 가아닌 CYP4A가간 T2DM 발생의주요조절제로서작용할수있음을보여주었다. [0029] CYP4A는마우스에서지방산, 특히로린산 (LA) 및아라키돈산 (AA) 의 ω-히드록실화를촉매하는것으로알려져있다. 당뇨병에서 CYP4A의역할을연구하기위하여, 본발명자들은 CYP4A-특이적저해제인 HET0016(N-히드록시- N'-(4-부틸-2-메틸페닐 )-포름아미딘( 도 5) 을사용하였으며, 이는이들지방산들에대한효소활성을저해한다. HET0016을 2주동안 8주령 db/db 마우스들에게복강내주사 (5mg/kg/ 일 ) 로투여하였다. 먼저, 본발명자들은당뇨병생리학에대한 HET0016의영향을검사하였다. 복강내내당성시험 (IPGTT) 은 HET0016을이용한 Cyp4a 활성의저해가당뇨병쥐들에서의인슐린내성을현저히개선시켰음을나타내었다 ( 도 9). 또한, 당뇨병마우스에서 HET0016에의해혈당수준이감소되었다 ( 도 15). C57BL6J 대조구마우스에서의인슐린수준보다현저히높았던 db/db 마우스에서혈청인슐린수준은 HET0016 처리에의한인슐린내성에서의감소로인해현저하게감소되었다 ( 도 13). 또한, db/db 당뇨병간에서의심각한간지방증이 HET0016에의해구제되었다 ( 도 10). 본발명자들은 ER 스트레스와관련되고 T2DM 환자들에서상승되는 CYP4A와간과산화간의관계도측정하였다. 실제로, 간지방과산화는정상의 C57BL/6J 마우스들에비해 db/db 마우스들에서증가하였으며, 이러한증가는 HET0016 처리에의해현저히감소하였다 ( 도 11). 아울러, 본발명자들의실험데이터는 Cyp4a 활성의간저해가 db/db 마우스들에서 Cyp4a 활성을개선시킨다는것을강하게보여준다. [0030] [0031] 다음으로, 본발명자들은 HET0016에의한생체내당뇨병생리학의관찰된개선이비만-유도된당뇨병들을일으키는 ER 스트레스에대한영향으로인한것인지의여부를평가하였다. UPR의성분들은생리학적조건들하에서는유리한조절제들로서작용하거나, 또는만성스트레스상태에서는세포기능부전및아폽토시스의촉발제로서작용하는이중의역할을한다. 세포주계통에서, ATF6, IRE1 및 PERK 시그널링의조합된초기활성화는세포보호신호를생성한다. 반면, PERK 활성화의유지와연결된 ATF6 및 IRE1의하향-조절은아폽토시스성세포사멸을유도한다. 당뇨병간에서 UPR 시그널링의상태를조사하기위하여, 본발명자들은 UPR 성분들의발현을시험하였다. db/db 마우스간에서 ATF6 및 IRE1의발현은감소되었으며 ( 도 3), XBP1의스플라이싱 (splicing) 은억제되었다 ( 도 4). 또한, ERP72 및 BiP와같은분자샤페론들의발현수준도 db/db 마우스들에서감소되었다. 그러나, PERK만이상향조절되었으며, 그의다운스트림 (downstream) 시그널링은당뇨병간에서활성화되어 ( 도 3), 당뇨병마우스들의간이연장된 ER 스트레스로인한심한아폽토시스상태에있음을나타내었다. 흥미롭게도, db/db 마우스에게 CYP4A 저해제인 HET0016을접종시 PERK의발현이감소되었으며, eif2α의인산화상태및 CHOP의발현수준과같은 PERK 다운스트림시그널링활성들도저해되었다 ( 도 12 및도 14). 또한, ER 스트레스반응들의중요한성분인 JNK 활성화가 HET0016에의해현저히감소되었다. 그러나, Cyp4a의발현은 HET0016에의해변화되지않았다 ( 도 12 및도 14). 최근의보고들은 ER 스트레스-매개된 JNK 활성화가인슐린활성을방해하고, 간에서아폽토시스를유도한다는것을증명하였다. 이들보고들의고려시상기발견들은본발명자들이인슐린내성및아폽토시스에대한 HET0016의영향에대한연구를서두르도록하였다. 흥미롭게도, db/db 마우스들에서 HET0016을이용한 Cyp4a 활성의저해는인슐린수용체 (IR) 및 Akt의인산화를증가시켰으며, 이는인슐린시그널링이당뇨병간에서 HET0016 처리에의해구제됨을의미한다 ( 도 13 및도 14). 또한, 당뇨병간조직의아폽토시스도 HET0016에의해저해되었다. 카스파제-3 및카스파제-9의활성형태의농도가감소되었으며, 사멸-선호 (pro-death) 단백질인 Bax의발현이억제되었다. 반면, 항-아폽토시스조절제 Bcl-2의발현은증가되었다 ( 도 13 및도 14). 따라서, 이러한결과들은 CYP4A가 T2DM에서 ER 스트레스-유도된인슐린내성및아폽토시스의중요한조절제임을강하게시사하는것이다. 이러한아이디어의뒷받침으로, 본발명자들은 Cyp4a의특이적유도제인클로피브레이트 (clofibrate) 에의한 Cyp4a의주사가 db/db 마우스들에서 PERK, eif2α 및 JNK의활성화및 CHOP 발현의상승시키는결과를초래한다는것도발견하였다. 또한, 인슐린내성및아폽토시스도현저하게조절되었다. [0032] 그후, 본발명자들은 HET0016 에의한 ER 스트레스의관찰된생체내개선이 HET0016 의 ER 스트레스에대한직 접적인세포 - 자발적인효과로인한것인지또는다양한경로들중복잡한생체내상호작용의간접적인결과로 - 7 -

8 인한것인지의여부를결정하고자하였다. 4μg /ml의투미카마이신에의해 HepG2 간암세포들에서 ER 스트레스가유도된경우, 예측된바와같이, PERK, 포스포-eIF2α 및포스포-JNK 의발현이증가되었다. 4mM HET0016와의병용처리는 HepG2 세포들에서 3개의모든 ER 스트레스마커들의발현을현저하게하향-조절하였으며 ( 도 17 및도 18), 이는 HET0016가세포성 ER 스트레스를직접적으로개선시킴을암시한다. [0033] 남은문제들중하나는정상의마우스들에서의 Cyp4a 저해가 T2DM의치료를위한치료옵션으로서 CYP4A 저해의이용에대한장애일수있는어떤부작용을일으킬수있는지의여부이다. 이목적을위하여, 8주령의수컷야생형 C57BL/6J 마우스에 db/db 마우스에주사한것과동일한 HET0016를동일투여량으로복강내투여하였다. IPGTT 결과는인슐린내성이변경되지않았으며 ( 도 19), 혈청인슐린수준 ( 도 20) 또는간생리학 ( 도 21), 및중성지방 ( 도 22) 에서어떤차이도관찰되지않았음을증명하였다. [0034] 결론적으로, 본발명자들은 T2DM의발생에서마우스모델을이용하여 CYP4A의생리학적및기능성중요성을증명하였다. 이는 CYP4A가 ER 스트레스-유도된간인슐린내성및아폽토시스를조절하는분자적메커니즘을나타내는최초의연구이다. 또한, HET0016을이용한본발명자들의발견은 ER 스트레스를감소시키고, 내당성을증진시키고, 간지방증및아폽토시스를감소시킬수있는 CYP4A 활성을효과적으로감소시키는목적의치료제의개발을위한새로운통찰을제공하는것이다. [0035] 이하에서는실시예를통하여본발명을구체적으로설명한다. [0036] < 실시예 > [0037] [0038] 동물들및조직학실험수컷 C57BL/6J 및 C57BL/KsJ-db/db 마우스를 Japan SLC로부터구매하였다. HET0016(5mg/kg/ 일 ) 및클로피브레이트 (400mg/kg/ 일 ) 를 8주령마우스에게 2주동안복강내주사하였다. HET0016에대한같은배의새끼 (littermate) 마우스대조구는 DMSO로처리하고, 클로피브레이트에대한같은배의새끼마우스대조구는옥수수유로처리하였다. 하룻밤동안금식시킨후, PBS 중에용해시킨 1g/kg 글루코오스를복강내주사하므로써, 복강내내당성시험 (IPGTT) 을실시하였다. 글루코오스주사전 (0분) 및주사후 15, 30, 60, 90 및 120분에 One Touch Ultra 혈당계 (LifeScan, Inc.) 를이용하여혈당농도를측정하였다. 10주령마우스로부터분리된간을 10% 중성버퍼화된포르말린용액 (Sigma) 중에서고정시키고, 파라핀절제물들을헤마톡실린-에오신으로염색하였다. [0039] [0040] 세포배양및화학처리 HepG2 세포들을열 - 불활성화된 10% 우태아혈청 (FBS) 및항생제들로보충된저글루코오스둘베코변형이글배지 (DMEM, Gibco) 중에서 37, 습윤된 5% CO 2 및 95% 공기하에서배양하였다. 세포들을 세포들 /cm 2 의밀도로 플레이팅하고, 처리전 24 시간동안세포배양배지에서유지하였다. 4μg/ml 의투니카마이신을 6 시간동안 HET0016 없이또는 4μM HET0016 으로처리하였다. 대조구로서 HepG2 세포들을 DMSO 로처리하였다. [0041] [0042] 막단백질들의분리및질량분광법이전에기재된것과같이, 탄산나트륨을사용하여 C57B/6J 또는 db/db 마우스의간으로부터막단백질을분리하였다. 간략하게는, 마우스간을균질화하고, 간용해들을 0 에서 30분동안 ph 11.5, 100mM 탄산나트륨으로희석시켰다. 현탁액을 50,000 rpm에서 4 에서 1시간동안원심분리하였다. 막펠렛을증류수로헹구고, PAGE용 SDS에용해시켰다. 질량분광법을위해, 10μg의단백질샘플들을 12% SDS-PAGE로분리하였다. 겔을쿠마씨브릴리언트블루 (Coomassie Brilliant Blue) R-250으로염색하고, 분자량에따라 6 부분으로분획화하였다. 각겔단편을그단백질의시스테인들의환원및알킬화후, 37 에서 16시간동안트립신 (1.2μg) 으로분해시켰다

9 분해된펩티드를추출용액 (50mM 중탄산암모늄, 50% 아세토니트릴, 및 5% 트리플루오로아세트산 ) 으로추출한후, 0.02% 포름산및 0.5% 아세트산을포함하는샘플용액중에용해시켰다. 질량분광법에적용하기위하여, 펩티드샘플을 Easy-column (L 2cm, ID 100μm, 120A, C18-A1) 트랩핑 (trapping) 컬럼 (PROXEON) 상에서농축시킨후, 상기컬럼으로부터용리시키고, Easy-column (L 10cm, ID 75μm, 120A, C18-A2) 역상컬럼 (PROXEON) 으로 200nl/ 분의유속으로향하도록하였다. 펩티드를 0~65% 아세토니트릴구배에의해 120분동안용리시켰다. LTQ-Velos ESI 이온트랩질량분광계 (Thermo Scientific) 에서의모든 MS 및 MS/MS 스펙트럼들은데이터-의존모드로획득되었다. 각각의전체 MS(300 내지 2,000의 m/z 범위 ) 스캔후, 동적배제를가능하게하여 MS 스펙트럼에서가장많은전구체이온들의 3회의 MS/MS 스캔을수행하였다. 단백질확인을위하여 MASCOT (Matrix Science) 로 MS/MS 스펙트럼을검색하였다. 인간게놈서열을단백질확인용데이터베이스로서사용하였다. 부모이온또는단편이온의질량내성은 0.8Da이었다. 트립신성펩티드의다양한변경으로서 MS/MS 분석에서시스테인의카바미도메틸화및메티오닌의산화를고려하였다. [0043] [0044] 마우스간으로부터의마이크로솜의제조신선한마우스간으로부터상기설명된방법을약간변경하여간마이크로솜을제조하였다. 분리된간에빙냉된 1.15% KCl 용액을철저히살포하였다. 그후, 간을 4배부피의균질화버퍼 (0.1 M Tris-HCl, ph 7.4; 0.1M KCl; 1mM EDTA, ph 7.5; 25μM 부틸화히드록시톨루엔 ) 를이용하여균질화하였다. 파괴되지않은세포, 핵및미토콘드리아를제거하기위하여상기균질물을저원심분리력 (1,000 g, 4 에서 15분동안 ) 에서원심분리하였다. 상등액으로부터보다높은원심분리력 (100,000 g, 4 에서 60분동안 ) 으로마이크로솜들을침전시켰다. 마이크로솜들의단단하게뭉쳐진펠렛들을균질화기를이용하여 3ml 빙냉된피로인산염버퍼 (0.1M 칼륨피로포스페이트 ; 1mM EDTA, ph 7.5; 20μM 부틸화히드록시톨루엔 ) 중에재현탁시키고, 4 에서 60분동안 100,000 g 에서다시원심분리시켰다. 세척된마이크로솜펠렛을최종적으로 2ml 빙냉된마이크로솜버퍼 (10mM Tris-HCl, ph 7.4; 1mM EDTA, ph 7.5; 20% 글리세롤 ) 에현탁시켰다. [0045] [0046] 웨스턴블롯분석단백질들을 95% 에서비등시켜변성시키고, SDS-PAGE로분리하고, 이어서니트로셀룰로스 (NC) 또는폴리비닐리덴플루오라이드 (PVDF) 막상에서전기블롯팅하였다. 5% 무지방우유 (skim milk) 또는 5% 소혈청알부민 (BSA) 을포함하는 TBST(Tris-버퍼화식염수, 0.1% Tween-20) 중에서블록킹 (blocking) 한후, 상기막을표지된일차항원과함께인큐베이션시켰다. 그후, 막을 TBST로세척하고, 추가로고추냉이과산화제와커플링된 2차항원과인큐베이션시켰다. ECL 키트를이용하여단백질블롯을검출하고, 발광영상분석기 LAS-4000 미니시스템및소프트웨어 (FujiFilm) 를이용하여가시화하였다. 하기항체들을사용하였다 : 마우스항-β-액틴 (sc-47778), 토끼항-CYP4A(sc-98988, Santa Cruz Biotechnology), 마우스항-ATF6(IMG-273, Imgenex), 마우스항-eIF2α (ab5369), 토끼항-포스포-eIF2α Ser51(ab32157), 토끼항-IRE1(ab37073, Abcam), 토끼항-PERK(#3192), 토끼항-포스포-PERK Thr980(#3179), 토끼항-BiP(#3177), 마우스항-CHOP(#2895), 토끼항-SAPK/JNK(#9252), 토끼항-포스포-SAPK/JNK Thr813/Tyr185 (#9251), 토끼항-인슐린수용체 β(#3025), 토끼항-포스포-인슐린수용체 β Tyr1150/1151(#3024), 토끼항-Akt(#4691), 토끼항-포스포-Akt Ser473(#4060), 토끼항-Bcl-2(#2876), 토끼항-Bax(#2772), 토끼항-분할된카스파제-3(#9664), 토끼항-분할된카스파제-9(#9509) 토끼항-Bax(#2772, Cell Signaling Technology), 토끼항-ERP72(Dr. O.Y. Kwon, College of Medicine, Chungnam National University로부터제공받음 ). [0047] [0048] 역전사및실시간 RT-PCR 총 RNA를추출하기위하여, 마우스간조직들을 TRI 시약 (Molecular Research Center, Inc.) 과함께균질화하고, 4 에서 10분동안 12,000rpm에서원심분리하였다. 상분리를위하여, 균질화에사용된 TRI 시약 1ml 당 BCP(1-브로모-3-클로로프로판, Molecular Research Center, Inc.) 0.1ml와함께상등액을격렬하게혼합하였다. 4 에서 10분동안 12,000rpm에서원심분리한후, 수상을추가의페놀-클로로포름추출에사용한후, 총 RNA를 RN나제가없는물중에침전및용해시켰다. 추출된 RNA를랜덤 6량체프라이머들을사용하여 Transcriptor First Strand cdna Synthesis Kit(Roche) 를이용하므로써역전사하였다. LightCycler 480 DNA SYBR Green I Master(Roche) 를이용하여실시간 PCR을수행하고, Real-Time PCR System(Roche) 을제조자설명 - 9 -

10 에 따라 이용하여 PCR 산물들을 검출하였다. 하기 프라이머들을 사용하였다 : CPY4A10, 5'- AGCCACAAGGGCAGTGTTCAGG-3' ( 순방향 ) 및 5'-CCAAGCGGCCATTGGAAGAAAG-3' ( 역방향 ); CYP4A12, 5'- GCCTTATACGGAAATATGGCA-3' ( 순방향 ) 및 5'-TGGAATCCTGGCCAACAATC-3' ( 역방향 ); CYP4A14, 5'- TGAATTGCTGCCAGATCCCACCAGGATC-3' ( 순방향 ) 및 5'-GTTCAGTGGCTGGTCAGA-3' ( 역방향 ); XBP1, 5'--3' ( 순방향 ) 및 5'--3' ( 역방향 ); CHOP, 5'--3' ( 순방향 ) 및 5'--3' ( 역방향 ). [0049] [0050] 대사산물들의측정희생시킬때심장에구멍을내어혈액을채취하였다. 상업적마우스인슐린 ELISA 키트 (Shibayagi Co., Ltd.) 를이용하여제조자설명에따라혈청인슐린농도를측정하였다. OxiSelectTMTBARS Assay Kit(Cell Biolabs, Inc.) 를사용하여간균질화물중에서지질과산화반응의천연부산물들인 MDA( 말론디알데히드 ) 를정량화하므로써지질과산화를측정하였다. Triglyceride Quantification Kit(Abcam) 를사용하여마우스간에서트리글리세리드수준을측정하였다. [0051] [0052] Cyp4a 효소활성분석대조구및 db/db 마우스들의간마이크로솜추출물에의해로린산생성물들을기체크로마토그래피 / 질량분광기 (GC/MS) 로측정하였다. 100μM 로린산과대조구및 db/db 마우스들의 0.2mg 간마이크로솜추출물을 37 에서 30분동안 0.5ml 부피의 100mM 인산칼륨버퍼 (ph 7.4) 중에인큐베이션하므로써대사산물들을생성시켰다. 인큐베이션후, CH 2 Cl 3 을이용하여대사산물들을추출하고, 유기용매를질소흐름하에제거하였다. 잔류물을트리메 틸클로로실란 (1%, v/v) 을포함하는 N,O-비스 ( 트리메틸실릴 )-트리플루오로아세트아미드 (BSTFA: 50μl) 중에용해시켰다. 용액을유리바이알로옮기고, 75 에서 20분동안인큐베이션하여트리메틸실릴화생성물들을산출하였다. 전자-충격이온화를이용한 Shimadzu QP2010 ( 컬럼 : 길이 : 30cm, 내부직경 : 0.25mm, 필름두께 : 0.1μ m) 상에서 GC/MS 분석을실시하였다. GC 오븐온도를 70 에서 1분동안, 이어서, 하기속도로상승되도록프로그램하였다 : 170 까지 25 / 분, 200 까지 5 / 분, 및 280 까지 20 / 분. 오븐을마지막으로 280 에서 5분동안유지시켰다. MS 소스및인터페이스는 250 및 280 에서각각유지되었으며, 4분의용매지연 (delay) 을이용하였다. 생성물들을그들의특징적인질량분획패턴들에의해확인하였다. 생성물들의분포는가스크로마토그램의상대적피크면적에기초하였다. 도면 도면

11 도면 2 도면 3 도면

12 도면 5 도면 6 도면 7 도면

13 도면 9 도면 10 도면

14 도면 12 도면 13 도면

15 도면 15 도면 16 도면

16 도면 18 도면 19 도면 20 도면

17 도면

- 1 -

- 1 - - 1 - - 2 - - 3 - - 4 - 장비구성 : - 5 - - 6 - 치 - 7 - μ - 8 - - 9 - 고체흡착관의안정화방법및기기 (Tube conditioner) - 10 - - 11 - - 12 - - 13 - - 14 - - 15 - - 16 - - 17 - 전기냉각저온농축장치 (TD) GC/FPD - 18 - GC/FID Headspace