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1 최종연구보고서 돌나물의건강기능성구명과유전자원보존및산업적이용기술개발 Studies on health-benefit function, genetic resources conservation, and industrial utilized techniques for Sedum sarmentosum 연구기관 원광대학교 농림수산식품부 - 1 -

2 제출문 농림수산식품부장관귀하 본보고서를 돌나물의건강기능성구명과유전자원보존및산업적이용기술개발 과제의최종보고서로제출합니다 년 4 월 24 일 주관연구기관명 : 원광대학교 총괄연구책임자 : 이승엽 세부과제책임자 : 이승엽 연구원 : 김효진 안보라미 연구보조원 : 전신영, 김종수, 박정희, 협동연구기관명 : 김형순, 김양희, 김민수, 최경희, 김진영, 양권승 ( 주) 대덕바이오 협동연구책임자 : 김혜영 연구원 : 이정현, 서인현, 백승영, 위탁연구기관명 : 임소용, 가소근, 임득균, 이미라 CNU바이오텍 위탁연구책임자 : 모은경 연구원 : 이청하, 양선아, 김현호 고리주안 - 1 -

3 요약문 Ⅰ. 제 목 돌나물의건강기능성구명과유전자원보존및산업적이용기술개발 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 21 세기에인류의복지를위한유전자원의중요성은생명공학기술의눈부신발 전과함께더욱그중요성이부각되고있으며, 선진국을비롯한개발도상국들이자 국의유전자원뿐만아니라, 새로운유전자원의탐색에많은인력과경비를투자하 고있다. 우리나라의자생식물들중에는의약품, 화장품, 건강보조기능성식품원료 등으로고부가가치를가지고있는식물종들이많은데, 이러한자생식물을멸종위기 에서보존하고, 성인병예방과치료를위한의약품및식품원료등으로자원화하는 것이시급하다. 돌나물은봄나물중에서영양이풍부하고독특한향미를갖고있으며, 민간에서는 생즙을간염, 대하증, 화상등에이용하고있으며, 최근약리작용이과학적으로구명되고있어 건강식품으로의개발이가능하다. 그러나우리나라의산야에서흔히보아왔던돌나물 은최근의개발과제초제남용등으로대부분사라져가고있는실정이다. 특히식 ㆍ의약적으로중요한식물들을보존하는일은자원전쟁의시대에국가적으로도아주 중요하다. 영양번식식물의유전자원을포장에서보존할경우, 많은시간과숙련된 인력및시설이필요하고, 병리적ㆍ생리적퇴화가능성, 기상재해에의한소실이나 유전적침식등의위험에노출되어있다. 이에따라기내활성보존(in vitro conservation) 이나초저온동결보존(cryopreservation) 을이용하여보존하면, 좁은공 간에서다수의유전자원을보존할수있어경제적이므로돌나물에서도이와관련된 연구가시급하다. 또한돌나물은다육식물로서유통및저장시에수분증발로시들은 상태로전시판매되는경우가많아시장성이낮은한원인이되고있어, 소포장및 저온유통이시급하지만관련연구가미흡한실정이다. 돌나물은비타민 C 의함량이높고, 칼슘, 철분, 아연등의무기물함량도높을뿐 만아니라, 민간에서는생즙을간염, 대하증, 화상등에이용하고있으며, 최근약리작용이 과학적으로구명되고있어건강식품으로의개발이가능하다. 최근돌나물은골다공증에유 효하고, 간기능개선능이있는것으로보고되고있으나, 저장성이낮고이를이용한 가공식품이없어부가가치가매우낮다. 그러나유효지표성분이분리 동정이되지 - 2 -

4 않고있으며, 체내에서의기능성발현기전또는대사관련연구가미흡한실정이다. 최근기능성식품에대한관심이높아지고있는데, 이들식품에는비타민 A, C, E, flavonoids, anthocyanins, carotenoids, tanic acid 등의항산화물질이풍부하게들어있어활성산소가생기는것을막고노화를억제시키거나, 각종암및질병을예방하는데도움이된다. 이러한기능성물질이많이함유된식품재료를이용하여기능성식품으로개발하여산업화하려는연구가많이이루어지고있는데, 돌나물은우리나라에서는어느지역에서나생산이가능한건강채소로서건강식품재료로적합하지만, 이를산업화하려는적극적연구는미흡한실정이다. 이에따라돌나물의무기성분, 기능성영양성분및향기성분분석과항산화활성및생리활성등을다각도로검정하여기능성식품으로개발할필요가있다. 따라서본연구의목적은첫째, 식ㆍ의약적으로중요한돌나물유전자원의유연 관계분석과기내활성보존및초저온동결보존법을개발하고, 출하돌나물의시장 성을높이기위한소포장용저온저장온도를구명하며, 둘째, 수요가한정되어있는 돌나물의이용성과부가가치를높이기위하여, 체내에서의기능성발현기전과대사 관련연구를통한건강기능성식품을개발하고, 셋째, 돌나물의기능성식품화에영 향을미치는무기ㆍ영양성분및향기성분을분석하고, 개발제품의급성및아급성 독성과유전독성, 세포독성등의안전성과제품보존을위한안정성을연구하여, 부가 가치가높은건강식품으로서의안전성과안정성을구명하고자한다. Ⅲ. 연구개발내용및범위 1. 돌나물유전자원보존및저장성향상기술개발 식ㆍ의약적으로중요한돌나물유전자원의유연관계분석과기내활성보존및 초저온동결보존법을개발 - 31 개돌나물지역종의영양생장기및개화기형태적특성조사하여, Ward의 방법(SAS Institute) 으로제곱유클리디안거리측도를 Z정수로변수변환하 여군집분석한결과를 dendorgram으로작성하여비교 - RAPD를이용한돌나물의유연관계분석을위하여 31개지역종의 DNA 추출 및다형성을가진 primer 탐색과, NTSYS program으로 dendrogram 작성 - 돌나물유전자원의기내활성보존을위한기내영양체최적번식법개발하고, 영양체의기내활성보존에의한저온(0-4 ) 및단기(1-2 년) 보존법확립 - 3 -

5 - 돌나물유전자원의초저온동결보존을위하여동아및기내신초의초저온동 결보존법을확립 출하돌나물의시장성을높이기위한소포장용저온저장온도를구명과 돌나 물지역종들의항산화활성및비타민 C 함량을분석하여제품개발을위한 우량돌나물계통선발 - 돌나물유통을위한수확후적정저장온도를구명하여저장성향상 - 지역수집종들의항산화활성및비타민 C 함량을분석 2. 돌나물의건강기능성구명및고부가가치상품의개발 돌나물의간기능개선및간암억제물질의분리ㆍ동정과효과탐색및제품개발 - 돌나물의간기능개선및간암억제효과탐색 - 돌나물로부터간암억제물질의분리및동정 - 돌나물및돌나물추출물이백서의간기능에미치는영향 - 간기능관련단백질의탐색 - 돌나물및돌나물추출물이간암세포의분화에미치는영향탐색 - 간기능개선및간암억제작용이강화된제품의개발 돌나물의항산화및면역활성물질의분리ㆍ동정과효과탐색및제품개발 돌나물의항산화및면역활성탐색 돌나물로부터항산화및면역활성물질의분리및동정 돌나물및돌나물추출물이백서에서의항산화관련효소활성구명 돌나물및돌나물추출물이면역활성에미치는영향 항산화및면역활성관련단백질의탐색 항산화및면역활성이강화된제품의개발 지질대사및혈행개선물질의분리ㆍ동정및제품개발 - 돌나물의지질대사및혈행개선연구 - 돌나물로부터지질대사및혈행개선물질의분리및동정 - 돌나물및돌나물추출물이비만에미치는영향 - 지질대사및혈행개선지표단백질의동정 - 돌나물및돌나물추출물이지질대사및혈행개선에미치는효과구명 - 지질대사및혈행개선기능이강화된제품의개발 - 4 -

6 3. 돌나물의성분분석및건강기능성돌나물제품의안전성및안정성평가 돌나물의일반성분, 영양성분, 향기및향미성분분석 - 돌나물의우량지역종에대한수분함량, 회분, 환원당, 비타민 A, C, 조지방, 조단백등의함량측정하고, 향기및향미성분등을 GC/MS 분석 돌나물성분분석및건강기능성돌나물제품 ( 간기능개선및간암억제효과 ) 의안전성및 안정성평가 - 돌나물숙취해소음료에대한반복독성시험, 항돌연변이원성검정, 소화기세 포에대한세포독성시험, hemolysis test, 동물실험을통한간독성유발시험을 통하여안전성평가 - 실온에저장시 3 개월간제품의성상, 중량편차, 증발잔류물, 성분확인, 품질특 성에대한변화와대장균, 녹농균, 살모넬라균, 황색포도구균, 일반세균, 진균 등의미생물오염을조사 항산화및면역활성이강화된돌나물제품( 돌나물젤리) 의안전성및안정성 평가 - 돌나물젤리에대한반복독성시험, 항돌연변이원성검정, 소화기세포에대한 세포독성시험, hemolysis test, 동물실험을통한간독성유발시험을통하여안 전성평가 - 저온에저장시제품의성상, 중량편차, 증발잔류물, 성분확인, 품질특성에대 한변화와대장균, 녹농균, 살모넬라균, 황색포도구균, 일반세균, 진균등의미 생물오염을조사 지질대사및혈행개선기능이강화된돌나물제품( 돌나물차) 의안전성및안정 성평가 - 돌나물차에대한반복독성시험, 항돌연변이원성검정, 소화기세포에대한세 포독성시험, hemolysis test, 동물실험을통한간독성유발시험을통하여안전 성평가 - 실온에 6 개월간저장시제품의성상, 중량편차, 증발잔류물, 성분확인, 품질특 성에대한변화와대장균, 녹농균, 살모넬라균, 황색포도구균, 일반세균, 진균 등의미생물오염을조사 - 5 -

7 Ⅳ. 연구개발결과및활용에대한건의 1. 연구개발결과 가. 돌나물유전자원보존및저장성향상기술개발 돌나물의 31 지역종에대한개화전생육특성과개화기화기특성을토대로 군집분석을실시한결과크게 2 군으로나눌수있었으며, Ⅰ군에는 29 지역 종이속하였고, Ⅱ군에는꽃이피지않는완주및군산지역종등이속하였 다. Ⅰ군은다시두개의소그룹으로나눌수있었는데, Ⅰ-1군은개화특성이 양호한금산, 부천, 포천, 용인등 4 개지역종이속하였고, 특성이비슷한 25 지역종들은 Ⅰ-2 군에속하였다. RAPD 를이용한유연관계를분석한결과, 크 게 2 군으로분류할수있었으며, Ⅰ군에는완주및군산지역종을포함한 27 개지역종이속하였고, Ⅱ군에는줄기와잎이가늘고꽃이잘피는금산, 부 천, 포천, 용인등 4 지역종이속하였다. 돌나물의기내배양묘육성은 0.2 mg/l BA를첨가한 MS 배지에서 일배양시초장의신장이적당하고, 마디가짧으며줄기가굵은다아체를얻 을수있었다. 돌나물의기내저온활성보존은 0.2mg/L BA와 50mg/L sucrose, 1.2% agar를기본으로한배지에 10-20mg/L ABA 또는 6-9% sucrose 를첨가하는것이유전자원의생육및활성이양호하였다. 돌나물기 내신초의초저온동결보존실험결과, M sucrose 용액에서 1일동안 전배양후냉동보존한기내신초의재생율은 % 였다. 돌나물의수확후생체중은저장온도에따라 % 의감소를보였으며, 저 장온도가높을수록생체중감소율도높았다. 생체중감소는포항지역종이가장 컷으며, 완주지역종의변화가비교적적었다. 외관상품질은완주지역종의저 장성이양호하였으며, 군산, 완도, 포항순으로부패율이높았다. 따라서돌나 물을스치로폼접시에랩포장할경우, 지한상태로저장이가능하였다. 5 에서는수확후 8일까지상품성을유 생육특성이양호한 13 지역종의항산화활성을비교한결과, 광양, 순천, 완도 지역종에서항산화활성이높았으며, 제주, 부천, 용인, 완주지역종이낮은 활성을보였다. 돌나물의비타민 C 함량은완주, 군산, 부안, 금산, 부천, 포 천지역종에서비교적높았으나, 대체로비슷한수준을나타내었다

8 나. 돌나물의건강기능성규명및고부가가치제품의개발 Ethyl acetate 추출물로부터간기능개선및간암억제화합물은 tetrahydroxyflavonol (quercetin) 로동정되었다. 사염화탄소에의한급성간 독성을유발한백서에서돌나물추출물은 silymarin( 대조구) 보다체중당간 중량의증가폭이유의하게낮았으며, GOT, GPT 활성에서도 hexane, ethyl acetate, butanol 추출물이 silymarine 투여군보다간보호효과가높았다. 돌나물추출물은사염화탄소로인한간손상을재생시키는데효과적이었으 며, 특히 methanol 추출물을투여한백서의간조직에서는세포의괴사가관 찰되지않을만큼세포재생이빨라져 silymarine( 대조구) 보다우수하였다. 돌나물추출물은 ethionine 및 ethanol에의한지방간유도를유의적으로억 제하였고, 특히 hexane과 ethyl acetate 추출물에서지방간억제효과가매우 우수하였다. 간암세포주 HepG2의성장에미치는 ethyl acetate 추출물의 IC50은 μg/ml 로세포성장억제효과가가장우수하였다. HepG2 세포에돌나물의 ethyl acetate 추출물을처리한후, 72시간배양시에는 92.8% 가 apoptosis를 거쳐괴사되었거나 necrosis 과정으로이행되었다. 돌나물즙과 ethanol을백서에경구투여한후 2시간이지났을때혈중 ethanol 농도는대조구보다약 2.3배낮게나타나돌나물즙의 ethanol을분 해효과가우수하였다. Ethanol을투여한백서에서돌나물의 methanol 및 butanol 추출물은 ADH 및 ALDH 효소활성을유의적으로증가시켰다. 백서에 ethanol 경구투여전에돌나물추출물투여구에서는 1시간경과시혈 중 acetaldehyde의농도가대조구의약 50% 였으며, 시간이경과하면서빠 르게감소하였다. 인체에서도알코올섭취전에돌나물즙과추출물의섭취 는혈중 ethanol 및 acetaldehyde 의농도를유의적으로감소시켰다. 이에따라돌나물추출물을주원료로하여숙취해소효과가있는것으로 알려진청피, 홍삼박, 당귀및상황쌀을첨가하여돌나물숙취해소음료를 제조하였으며, 특허출원중에있다

9 돌나물의 DPPH radical scavenging 효과를측정한결과, ethyl acetate 추출 물의 subfraction E4 의항산화활성이가장우수하였으며, 항산화활성이가 장높은물질은 quercetin 으로동정되었다. ethyl acetate 추출물 subfraction 5 의면역활성이가장우수하였다. 돌나물의면역활성은 ethyl acetate 추출물 subfraction E5 에서가장우수하였으며, 이물질은 coumarin 계의 esculetin 인것으로확인되었다. 백서에돌나물추출물을 4주간섭취시킨간조직및혈액에서의효소활성은 양성대조구인 tocopherol 또는 ascorbic acid와유사하거나우수한항산화능 을나타내었다. 특히돌나물 methanol 및 ethyl acetate 추출물에서 polyphenol 함량이높게나타났으며, 이는 methanol 추출물투여구가전반적 으로높은항산화능을나타낸것과일치하였다. 대식세포인 RAW cell lines에 LPS(lipopolysaccharide) 또는돌나물 용매추출분획을첨가하고 2일간배양한후에생성된 nitric oxide의양은 LPS 농도가 0.1 μg/ml 일때, methanol, hexane 및 ethyl acetate 추출물에 의해생성되는 nitric oxide 의양이감소되었다. 또한 LPS 처리에의해발현되 는 inos 단백질은돌나물추출물에의해그생성양이감소하였다. 백서에고지방식을급여한후돌나물추출물처리에의해변화된단백질의 발현양상은항산화와관련된 glutathione peroxidase, glutathione reductase 의발현이증가되었고, 면역기능과관련된단백질중에서는 COX2의발현이 증가되었다. 돌나물즙(juice) 에당과겔화제를혼합하여농축, 성형하여젤리를제조하였 으며, 돌나물젤리에는돌나물즙(juice) 의참가농도에따라칼슘, 철분, 칼 륨, ascorbic acid 및유기산등의함량이증가되었다. 돌나물추출물의지방세포의성장을억제하는효과는 ethyl acetate subfraction E1 의효과가가장우수하였으며, 지방세포성장을억제하는물질을순수분리한결과, caffeic acid 인것으로동정되었다

10 돌나물의 ethyl acetate 추출물을첨가하여지방전구세포 MC3T3-L1이지방 세포로분화되는것을 50% 억제시키는농도 (IC 50 ) 는 μg/ml 이었다. 유전자들의발현양을측정한결과, PPAR-gamma는 ethyl acetate 추출물을 첨가시거의발현되지않았다. 백서의콜레스테롤식이에서돌나물의동결건조한분말 1.5~4.5% 첨가할경 우, 분말급여량이많을수록식이섭취량이대조구보다많았음에도체중증가 량은크게감소하였다. 돌나물분말투여구에서 total cholesterol, TG 및 LDL 농도및동맥경화지수 (AI) 가대조구보다유의하게감소하였고, 간조직 에축적된지방양및혈청의 ALP 농도도대조구보다상대적으로낮았다. 돌나물분말이고지방식으로유도된비만, 고지혈증, 비알코올성지방간질환 에대한효과가우수하였으므로돌나물분말을이용하여돌나물차를개발 하였다. 다. 돌나물의성분분석및건강기능성돌나물제품의안전성및안정성평가 돌나물의수분함량은개화기보다영양생장기에높았다. 조회분, 조지방, 조단 백질은지역종간에유의한차이가없었다. 금산, 완도, 군산지역종이칼륨, 칼슘, 철분의함량이높아우수하였다. Ascorbic acid와 beta-carotene 함량 은군산지역종에서가장높았다. 돌나물의향기성분은총 16종이분리되었 는데, pyrazine 및이들유도체가주성분이었다. 돌나물을이용한숙취해소음료, 항산화및면역활성강화젤리, 지질대사 및혈행개선차제품의안전성평가에서반복독성시험, 항돌연변이원성검 정, 소화기세포에대한세포독성시험, hemolysis test, 동물실험을통한간 독성유발시험에서안전한것으로확인되었고, 동물실험종료후의조직검 사에서도정상조직과다른점을발견할수없었다. 따라서돌나물을이용한 제품은인체에독성을유발하지않는안전한제품으로판단되었다. 돌나물음료, 젤리, 차제품의안정성평가에서돌나물음료는실온에서 3개 월, 돌나물젤리는 4 냉장저장할경우 10일동안제품의품질이변하지 않았으며, 돌나물차제품은실온에서 6 개월동안품질이변하지않았다

11 2. 연구개발결과의활용실적 산업재산권출원및등록 구분명칭국명출원일 발명특허 특허출원 돌나물추출물로부터분리한플라보노이드화합물들을포함하는고혈압의예방및치료용약학조성물 돌나물즙을첨가한젤라틴젤리제조및품질특성 비고 ( 등록/ 출원번호) 대한민국 대한민국 산업체기술이전 기술내용산업체기술이전일 간기능보호능이강화된돌나물음료의제조에관한기술 돌나물즙을첨가한젤리의제조에관한기술 돌나물분말차제조에관한기술 ( 주) 대덕바이오자체활용예정 ( 주) 대덕바이오자체활용예정 ( 주) 대덕바이오자체활용예정 전시회 전시품목전시회명칭일시장소 돌나물효능홍보판넬및우량계통증식포장 돌나물기내배양유전자원및돌나물음료및젤리시제품 돌나물기능설명판넬및유전자원포장 2006 돌나물연구회현장간담회 자생식물산업화기술발표및전시회 2007 돌나물연구회현장간담회 원광대학교 경상대학교 원광대학교 교 육 교육내용 지피식물로서돌나물을비롯한몇가지약용식물의이용 돌나물우량계통선발및주요특성 돌나물주년생산을위한재배기술 대상및참석인원( 장소) 교육일시 전북진안군농가/50명 ( 원광대학교식물원) 돌나물연구회원및재배농가 /25 명 ( 원광대학교생자대시청각실) 돌나물연구회원및재배농가 /28 명 ( 원광대학교생자대시청각실) ~

12 학술발표 No. 논문제목학술대회명발표년월일 형태적특성을이용한돌나물유연관계분석 CCl 4 급성간독성에대한돌나물추출물의간보호효과 돌나물의캘러스형성및식물체분화에미치는절편부위및배지첨가물의영향 RAPD 방법을이용한돌나물의유연관계분석 돌나물수집종의비타민 C 산화활성비교 함량및항 Effect of medium supplements and basal medium on plant regeneration of Sedum sarmentosum Detoxification effect of Sedum sarmentosum on acute alcohol ilver injury Sedum sarmentosum prevent ethanol induce liver injury in rats Preparation and Quality of Jelly with Sedum sarmentosum 06 한국자원식물학회춘계학술발표회 06 한국식품과학회 춘계학술발표회 06 한국자원식물학회추계국제심포지움 07 한국약용작물학회춘계학술발표회 07 한국자원식물학회춘계학술발표회 07 한국육종학회춘계학술발표회 The 10th Asian Congress of Nutrition 한국식품영양과학회 추계학술발표회 07 한국식품영양과학회 추계학술발표회 Antiobese and hypolipidemic effects of 07 한국식품영양과학회 Sedum sarmentosum on high fat diet 추계학술발표회 Effect of Sedum sarmentosum 07 한국식품영양과학회 extract on cell death in cultured liver cancer cell 추계학술발표회 Hepatic Detoxification Activity and Reduction of Ethanol and 07 한국식품영양과학회 Acetaldehyde Concentrations of Sedum 추계학술발표회 sarmentosum Comparion of Growth and Quality among local strains in Hydroponic Culture of Sedum sarmentosum Effects of Cutting date and bedsoil on root and shoot growth in cutting of Sedum sarmentosum 07 한국원예학회추계학술대회 07 한국식물과학협의회공동국제심포지엄

13 논문게재 논문제목 돌나물삽목번식과기내마디배양에서신초형성및발근에미치는영향 국내자생돌나물의형태적특성에의한유연관계분석 돌나물수집계통의수확후저장온도에따른품질변이 차광재배가돌나물의수량및품질에미치는영향 돌나물즙을첨가한젤라틴젤리의제조및품질특성 한국산돌나물수집종의연관계분석 RAPD에의한유 돌나물의가을노지삽목에서삽수부위및삽식방법에따른생육특성 Optimization of productive composition for beverage adding Sedum sarmentosum extract using response surface methodology Hepatoprotective effect of Sedum sarmentosum extract on CCl 4 induced liver damage Hepatoprotective effect of Sedum sarmentosum extract on ethanol induced liver damage of rat 게재학술지명 권및쪽수 ( 년도) 한국원예과학기술지 24(1):43-47 (2006) 한국원예과학기술지 25(2): (2007) 한국생물환경조절학회지 한국생물환경조절학회지 16(3): (2007) 16(4): (2007) 한국식품과학회지 39(6): (2007) 한국원예과학기술지 25(1):68-74 (2008) 한국생물환경조절학회지 Food Sci. Biotechnol. 17(1):60-65 (2008) 투고중 구분 국내 국내 국내 국내 국내 국내 국내 SCIE Life Sci. 투고중 SCI Life Sci. 투고중 SCI 연구인력양성 구분소속인원비고 학사석사계 원광대학교 4 충남대학교 6 원광대학교 3 충남대학교 2 학사 10 명 석사 5 명 총 15명

14 3. 연구개발결과활용에대한건의 돌나물의 31 군집분석결과와 지역종에대한개화전생육특성과개화기화기특성을토대로한 RAPD를이용한유연관계분석결과는일부지역종을제외 하고는일치하였으며, 이는타작물의유전자원이나근연종간유연관계분석 및유전육종재료로의이용을위한자료로활용기능하였음. 기내배양묘를육성은 0.2 mg/l BA를첨가한 MS 배지에서배양후 80-90일 경에양호하였고, 기내활성보존을위한 agar 농도는 % agar 첨가할 경우, 상온에서도년1회의계대배양으로도유전자원을유지ㆍ보존할수있었 으며, ABA는 20 mg/l 첨가배지에서만 1년후까지도적정한활성을유지할 수있었음. 또한 2 저온항온기에서 agar 및 ABA 첨가에따른생육은농도 가높을수록억제되는경향을보였으며, 1년후에도계대배양없이 100% 생 존할수있어타영양번식작물의기내보존에활용할수있으므로타작물의 유전자원보존활용에이용할수있을것으로기대되었음. 돌나물을스치로폼접시에랩포장할경우, 5 에서는수확후 8일까지상품성을 유지한상태로저장이가능하므로, 돌나물수확후저온유통이바람직하였으 며, 이는돌나물유통기한을늘릴수있을뿐만아니라, 상품가치도높일수 있을것으로기대되었음. 본연구결과, 돌나물추출물을주원료로하는 숙취예방/ 해소음료, 돌나물 즙을함유하는 돌나물젤리 및지질대사개선효과가있는 돌나물차 를개 발하였으며, 이들제품에대해서특허를출원중에있으며, 향후상업화를통 하여농가수익증대에기여할수있을것으로기대되며, 돌나물은다음과같 은효능을가지고있어국민건강에도크게기여할것으로기대되었음. - 돌나물은고지방식으로인한비알코올성지방간질환을예방하고, 과량의알코올섭취로유발되는간손상을예방또는회복시키는효과를지니고있는것으로확인되었으며, 인간간암세포의성장을억제하는효과가있음. - 돌나물은자체내에함유된다량의 polyphenol 화합물들에의해항산화능을갖고있었고, in vitro/in vivo 실험에서항산화와관련된단백질들의활성을증가시키며, 장관면역촉진효과가우수함

15 - 돌나물은고지방식으로유도할수있는고지혈증및비만증을예방하는효과가있으며, 혈액의흐름을방해하는혈관내부의접합인자들의활성을억제하고이와관련된효소활성을억제함으로써지질대사및혈행을개선시키는효과가있음. 돌나물지역종의일반성분과영양성분을분석한결과, 일반성분에서는산지별 로유의적인차이를나타내지않았으나영양성분분석결과에서는 군산 지역 종이가장우수하였으며, 꽃이피지않아주년생산이가능하고, 형태적특성도 양호하므로, 이를우량품종으로등록할예정임. 돌나물및추출물을이용한신규제품에대하여반복독성시험, 항돌연변이원 성시험, 세포막용혈시험, 소화관세포독성시험및동물실험후의조직검사 등을시행한결과, 돌나물을이용한제품은모두안전한것으로판단되어향 후상업적생산이가능하다고판단되었음. 신규시제품에대한안정성검사에서돌나물음료는실온에서 3 개월, 젤리는 냉장보관시 10 일, 돌나물차는실온에서 6개월간제품의안정성을유지하는것 으로판단되어비교적보존기간이양호하였으므로상업화에바람직하였음. 따라서본연구에서개발된제품은특허출원/ 심사중에있으며, 특허진행이 완료되면참여기업인 ( 주) 대덕바이오에서상품화되어시판될것이다. 또한본연 구에서는돌나물의건강기능성을방대하게연구하였으나, 앞으로도돌나물이나 타내는건강기능성기전에대한연구는계속진행되어야할것으로사료되었다. 한국인의식품소비트렌드가점차건강지향성으로전환되고있음을고려할때, 돌나물이지닌새롭고다양한건강기능성을파악할필요성이있으며, 이와관련 된기술및지식의축적은국가경쟁력의향상에도기여할것으로기대되며이에 대한후속적인연구가필요한것으로보인다

16 SUMMARY Studies on health-benefit function, genetic resources conservation, and industrial utilized techniques for Sedum sarmentosum One of the genus Sedum of Crassulaceae, S. sarmentosum Bunge is widely distributed in North-East Asia. S. sarmentosum is one of the favorite fresh-vegetables in Korea. The whole plant of S. sarmentosum has been traditionally used as a folk medicine for clinic of chronic viral hepatitis, skin burn, and cancer in Korea. The plant has several alkaloids and terpens as major constituents, and its anti-hepatoxic property was also strong. Recently, S. sarmentosum was known as a source of herbal estrogen. In China, it is also used as a general gastric and renal regulator using various extracts or powders. However, S. sarmentosum has a low storage potential, and any healthy-food is not developed in Korea. Accordingly, there is an urgent need to work related to functional mechanisms and metabolism for producing health-benefit function food with high additive value in S. sarmentosum. This work was conducted with the following objectives; ⅰ) To study genetic relationship and in vitro conservation or cryopreservation for genetic resources and the storage temperature of shoot products for marketing of S. sarmentosum; ⅱ) To develope the health-benefit function food based on the works related to functional mechanisms and metabolism for increasing the utilization and additive value of S. sarmentosum; ⅲ) To investigate safety and stability of products for commercializing health- benefit function food using S. sarmentosum. 1. Anaysis of genetic relationship, in vitro conservation of genetic resources and development of shoot storage technique in S. sarmentosum Thirty-one strains were classified into two groups by cluster analysis based on the morphological characteristics, and Group Ⅰ included most of local strains with flowering characteristic, and Group Ⅱ included non-flowering, Wanju and Gunsan strains. Wanju and Gunsan local strains with good growth and non-flowering characteristics were favorable as edible resources. In

17 analysis of genetic relationship among 31 strains by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) with fifteen 10-mers and twelve 20-mers random primers, the result analyzed by 20-mers primers was matched well with morphological characteristics compared to 10-mers primer. Thirty-one strains were clustered into 2 groups. Group Ⅰ included twenty-seven local strains, and Group Ⅱ included Keumsan, Bucheon, Pocheon and Yongin strains with long hight, slender stem, narrow leaf, and abundant flowering characteristics. In vitro multi-shoots were produced on MS medium with 0.2 mg/l BA in days after node culture. For In vitro conservation of genetic resources, when shoot tips were cultured on MS media containing 5% sucrose and 1.2% agar, 0.2mg/L BA, and mg/l ABA at 4, or MS media containing 1.2% agar, 0.2 mg/l BA, and 6-9% sucrose, they could be conserved over one year without subculture. In vitro shoot-tips were successfully cryopreserved in PVS 2 solution with the preculture vitrification technique using M sucrose. The range of % post-thaw regeneration was obtained. The result showed a low viability, and S. sarmentosum was one of recalcitrant species for cryopreservation. Accordingly, the conservation of genetic resources of S. sarmentosum was more efficiency in vitro conservation using hard agar medium or ABA. The weight loss of fresh shoots showed significant difference ( %) between just before storage and 10 days after storage. Wanju local strain showed the lowest weight loss, and the most severe case was Pohang local strain. The freshness of shoot after storage was maintained in order of Wanju, Gunsan, Wando and Pohang local strain. When the fresh shoot was stored with wrap film-packaged condition, the freshness of shoots was maintained for 8 days after 5 storage. Vitamine C content and antioxidant activity of 13 local strains were analysed. Vitamin C contents of 13 local strains were ranged from to mg/kg, and it was high in Gunsan, Gwangyang, Buan, Wanju, Keumsan, Pocheon, and Bucheon strains. Gwangyang, Suncheon, Wando strains showed high EDA compared to the others. Vitamine C content and antioxidant activity were highest in Gwangyang strain

18 2. Investigation of health-benefit function and development of healthy-food with high additive value A. Improvement of hepatoprotective effect, isolation and identification of cancer inhibitory substance, and development of functional beverage using S. sarmentosum extracts Hepatic protective and cancer inhibitory substance was identified as tetrahydroxyflavonol (quercetin). Hepatoprotective effect to the liver injury induced by carbon tetrachloride in rats was higher in hexane, ethyl acetate, butanol extracts than in silymarine (control). Methanol, hexane, ethyl acetate and butanol extracts was significantly inhibited the induction of fatty liver by ethionine and ethanol, and hexane and ethyl acetate extracts were excellent inhibited effect compared to the others. Inhibitory effect of solvent extracts on human hepatoma HepG2 cell growth was highest in ethyl acetate extract (IC 50 = μg/ml). After oral adminstration of ethanol and aqueous or solvent extracts of S. sarmentosum in rats, blood ethanol level in aqueous extract was lower 2.3 times than the control, and ethanol oxidation in aqueous extract was more enhanced compared to the solvent extracts. Methanol and butanol extracts were significantly enhanced ADH and ALDH activities of ethanol administered rat. When aqueous or solvent extracts fermented before oral adminstration of ethanol in rats, blood acetaldehyde level in solvent extracts was decreased about 50% after one hour compared to the control, that in aqueous extract was hardly detected after four hour. Blood ethanol and acetaldehyde levels in human were significantly decreased by fermentation of aqueous or solvent extracts before oral adminstration of ethanol. Accordingly, a alcohol detoxification beverage contained S. sarmentosum extracts was prepared, and it is appling the patent

19 B. Isolation and identification of antioxidant- and immune-activity substances, mechanisms of antioxidant and immune activities, and development of functional jelly using S. sarmentosum extracts DPPH radical scavenging activity was most superior in subfraction E4 from ethyl acetate among solvent extracts, and the substance was identified as quercetin. Immune activity was most superior in subfraction E5 from ethyl acetate among them, the substance was identified as esculetin of coumarin group. After oral adminstration of S. sarmentosum solvent extracts for 4 weeks in rats, antioxidant activity was similar or high compared to the tocopherol or ascorbic acid (controls). Polyphenol concentration was high in methanol and ethyl acetate extracts, and it accorded that antioxidant activity was high in oral adminstration of methanol extract. When the RAW 264.7, murin macrophage cell line, was cultured in medium adding solvent extracts or LPS (lipopolysaccharide) for 2 days, nitric oxide (NO) production was decreased by methanol, hexane and ethyl acetate extracts in 0.1 μg/ml LPS level. Levels of decreased in solvent extract treatments. In rats fed with high fat diet and inos protein with LPS treatment was S. sarmentosum extracts, an aspect of protein expression increased glutathione peroxidase and glutathione reductase related to the antioxidant activity, and COX2 related to the immune activity. Accordingly, the Sedum jelly was prepared using S. sarmentosum juice supplemented with sugar and gelling agent, and contents of Ca, Fe, K, ascorbic acid and organic acids were increased to high levels of S. sarmentosum juice. Feeding preference was highest in jelly contained S. sarmentosum juice than solvent extracts. C. Isolation and identification of substances related to lipid metabolism and blood flow and immune activities, mechanisms of S. sarmentosum extracts and powder on lipid metabolism and blood flow, and development of functional tea using S. sarmentosum power

20 Inhibition of S. sarmentosum extracts in rat adipocytes proliferation was highest in ethyl acetate subfraction E1, the substance was identified as caffeic acid. IC 50 of ethyl acetate extract on inhibition of MC3T3-L1 differentiation was μg/ml, and PPAR-gamma gene expression was hardly detected in adding ethyl acetate extract. When S. sarmentosum power ( %) was added in hypercholesterol feed of rat, the level of weight gain in more increased S. sarmentosum power was low in spite of higher feed intake. In feeding S. sarmentosum power, total cholesterol, TG and LDL levels, and atherogenic indices were significantly decreased, and liver lipid and serum ALP levels was low compared to the control. Diet intake of S. sarmentosum could be prevented obesity, non-alcoholic fatty liver disease and hyperlipidemias induced by high fat diet, and it, inhibited hypertension, atherosclerosis and diabetes etc. Accordingly, the Sedum tea was prepared using S. sarmentosum powder. 3. Analysis of inorganic, nutritive and volatile contents and estimation of safety and stability for products of healthy-food Water content was higher at vegetative stage than flowering stage, and the range was %. K, Ca and Fe contents were high in Keumsan, Wando, Gunsan strains. Ascorbic acid and beta-carotene was highest in Gunsan strain. Sixteen volatile compounds was analyzed from shoot, and main compound was pyrazine and its derivatives. Beverage, jelly or tea adding solvent extracts, aqueous extract or powder of S. sarmentosum were safe in repeated toxicity test, antimutagenic test, cytotoxicity test, inhibition effect of cancer cell, and hepatotoxicity test. Beverage with hepato-protective activity was stable for 3 months at room temperature, and powder tea was stable after 6 months at room temperature. Jelly adding aqueous extract was stable for 10 days at

21 CONTENTS Preface 1 Summary (in Korean) 6 Summary (in English) 15 Content (in English) 20 Content (in Korean) 22 Chpapter 1. Introduction of the Project 24 Section 1. Objective of the Project 24 Section 2. Necessity of the Project 25 Section 3. Contents and Scope of the Project 27 Chpapter 2. Recent Development of Internal and External Technology 30 Section 1. Recent Research of S. sarmentosum in Korea 30 Section 2. Recent Research of S. sarmentosum in Foreign Countries 32 Chpapter 3. Research Results 33 Section 1. Anaysis of genetic relationship, in vitro conservation of genetic resources and development of shoot storage technique in S. sarmentosum Introduction Materials and Methods Results and Discussion 40 1) Genetic relationship of S. sarmentosum genetic resources 40 2) In vitro active collection and cryopreservation of S. sarmentosum 55 3) Variation of shoot quality by storage temperature after harvesting 61 4) Antioxidative activity and vitamin C content of S. sarmentosum Conclusions

22 Section 2. Investigation of health-benefit function and development of healthy-food with high additive value Introduction Materials and Methods Results and Discussion 77 1) Improvement of hepatoprotective effect, isolation and identification of cancer inhibitory substance, and development of functional beverage using S. sarmentosum extracts 77 2) Isolation and identification of antioxidant- and immune-activity substances, mechanisms of antioxidant and immune activities, and development of functional jelly using S. sarmentosum extracts 118 3) Isolation and identification of substances related to lipid metabolism and blood flow and immune activities, mechanisms of S. sarmentosum extracts and powder on lipid metabolism and blood flow, and development of functional tea using S. sarmentosum power Conclusions 165 Section 3. Analysis of inorganic, nutritive and volatile contents and estimation of safety and stability for products of healthy-food Introduction Materials and Methods Results and Discussion 172 1) Water contents and inorganic, nutrient, volatile components of S. sarmentosum 172 2) Estimation of safety and stability for functional beverage using extracts 176 3) Estimation of safety and stability for functional jelly using juice 186 4) Estimation of safety and stability for functional tea using power Conclusions 200 Chpapter 4. Attainment of Research Purpose and Contribution 202 Chpapter 5. Application of Research Results 208 Chpapter 6. Information of Foreign Science and Technology Related to Project 210 Chpapter 7. References

23 목 차 제출문 1 요약문 6 Summary( 영문) 15 Content( 영문) 20 제 1 장연구개발과제의개요 24 제 제 1 절연구개발의목적 24 2 절연구개발의필요성 25 제 3 절연구개발의내용및범위 27 제 2 장국내외기술개발현황 30 제 1 절국내연구현황 30 제 2 절국외연구현황 32 제 3 장연구개발수행내용및결과 33 제 1 절돌나물유전자원유연관계분석, 기내보존및저장성향상기술개발 서언 연구방법 결과및고찰 40 가. 돌나물유전자원의유연관계 40 나. 돌나물유전자원기내활성보존및초저온동결보존 55 다. 수확후저장온도에따른품질변이 61 라. 지역수집종들의항산화활성및비타민 C 함량 결론

24 제 2 절돌나물의건강기능성규명및고부가가치상품의개발 서언 연구방법 결과및고찰 77 가. 간기능개선및간암억제물질의분리ㆍ동정과효과탐색및제품개발 77 나. 항산화및면역활성물질의분리ㆍ동정과효과탐색및제품개발 118 다. 지질대사및혈행개선물질의분리ㆍ동정과효과탐색및제품개발 결론 165 제 3 절돌나물의성분분석및건강기능성돌나물제품의안전성및안정성평가 서언 연구방법 결과및고찰 172 가. 돌나물의주요성분 172 나. 간기능개선및간암억제작용이강화된돌나물제품의안전성및안정성평가 176 다. 항산화및면역활성이강화된돌나물제품의안전성및안정성평가 186 라. 지질대사및혈행개선기능이강화된돌나물제품의안전성및안정성평가 결론 200 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 202 제 5 장연구개발결과의활용계획 208 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 210 제 7 장참고문헌

25 제 1 장연구개발과제의개요 제 1 절연구개발의목적 돌나물 (Sedum sarmentosum Bunge) 은돌나물과에속하는다년생초본으로예로 부터봄철에어린싹을초고추장무침이나물김치등의식용으로이용하여왔으나, 최근우리나라의산야에서흔히보아왔던돌나물은난개발과제초제남용등으로대 부분사라져가고있는실정이다. 특히식ㆍ의약적으로중요한식물들을보존하는 일은자원전쟁의시대에국가적으로도아주중요하다. 돌나물은봄나물중에서영양 이풍부하고독특한향미를갖고있으며, 다육질의잎과줄기를가진여러해살이초 본식물로서두텁고윤기있는잎이줄기의마디를따라 3 장씩윤생한다. 5월중하 순에 15cm 내외의화경이발달하여 5매의꽃잎을가진연황색소화가여러개피는 데, 개화기간이비교적길어관상용으로도가치가있는중요한자생식물의하나이다. 돌나물은비타민 C 의함량이높고, 칼슘, 철분, 아연등의무기물함량도높을뿐 만아니라, 민간에서는생즙을간염, 대하증, 화상등에이용하고있으며, 최근약리 작용이과학적으로구명되고있어건강식품으로의개발이가능하다. 최근돌나물은 골다공증에유효하고, 간기능개선능이있는것으로보고되고있으나, 저장성이낮고 이를이용한가공식품이없어부가가치가매우낮은식품이다. 그러나유효지표성 분이분리 동정이되지않고있으며, 체내에서의기능성발현기전또는대사관련 연구가미흡한실정이다. 또한아직까지국내외적으로돌나물을이용한기능성식품 은개발되지않고있어, 새로운식품소재로서도매력이크다고할수있다. 따라서본연구의목적은다음과같다. 첫째, 식ㆍ의약적으로중요한돌나물유전자원의유연관계분석과기내활성보존 및초저온동결보존법을개발하고, 출하돌나물의시장성을높이기위한소포장용 저온저장온도를구명하여돌나물유통을활성화시키기위한기본기술을확립하고 한다. 둘째, 수요가한정되어있는돌나물의이용성과부가가치를높이기위하여, 체내 에서의기능성발현기전과대사관련연구를통한건강기능성식품을개발하여, 생 산농가의소득증대와국민건강에기여하고자한다. 셋째, 돌나물의기능성식품화에영향을미치는무기ㆍ영양성분및향기성분을 분석하고, 개발제품의급성및아급성독성과유전독성, 세포독성등의안전성과제 품보존을위한안정성을연구하여, 부가가치가높은건강식품으로개발하고자한다

26 제 2 절연구개발의필요성 21 세기에인류의복지를위한유전자원의중요성은생명공학기술의눈부신발전 과함께더욱그중요성이부각되고있으며, 선진국을비롯한개발도상국들이자국 의유전자원뿐만아니라, 새로운유전자원의탐색에많은인력과경비를투자하고 있다. 우리나라의자생식물들중에는의약품, 화장품, 건강보조기능성식품원료등 으로고부가가치를가지고있는식물종들이많은데, 이러한자생식물을멸종위기에 서보존하고, 성인병예방과치료를위한의약품및식품원료등으로자원화하는 것이시급하다. 1. 기술적측면 영양번식식물의유전자원을포장에서보존할경우, 많은시간과숙련된인력및 시설이필요하고, 병리적ㆍ생리적퇴화가능성, 기상재해에의한소실이나유전적침 식등의위험에노출되어있다. 이에따라기내활성보존(in vitro conservation) 이나 초저온동결보존(cryopreservation) 을이용하여보존하면, 좁은공간에서다수의유전 자원을보존할수있어경제적이므로돌나물에서도이와관련된연구가시급하다. 또한돌나물은다육식물로서유통및저장시에수분증발로시들은상태로전시판매 되는경우가많아시장성이낮은한원인이되고있어, 소포장및저온유통이시급 하지만관련연구가미흡한실정이다. 돌나물의소비량을증대시키기위해서는주년생산을해야하며, 계절에알맞은 계통선발도필요하다. 농가에서는주로겨울철부터봄철출하를목적으로돌나물을 재배하고있으며, 개화후에는줄기가붉어지고질기며, 쓴맛이증가하여식용에부 적합하여생산을기피하고있다. 농가에서주로하고있는동계무가온하우스재배 는저온하에서생육이양호한계통을선발하여재배하는것이좋고, 여름철재배를 위해서는차광하에서내음성이높은계통을선발할필요가있다. 최근기능성식품에대한관심이높아지고있는데, 이들식품에는비타민 A, C, E, flavonoids, anthocyanins, carotenoids, tanic acid 등의항산화물질이풍부하게들 어있어활성산소가생기는것을막고노화를억제시키거나, 각종암및질병을예 방하는데도움이된다. 이러한기능성물질이많이함유된식품재료를이용하여기 능성식품으로개발하여산업화하려는연구가많이이루어지고있는데, 돌나물은우

27 리나라에서는어느지역에서나생산이가능한건강채소로서건강식품재료로적합하지만, 이를산업화하려는적극적연구는미흡한실정이다. 이에따라돌나물의무기성분, 기 능성영양성분및향기성분분석을통하여돌나물제품개발을위한정보를확충하고, 돌나 물의기능성에대한소비자의이해를증진시키며, 항산화활성및생리활성등을다각도 로검정하여, 녹즙, 음료, 젤리, 차등과같은다양한기능성식품으로개발할필요가있다. 돌나물을재료로음료, 젤리, 차등의건강기능성식품으로개발하였을경우, 돌 나물제품에서급성및아급성독성과유전독성, 세포독성시험과세포막안정화시험 및간독성지표효소의활성도, 아급성독성시험후의조직검사등을통하여안전 성을검정할필요가있다. 또한생산된제품의성상, 중량( 용량) 편차, 확인시험, 함량 시험, 보존제시험, 미생물오염시험, 중금속시험및 ph, 알코올도수등의분석을통 한안정성검정도필수적으로이루어져야한다. 2. 경제 산업적측면 돌나물의재배는일부농가에서겨울철에서봄철생산을위하여무가온비닐하 우스에서주로이루어지고있는데, 수요가많지않아주년생산이이루어지지않고, 한정적으로생산되고있다. 이에따라고부가가치돌나물제품을개발하여수요를 창출함으로서, 농가의지속적인재배생산과농가수익을증대시킬수있을것이다. 신선채소로비타민 C와칼슘함량이높아식품재료로서의가치가높을뿐만아 니라, 김치, 샐러드, 초무침등의신선채소로서재배전망이높은돌나물의형태적특 성과 RAPD에의한유연관계분석을통하여우량계통선발및신품종육성의기초정 보를얻을수있으며, 앞으로이를토대로농가에새로이육성된우량품종을공급할 수있다. 돌나물을대량으로소비할수있는효능효과가규명된기능성제품의개발로판 매량을증가시킨다면농가에서대량생산할수있는기반이조성될것이다. 돌나물 의효능효과물질을분석한결과, 다양한건강기능성돌나물제품을개발가능하며, 이 를통하여돌나물소비량도크게늘어날수있고, 지적재산권을확보가가능하다. 또한가공 유통기술을높여기존의채소류와차별화된소비시장을개척할수있으 며, 국내건강기능성채소( 산야채류) 류시장의규모에비해크게낙후된돌나물유통 체계확립을통하여돌나물의소비증가에따른재배농가의규모화와수익성제고할 수있을것이다

28 3. 사회 문화적측면 오랫동안민간에서김치, 샐러드, 초무침등의신선채소로서이용되어왔던돌나 물유전자원을보존하므로서, 유전자원으로서의가치뿐만아니라바위틈에서도잘 자라는강인한생태적특성을이용하여, 옥상정원이나공원의지피식물로의이용이 가능하여, 국민들의휴식과향토음식소재로서활용할수있다. 우리나라는알코올섭취량이높아국가ㆍ사회적으로많은문제를야기하고있는 데, 돌나물음료의개발은과량의알코올섭취로유발되는간손상을예방또는회 복시키며, 인간간암세포의성장을억제하는특성이있어국민건강향상에크게이바 지할수있다. 또한전세계적으로비만이국가적과제로인식되는가운데, 돌나물은고지방식 으로유도되는비알코올성지방간을예방하는효과가있고, 고지혈증및이와관련 된고혈압, 동맥경화증, 당뇨병등의발생을억제시킬수있을것으로기대되어국민 건강향상에크게기여할것으로보인다. 제 3 절연구개발의내용및범위 1. 돌나물유전자원보존및저장성향상기술개발 식ㆍ의약적으로중요한돌나물유전자원의유연관계분석과기내활성보존및 초저온동결보존법을개발 - 31 개돌나물지역종의영양생장기및개화기형태적특성조사하여, Ward의 방법(SAS Institute) 으로제곱유클리디안거리측도를 Z정수로변수변환하 여군집분석한결과를 dendorgram으로작성하여비교 - RAPD를이용한돌나물의유연관계분석을위하여 31개돌나물지역종의 DNA 추출및다형성을가진 primer 탐색과, NTSYS program을이용한 dendrogram 작성 - 돌나물유전자원의기내활성보존을위한기내영양체최적번식법개발하고, - 영양체의기내활성보존에의한저온(0-4 ) 및단기(1-2 년) 보존법확립 돌나물유전자원의초저온동결보존을위하여동아및기내신초의초저온동 결보존법을확립

29 출하돌나물의시장성을높이기위한소포장용저온저장온도를구명과 돌나 물지역종들의항산화활성및비타민 C 함량을분석하여제품개발을위한 우량돌나물계통선발 - 돌나물유통을위한수확후적정저장온도를구명하여저장성향상 - 지역수집종들의항산화활성및비타민 C 함량을분석 2. 돌나물의건강기능성구명및고부가가치상품의개발 돌나물의간기능개선및간암억제물질의분리ㆍ동정과효과탐색및제품개발 - 돌나물의간기능개선및간암억제효과탐색 - 돌나물로부터간암억제물질의분리및동정 - 돌나물및돌나물추출물이백서의간기능에미치는영향 - 간기능관련단백질의탐색 - 돌나물및돌나물추출물이간암세포의분화에미치는영향탐색 - 간기능개선및간암억제작용이강화된제품의개발 돌나물의항산화및면역활성물질의분리ㆍ동정과효과탐색및제품개발 돌나물의항산화및면역활성탐색 돌나물로부터항산화및면역활성물질의분리및동정 돌나물및돌나물추출물이백서에서의항산화관련효소활성구명 돌나물및돌나물추출물이면역활성에미치는영향 항산화및면역활성관련단백질의탐색 항산화및면역활성이강화된제품의개발 지질대사및혈행개선물질의분리ㆍ동정및제품개발 - 돌나물의지질대사및혈행개선연구 - 돌나물로부터지질대사및혈행개선물질의분리및동정 - 돌나물및돌나물추출물이비만에미치는영향 - 지질대사및혈행개선지표단백질의동정 - 돌나물및돌나물추출물이지질대사및혈행개선에미치는효과구명 - 지질대사및혈행개선기능이강화된제품의개발

30 3. 돌나물의성분분석및건강기능성돌나물제품의안전성및안정성 평가 돌나물의일반성분, 영양성분, 향기및향미성분분석 - 돌나물의우량지역종에대한수분함량, 회분, 환원당, 비타민 A, C, 조지방, 조단백등의함량측정하고, 향기및향미성분등을 GC/MS 분석 돌나물성분분석및건강기능성돌나물제품 ( 간기능개선및간암억제효과 ) 의안전성및 안정성평가 - 돌나물숙취해소음료에대한반복독성시험, 항돌연변이원성검정, 소화기세 포에대한세포독성시험, hemolysis test, 동물실험을통한간독성유발시험을 통하여안전성평가 - 실온에저장시 3 개월간제품의성상, 중량편차, 증발잔류물, 성분확인, 품질특 성에대한변화와대장균, 녹농균, 살모넬라균, 황색포도구균, 일반세균, 진균 등의미생물오염을조사 항산화및면역활성이강화된돌나물제품( 돌나물젤리) 의안전성및안정성 평가 - 돌나물젤리에대한반복독성시험, 항돌연변이원성검정, 소화기세포에대한 세포독성시험, hemolysis test, 동물실험을통한간독성유발시험을통하여안 전성평가 - 저온에저장시제품의성상, 중량편차, 증발잔류물, 성분확인, 품질특성에대 한변화와대장균, 녹농균, 살모넬라균, 황색포도구균, 일반세균, 진균등의미 생물오염을조사 지질대사및혈행개선기능이강화된돌나물제품( 돌나물차) 의안전성및안정 성평가 - 돌나물차에대한반복독성시험, 항돌연변이원성검정, 소화기세포에대한세 포독성시험, hemolysis test, 동물실험을통한간독성유발시험을통하여안전 성평가 - 실온에 6 개월간저장시제품의성상, 중량편차, 증발잔류물, 성분확인, 품질특 성에대한변화와대장균, 녹농균, 살모넬라균, 황색포도구균, 일반세균, 진균 등의미생물오염을조사

31 제 2 장국내외기술개발현황 제 1 절국내돌나물연구현황 1976 년고려대학교에서처음으로돌나물의지역수집종에대한연구를수행 하였으며, 국내 13개소의지역종간에는형태적으로차이가있는생태형이나 변종은없고, 잎의형태나절간장의차이는환경변이에서오는것으로서유전 적변이는아닌것으로추정하였음 ( 곽, 1976) 년농촌진흥청에서지도용교재로돌나물의번식및재배법에관한내용 을다루고있으며, 우량지역종선발이나품종개발은아직보고된바없음 ( 농촌진흥청, 1990) 년고려대학교에서돌나물의담액수경재배에관한연구에서, 수경배양 액은 Yamazaki- 상추배양액에서생체중, 근장, 엽장이좋은생육을보였으 며, 수경재배돌나물의비타민 C 함량은낮은경향이었음. 수경재배용배양묘 는반음지에서생육한것이양호하여, 차광재배가필요하다고하였음( 김, 고 려대학교석사학위논문, 1996) 1996 년제주도농업기술원은항암효과가있는자생식물로천문동과함께돌 나물을유망약초로선발한바있음( 제주농업시험연구보고 , 1996) 1996 년강원대학교에서돌나물의항돌연변이효과가있다고보고하였음( 한국 식품영양과학회지 27: , 1998) 년보건환경연구원에서돌나물을비롯한국내자생산채류에대한영양 성분을분석한결과, 돌나물의비티민 C함량이시금치보다 2-3배많이함유 되어있으며, 많은미량요소및비타민의보고로서영양학적으로가치가높 다고하였음( 보건환경연구원보 8:27-32, 1997) 년경상북도농업기술원에서유망자생지피식물개발에관한비교연구 에서돌나물은식재장소에관계없이식재면적당피복면적의증가율이 215배

32 로가장높아지피식물로유망하다고보고하였음( 경상북도농업기술원, 1997) 년안동대학교돌나물자생지의서식환경과생장특성에관하여조사한 결과, 생육적온은 25 내외이고, 15 에서도생장이이루어지며, 50% 차광 조건에서개화는지연되었으나, 생체중은증가하는것으로나타나여름철재 배가능성이높았음.( 이, 안동대학교석사학위논문, 1998). 2000년원광대학교의과대학의연구결과돌나물추출물은간암세포에대한증식을억제하는기능이있어, 항암효과가있는식물로서유망한것으로보고하였음 (J. Ethnopharmacol. IRELAND 70: , 2000) 년돌나물이난소절제한흰쥐의혈중지질함량을낮추며, 도라지추출물첨가에의한돌나물의항발암상승효과가있다고하였음( 김등, 한국식품영양과학회지 31(1): ; 31(2): ) 2002 년순천청암대학교에서야채건강음료재료로서의돌나물에관한성분분 석결과, 음료개발적성이높다고하였음( 정등, 한국조리과학회지 8(1):55-69, 2002) 2003 년진주산업대에서저토심옥상녹화시스템에서돌나물의생육에대한 인공배지종류, 토심, 그리고배수형태의효과를보고하였음( 강, 한국조경학 회지 31(2): , 2003) 년초임계이산화탄소를이용한돌나물추출물이사염화탄소로유발된흰 쥐의간지질대사, 지질과산화를조절하여지방간을억제하며, 항산화관련효 소의발현이높다고하였음( 김등, 한국유화학회 21(3): , 2004) 이상과같이돌나물에관한연구는최근연구보고가많이이루어지고있으 나, 유전자원관련연구가미흡하여식용, 관상및지피식물로서의가치가우 수함에도불구하고, 신품종개발이이루어지지않고있으며, 간보호및항 암관련유용물질의분리 동정을통한부가가치가높은건강식품으로개발된 예는아직없으며, 타식물에비하여관련연구는미흡한실정임

33 제 2 절국외돌나물연구현황 우리나라에서만신선채소로애용되는돌나물은식용으로하는국가가없어 외국의식용관련연구는거의없으며, 중국을중심으로간보호관련추출물 의효과와성분분석을중심으로연구되고있는실정임. 중국의상해의과대학에서는돌나물에서간세포보호기능을가진 sarmentolin 이란물질을분리동정한바있으며, 동연구진은한국에서수집한 돌나물에서인간면역결핍바이러스(HIV) 에대한억제효과가있음을밝혔는 데, 중국에서는홍경천을비롯한돌나물과식물들이약용식물로서연구개발 되고있는추세임 (J. Ethnopharmacol. IRELAND 70: , 2000; Phytochemistry 49: , 1998; Phytomedicine 4:53-58, 1997). 미국에서는돌나물이번식이용이하고, 생장이빨라지피식물(groundcover) 로서이용할수있다고하였으며, 스페인에서는돌나물을비롯한 sedum 속 식물들이옥상정원(roof garden) 을위한식물로적합한데, 그이유는 sedum 속식물들이뿌리가깊지않아낮은토층에서생육이가능하며, 건조와서리 에강할뿐아니라생육이빨라지표를단기간에피복할수있기때문이라고 하였음 (Plant propagator, USA. 28:9, 1982; Agricultura Revesta Agropecuaria, Spain 65: , 1996). 네덜란드에서아시아 Sedum 속식물의알카로이드분석을보고하였음 (Phytochemistry 41(5): , 1996). 중국에서돌나물의플라보노이드와 Sterol 의성분분석을실시하였음(Chinese Traditional and Herbal drugs, 28(5): , 1997; Journal of China Pharmaceutical University, 28(5): , 1997). 돌나물추출물로부터간보호활성이높은성분을추출하였음 (Chinese Pharmaceutical Affairs 16(6): , 2002) 따라서이러한국내외추세에따라, 1인당알코올소비량이가장많은우리 나라에서돌나물의간보호관련유효지표성분의분리 동정과건강기능성연 구에따른체내에서의기능성발현기전또는대사연구를시급히선점할필 요가있음

34 제 3 장연구개발수행내용및결과 제 1 절돌나물유전자원유연관계분석, 기내보존및 저장성향상기술개발 1. 서 언 우리나라의자생식물은약 4,500여종으로이중 640종이식용및약용으로이 용가능하다(Kang 등, 1997). 예로부터취나물류, 고사리, 두릅, 더덕, 도라지, 잔대 등의산에서자라는것들과냉이, 달래, 쑥, 씀바귀, 고들빼기, 질경이, 민들레등의 들에서자라는산채들이식품이나구황식물로이용하여왔는데, 최근자원식물의중 요성이인식되면서관련연구가급증하고있다. 돌나물(Sedum sarmentosum Bunge) 은돌나물과의여러해살이초본식물로서예로부터봄철에자란어린싹을 식용으로이용하여왔다. 다육질의잎과줄기에는비타민 C 와칼슘함량이높고, 음 료적성도높으며(Kim 등, 2002), 항산화활성, HIV 및간염바이러스억제효과및 항암활성도높다(He 등, 1998; Park 등, 2002; Woo 등, 1997). 농가에서는주로겨울 철부터봄철출하를목적으로돌나물을재배하고있으며, 개화후에는줄기가붉어지 고질기며, 쓴맛이증가하여식용에부적합하다. 따라서돌나물의주년생산을위해서 는계절에알맞은계통선발이필요한데, 동계무가온하우스재배에서는저온하에 서생육이양호한계통을선발하여재배하는것이좋고, 여름철재배를위해서는차 광하에서내음성이높은계통을선발할필요가있다. 최근산업화에따른환경파괴와오염은멸종위기식물의증가를가속화하고있 다. 특히식ㆍ의약적으로중요한식물들을보존하는일은자원전쟁의시대에국가적 으로도아주중요하다. 영양번식식물의유전자원을포장에서보존할경우, 많은시 간과숙련된인력및시설이필요하고, 병리적ㆍ생리적퇴화가능성, 기상재해에의 한소실이나유전적침식등의위험에노출되어있다. 이에따라조직배양산물을 기내활성보존(in vitro conservation) 이나초저온동결보존(cryopreservation) 을이용 하여보존하면, 좁은공간에서다수의유전자원을보존할수있어경제적이므로돌 나물에서도이와관련된연구가필요하다. 한편돌나물은다육식물로서유통및저 장시에수분증발로시들은상태로전시판매되는경우가많아시장성이낮은한원인 이되고있어, 소포장및저온유통이시급한실정이다. 본연구는식ㆍ의약적으로중요한돌나물유전자원의유연관계분석과기내활 성보존및초저온동결보존법을개발하고, 출하돌나물의시장성을높이기위한소 포장용저온저장온도를구명하고자실시하였다

35 2. 연구방법 가. 돌나물유전자원의유연관계분석 1) 형태적특성에의한유연관계분석 시험에사용한재료는여러지역에서수집한 31개돌나물지역종을원광대학교 포장에재식하여 9월중순에약 10cm 자란줄기를채취하여, 마디사이가 5mm이하인 정단부 3마디를 50 mm 길이로잘라계통당 1 m2 시험구에 1010 cm간격으로 3반복 삽목한다음, 월동후신초의생육을조사하였다. 시비량은삽목 2 일전에인산(10 kg /10a) 은전량기비로칼리(15 kg/10a) 와질소(15 kg/10a) 는기비 70%, 이듬해봄 4월 5일에추비 30% 로시비하였다. 생육조사는화경출현전에지상부생육과개화특성을반복당 10개체씩조사하 였다. 초장은가장긴줄기의기부에서줄기선단의잎까지측정하였고, 잎의장폭은 가장길고넓은부위를측정하였으며, 줄기두께는다이엘게이지로줄기의중앙부위 를측정하였다. 개화특성은개화시, 개화성기, 화경수등을조사하였고, 화기특성은 화경당소화수, 화판장의폭, 꽃받침의장폭, 약, 화사, 주두및자방장등을조사하 였다. 조사결과는 SAS(version 8.2) 를이용한계층적군집분석에서 Ward의방법 (SAS Institute) 으로제곱유클리디안거리측도를 결과를 dendorgram 으로작성하여비교하였다. Z정수로변수변환하여분석한 2) RAPD 에의한유연관계분석 가) 공시재료및 DNA 추출 전국 31개지역에서수집한돌나물지역종의어린잎을계통당 0.2 g씩유발에 넣어액체질소로급냉시켜마쇄한다음, Eppendorf tube로옮겨 600 μl DNAzol ES(Molecular Research Center, Inc., USA; 6 μl 2-mercaptanol, 60 μl 10% polyvinylpyrrolidone, 534 μl DNAzol ES) 를혼합하여잘섞어준뒤 20 rpm으로 1 시간동안교반하였다. 600 μl chloroform을첨가하여 5 분간둔다음, 원심분리(12,000 g, 4, 4 min) 하여상등액을새로운 tube에옮겨 0.75배의에탄올을첨가하고잘섞 어 5 분간방치한뒤원심분리(5,000 g, 4, 4 min.) 하였다. 상등액을버리고 80 μl ( 초순수 75 μl, RNase 5 μl ) 의 RNAse로잘녹인후 37 에서 30분간배양한뒤 460 μl DNAzol과 340 μl에탄올을첨가하여잘섞은후 5분간상온에방치하여원 심분리(5,000 g, 4, 4 min) 후상등액을제거하였다. 1 ml 75% 에탄올을첨가하고 5 분동안간헐적으로약하게섞어준뒤원심분리(5,000 g, 4, 4 min.) 하여상등액을 버리고에탄올을완전히제거한후멸균한 3차증류수로 DNA 를녹였다. 추출된 DNA는 1.2% agarose gel에서약 10분간전기영동하여 genomic DNA 관찰하였으

36 며, fluorometer(td-360, Turner Designs Sunyvale, CA, USA) 로 DNA양을확인하 고추출한 DNA의농도를계산하여최종농도가 20 ng/ μl가되도록희석하여실험에 사용하였다. 나 ) Polymerase chain reaction RAPD 분석을위한 primer는 15종의 10-mers Operon primer (Operon Technologies Inc., USA) 와 12종의 20-mers SRILS Uniprimer (SeouLin Bioscience Inc., Korea) 를이용하였다(Table 1). PCR(T-gradient 96, Biometra Co.) 반응액은 20 μl당 250 um dntp, 1 unit Taq DNA polymerase, 10 mm Tris-HCl, 40 mm KCl 및 1.5 mm MgCl 2 를함유한 Accupower PCR Premix(Bioneer Co.) 를이용하여 20ng gdna 를첨가하였다. PCR 과정은 94 에서 5분간 pre-denaturation 후, 94 에서 1분간 denaturation, 38 (10-mers Operon primer) 및 55 (20-mers SRILS Uniprimer) 에서 1분간 annealing, 72 에서 2분간 extension 과정을 45 cycle 수행 한다음, 72 에서 7분간 last extension 을수행하였다. PCR 산물은 1.5% agarose gel에서 50 V에서 1시간 20분동안전기영동 (Mupid-2, Cosmo Bio. Co.) 하여자외선하 에서증폭된 DNA 를관찰하고사진으로기록하였다. DNA 다형성을보이는 primer를 선발한다음, 2회반복하여재현성있는 band를유연관계분석에이용하였 다. 다) 유연관계분석 수집한돌나물의지역종간유연관계분석은 NTSYS(Numerical Taxonmy and Multivariate Analysis System) computer program의 UPGMA (Unweighted Pair-Group Method, Arithmetic average method; Rohlf, 1989) 방법으로 31개의지역종에대하여출현한 밴드를 1 로하고, 분명하지않거나나타나지않는밴드를 0으로 code화하여분석한 결과를토대로 dendorgram 을작성하였다

37 Table 1. Nucleotide sequence of primers used for RAPD analysis of S. sarmentosum. 10-mers primer y Nucleotide sequences (5 to 3 ) 20-mers primer z Nucleotide sequences (5 to 3 ) OPA 01 5'-CAGGCCCTTC-3' SRILS 1 5'-ATCCAAGGTCCGAGACAACC-3' OPA 02 5'-TGCCGAGCTG-3' SRILS 2 5'-CCCAGCAACTGATCGCACAC-3' OPA 03 5'-AGTCAGCCAC-3' SRILS 3 5'-GTGTGCGATCAGTTGCTGGG-3' OPA 10 5'-GTGATCGCAG-3' SRILS 4 5'-AGGACTCGATAACAGGCTCC-3' OPA 11 5'-CAATCGCCGT-3' SRILS 5 5'-GGCAAGCTGGTGGGAGGTAC-3' OPA 13 5'-CAGCACCCAC-3' SRILS 6 5'-ATGTGTGCGATCAGTTGCTG-3' OPC-01 5'-TTCGAGCCAG-3' SRILS 7 5'-GGTGAACAGTGAGATGAACC-3' OPC-06 5'-GAACGGACTC-3' SRILS 8 5'-TACATCGCAAGTGACACAGG-3' OPC-20 5'-ACTTCGCCAC-3' SRILS 9 5'-AATGTGTGGCAAGCTGGTGG-3' OPD-02 5'-GGACCCAACC-3' SRILS 10 5'-GATGTGTTCTTGGAGCCTGT-3' OPD-07 5'-TTGGCACGGG-3' SRILS 11 5'-GGACAAGAAGAGGATGTGGA-3' OPJ-18 5'-TGGTCGCAGA-3' SRILS 12 5'-GGTTGTAGGCCGATATTGTC-3' OPN-11 5'-TCGCCGCAAA-3' OPQ-01 5'-GGGACGATGG-3' OPR-13 5'-GGACGACAAG-3' y Operon random primer (Operon Technologies Inc.) z SRILS uniprimer (SeouLin Bioscience Inc.) 나. 유전자원의기내활성보존및초저온동결보존 1) 마디배양을위한다아체(multi-shoot) 형성 돌나물유전자원의기내활성보존및초저온동결보존을위한재료를육성 하기위하여군산, 포항, 용인, 금산지역종의마디배양을하였다. 7-8cm 크기의신 초로부터상부줄기를채취하여, 70% 30 초간, 0.5% sodium hypoclorite에 15분간살 균하여멸균수로 5 회수세하였다. 잎을제거한상부마디를 10 mm 크기로잘라서 0.2 mg/l BA(benzyl amino purine) 를첨가한 MS 배지에샤레당 10개체씩치상하였 2 다. 배양조건은 25±2 에서 27 μmol/m (18/6 h, day/night) 하에서명배양하였으며, 30 일간격으로계대배양하여줄기수를조사하였다

38 2) 기내활성보존 돌나물의기내활성보존에미치는 ABA, sucrose, 한천(agar), Gelrite의영 향을조사하기위하여, 첨가농도를각각달리한배지를직경 mm 샤레에 25mL 씩분주하였다. ABA 영향은 0.2 mg/l BA와 sucrose 50 g/l, agar 1.2% 를 기본으로넣은 MS배지에 ABA 0, 5, 10, 20 mg/l 를첨가하였다. 삼투조절제로서 sucrose 영향은 0.2 mg/l BA와 agar 1.2% 를기본으로넣은 MS배지에 2, 3, 6, 9% g/l sucrose 를첨가하였다. 수분스트레스로생장을조절하기위하여한천과 Gelrite 를 0.2 mg/l BA와 50 g/l sucrose를기본으로넣은 MS배지에한천은 0.8, 1.2, 1.6, 2.0%, Gelrite는 0.4, 0.6, 0.8, 1.0% 를첨가하였다. 군산과용인지역종의기내증식된 10 mm 크기의 3개체로된기내신초를샤레당 5 포기씩치상하였다. 치상이끝난샤 레는랩 3 겹과파라필름(Parafilm M, USA) 으로싸서 25, 20, 15, 10 에서 각각 5일씩순화시켜 4±1 저온항온기에보존하면서생육상태를관찰하였다. 1년 후의생육및생존율을조사하였다. 생존율은 25 배양실에서, 7 일간회복시킨후, 새로운배지로계대배양하여조사하였다. 3) 초저온동결보존 돌나물의기내신초및동아를이용한초저온보존을위하여, 포항지역종의 기내신초상부 10 mm를잘라내어 0, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 1.0 M sucrose 용액에서 1 일동안전배양한다음, 5 ml cryogenic vial에 5개체씩 6 반복으로넣고, 2 ml PSV 2(Sakai 등, 1990) 동결보호제를첨가하여 -40 까지는 programed cell freezer 로 -0.5 /min 동결시킨후, 액체질소로최종동결하였다. PSV 2 동결보호제의조성 은 30% glycerol(3.26 M), 15% ethylene glycol (EG, 2.42 M) 과 15% DMSO(1.9 M) 를첨가하였다. 동결 3일후에꺼내어 35 수조에서 2분간신속해동시켜멸균수로 4 회수세한다음, 0.2 mg/l BA를첨가한 MS배지를 20 ml 씩분주한 mm 샤레에서배양하여생존율을조사하였다. 또한같은방법으로휴면기동아와동아가 2-3개붙은줄기를 5 cm 길이로채취하여각각 70% EtOH에표면살균후 1% sodium hypoclorite 용액에 20 분간살균한다음, 멸균수로 5 회수세하였다. 무균작업 대에서 1시간건조또는 0.5 M sucrose 용액에서 4시간전배양한것을기내신초와 같은방법으로액체질소에동결하였다가해동시켜, 동아는 0.2 mg/l BA를첨가한 MS 배지에서배양하였고, 동아가붙은줄기는멸균한버미큐라이트에심은후, 25 에서순화관리하면서생존율을조사하였다

39 다. 수확후저장온도에따른품질변이 돌나물의수확후저장성을증진시키기위하여, 수집한돌나물지역종들중생 식용으로유망한완주, 군산, 포항, 완도등 4개지역종을재료로선발하여원광대학 교실습포에서 9월 10 에노지에삽목재배하였다. 시비량은질소-인산-칼리를 kg/10a으로인산은전량기비로질소와칼리는기비 70% 와추비 30% 로 관리하였다. 추비는이듬해 4월1 일실시하였다. 실험에사용한돌나물은 5월 10 일개화전초장이최대에달하였을때, 10cm 길이 로줄기를채취하였다 cm 사각스티로폼접시에 40개의돌나물줄기를 20개 씩두줄로놓은다음, 랩(linear LDPE) 으로포장하여 20, 10, 5 에각각저장하였다. 저장후생체중, 수분함량, 엽록소함량, 색도등의변화를 2 일간격으로조사하였고, 측정이끝난시료는새로운랩으로재포장하여같은조건으로저장하였다. 마지막 10일째에는줄기에있는잎의 50% 이상변색하거나부패한개체수의비율을조사하 였다. 생체중은전자저울을이용하여 mg 단위까지조사하였고, 수분함량은동결건조 기에건조하여건물중을측정한후, 생체중에서건물중을뺀값을구하였다. 엽록소 함량은완전전개된중간부위의잎에서 SPAD 값 (Model MINOLTA SPAD-502, Minolta camera co., Ltd) 을측정하여비교하였고, 엽색은 Chroma meter(model CR 2000, Minolta camera Co., Ltd) 로 Hunter L(lightness: black=0, white=100), a(redness to greeness:red=+100, green=-80), b(yellowness to blueness: yellow=+70, blue=-70) 값을측정하였다. 실험은 4 반복으로실시하였으며, 데이터분석은 SAS 통계프로그램(V 9.12, SAS Institute Inc.) 을이용하여 ANOVA 분석으로변량간유의차를구하였고, 평균값에 대한유의차는 P 0.05에서 DMRT 를이용하여비교하였다. 라. 지역수집종들의항산화활성및비타민 C 함량분석 1) 돌나물우량계통의항산화능 생육특성이양호한 13 지역종으로부터 3반복채취한생체시료 20g을 MeOH 200mL로 3일씩 2 회추출하고, 남은조직은비이커에취하여 MeOH 100mL를넣고 호모게나이저로마쇄하여뷔흐너깔때기로감압여과하였다. 총 500mL의 MeOH 추 출액을 rotary evaporator에서농축후동결건조시켜 50,000ppm 농도가되도록 MeOH 을가하여가용성성분을녹이고고상으로남아있는부분을분산시키기위해 sonication 하였다. 이중 175μL를취해 MeOH 325μL를가하여 17,500ppm이되도록 희석하여, 20μL를 DPPH free radical scavenging assay 에활용하였다. 동결건조시 료는 1g당증류수 5 ml을가하여 2시간방치한여 MeOH 30mL로 24 시간 4회

40 gyratory shaker 상에서진탕추출(100 rpm) 하여원심분리(8,000rpm, 1min) 하고각상 등액을모아약 150 ml의 MeOH 추출액을 lotary evaporator에서농축하여 MeOH ( 약5-10 ml) 에녹여 20mL glass vial에서 Air gas 로농축후동결건조한다음, 14,000ppm(14 mg/ml) 농도가되도록 MeOH을가하여가용성성분을녹이고고상 으로남아있는부분을분산시키기위해 sonication 하였다. 시료를고르게진탕분산시 킨후 100μL를취해 MeOH 9.9 ml를가하여 140ppm(350μg/2.5mL) 이되도록희석 하고그중 2.5 ml 씩을 DPPH free radical scavenging assay 에활용하였다. 항산 화성검정은이와이(2004) 의방법에따라 300μM DPPH에서흡광도를측정하여항 산화활성을계산하여비교하였다. (Sample+DPPH 용액의흡광도 )-(Sample+MeOH 의흡광도 ) 항산화활성 (%) = (MeOH+DPPH 용액의흡광도 )-(MeOH 의흡광도 ) 2) 돌나물우량계통의비타민 C 함량 개화전식물체를채취하여 40 에서 5 일간건조시킨다음, 20 mesh 스크린 을통과하도록분쇄하여비타민 C 분석시료로사용하였다. 분쇄한시료 10g을취하 여 10% metaphophoric acid 40mL를가하여 10분간추출한후 3,000 rpm으로원심 분리하여상등액을취하는추출과정을 2회반복하여합한상등액을 100 ml로정용 하여 HPLC(Waters 2695 Alience system) 로분석하였다. Column은 capcellpack UG-120 C18( , 5 μm) 을사용하였고, flow rate은 0.5 ml/min., detector는 UV 254 nm 조건으로측정하였다. 표준용액은 ascobic acid(a 5960, Sigma Com. Ltd.) 를 5% metaphophoric acid 에녹여사용하였다

41 3. 결과및고찰 가. 돌나물유전자원의유연관계 1) 형태적특성에의한유연관계 가) 지역수집종의형태적특성 우리나라에서자생하는 31개지역의돌나물지역종들을삽목하여동일한재배조 건에서개화전과개화기의생육특성을조사한결과, 개화전생육특성은초장, 엽수, 엽크기, 엽형, 등의특성은큰차이를보이지않았다. 울산지역종은엽장이짧은타 원형잎이었으며, 포천, 용인, 부천, 금산의지역종들은다른지역종들에비하여마디 길이가길고, 줄기직경이가늘며, 엽폭이좁은타원형잎을가졌다. 초장은용인지 역종이 36.1 cm로가장컸으며, 엽장과엽폭이각각 2.0, 0.6 mm로좁은타원형에가 깝고, 줄기직경도 2.0 mm로가장가는특성을보였다(table 2). 개화특성에서개화시 는 5월 14일~5월 18 일이었고, 개화기는 5월 24일~6월 1일로개화가가장빠른계 통은포천, 용인, 금산, 완도지역종이었고, 개화가가장늦은계통은부산, 논산, 무 안, 김천, 여주, 천안지역종들이었다(Table 3). 개화기간은약 1개월정도지속되었 으며, 용인, 금산, 부안목포지역종들은, 꽃이크고, 화경수, 소화수등이많아관상 가치가높았다. 특히용인및금산지역종의화경장은 53.1과 50.1 mm로가장커서 관상용으로기대되었다. 그리고완주및군산지역종은생육이왕성하고, 꽃이피지 않아서돌나물주년생산에적합한계통으로보였으며, 또한개화하는포항, 완도, 용인지역종은 28.7~36.1 cm로왕성한초신장을보였고, 특히완도포항의지역종은 줄기직경이굵고마디수도많다. 따라서용인, 금산, 지역종들의엽의형태는장폭 비가큰장타원형이었고, 줄기직경이 2.0~2.2 mm로가늘고, 개화특성이양호하여관 상용으로유망하였다. 완주, 군산지역종은꽃이피지않고생육이왕성하여식용으 로유망하였으며, 그외에포항, 완도, 지역종들은생육및개화특성모두양호하여 다양한용도로활용가능할것으로기대되었다. 나) 생육및개화특성에따른군집분석 31 개돌나물지역종들에대한개화전생육특성과개화특성에대한군집분석결 과를토대로 dendorgram 을작성한결과, 개화전생육특성에따른군집분석에서는 SPRSQ(SemiPartial R-Square) 값 0.168을기준으로크게 2군으로나눌수있었다 (Table 4). 부산, 서천, 울산, 부안등 27 개지역종들이 Ⅰ군에속하였으며, 포천, 용 인, 부천, 금산등 4 개지역종은 Ⅱ군에속하였다. Ⅰ군은다시두개의그룹으로나 눌수있었다. Ⅰ-2 군내에서도두개의소그룹으로나뉘어졌는데, 꽃이피지않는완

42 주와군산지역종은여주, 봉평, 구례지역종과같은그룹으로분류되었다. 다른지 역종들에비하여초장이다소길고, 잎의장폭비가긴타원형으로줄기직경이가는 특성을가진포천, 용인, 부천, 금산등 4개지역종은 Ⅱ군에속하여개화전형태적 특성으로도군집이잘이루어졌다. 한편개화기의개화특성에따른군집분석에서는 SPRSQ값 0.042를기준으로하여 2 군으로나눌수있었는데(Table 4), Ⅰ군에는꽃 이피지않는두지역종을제외한 29 개의지역종들이속하였으며, Ⅱ군에는꽃이피 지않아확연히구분되는군산및완주지역종들이속하였다. 그러나개화전형태적 특성과개화기의화기특성을구분하여분류한경우, 품종군이일치하지않았는데, 초 장이크고잎과줄기가가는특성을가지며, 소화수와꽃이약간큰것으로나타난 4 개의지역종중포천지역종은부천, 용인, 금산과다르게분류되며, 형태적특성과 는약간다르게분류되어개화특성만으로군집분석하는것은바람직하지않은것으 로생각되었다. 따라서생육특성및개화특성을모두이용하여군집분석한결과 (Fig. 1), SPRSQ값 0.153를기준으로크게 2 군으로나눌수있었는데, Ⅰ군에는꽃 이피는 29 지역종이속하였다. Ⅰ군은다시두개의소그룹으로나눌수있었는데, Ⅰ-1 군은초장이크고잎과줄기가가늘며개화특성이양호한포천, 용인, 부천, 금 산등 4 개지역종이속하였고, 형태적특성및개화특성이명확하지않은 25지역종 들은 Ⅰ-2 군에속하였다. Ⅱ군에는꽃이피지않아다른지역종과확연히구분되는 군산및완주지역종들이속하였다. 또한 SPRSQ값 0.051를기준으로하면 3 그룹으 로나눌수있는데, 개화특성이양호한포천, 용인, 부천, 금산등 4개지역종을 Ⅰ 군, 개화및생육특성이비슷한 25 지역종들은 Ⅱ군으로, 개화가되지않는군산, 완 주지역종은 Ⅲ군으로나누는것도좋은군집분석이될수있지만, 여기서는개화특 성을중심으로크게 2 군으로나누고, 포천, 용인, 부천, 금산등 4개지역종을 Ⅰ군내 소그룹으로나누어지는것이가장이상적이라고보았다. 따라서개화전생육특성이 나개화특성만으로군집분석을하는것보다는개화전생육특성과개화특성을모두 이용하는것이형태적특성에따른분류와가장일치하였다

43 Table 2. Morphological characteristics of Korean native S. sarmentosum. Local strain Plant height ( cm) Stem Internode diameter /length ( mm) ( cm) No. of node /stem No. of Leaf /stem Leaf (mm) Length Width L/W Wanju 19.6± ± ± ± ± ± ± ±0.3 Gunsan 21.8± ± ± ± ± ± ± ±0.5 Gwangyang 26.4± ± ± ± ± ± ± ±0.4 Jeju 24.4± ± ± ± ± ± ± ±0.4 Mokpo 28.2± ± ± ± ± ± ± ±0.6 Suncheon 30.7± ± ± ± ± ± ± ±0.5 Buan 30.7± ± ± ± ± ± ± ±0.4 Wando 30.7± ± ± ± ± ± ± ±0.2 Pohang 28.7± ± ± ± ± ± ± ±0.4 Gangnung 28.2± ± ± ± ± ± ± ±0.4 Kimcheon 26.3± ± ± ± ± ± ± ±0.4 Gurye 26.8± ± ± ± ± ± ± ±0.4 Gumi 27.2± ± ± ± ± ± ± ±0.6 Nonsan 29.0± ± ± ± ± ± ± ±0.4 Muan 26.6± ± ± ± ± ± ± ±0.3 Busan 27.2± ± ± ± ± ± ± ±0.4 Boseong 26.9± ± ± ± ± ± ± ±0.4 Bongpyeong 24.9± ± ± ± ± ± ± ±0.8 Seosan 27.6± ± ± ± ± ± ± ±0.5 Taean 26.2± ± ± ± ± ± ± ±0.3 Yeojoo 26.1± ± ± ± ± ± ± ±0.6 Yeosu 28.2± ± ± ± ± ± ± ±0.6 Iksan 28.2± ± ± ± ± ± ± ±0.3 Ulsan 29.7± ± ± ± ± ± ± ±0.6 Jangsu 28.8± ± ± ± ± ± ± ±0.4 Chonan 30.0± ± ± ± ± ± ± ±0.4 Hongseon 27.6± ± ± ± ± ± ± ±0.5 Pochun 31.0± ± ± ± ± ± ± ±0.9 Yongin 36.1± ± ± ± ± ± ± ±0.6 Bucheon 32.2± ± ± ± ± ± ± ±0.8 Geumsan 31.1± ± ± ± ± ± ± ±

44 Table 3. Flowering characteristics of Korean native S. sarmentosum. Local strain First Flowering Flower stock length flowering time ( cm) No. of flower/ stock Wanju - No flowering - Gunsan - No flowering - Flower diameter ( mm) Petal (mm) Length Width Gwangyang May16 May ± ± ± ± ±0.3 Jeju May15 May ± ± ± ± ±0.2 Mokpo May16 May ± ± ± ± ±0.0 Suncheon May16 May ± ± ± ± ±0.0 Buan May16 May ± ± ± ± ±0.1 Wando May14 May ± ± ± ± ±0.0 Pohang May16 May ± ± ± ± ±0.2 Gangnung May16 May ± ± ± ± ±0.0 Kimcheon May17 May ± ± ± ± ±0.1 Gurye May16 May ± ± ± ± ±0.1 Gumi May16 May ± ± ± ± ±0.2 Nonsan May16 May ± ± ± ± ±0.0 Muan May17 May ± ± ± ± ±0.2 Busan May18 June ± ± ± ± ±0.0 Boseong May16 May ± ± ± ± ±0.1 Bongpyeong May16 May ± ± ± ± ±0.1 Seosan May16 May ± ± ± ± ±0.1 Taean May16 May ± ± ± ± ±0.1 Yeojoo May17 May ± ± ± ± ±0.1 Yeosu May16 May ± ± ± ± ±0.1 Iksan May17 May ± ± ± ± ±0.0 Ulsan May16 May ± ± ± ± ±0.0 Jangsu May15 May ± ± ± ± ±0.0 Chonan May17 May ± ± ± ± ±0.1 Hongseon May16 May ± ± ± ± ±0.1 Pochun May14 May ± ± ± ± ±0.1 Yongin May14 May ± ± ± ± ±0.1 Bucheon May15 May ± ± ± ± ±0.0 Geumsan May14 May ± ± ± ± ±

45 Table 3. Continuous data. Local strain Sepal (mm) Filament Length (mm) Anther length (mm) Length Width Long Short Long Short Style length (mm) Ovary length (mm) Wanju Gunsan Gwangyang 5.6± ± ± ± ± ± ± ±0.5 Jeju 7.4± ± ± ± ± ± ± ±0.5 Mokpo 4.8± ± ± ± ± ± ± ±0.1 Suncheon 3.9± ± ± ± ± ± ± ±0.2 Buan 4.8± ± ± ± ± ± ± ±0.1 Wando 4.0± ± ± ± ± ± ± ±0.2 Pohang 5.8± ± ± ± ± ± ± ±0.1 Gangnung 5.0± ± ± ± ± ± ± ±0.1 Kimcheon 5.9± ± ± ± ± ± ± ±0.2 Gurye 5.8± ± ± ± ± ± ± ±0.0 Gumi 6.2± ± ± ± ± ± ± ±0.2 Nonsan 5.3± ± ± ± ± ± ± ±0.1 Muan 5.6± ± ± ± ± ± ± ±0.1 Busan 4.7± ± ± ± ± ± ± ±0.1 Boseong 6.3± ± ± ± ± ± ± ±0.1 Bongpyeong 7.0± ± ± ± ± ± ± ±0.4 Seosan 4.6± ± ± ± ± ± ± ±0.1 Taean 6.3± ± ± ± ± ± ± ±0.1 Yeojoo 4.5± ± ± ± ± ± ± ±0.1 Yeosu 6.1± ± ± ± ± ± ± ±0.1 Iksan 6.8± ± ± ± ± ± ± ±0.1 Ulsan 4.1± ± ± ± ± ± ± ±0.1 Jangsu 3.3± ± ± ± ± ± ± ±0.3 Chonan 6.5± ± ± ± ± ± ± ±0.3 Hongseon 4.8± ± ± ± ± v ± ±0.2 Pochun 4.8± ± ± ± ± ± ± ±0.1 Yongin 5.3± ± ± ± ± ± ± ±0.2 Bucheon 4.9± ± ± ± ± ± ± ±0.1 Geumsan 6.3± ± ± ± ± ± ± ±

46 Table 4. Classification of Korean native S. sarmentosum based on growth and flowering characteristics. Growth stage Growth before flowering Flower structure at flowering stage Grouping Local strains No. Group I-1 Group I-2 Busan, Iksan, Wando, Suncheon, Chonan, Pohang, Mokpo, Ulsan, Yeosu, Gwangyang Hongseong, Jangsu, Seosan, Buan, Muan, Kimcheon, Boseong, Gumi, Nonsan, Gangnung, Taean, Jeju, Yeojoo, Bongpyeong, Gurye, Gunsan, Wanju Group II Geumsan, Yongin, Bucheon, Pocheon 4 Group I-1 Group I-2 Taean, Yeosu, Muan, Hongseong, Gurye, Busan, Gangnung, Yeojoo, Seosan, Wando, Iksan, Chonan, Gumi, Boseong, Pohang, Bongpyeong, Jeju Bucheon, Geumsan, Yongin, Nonsan, Pocheon, Ulsan, Suncheon, Buan, Mokpo, Jangsu, Kimcheon, Gwangyang Group II Gunsan, Wanju

47 Ⅰ- 1 Geumsan Yongin Bucheon Ⅰ Pochun Jangsu Yeojoo Hongseon Seosan Bongpyeong Gurye Ⅰ-2 Taean Boseong Jeju Suncheon Buan Mokpo Iksan Busan Wando Yeosu Muan Nonsan Gangnung Gumi Kimcheon Chonan Ⅱ Pohang Ulsan Gwangyang Gunsan Wanju Fig. 1. Classification of S. sarmentosum based on growth and flowering characteristics

48 최근들나물은항산화및항바이러스성약리효과가뛰어나(Park 등, 2002; He 등, 1998; Woo 등, 1997). 신선채소로서뿐만이아니라, 자생화훼로서의가치가높아 지피식물, 분화용, 실내및옥상정원등에도널리이용되고있으며, 돌나물을비롯한 Sedum 속식물들에대한연구가최근활발하게이루어지고있다 (Jeong, 1999; Kim, 1994; Kim & Huh, 2003). 돌나물과의 Sedum 속에는애기기린초 (Sedum middendorffianum ), 태백기린초(Sedum latiovalifolium ), 땅채송화 (Sedum oryzifolium), 꿩의비름 (Sedum drythrostichum Miq. ), 둥근잎꿩의비름(Sedum ortundifolium), 세잎 돌나물 (Sedum sieboldii) 등이있다(Kwon & Jeong, 1999). Sedum 속식물에대한종분류는 Nakai(1909) 에의해처음이루어졌으며, 그 후식물분류학적인연구가석엽표본이나재배실험에의한생체표본조사등이지속 적으로이루어져왔다(Clausen, 1975; Paterson 등, 1988). 한국산 Sedum 속식물은 한분류군내종간및종내에서도잎이나외형의변이가심하며, 영양기관뿐만아니 라생식기관인꽃에서도크기나수의변이가흔히나타난다(Chung과 Kim, 1989; Kim, 1989). 오(1985) 는한국산돌나물과식물들을 5 속, 34 종, 7변종으로나누어분류 학적체계를세웠으며, Park 등(2003) 은한국산돌나무속가는기린초아속식물의형 태적유연관계분석을통하여한국특산종인속리기린초, 섬기린초와태백기린초는 기린초집단에포함된다고하였다. Sedum 속식물은같은종내에서도잎이나줄기 같은외형의변이가크고, 생식기관인꽃의크기나수의변이도흔히나타나지만, 이 러한형태적특성이군집분석결과와일치하지않는경우가많으며(Chung과 Kim, 1989; Kim, 1989), 쌀보리(Cho 등, 2002), 들깨 (Kim 등, 2003), 미나리(Kim 등, 2000) 등 다른식물들의군집분석에서도형태적특성과분류학적기준이일치하지않는경우 가많다. 본연구에서는형태적특성및개화특성에따라품종군분류가뚜렷하게 나타났으며, 이러한결과들은품종구분이나육종을위한기초자료로유용하게이용 될수있을것으로기대된다. 이와같이자원식물의개발에있어서유전자원의다양성에대한정보는매우중 요하며, 종이나집단간의유전적연관성에대한평가는새로운유전적조합을위한 유전자도입의선택에큰역할을제공하는데(Sneath와 Sokal, 1973), 지역재래종의 경우한정된조건에서다년간재배적응되어왔으므로육종재로로활용하는데변이 가적은것이결점이다(Kwack, 1976). 식물의유전적유연관계를평가하는방법으로 주로식물의형태적특징이나생화학적인동위효소분석그리고 DNA분석등을통 하여이루어지고있다. 식물의유연관계분석에서본연구에서와같이형태적특성 을이용한방법은경제적이면서일반적인방법이지만, 환경의영향에민감하여때때 로품종구별을하는데어려움이있어, RAPD 분석에의한유연관계와비교하였다

49 2) RAPD 에의한유연관계 가) Primer에따른 PCR products 우리나라에서자생하는 31개지역의돌나물지역종들을삽목하여동일한재배조 건에서재배하여 genomic DNA 를추출하여, 15개의 10-mers random primer와 12개 의 20-mers random primer를이용하여 RAPD 분석을실시한결과, polymorphism 을 보인 10-mers random primer는 14 개, 20-mers primer는 6 개로, 이들 primer의 GC 함량, 증폭산물의수, polymorphic band 수, polymorphism 은 Table 5와같다. 10-mers primer는총 band수 143개중에서 polymorphic한 band수는 47 개, primer당 평균 band수는 3.4 개로나타났다. 또한 20-mers primer 는총 band수 116개중에서 polymorphic 한 band수는 90 개, primer당평균 band수는 15 개였다. 본연구에서 polymorphic band 수는카네이션(Lee 등, 2002), 자생붓꽃(Hong과 Koh, 2004), 제비 꽃속(Yoo 등, 2004) 에서보고된것과비교하여적은결과를얻었으나, SRILS UniPrimer 1, 7, 8, 11은 primer 당 15개이상의 polymorphic band 를나타냈다. OPC-20(10-mers) 에서의 band pattern은 15개 band중 4개의 polymorphic band를보 였는데, 포천, 용인, 부천, 금산지역종에서만나타나거나, 또는용인, 부천지역종에 서만나타났다. SRILS Uniprimer(20-mers) 5는 14개 band중 7개의 polymorphic band 가나타났으며, 논산지역종에서만나타나거나, 또는포천, 용인, 부천, 금산지 역종에서는나타나지않았다. 또한 SRILS Uniprimer(20-mers) 7에서는 20개 band중 18개의 polymorphic band를보여돌나물지역지역종간분류에유용하였다 (Fig. 2). 이와같이 primer당 band수는 20-mers SRILS Uniprimer 에서높게나타났는데, Um 등(2001) 도 20-mers SRILS Uniprimer를이용한인삼의 RAPD 분석에서본실험과 같은조건으로증폭한결과, 5개의 primer에서평균 11.4개의 polymorphic band를 얻었다고하였다. RAPD를이용한유연관계분석에는종특이적밴드의탐색이중요 한데, 포인세티아에서는 polymorphic band pattern을보인두개의 primer만을이용하 여집단분류가가능하였으며 ( Ling 등, 1997), 마늘에서는화분임성을구분할수있었 고(Choe 등, 2003), 카네이션에서도종특이적밴드를보여 RAPD 분석에의한유연 관계분석이효율적이었다고하였다(Lee 등, 2002). 그러나 RAPD를이용한 DNA의 polymorphism 은식물종에따라다르며(Welsh 등, 1991), template DNA내의 GC 함 량(Innis 등, 1990), primer의염기구성의 GC 함량(Heo 등, 2004; Williams 등, 1993) 및 PCR에조건등에따라달라질수있어식물종별유전변이분석에중요한요인 으로작용하기때문에보다정확한검토가필요하다. 또한 primer 길이에따라서도 polymorphism 에차이가나타나는데, 장미(Debener와 Mattiesch, 1999; Kim 등, 2006) 와아시아계백합(Yamagishi, 2002) 등에서는 10-mers primer보다 12-mers 또

50 는 15-mers 이상의긴 primer에서 primer당밴드수도많고다양한크기의밴드가 나타나며, polymorphism 이높게나타난다. 그러나 17-mers 이상의 primer간에는유 의한차이가없다(Ye 등, 1996). 다만 10-mers의짧은 primer를이용하는경우에도 primer의 GC함량및염기구성이알맞고 DNA 정제가잘되어있으면재현성에전혀 문제가없다(Patwary 등, 1994; van Oppen 등, 1996). 본연구에서도얻어진 polymorphic band들은명확하고재현성있는 band 로분석되었으며, 20-mers SRILS Uniprimer는 10-mers primer보다 primer당 polymorphism 이높게나타났다. Table 5. Primers selected for RAPD analysis of S. sarmentosum. Primer OPA OPC OPD OPJ-18 OPN-11 OPQ-01 OPR-13 GC content (%) No. of amplification products No. of polymorphic products Total (Mean) (3.4) SRILS Total (Mean) (15.0)

51 Fig. 2. RAPD products generated with OPC-20 (upper), SRILS Uniprimer 5 (middle), and SRILS Uniprimer 7 (below) among 31 S. sarmentosum. ( polymorphic band)

52 나) 유연관계 Operon primer 14개와 SRILS Uniprimer 6개를이용하여돌나물 RAPD-PCR에 의해얻어진 polymorphic band를각각하나의형질로보아기초자료행렬을작성하 고이를 NTSTS-PC program으로분석하여 dendrogram 을작성하였다(Fig. 3, 4). Operon primer(10-mers) 에서는유연계수 0.76을기준으로하여크게 2군으로나눌 수있었는데, Ⅰ군은금산지역종을포함하여 28 지역종이속하였으며, Ⅱ군은포천, 부천, 용인등 3 지역종이속하였다. Ⅰ군은다시두개의소그룹으로나누어졌는데, 형태적특성이포천, 부천, 용인과비슷한금산지역종은따로분류되었으며, 완주와 군산등 2 지역종, 광양, 구례, 무안, 장수등 4 지역종, 포항, 김천, 봉평, 천안익산, 여산, 태안등 7 지역종, 구미와홍천등 2 지역종, 순천, 완도, 논산등 3 지역종간 에는각각낮은유연계수수준에서유집되어유연관계가밀접한것으로나타났다 (Fig. 3). 10-mers Operon primer 를이용한국내자생식물의유연관계분석에서수집 계통간유연관계가밀접하게나타나는경우가미나리(Kim 등, 2000) 와반하(Tae 등, 2005) 에서도보고된바있다. 한편 SRILS Uniprimer(20-mers) 를이용한분석결과 에서는유연계수 0.64를기준으로하여크게 2 군으로분류할수있었는데, Ⅰ군에는 완주및군산지역종을포함하여 27 지역종들이속하였으며, Ⅱ군은포천, 용인, 부 천, 금산등 4 지역종들이속하였다(Fig. 4). 특히 Ⅱ군에속한포천, 용인, 부천, 금 산지역종들은초장이길며( cm), 줄기가가늘고( mm) 잎모양또한 장폭비가큰긴타원형( ) 으로다른지역종들과형태적특성에서차이를보였 는데 (Table 6), RAPD 분석결과에서도같은그룹으로분류되었다. 이러한결과는저자 등(Kim과 Lee, 2007) 이이에앞서보고한지역종들의형태적특성에따른군집분석 결과와도잘일치하였다. 그러나 10-mers와 20-mers primer에서나타난 polymorphic band를종합하여작성한 dendrogram은형태적특성과의분류연관성 이낮았다(data not shown). 따라서 10-mers Operon primer에서보다 20-mers SRILS Uniprimer를이용한 RAPD 분석에서지역종간유연계수차이가뚜렷하였고, 형태적특성과도잘일치하였는데, 이는 10-mers primer보다 20-mers SRILS Uniprimer에서 primer 당밴드수가많고, 종특이적 polymorphism이높게나타났기 때문으로보인다(Debener와 Mattiesch, 1999; Kim 등, 2006; Yamagishi, 2002; Ye 등, 1996)

53 Table 6. Morphological characteristics of S. sarmentosum in Korea. Local Plant Leaf Flowering Stem diameter height length/ ( mm) strain ( cm) width time Wanju 19.6± ± ±0.3 no-flowering Gunsan 21.8± ± ±0.5 no-flowering Gwangyang 26.4± ± ±0.4 May 29 Jeju 24.4± ± ±0.4 May 30 Mokpo 28.2± ± ±0.6 May 27 Suncheon 30.7± ± ±0.5 May 29 Buan 30.7± ± ±0.4 May 29 Wando 30.7± ± ±0.2 May 28 Pohang 28.7± ± ±0.4 May 30 Gangnung 28.2± ± ±0.4 May 30 Kimcheon 26.3± ± ±0.4 May 26 Gurye 26.8± ± ±0.4 May 26 Gumi 27.2± ± ±0.6 May 30 Nonsan 29.0± ± ±0.4 May 30 Muan 26.6± ± ±0.3 May 28 Busan 27.2± ± ±0.4 June 01 Boseong 26.9± ± ±0.4 May 26 Bongpyeong 24.9± ± ±0.8 May 27 Seosan 27.6± ± ±0.5 May 28 Taean 26.2± ± ±0.3 May 26 Yeojoo 26.1± ± ±0.6 May 28 Yeosu 28.2± ± ±0.6 May 29 Iksan 28.2± ± ±0.3 May 27 Ulsan 29.7± ± ±0.6 May 29 Jangsu 28.8± ± ±0.4 May 29 Chonan 30.0± ± ±0.4 May 30 Hongseon 27.6± ± ±0.5 May 30 Pochun 31.0± ± ±0.9 May 28 Yongin 36.1± ± ±0.6 May 26 Bucheon 32.2± ± ±0.8 May 28 Geumsan 31.1± ± ±0.9 May 25 이와같이 RAPD 분석기법은여러식물종에서유전자원의변이탐색과종속간유 연관계를분석하는데널리이용되어왔다. Yoo 등(2004) 도 RAPD 분석방법이 ISSR 이나 PCR-RFLP 분석보다한국산제비꽃속의종간유연관계를밝히는데유용하다 고하였다. RAPD를이용한유연관계분석결과와종또는형태적특성간에는식물 종및연구자에따라일치하는경우도있지만, 그렇지않은경우도많다. Sedum속 식물(Kwon과 Jeong, 1999), 카네이션(Lee 등, 2002), 자생붓꽃(Hong과 Koh, 2004),

54 둥굴레속(Jang 등, 2004) 및제비꽃속(Yoo 등, 2004) 에서는 RAPD 분석결과와형태 적특성또는종속간분류가일치하기도하지만, 들깨(Kim 등, 2003), 천남성속(Lee 와 Kim, 2005) 및고추냉이(Heo 등, 2004) 등에서는일부계통에서형태적특성과 RAPD 분석결과와상이하게나타나기도한다. 본연구에서 6종의 20-mers SRILS Uniprimer를이용한 RAPD 분석결과, 밴드의 polymorphism이비교적잘나타났으 며, 형태적특성에따른분류(Kim과 Lee, 2007) 와도잘일치하여짧은시간내에변 이탐색및품종군분류와교배모본선정등에이용될수있을것으로보인다 Wanju Gunsan Gwangyang Gurye Muan Jangsu Pohang Kimcheon Bongpyeong Chonan Iksan Yeosu Taean Seosan Gangnung Gumi Hongseon Boseong Jeju Suncheon Wando Nonsan Ⅰ Ⅱ Buan Mokpo Busan Ulsan Geumsan Pochun Bucheon Yongin Fig. 3. Genetic relationships among 31 local strains of S. sarmentosum based on RAPD markers with 10-mers primer (Operon random primer, Operon Technologies Inc.)

55 0.64 Wanju Mokpo Gunsan Gwangyang Seosan Taean Busan Boseong Bongpyeong Jangsu Chonan Iksan Kimcheon Gurye Muan Ⅰ Gumi Jeju Nonsan Yeojoo Yeosu Ulsan Gangnung Hongseon Suncheon Buan Wando Pohang Ⅱ Pochun Bucheon Yongin Geumsan Fig. 4. Genetic relationships among 31 local strains of S. sarmentosum based on RAPD markers with 20-mers primer (SRILS UniPrimer, SeouLin Bioscience Inc.)

56 나. 돌나물유전자원기내활성보존및초저온동결보존 영양번식작물의유전자원관리에서가장큰문제는포장보존에따른포장 관리, 시간및노력등유지비용이과다하고, 타식에의한유전적퇴화및병리적ㆍ 생리적퇴화로인한특성유지가어려우며, 예기치않은기상재해로인한유전자원 소실의위험이크다. 이에따라최근영양번식작물의유전자원을효과적으로보존 하기위하여기내보존및초저온보존을통하여유전자원의유실및퇴화방지를위 한장기저장방법의연구가이루어지고있다. 1) 마디배양을위한다아체(multi-shoot) 형성 돌나물유전자원의기내저온보존을위한기내배양묘를육성하기위하여 0.2 mg/l BA를첨가한 MS 배지에서군산, 포항, 용인, 금산지역종을마디배양하여 30 일간격으로계대배양을하였다. 증식된줄기수를조사한결과(Table 7), 초대배양 30일경에는 7.5 개의신초가형성되었고, 60일경에는 21.6 개, 21.6 개, 90일경에는 49.8 개의신초가발달하였다. 120일경에는 100개이상의신초를가진다아체 (multi-shoot) 를형성하였다(Fig. 5). 이들다아체는초대배양후 80-90일경에초장 의신장이적당하고, 마디가짧으며줄기가굵어기내활성보존및초저온동결보존 재료로편리하게사용할수있었다. 기내활성보존및초저온동결보존은새로운배 지로계대배양하여약 2 주후발근이되고, 초세가안정화된후에사용하는것이바 람직하였다. 또한이렇게증식된돌나물다아체는여러종류의기내배양재료로도 편리하게이용할수있을것으로기대되었다. Table 7. Variation of multi-shoot according to the days after culture in vitro propagation of S. sarmentosum. Number of No. of multi-shoot by local strain subculture z Wanju Pohang Geumsan Mean z Explants were subcultured in the interval of 30 days on MS medium supplemented with 0.2mg/L BA

57 Fig. 5. Multi-shoot derived from in vitro node culture of S. sarmentosum at 120 days after culture. Culture medium was MS medium supplemented with 0.2mg/L BA. 2) 기내활성보존 종자와마찬가지로기내에서배양된세포, 기관, 조직, 유식물체등은 0-5 저온하에서기내활성보존(in vitro conservation) 이가능하다. 삼투압, 배지지지물, 생장조절제등의배지조성이나산소, 광등을조절하여생장을억제시키면기내에서 도년1 회의계대배양으로유전자원을장기간보존할수있다. 이에따라돌나물유 전자원을 ABA, sucrose, 한천및 Gelrite 농도를조절하여 4±1 저온항온기에서배 양하여 1 년후의생존율을조사하였다(Table 8, 9). ABA 첨가영향은첨가농도가 높을수록생육이억제되었으며, 대조구에서만이듬해여름철웃자라는현상이나타 났으나, 1년후에도양호한활성을보여 100% 생존율을보였다(Fig. 6A, Table 8). Sucrose 농도의영향은 2%, 3% 에서는웃자라는경향을보였으며, 6% 와 9% 에서는 기부에서캘러스화하는경향이있었으나, 1 년후에도양호한활성을보였다(Fig. 6B, Table 9). 한천과 Gelrite 첨가농도의영향은생존에는문제가없었으나, 첨가농도에 관계없이 10 개월경부터웃자라는현상이나타나부적합하였다. 따라서돌나물의 기내저온활성보존은 0.2mg/L BA와 50mg/L sucrose, 1.2% agar를기본으로한배 지에 10-20mg/L ABA 또는 6-9% sucrose를첨가하는것이유전자원의생육및활 성이양호하였다

58 Table 8. Effect of ABA concentration on growth of S. sarmentosum (Yongin ABA (mg/l) strain) in one year after in vitro conservation at 4. Plant height (cm) No. of shoot Fresh weight (mg/explant) survival rate (%) Table 9. Effect of sucrose concentration on growth of S. sarmentosum (Yongin Sucrose (%) strain) in one year after in vitro conservation at 4. Plant height (cm) No. of shoot Fresh weight (mg/explant) survival rate (%) ) 초저온동결보존 식물의세포나조직, 유식물체등의조직배양산물을액체질소(-196 ) 에보 존하는초저온동결보존(cryopreservation) 은유전자원을반영구적으로저장할수있 으며, 필요에따라수시로꺼내어사용할수도있어편리하다. 식물세포는초저온에 저항성이없으므로동결전전처리로탈수시킨다음, 동결보호제에넣어동결시켜야 생존할수있다. 최근에는고농도의동결보호제에짧은시간동안탈수시켜직접 액체질소에넣는급속동결법은동결및해동과정에서세포내자유수와동결보호제가얼음결정을형성하지않기때문에세포내외가유리처럼고체 (glass-like solidification) 또는비결정의겔상태(amorphous phase) 로유리화(vitrification) 되기때문에 유리화동결보존 (vitrification cryopreservation) 으로불리며, 세포손상을최소화할 수있기때문에널리이용되고있다(Fahy et al., 1984). 돌나물기내신초를삼투조절 제농도를달리하여전배양한후액체질소에동결하였다가, 0.2 mg/l BA 첨가배지 에배양한결과, 기내묘의초저온동결시험결과, 재료의탈수를위하여 sucrose 용액

59 에서 1일동안전배양후냉동보존한기내신초의재생율은 M sucrose 처리시 에만 % 정도의생존율을보였다(Table 10). 생존 shoot는조직의일부가비 대하다가캘러스화하여정상 shoot로재생되기까지는 50 일정도소요되었다. 그러나 생존율이너무낮아실용화하기는어렵고, 앞으로좀더연구가필요하다고본다. 또한휴면기돌나물의동아에대한액체질소초저온동결보존시험결과, 모든개체에서오염이심하여식물체재생결과를볼수없었다(Fig. 7). 2차시험에 서오염방지를위하여동아를줄기에붙여초저온동결후버미큐라이트를멸균하여 재생시험을한결과에서도자체적인부패를초래하여마찬가지로식물체재생결과를 볼수없었다. 이러한원인은중첩된소엽사이에있는병원균의원인으로재료의구 조상살균이제대로이루어지지않거나, 체내공생균의오염때문으로생각되었다. 돌나물의경우다육식물로서과다한탈수에따른생존율저하로동결보존에는부적합하였다. Table 10. Survival rate of in vitro shoot tip cryopreservated by preculture with different sucrose concentration in S. sarmentosum. Preculture y (sucrose, M) No. of treated shoot tip Z Survival rate (% of regenerated plant) ± ± ± y shoot tips were precultured in MS media containing 0.2 mg/l BA for 1 day. Z Cryoprotectant was contained 30% glycerol, 15% ethylene glycol and 15% DMSO

60 Fig. 6. Growth of S. sarmentosum by different ABA and sucrose concentration in one year after in vitro conservation at 4. A1, MS medium containing 3% sucrose and 0.8% agar without 0.2mg/L BA; A2-5, MS medium containing 5% sucrose and 1.2% agar and 0.2mg/L BA in order of 0, 5, 10, and 20 mg/l ABA. B1-4, MS medium containing 5% sucrose and 1.2% agar and 0.2mg/L BA in order of 2, 3, 6, 9% sucrose. Fig. 7. Contamination and necrosis of winter buds cryopreserved in liquid nitrogen. A, winter buds after sterilizing; B, stem with winter buds; C, survival test of winter buds on MS medium with 0.2 mg/l BA; D, survival test of stem with winter buds on sterilized vermiculite

61 이와같이식물에따라서는동결에따른손상으로인하여재분화가어려운 경우가있는데, 돌나물의경우에도재분화가어려운것으로보였다. 앞으로여러가 지문제점을검토하여적정전처리농도및기간과동결보호제선발을위한다각적 검토가필요하다. 영양체의초저온동결보존의핵심은유리화( 세포탈수) 과정을거 쳐, 동결보호제(cryoprotectants) 에넣은후 -40 까지예비냉동후액체질소에보관하 는것이일반적이다. 돌나물은기내 multi-shoot 및동아를이용한초저온보존은섬 유질이적고, 수분함량이많은다즙식물로서탈수처리만으로는동결처리시세포손상 을회피하기어렵기때문에생존율이낮아초저온동결보존에어려움이있었다. 특 히기내 shoot 는오염문제를해결할수있었지만, 조직이연약한단점이있기때문 에생존율이너무낮아실용화하기에는위험부담이클것으로보였다. 또한동아의 초저온동결보존은오염문제가선결되어야할것으로생각되었다. 특히초저온동결보존은기내의장기배양과정에서나타나는후생유전적 변이(epigenetic variation) 와오염발생을감소시키고, 빈번한계대배양에필요한인력 과시간을절약할수있는장점이있다. 특히식물유전자원은자연적또는인위적 선택에의한우량유전자의집적체로농산업및의약산업분야에매우중요하다. 최 근생물공학의발전에따라기초연구및응용분야에서활용도가더욱높아지고있 다. 특히종자가아닌영양번식을하는식물들은환경파괴, 기상재해및여러가지 원인에의하여형질변이와멸종의위험이항상존재한다. 따라서영양번식식물을 비롯한우량 F 1 개체, 종속간교잡및세포융합에의해육성된식물, 과수및임목류 의배양세포, 생장점, 경정등을기내활성보존및초저온동결보존을하면좁은공 간에많은생식질을보관할수있어유전자은행(gene bank) 의관리및유지에경제 적이므로, 금후식물조직배양산물의초저온동결보존은종자보존기술과마찬가지 로유전자원의장기보존에중요한수단이될것이다. 따라서돌나물영양체의초저온동결보존은효율적측면과경제적측면에서 유전자원의안전한보존에실패할위험성이크므로, 조직배양 shoot의기내저온보 존법이효과적일것으로판단되었다

62 다. 수확후저장온도에따른품질변이 돌나물의수확후신선도를장기간유지하여돌나물유통기간을증대시키는것은 생산자와소비자모두에게중요하다. 돌나물의적정저장온도를구명하기위하여, 당일 채취한신선돌나물을 20, 10, 5 에저장후생체중의변화를 2일간격으로조사한 결과(Table 11), 생체중은저장온도에따라 % 의감소를보였으며, 저장온도가 낮을수록생체중감소가적었다. 20 저장에서는수확후 4일경까지생체중감소가컷 으며, 특히 6일경부터급격히감소하여 10일째에는 % 까지감소하였다. 외관 상품질은 20 저장에서 4일경부터하위잎에서부터잎의변색과함께부패하기시 작하여 5 일경에는상품성이크게훼손되었다. 이러한결과는온도가높을경우랩포 장으로인한수분과다로인하여부패가빨리시작될가능성높다는것을보여주었 다. 10 저장에서는생체중은완만하게변화하였으나, 외관상품질은 6일경부터하 위잎에변색이나타나면서, 서서히부패하기시작하였다. 5 저장에서생체중은큰 변화없이서서히감소하여 10일째에는 % 까지감소하였다(Table 12). 5 에서 의외관상품질은 8일이후부터하위잎에서변색과함께짓무르는현상이나타나 기시작하였다. 계통에따른생체중감소는포항지역종이가장컷으며, 완주지역종의변 화가비교적적었다. 따라서생체중의변화에따른돌나물의신선도는랩포장의경우, 20 에 서는 4 일이내, 10 에서는 6 일이내, 5 에서는수확후 8일까지가상품성을유지한 상태로유통이가능할것으로판단되었다. 특히상온유통에서는포장을않는것이 오히려과습에의한하위잎의부패를막을수있는것으로생각되었다. 신선채소의품질를판단하는외관상기준은잎의색이중요한데, 돌나물의수확후 저장온도에따른엽록소함량과잎색의변화를조사한결과 (Table 13, 14), SPAD 값으로조사한엽록소함량은저장온도가높아짐에따라급격히감소하였으며, 저온 일수록변화가적었다. 10 와 20 저장에서는 6일과 4일이후에급격한감소를보였으 나, 5 저장에서는완만한감소를보였다. 그러나 4일경까지는육안으로는변화를알기 가어려웠다. 반면잎색은 20 저장에서는수확후 4 일후부터, 10 저장에서는 6일경 부터하위잎에서황화하기시작하여 2-3 일후에는심하게변색되었다. 5 저장에 서는 8 일경부터하위잎에서변색이나타나기시작하였다. 잎의색도변화를조사한 결과, 잎색의명도를나타내는 Hunter L값과녹색-적색을나타내는 a값은저장온도 가높을수록저장일수에따라증가하였으며, 10일째에는 4계통모두수확당시보다 유의하게증가하였다(Table 14). 황색-청색을나타내는 b값은저장온도가낮을수록 감소폭이적었으며, 10일째에는수확당시보다 4 계통에서모두유의한감소를보였다

63 Table 11. Variation of fresh weight by storage temperature and days after storage Storage temp. ( ) in four local strains of S. sarmentosum. Days after storage Significance Local strain (LS) Storage temperature (ST) Days after storage (DAS) Reduction of fresh weight (%) z Wanju Gunsan Pohang Wando a a a a b 94.6 b 92.8 b 93.2 b c 91.1 c 88.4 c 89.1 b d 88.1 d 85.2 d 85.3 c e 83.5 e 80.9 e 81.8 d f 78.2 f 74.7 f 75.7 e a a a a b 96.4 b 94.2 b 95.7 b c 94.7 b 90.8 c 94.0 b d 92.8 c 89.7 cd 91.1 c d 90.9 d 88.2 cd 89.8 cd e 88.1 e 87.2 d 88.5 d a a a a a 97.5 b 96.6 b 95.7 b b 94.4 c 95.3 c 95.0 c bc 92.6 d 93.5 d 94.0 d cd 91.3 e 91.9 e 92.4 e d 90.4 f 89.8 f 90.8 f *** *** *** LS ST LS DAS ST DAS LS ST DAS *** ** *** NS y Mean separation within columns by Duncan's multiple range test at P *, ***, NS Nonsignificant or significant at P 0.05 or 0.001, respectively

64 Table 12. Variation of SPAD value by storage temperature and days after Storage Temp. ( ) storage in local strains of S. sarmentosum. Days after storage Significance Local strain (LS) Storage temperature (ST) Days after storage (DAS) SPAD value among local strains y Wanju Gunsan Pohang Wando a a a a b b b ab c c c bc d d d cd de e d de e f e e a a a a b ab ab ab bc b b bc c c b c d d c c d d d d a a a a b ab a a bc ab b b c b c b d c d b d d e c *** *** *** LS ST LS DAS ST DAS LS ST DAS * *** *** NS y Mean separation within columns by Duncan's multiple range test at P *, ***, NS Nonsignificant or significant at P 0.05 or 0.001, respectively

65 Table 13. Variation of Hunter L value, a and by storage temperature and days Storage Temp. ( ) after storage in local strains of S. sarmentosum. Days after storage Significance Local strain (LS) Storage temperature (ST) Days after storage (DAS) LS ST LS DAS ST DAS LS ST DAS L value Wanju Gunsan Pohang Wando a a a a b b b b c c bc c d d c d e e d de e e d e a a a a b b b b c bc c c c c d d d d e e d d f e a a a a b b b b c c c c d d d d de e e e e e f e *** *** *** NS NS *** NS Mean separation within columns by Duncan's multiple range test at P *, ***, NS Nonsignificant or significant at P 0.001, respectively

66 Table 14. Variation of Hunter a and b value, a and Storage Temp. ( ) and days after storage in local strains of S. sarmentosum. Days after storage a by storage temperature Wanju Gunsan Pohang Wando Wanju Gunsan Pohang Wando a a a a a a a a b b b b b b b b b c c c c c c c c d d d d d d d d d e e e e e de d e f f f f f e e a a a a a a a a b b a b b b b b c c b c c c c c d d c d d d d cd d e d e d e e de e f e f e f e e a a a a a a a a a b b a a b b b b c c b b c c c c d d c bc c d cd d e e d bc d d de e f f e c d e e Significance Local strain (LS) Storage temperature (ST) Days after storage (DAS) LS ST LS DAS ST DAS LS ST DAS NS *** *** * *** *** NS NS *** *** ** *** *** ** Mean separation within columns by Duncan's multiple range test at P *, ***, NS Nonsignificant or significant at P 0.05, 0.01 or 0.001, respectively

67 신선돌나물을 20, 10, 5 에저장후 10일째에잎의 50% 이상이변색되었거 나하부의잎이부패하여상품가치가없는줄기수를조사한결과, 저장온도가높은 20 에서크게증가하였으며, 저장온도및계통들간에유의한차이( P ) 를보 였다. 계통간에는완주지역종이비교적저장성이높았으며, 완주> 군산> 완도> 포항 순으로변색및부패비율이높았다(Fig. 8, 9). 이는수확시의수분함량이완주지역 종이가장낮은것과밀점한관계가있었는데(Fig. 10), 변색및부패비율은수분함 량과유의한정의상관관계 (P 0.01, r=0.697, 0.638, 0.724/20, 10, 5 ) 를보였다. 돌나물은신선채소로서수분함량이높아수확후품질유지를위한저온저장 이필수적인데, 저장온도는낮을수록생체중감소가적으며, 황화및외관상변화가 적었다. Ko(2004) 는상추의저온저장에서 5 에서 8 일까지저장이가능하며, Hunter L 값도유의하게감소하였다고하여, 돌나물저장성과비슷한특성을보였다. 잎상추 의경우, 0-5 가적정저온저장온도로알려져있는데(Kader, 1992), 0-1 저장이 4-5 저장보다생체중감소가적으며, 황화및외관상변화가적으며(Jeong 등, 1990). 0 에서도동해가나타나지않는다(Bae와 Chung, 2003). 또한 0 를기준으로 10 올라가면잎상추의부패지수는 3 배나증가하는데, 이는호흡율의높아짐으로서 증산량이많아지고유해가스의발생량이증가하기때문이다 (Kader, 1992; Watada 등, 1996). 신선채소의저장시발생하는에틸렌은조직을조기에노화시키거나부패 를촉진시키기때문에발생된에틸렌가스를직접흡착또는제거하여저장성을높 일수도있다(Jeong 등, 2003; Saltveit, 1999; Watada, 1986). 또한신선편이식품에 서도적정유통온도는 0 이지만, 대부분의유통업자들이 5 또는 10 에서유통시 킴으로서호흡율(Q10) 의값을높이게되므로품질저하가빨라지게된다(Paull, 1999; Watada 등, 1996). 한편포장재의종류도저장성에영향을미치는데, 상추를 PE필름 을이용하여 5 저장하는경우에는유공필름보다무공필름에서저장성이높다(Lee 등, 2006). 돌나물에서현재관행적으로이용되는랩포장은증산에의한포장재내부 의결로현상으로소비자들의선호도가낮아지고, 이로인하여품질저하및위생에도 문제가발생할수있기때문에(Wagner, 2001), 수확직후부터소매점으로이동시에는 무공필름이생체중의감소가적어좋을것으로보이며, 소매점의경우유공필름을 이용하는것이결로현상을방지하고에틸렌발생에의한노화와부패를지연시킬수 있어바람직할것으로보이며, 앞으로이에대한상세한연구가필요하다. 이와같 이신선채소의수확후품질유지를위해서는저온저장과저온유통이필수적이지만, 돌나물에서는현실적으로저온유통체계가확립되지않아어려움이있으므로, 소매 점에서라도 5 정도의저온보관및판매체계가이루어져야할것으로생각된다. 본연구결과, 돌나물을관행과같이스치로폼접시에랩포장하는경우, 저장온도에따른생

68 체중및잎의외관상변화를기준으로한돌나물의신선도는 20 에서는 4 일이내, 10 에서는 6 일이내, 5 에서는수확후 8일까지가신선도를유지한상태로유통이가능 할것으로판단되었다. Discoloration Inferior quality or decay (%) (%) a a a b b a a a ab a ab b Storage temperature ( ) Fig. 8. Percentage of discolored or decayed shoot at 10 days after storage in fresh shoot of S. sarmentosum. Fig. 9. Inferiority aspects of fresh shoot under 15 storage after harvesting in S. sarmentosum

69 Water content (%) b ab a a 60 Wanjo Gunsan Pohang Wando Local strains Fig. 10. Water content of fresh shoot in four local strains of S. sarmentosum. 라. 지역수집종들의항산화활성및비타민 C 함량 1) 돌나물우량계통의항산화능 수집한돌나물유전자원중에서생육특성이양호한 13 지역종을동일조건으 로재배하여항산화활성을비교한결과(Table 15), 광양순천완도지역종에서항산 화활성이높았으며, 제주, 부천, 용인, 완주지역종이낮은활성을보였다. 부안, 금 산지역종은생체검정및동결건조간에차이를보였는데, 녹즙제조와관련한재료 가아닐경우는동결건조에의한방법이정확한것으로생각되었다. 세포의호흡과정에서생성되는활성산소(free radical) 는항상체내에존재하 며, 과도한스트레스나운동, 자외선, 흡연이나배기가스와같은환경오염물질등에 의하여발생하는데, 강한살균작용을가지고있어인체를병원체로부터보호하는역 할을한다. 그러나지나치게발생된활성산소는단백질, DNA, T 세포등의기능을 손상시키고세포의사멸을유도할수도있어, 각종암을비롯한질병의원인이되기 도하는데, 활성산소는대개몸속의 bilirubin, glutathione, superoxide dismutase(sod), catalase(cat), peroxidase(gsh-px) 등의항산화물질및효소에 의해분해된다(Ames 등, 1993; Dean 등, 1993). 식품에는비타민 A, C, E, 건강기능 성식품 flavonoids, anthocyanins, carotenoids, tanic acid 등의항산화물질이풍부하 게들어있어활성산소가생기는것을막고노화를억제시키거나, 각종암및질병 을예방하는데도움이된다(Cameron 등, 1979; Sen, 1955)

70 Table 15. Antioxidant activity of fresh and freeze-drying extracts in shoot of S. sarmentosum. Fresh extract Freeze-drying extract Local strain Antioxidant Antioxidant Local strain activity (%) activity (%) Gwangyang Gwangyang Suncheon Wando Geumsan Suncheon Wando Mokpo Pocheon Buan Mokpo Gunsan Pohang Pohang Gunsan Poch대n Wanju Bucheon Bucheon Wanju Yongin Yongin Buan Jeju Jeju Geumsan 최근건강기능성식품에대한관심이부각되면서항산화활성이높은식용 및약용식물에대한많은연구가이루어지고있다. 전통적으로천연물을이용한대 체의학이발달한한국, 중국, 인도, 일본등에서많은약용식물추출물들이항암, 항 균, 항산화활성이뛰어나다는것이밝혀졌다(Kim 등, 2004; 2006; Rastogi와 Dhawan, 1990; Ruan 등, 2006; Takeya, 2000). 이들중돌나물과의 Sedum속에속하 는자주꿩의비름(Bonina 등, 2000) 이나기린초(Kim 등, 2004) 등은항산화및항염증 작용이높은것으로알려져있다. 우리나라에자생하고있는 Sedum속에는애기기린 초 (S. middendorffianum ), 태백기린초 (S. latiovalifolium ), 꿩의비름 (S. drythrostichum MIQ.), 땅채송화(S. oryzifolium ), 둥근잎꿩의비름 (S. routundifolium), 등이있는데 (Kwon 과 Jeong, 1999), 주로관상용으로이용되고있으며돌나물만이식용으로이 용된다. 돌나물(Sedum sarmentosum BUNGE.) 은돌나물과에속하는다육질의다년 생초본식물로약리효과가뛰어나한방에서는청열소종의효능이있어예로부터인 후염과만성간염의치료에이용되어왔으며, 해독작용도뛰어나독충이나해충에물 렸을때전초를으깨어환부에붙이기도한다. 최근의연구에의하면 HIV 및간염 바이러스에도억제효과가있으며(He 등, 1998; Woo 등, 1997), 항암작용(Kang 등, 2000; Park 등, 2002), 항고혈압작용(Oh 등, 2004) 및에스트로겐유사작용(Kim 등,

71 2002b) 등과같은약리효과를갖는다. 한편돌나물은비타민 C와칼슘함량이높은 신선채소로서가치가높아어린싹을초고추장무침, 김치, 샐러드등의식용으로이 용되고있다. 건강기능성식품소재로서항산화활성이높고(Kim 등, 2006), 음료개 발에도좋은특성을가지고있어(Kim 등, 2002a), 앞으로돌나물은건강식품은물 론생식, 녹즙등신선채소로의이용도크게증가할것으로보인다, 2) 돌나물우량계통의비타민 C 함량 한편, 13지역종에대한비타민 C 함량을분석한결과(Fig. 11), 식용부위인 shoot의비타민 C 함량은완주, 군산, 부안, 금산, 부천, 포천지역종에서비교적높 았으나, 대체로비슷한수준을나타내었다. 생육특성과는달리비타민 C 함량의지 역종간차이는크지않았다. 따라서이들항산화능과비타민 C 함량이비교적높고생육특성이양호한 우량계통들은삽목번식을통하여제품개발을위한증식을하였고, 기내에서는 multi-shoot 를유도하여유전자원으로보존하였다 Vitamin C (mg/kg) Local v ariety Fig. 11. Vitamin C contents in local strains of Korean native Sedum. sarmentosum. Materials were collected at April 30th in field. 1, Wanju; 2, Gunsan; 3, Gwangyang; 4, Buan; 5, Suncheon; 6, Jeju; 7, Mokpo; 8, Pohang; 9, Wando; 10, Keumsan; 11, Bucheon; 12, Yongin; 13, Pocheon

72 4. 결 론 가. 돌나물유전자원의유연관계 돌나물 (Sedum sarmentosum Bunge.) 의 31 지역종에대한개화전생육특성 과개화기화기특성을토대로군집분석을실시한결과, 크게 2군으로나눌수있었 으며, Ⅰ군에는 29 지역종이속하였고, Ⅱ군에는꽃이피지않는완주및군산지역 종등이속하였다. Ⅰ군은다시두개의소그룹으로나눌수있었는데, Ⅰ-1군은개화 특성이양호한금산, 부천, 포천, 용인등 4 개지역종이속하였고, 특성이비슷한 25 지역종들은 Ⅰ-2 군에속하였다. RAPD 를이용한유연관계를분석한결과, 선발된 14 종의 10-mers primer로부터 47개의 polymorphic band를얻어 primer당평균 band수 는 3.4 개였으며, 20-mers primer로부터는 90개의 polymorphic band를얻어 primer당 평균 15개의 band 를얻었다. 31개수집종들은크게 2 군으로분류할수있었으며, Ⅰ 군에는완주및군산지역종을포함한 27 개지역종이속하였고, Ⅱ군에는줄기와잎 이가늘고꽃이잘피는금산, 부천, 포천, 용인등 4 지역종이속하였다. 나. 돌나물유전자원기내활성보존및초저온동결보존 돌나물유전자원의기내보존을위한기내배양묘를육성은 0.2 mg/l BA 를첨가한 MS 배지에서배양후 일경에초장의신장이적당하고, 마디가짧 으며줄기가굵은다아체를얻을수있었고, 기내활성보존및초저온동결보존재료 로적합하였다. 돌나물의기내저온활성보존은 0.2mg/L BA와 50mg/L sucrose, 1.2% agar를기본으로한배지에 10-20mg/L ABA 또는 6-9% sucrose를첨가하는 것이유전자원의생육및활성이양호하였다. 돌나물기내신초의초저온동결보존실험결과, M sucrose 용액에서 1일동안전배양후냉동보존한기내신초의재생율은 % 의생존율을보였 다. 생존 shoot는조직의일부가비대하다가캘러스화하여정상 shoot로재생되기까 지는 50 일정도소요되었다. 따라서돌나물영양체의초저온동결보존보다기내저온 보존법이효과적일것으로판단되었다

73 다. 수확후저장온도에따른품질변이 돌나물의수확후생체중은저장온도에따라 % 의감소를보였으며, 저 장온도가높을수록생체중감소율도높았다. 생체중감소는포항지역종이가장컷으며, 완 주지역종의변화가비교적적었다. 외관상품질은 20 에서 4 일경, 10 에서 6 일경, 5 에서 8일경부터하위잎에변색이나타나기시작하면서서서히부패하기시작하였 다. 계통간에는완주지역종의저장성이양호하였으며, 군산, 완도, 포항순으로부패 율이높았다. 따라서돌나물을스치로폼접시에랩포장할경우, 지상품성을유지한상태로저장이가능하였다. 5 에서는수확후 8일까 라. 지역수집종들의항산화활성및비타민 C 함량 생육특성이양호한 13 지역종을동일조건으로재배하여항산화활성을비교 한결과광양, 순천, 완도지역종에서항산화활성이높았으며, 제주, 부천, 용인, 완 주지역종이낮은활성을보였다. 돌나물 shoot의비타민 C 함량은완주, 군산, 부안, 금산, 부천, 포천지역종에서비교적높았으나, 대체로비슷한수준을나타내었다

74 제 2 절돌나물의건강기능성규명및고부가가치 제품의개발 1. 서 언 최근건강기능성식품에대한관심이부각되면서항암, 항균, 항산화활성이 높은식용및약용식물에대한많은연구가이루어지고있다. 전통적으로천연물을 이용한대체의학이발달한한국, 중국, 인도, 일본등에서많은약용식물추출물들이 항암, 항균, 항산화활성이뛰어나다는것이밝혀졌다(Kim 등, 2004; 2006; Rastogi와 Dhawan, 1990; Ruan 등, 2006; Takeya, 2000). 이들중돌나물과의 Sedum속에속하 는자주꿩의비름(Bonina 등, 2000) 이나기린초(Kim 등, 2004) 등은항산화및항염증 작용이높은것으로알려져있다. 우리나라에자생하고있는 Sedum속에는애기기린 초 (S. middendorffianum ), 태백기린초 (S. latiovalifolium ), 꿩의비름 (S. drythrostichum MIQ.), 땅채송화(S. oryzifolium ), 둥근잎꿩의비름 (S. routundifolium), 등이있는데 (Kwon 과 Jeong, 1999), 주로관상용으로이용되고있으며돌나물만이식용으로이 용된다. 돌나물(Sedum sarmentosum BUNGE.) 은돌나물과에속하는다육질의다년 생초본식물로약리효과가뛰어나한방에서는청열소종의효능이있어예로부터인 후염과만성간염의치료에이용되어왔으며, 해독작용도뛰어나독충이나해충에물 렸을때전초를으깨어환부에붙이기도한다. 최근의연구에의하면 HIV 및간염 바이러스에도억제효과가있으며(He 등, 1998; Woo 등, 1997), 항암작용(Kang 등, 2000; Park 등, 2002), 항고혈압작용(Oh 등, 2004) 및에스트로겐유사작용(Kim 등, 2002b) 등과같은약리효과를갖는다. 또한건강기능성식품소재로서항산화활성 이높고(Kim 등, 2006), 음료개발에도좋은특성을가지고있다(Kim 등, 2002a). 또한돌나물은비타민 C 의함량이높고, 칼슘, 철분, 아연등의무기물함량도높 을뿐만아니라, 민간에서는생즙을간염, 대하증, 화상등에이용하고있으며, 최근약리작 용이과학적으로구명되고있어건강식품으로의개발이가능하다. 최근돌나물은골다공증 에유효하고, 간기능개선능이있는것으로보고되고있으나, 저장성이낮고이를이 용한가공식품이없어부가가치가매우낮은식품이다. 그러나유효지표성분이분 리 동정이되지않고있으며, 미흡한실정이다. 체내에서의기능성발현기전또는대사관련연구가 따라서본연구는생식으로한정되어있는돌나물의이용성과부가가치를높이 기위하여, 체내에서의기능성발현기전과대사관련연구를통한건강기능성식품 을개발하고자실시하였다

75 2. 연구방법 가. 돌나물의용매추출물제조 동결건조한돌나물을분쇄한후 methanol을 5배분량으로첨가하여진탕추 출하고그여액을 1 차추출액으로하였다. 1차추출이끝난돌나물에다시 n-hexane 을첨가하여진탕추출하고그여액을 1차추출액과합한후감압하여용매를제거 하고 hexane 추출물을얻었다. Hexane 분획물잔사에 ethyl acetate를첨가한후같 은방법으로추출하여 ethyl acetate 추출물을얻었다. Ethyl acetate 분획물잔사에 butanol를첨가하여 butanol 추출물을얻었다. 동결분쇄된돌나물에증류수와 ethanol을각각첨가하여 2시간씩 3 회가열추출하고, 여과하여여액을각각동결건 조와감압농축하여물추출물과알콜추출물로사용하였다. 나. 효소원의조제 간조직 1g당 4배량의 0.25M sucrose buffer (ph 7.5) 를가하여빙냉하에서 ultra turax homogenizer (10,000 g, 2 분) 로마쇄하였다. 이마쇄액을 4, 600 g에 서 10분간원심분리하여핵및미마쇄부분을제거한후상등액을 15,000 g에서 20 분간원심분리하여 xanthine oxidase, superoxide dismutase, catalase, glutathine peroxidase 활성측정의효소원으로사용하였다. 한편채취한혈액은혈청을분리하여 alanine aminotransferase, asparate aminotransferase 측정의효소원으로사용하였다. 및 alkaline phosphatase 활성 다. 단백질정량및실험결과의통계처리 단백질의정량은 Lowry 등의방법에준하여 bovine serum albumin을표준 품으로측정하며, 본실험에서얻어진결과는평균± 표준오차로표시하며통계적유 의성검증은 students't-test, ANOVA test 등을이용하여상호검정하였다. 라. 혈청중 transaminase (SGOT 및 SGPT) 측정 SGOT치및 SGPT치의측정은 Rwitman-Frankl 법에따라 GOT용기질액 1.0 ml를가하고실온에서정확히 20분방치후 0.4 N-NaOH 10 ml를가한다음 10분 방치후 λmax 505 nm 에서증류수를대조로흡광도를측정하였다. SGPT는 SGT기질 액 1.0 ml를가한다음 SGOT 측정방법과동일하게조작하였다. 마. 혈청중 total cholesterol 측정 Cholesterol치의측정은 Abell-kendall 법에따라혈청 0.02 ml취하여효소시 액 3 ml 가한후, 37 항온조에서 5분간가온후 10분방치하여 λmax 500 nm에서 흡광도를측정하였다(AT: 검액의흡광도, AS: 표준액의흡광도)

76 바. 간장의병리학적변화 흰쥐를각실험군모두최종시료투여후조직병변을관찰하기위하여 24 시간이경과한다음, ether로마취시키고도살즉시간장의일부를채취하고 10% 의 중성 formalin에고정한후 hematoxylin-eosin 으로염색하고광학현미경( 200) 으로 간세포조직을관찰하면서지방변성, 괴사, 섬유화현상및간조직의재생등을각실 험군별로비교검토하였다. 사. 돌나물으로부터분리된물질이항산화작용에미치는영향 (in vitro 시험법 ) DPPH( α, α'-diphenyl-β-picrylgydrazyl) 법 : DPPH 16mg을 100ml 에탄올에 녹인후여기에 100ml 에탄올에녹인후여기에 100ml 증류수를혼합하여 Whatman 여과지 No.2를이용하여여과하고이여액 5ml에일정농도의시료용액 1ml을혼합한후 528nm 에서흡광도를측정하였다. 측정값은대조군과비교하여라 디칼소거율(%) 로표시하였다. 환원력측정: 농도별로조제한시료 20μL를 50mM 인산완충액(pH 6.6) 과 1% 의 patassium ferricyanide [ K 3 Fe(CN) 6 ] 와 1.4 : 1로혼합된용액 1.2mL에 첨가할다음, 50 에서 20 분간반응시킨후, 0.5mL의 10% trichloroacetic acid를 첨가하고 3,000rpm 10분간의원심분리를통하여얻어진상징액에 0.1% 의 FeCl 3 100μL 를넣어서발색반응을유도시킨다음, UV/VIS spectrophotometer를사용하여 700nm 의흡광도에서측정하였다. 아. 돌나물으로부터분리된물질이항산화작용에미치는영향 (in vivo 시험법 ) 실험동물및실험식이: SD계 rat (3 주령, female) 을대한동물사육센터로부 터분양받아고형사료 ( 삼양사) 로 1주일간적응시킨후난괴법을이용하여각군당 6마리씩 4 군( 국내산, 중국산, 뉴질랜드산녹용추출물각각처리군, 무첨가군) 으로 나누어 6 주간실험식이를공급하였다. 사육실환경은 24±2, 65% 의습도, 12시간 명암주기가되도록조절한다. 실험기간동안식이와물은자유급식으로하였다. 실험동물의체중및식이효율측정: 체중매주 1 회씩측정하고, 식이섭취량 은매주 2 회씩일정한시각에측정하였다. 식이효율은식이섭취량에대한체중증가 량을비율로환산하여나타내었다. 효소원조제: 간조직 1g당 4배량의 0.25M sucrose buffer를가하여빙냉하 에서 ultra turax homogenizer(10,000 g, 2 분) 로마쇄한다. 이마쇄액의일부는 TBARS량측정에사용하고나머지는 4, 600 g에서 10분간원심분리하여핵

77 및미마쇄부분을제거한후상징액을 15,000 g에서 20분간원심분리하여 mitochondria 분획을얻었다. Mitochondria분획을제거한상징액을 105,000 g에서 1시간동안초원심분리하여 cytosol 분획을분리하였다. Mitochondria분획은 catalase 활성측정에, cytosol분획은 SOD, XO 및 GSH-Px 활성측정에사용하였다. 한편 ALT, ALP 및 LDH활성은경동맥을절개하여혈액을채취하고실온에 20분간방치 한다음 3,000rpm에서 10 분간원심분리하여혈청을분리한후혈액자동분석장치( Johnson & Johnson, 사) 로측정하였다. 효소활성측정: 간조직중 XO 활성은 Downey 등의방법, SOD 활성은 Crapo 등의방법, catalase 활성은 Aebi 의방법, GSH-Px 활성은 Flohe 등의방법으 로측정하였다. 자. 3T3-L1 지방세포의분화능측정 분화된 3T3-L1 세포는 PBS로 2회세척한후 10% formalin 으로 30분간 고정화시켰다. 고정화용액을 PBS로 3회세척한후 Oil Red O 염색약으로 10분간염 색하였다. 염색된 Oil Red O를 isopropanol로용출시켜 ELISA reader 510nm에서흡 광도를측정하여세포의분화능을측정하였다. 차. 백서의지질대사에미치는영향 간의총지질은 Folch 법을이용하여측정하고, 추출한총지질을일정량의 cholroform 용매에녹여총콜레스테롤은 Seligson 법으로, 중성지방은 kit을이용한 효소비색법으로측정하였다. 혈청의총지질은 Frings법에의해 540nm에서비색정 량하고, 총콜레스테롤과 HDL 콜레스테롤, 중성지방의함량은 kit 을이용하였다. 혈 청의 LDL 콜레스테롤은총콜레스테롤에서 HDL 콜레스테롤과중성지방/5 을뺀값 으로하였다. 카. Cholesteryl Ester Transfer Protein (CETP) 활성도 실험동물의간조직을균질화시켜차가운 PBS로 2회세척한후 10mM Tris-HCl (ph7.4) 를첨가하고 sonication 하였다. 조직세포분해물은 4, 100,000 g 에서 40 분동안원심분리하였다. 상등액에있는단백질들은 8% SDS-PAGE 로전 기영동하여분리한후 nitrocellulose membrane에전이시키고 horseradish peroxidase가결합된 IgG 와 CETP에대한항체를첨가하여 hybridization 시켰다. Nitrocellulose 막은 enhanced chemiluminesence solution을처리하여 incubation 시 킨후 X-ray film 에노출시켰다

78 타. Lipoxygenase 활성도측정 각각의돌나물분획물(30 mg/ml) 들을 lipoxygenase 효소반응액 15 ml (ph9.0, 0.1N borate buffer) 에넣어 pre-incubation(10~30 분) 시키거나또는 pre-incubation 시키지않고즉시일정량(100 μl) 을취해효소반응을시켜잔존효소 활성도를측정하였다. 효소활성도 1unit는 linoleic acid를기질로하여 25, ph 9.0의 반응조건하에서, 1 분당흡광도(234 nm) 를 증가시키는효소양으로하였다. 파. 세포접합인자 (ICAM-1과 LFA-1) 활성측정 HL-60는 10%FBS를포함하는 RPMI-1640 배지에서배양하였다. 96 well flatted-bottom plate에 HL-60 세포를 cell/ml (200 μl/well) 가되도록분주하고 녹용분획물들을 30분간전처리한후 PMA를최종 25 nm의농도로첨가한뒤 48 시간배양한다. 배양후현미경으로세포의형태를관찰하였다. 3. 결과및고찰 가. 간기능개선및간암억제물질의분리ㆍ동정과효과탐색및제품개발 1) 돌나물로부터간암억제물질의분리및동정 돌나물을 methanol 에 24시간동안 soaking 한후용매의극성도에따라 hexane, ethyl acetate, butanol 로순차추출하여농축하였다. 추출후농축시획득하는양은점차감 소하였으며, 추출물의수율은용매의종류를달리할때마다감소하여 methanol 0.4%, hexane 0.06%, ethyl aceate 0.003, butanol 0.002% 이었다. Fig. 1. Extracted fractions of S. sarmentosum based on its polarity

79 Fig. 2. Effects of subfractions from S. sarmentosum extracts on the growth of human hepatomacarcinoma cell line, HepG2. A; methanol extract, B; hexane extract, C; ethyl acetate extract, D; butanol extract

80 용매의극성도에따라돌나물을추출하고박층크로마토그래피를실시하여 각용매추출물의 subfraction 을획득하였다. 이들 subfraction을분리한후인간간 암세포주의성장에미치는영향을 MTT assay 를통하여측정하였다 (Fig. 2). Fig. 2에서와같이 butanol 추출물의 3 번분획 (Fig. 3) 과 ethyl acetate의 4 번분획 (Fig. 4) 이간암세포의성장을억제하는데효과적인것으로사료되었다 (Fig. 5). Fig. 5에 서와같이 ethyl acetate 추출물 subfraction의간암세포성장억제효과가 butanol 추출물보다우수한것으로나타났으므로상기 subfraction 을분리동정하였다. Fig. 3. Thin layer chromatogram of the butanol extracts of S. sarmentosum

81 Fig. 4. Thin layer chromatogram of ethyl acetate extracts of S. sarmentosum

82 Fig. 5. Effects of butanol and ethyl acetate extracts of S. sarmentosum on HepG2 morphology. A: contol, B; number 3 subfraction of butanol extract, C; number 4 subfraction of ethyl acetate extract. HepG2 cells were grown for 48 hrs and magnification

83 Ethyl acetate 추출물의 4번 subfraction만을포집하여 HPLC로분석한결과 는 Fig. 6 과같다. Fig. 6에서와같이 ethyl acetate 4번 subfraction은 7개의서로다 른물질로분리되었다. 이들중가장양이많은 6번 fraction만을순수분리한후이 를동정하였다. Fig. 7에서와같이 6번 fraction은 TLC plate 상에서자외선 254 nm 파장하에서황색으로관측되며, FeCl 3 를분무했을때양성반응으로나타내며 10% H 2SO 4 를분무하고가열시황색으로발색되었다. FT-IR spectrum에서 3407 cm -1 (OH), 1660, 1562 (aromatic carbon, triple band) 등의흡수대를나타내어방향족화 합물인것으로사료되었다 (Fig. 8). 6번화합물을순수분리하여 GC-MS로분석한 결과는 Fig. 9 와같다. Fig. 9에서와같이본화합물은분자량 304인것으로확인되 었다. 1 H-NMR spectrum의 δ 7.69 ( 1 H, d), 7.57 ( 1 H, dd), 6.91 ( 1 H, d) 으로 H-2' 및 H-6' 의 meta coupling과 H-6' 및 H-5' 의 ortho coupling을하고있는 ABX type의 B-ring 구조인것으로사료되었다. 따라서본화합물의구조는 tetrahydroxyflavonol (quercetin) 인것으로사료되었다 (Fig. 10). 또한 13 C-NMR spectrum을 library의 quercetin data 비교하여각각의 signal이일치하였으므로본화합물은 quercetin인 것으로최종동정하였다 (Figs. 11~12). Fig. 6. HPLC analysis of S. sarmentosum ethyl acetate extract subfraction #4. Detector UV-Vis: 270 nm. Column 250 mm x 4.6 mm i.d. (C18). Mobile phase: methanol: phosphoric acid 1% (w/v) = 53 :

84 Fig. 7. Thin layer chromatogram of S. sarmentosum ethyl acetate extract subfraction #4 under UV 254 nm. Left; subfraction #4, Right; #6 peak in HPLC chromatogram of subfraction #4 (Fig. 6). Fig. 8. FT-IR spectrum of compound #6 from S. sarmentosum ethyl acetate extract subfraction #

85 Fig. 9. GC-MS chromatogram of compound #6 from S. sarmentosum ethyl acetate extract subfraction #4. Fig H-NMR spectrum of compound #6 from S. sarmentosum ethyl acetate extract subfraction # MHz, DMSO

86 Fig C-NMR spectrum of compound #6 from S. sarmentosum ethyl acetate extract subfraction #4. 75 MHz, DMSO. Fig. 12. Structure of compound #6 (quercetin) from S. sarmentosum ethyl acetate extract subfraction #

87 2) 돌나물및돌나물추출물이백서의간기능에미치는영향가) 돌나물추출물이사염화탄소로유도된간손상에미치는영향사염화탄소를백서에경구투여급성간독성을유발하면서이에미치는돌나물추출물의효과를측정하였다 (Table 1). 급성간독성을유발하였고실험기간이단기간이었으므로대조구및돌나물추출물처리구간의유의적인체중변화는관측되지않았다. Table 1. Effects of S. sarmentosum extracts on body and liver weight in CCl 4-treated rats. Experimental Body weight Liver weight Ratio groups (g) (g/100g B.W.) (L.W. / B.W.) Control ± ± a ± 0.34 CCl ± ± c ± 0.65 CCl 4 + Silymarin ± ± b ± 0.07 CCl 4 + MeOH ± ± a ± 0.17 CCl 4 + Hex ± ± b ± 0.58 CCl 4 + EtOAc ± ± ab ± 0.46 CCl 4 + BuOH ± ± ab ± 0.26 Values are mean ± S.D. B.W.; body weight, L.W.; liver weight, MeOH; methanol extract of S. sarmentosum, Hex; hexane extract of S. sarmentosum, EtOAc; ethyl acetate extract of S. sarmentosum, BuOH; butanol extract of S. sarmentosum. *; Mean with different letters are significantly different at p < 0.05 by Duncan's multiple range test. 그러나 Table 1에서와같이체중당간중량의비율은대조구에비하여사염 화탄소처리구가유의적으로높았으며, 돌나물추출물중 methanol 추출물처리구는 사염화탄소투여에의한간중량의증가가나타나지않았다. 사염화탄소의투여로인 해직접적인영향을받는간의중량은정상대조군에비하여사염화탄소처리구에서 약 20% 의증가를나타내었다. 반면에돌나물추출물처리구는양성대조구인

88 silymarin 투여구보다체중당간중량의증가폭이유의적으로낮은것으로관측되 었다. 사염화탄소를투여하면간세포막의손상으로세포막투과성이증가하여부종 이일어나고지방변성이생성되어간에다량의지질이축적됨으로써간장비대가나 타나는것으로보고되어있다. mitochondria 따라서돌나물추출물은사염화탄소에의한 reticuloendothelium 및 microsome 등의변화와같은간손상을억제하여간에과량의지 방이축적되는것을억제시키는효과가있는것으로사료되었다. 즉, 돌나물추출물 의투여는사염화탄소로인해유발되는간손상을보호하는효과가있는것으로나타 났으며, 특히 methanol 추출물의간손상보호효과는양성대조구로사용되는 silymarin 보다우수한것으로사료되었다. 돌나물의간손상보호효과는 GOT (Glutamate oxaloacetate transaminase, AST; Aspartate aminotransferase), GPT (Glutamate pyruvate transaminase, ALT; Alanine aminotransferase) 활성을측정한것으로보다확실히나타나고있다 (Table 2). 사염화탄소는간소포체에서 cytochrome P 450 에의해생성되는 free radical metabolite ( CCl3) 가단백질, 지질, 고분자물질과공유결합을형성하여세포를괴 사시키며지방간, 과산화지질등을생성하여간독성을유발하는물질이다. 간손상으 로인한간세포의괴사와간조직의파괴가진행됨에따라 유리되어높은활성을나타내는것이므로 세포의변성및괴사의지표가된다. GOT, GPT transaminase가혈중으로 등의효소활성의상승은간 사염화탄소를처리하지않은군에비하여사염화탄소처리군의간세포 GOT, GPT 수치가각각 와 (Karmen/mL serum) 로증가되었다. GOT 활성은 silymarine 투여군이 (Karmen/mL serum), methanol 추출물투여군이 (Karmen/mL serum), hexane 추출물투여군이 (Karmen/mL serum), ethyl acetate 추출물과 buthanol 추출물투여군이각각 (Karmen/mL serum), (Karmen/mL serum) 로 methanol 추출물을제외한모든돌나물추출물이 silymarine 투여군에비하여보호효과가높음을확인할수있었다. GPT 활성은 silymarine 투여군에서 (Karmen/mL serum) 이었고 methanol, hexane, ethyl acetate, buthanol 추출물에서는각각 (Karmen/mL serum), (Karmen/mL serum), (Karmen/mL serum), (Karmen/mL serum) 로 GOT 활성변화와유사하였다. 이는돌나물추출물이 silymarine 보다우수한간보호효과를나타낸것으 로, 특히 ethyl acetate 추출물에서간손상을보호하는효과가우수하였다

89 Table 2. Effects of S. sarmentosum extracts on GOT and GPT activities in CCl 4-treated rats. Experimental groups GOT (Karmen/ ml) GPT (Karmen/ ml) Control ± a* ± 1.92 a CCl ± c ± 7.07 c CCl 4 + Silymarin ± b ± b CCl 4 + MeOH ± b ± b CCl 4 + Hex ± b ± b CCl 4 + EtOAc ± b ± ab CCl 4 + BuOH ± b ± ab Values are mean ± S.D. *; Mean with different letters are significantly different at p < 0.05 by Duncan's multiple range test. MeOH; methanol extract of S. sarmentosum, Hex; hexane extract of S. sarmentosum, EtOAc; ethyl acetate extract of S. sarmentosum, BuOH; butanol extract of S. sarmentosum. 사염화탄소로유발한간독성에미치는돌나물추출물의효과를측정하기위 한실험종료후, 희생시킨백서의간조직을병리학적으로관측한결과는 Fig. 13과 같다. Fig. 13 에서와같이대조구의간세포와세포핵의형태는일정하게세밀하고, 퇴화나변성이관찰되지않았으나사염화탄소를단독투여한백서의간조직에있어서 는간세포의형태, 색깔이모두불분명하고핵의위치나모양도일정하지않았으며 지방변성및괴사가현저하게관찰되어손상의정도가심함을알수있었다. 사염 화탄소와양성대조물질인 silymarine을투여한군의간조직에서도세포괴사가관찰 되었지만사염화탄소단독투여군보다손상된조직의회복이관찰되었다. 이는양성 대조물질인 silymarine 의투여로인한효과로사료되었다

90 Fig. 13. The light microscopic investigation of hepatocyte in CCl 4 induced hepatotoxic rats with the extracts of S. sarmentosum. A; control, B; CCl 4, C; CCl 4 + silymarine, D; CCl 4 + methanol extract, E: CCl 4 + hexane extract, F; CCl 4 + ethyl acetate extract, G; CCl 4 + buthanol extract

91 즉, 조직괴사가일어난부분에세포재생의신호인핵의밀집을관찰할수 있었으며다른괴사부분에서도핵이나타나세포재생이시작되었음을확인하였다. 돌나물 methanol 추출물을투여한백서의간조직에서는세포의괴사가관찰되지않 아그만큼세포재생속도가빠른것으로판단하였고, hexane, ethyl acetate, butanol 추출물을투여한군에서도괴사가일어난세포주위로많은수의핵이무리지어관 찰되었다 (Fig. 13). 따라서전술한바와같이돌나물추출물은사염화탄소로인한 간손상을재생시키는데효과적인것으로사료되었고, 손상된조직을회복시키는속 도는양성대조물질인 silymarine 보다우수한것으로사료되었다. 나) 돌나물추출물이 ethionine으로유도된지방간에미치는영향 Ethionine은간장내 ATP 농도를고갈시켜간독성을유발시키고, 특히간 세포내에다량의지방을축적시켜미세수포지방증 (microvesicular steatosis) 을유 발시키는물질이다. 지방간이유도된간의중량은정상의간중량보다증가하는것 으로보고되어있다. Table 3에서와같이간중량은대조군에비하여 ethionine 단독 투여군에서는 10.7% 증가하였으며, ethionine과돌나물추출물을같이처리한모든 군은대조군보다 6.5~7.7% 만증가되어돌나물추출물이 ethionine에의한지방간 형성을억제하는것으로사료되었다. Table 3. Protective effects of S. sarmentosum extracts on ethionine-induced fatty liver disease. Experimental groups Liver weight (g/100g B.W.) Control 3.37 ± 0.22 Ethionine 3.73 ± 0.19 Ethionine + MeOH 3.61 ± 0.23 Ethionine + Hex 3.59 ± 0.11 Ethionine + EtOAc 3.60 ± 0.29 Ethionine + BuOH 3.63 ± 0.16 Values are mean ± S.D. MeOH; methanol extract of S. sarmentosum, Hex; hexane extract of S. sarmentosum, EtOAc; ethyl acetate extract of S. sarmentosum, BuOH; butanol extract of S. sarmentosum

92 Ethionine 과돌나물추출물을백서에투여하고지방간을유도한후, 혈청콜 레스테롤수치를측정한결과는 Fig. 14 와같다. Fig. 14에서보는바와같이총콜 레스테롤수치는 ethionine 투여구는대조구보다약 47.5% 증가하여이에의한지방 간형성이정상적으로유도된것으로사료되었다. 반면에 ethionine과돌나물추출물 을동시에투여한실험구의총콜레스테롤수치는대조군보다 2.9~20.0% 만증가하 였다. 따라서돌나물추출물은 ethionine에의한지방간유도를유의적으로억제하였 고특히 hexane 및 ethyl acetate 추출물의지방간억제효과가매우우수한것으로 사료되었다. Fig 14. Total cholesterol concentration of ethionine-induced fatty liver disease from S. sarmentosum extracts administered rats. Con; control, ETO; ethionine, MeOH; methanol extract of S. sarmentosum, Hex; hexane extract of S. sarmentosum, EtOAc; ethyl acetate extract of S. sarmentosum, BuOH; butanol extract of S. sarmentosum. Values are mean ± S.D. Mean with different letters are significantly different at p < 0.05 by Duncan's multiple range test

93 3) 돌나물추출물이 ethanol로유도된지방간에미치는영향 10일동안 ethanol 과돌나물추출물을경구투여한후, 체중과간무게를측 정한결과는 Table 4 와같다. 체중은대조구보다 ethanol 단독투여구에서 ± g으로 9.2% 감소하였고, 돌나물추출물투여구도체중감소가관측되었다. Ethanol의과량섭취로인하여체중이감소하는이유는 ethanol에의해산소의소비 및대사율이증가되어 microsome에서 ATP 생성이저하되기때문인것으로보고되 고있다. 따라서 Table 4에서와같이돌나물추출물의투여는 ethanol 섭취로인해 유발되는체중감소현상을보호하는효과가있는것으로사료되었다. Table 4. Effects of S. sarmentosum extracts on body and liver weights in ethanol treated rats. Experimental groups Body weight (g) Liver weight (g/100g B.W.) Control ± 6.49 a 3.27 ± 0.22 a EtOH ± b 3.53 ± 0.19 c EtOH+MeOH ± bc 3.37 ± 0.19 ab EtOH+Hex ± bc 3.35 ± 0.71 ab EtOH+EtOAc ± c 3.30 ± 0.20 a EtOH+BuOH ± c 3.34 ± 0.36 ab EtOH; ethanol, MeOH; methanol extract of S. sarmentosum, Hex; hexane extract of S. sarmentosum, EtOAc; ethyl acetate extract of S. sarmentosum, BuOH; butanol extract of S. sarmentosum. Values are mean ± S.D. Mean with different letters are significantly different at p < 0.05 by Duncan's multiple range test. 간중량은지방의축적으로인해대조군에비하여 ethanol 단독투여구가 약 8% 정도증가하였고, 돌나물추출물투여구는 0.9~3.1% 로 ethnol 투여구보다유 의적으로낮았다. 특히 ethyl acetate 추출물투여구의간중량은대조구와유의적인 차이를나타내지않았다. 또한혈청총콜레스테롤및 TG 농도는돌나물추출물투 여구가 ethanol 투여구보다유의적으로낮았다 (Figs. 15, 16). 따라서돌나물추출물 은 ethanol 에의한지방간유도를억제하는데효과적인것으로사료되었다. GOT

94 Table 5. Effects of S. sarmentosum extracts on GOT and GPT activities in ethanol treated rats. Experimental groups GOT (Karmen/ ml) GPT (Karmen/ ml) Control 5.21 ± ± 1.90 EtOH ± ± 2.53 EtOH +MeOH ± ± 2.66 EtOH +Hex ± ± 3.36 EtOH +EtOAc ± ± 3.95 EtOH +BuOH ± ± 4.72 Values are mean ± S.D. Mean with different letters are significantly different at p < 0.05 by Duncan's multiple range test. EtOH; ethanol, MeOH; methanol extract of S. sarmentosum, Hex; hexane extract of S. sarmentosum, EtOAc; ethyl acetate extract of S. sarmentosum, BuOH; butanol extract of S. sarmentosum. Fig. 15. Total cholesterol concentrations of ethanol-induced fatty liver disease from S. sarmentosum extracts administered rats. 1; Control, 2; ethanol, 3; ethanol + methanol extract of S. sarmentosum, 4; ethanol + hexane extract of S. sarmentosum, 5; ethanol + ethyl acetate extract of S. sarmentosum, 6; ethanol + buthanol extract of S. sarmentosum. Values are mean ± S.D. Mean with different letters are significantly different at p < 0.05 by Duncan's multiple range test

95 활성은 ethanol 단독투여구가대조구에비해약 8.6 배이상증가하였고, 돌나물추출 물투여구에서는 7.5~8.2배증가하여 ethanol 단독투여구와유의적인차이를나타내 지않았다. GPT 활성은대조군에비해 ethanol 단독투여구가 59.7% 증가하였고, 돌 나물추출물투여군에서는 3.9~23.4% 증가하였다 (Table 5). Fig. 16. Total cholesterol concentrations of ethanol-induced fatty liver disease from S. sarmentosum extracts administered rats. 1; Control, 2; ethanol, 3; ethanol + methanol extract of S. sarmentosum, 4; ethanol + hexane extract of S. sarmentosum, 5; ethanol + ethyl acetate extract of S. sarmentosum, 6; ethanol + buthanol extract of S. sarmentosum. Values are mean ± S.D. Mean with different letters are significantly different at p < 0.05 by Duncan's multiple range test

96 4) 돌나물추출물이간암세포분화및관련단백질변화에미치는영향 돌나물추출물이인간간암세포주인 HepG2 세포의성장에미치는영향을 측정한결과는 Fig. 17 과같다. Fig. 17에서와같이돌나물추출물의처리농도가증 가할수록간암세포주의성장을저해하는것으로나타났다. 간암세포주의성장을 50% 저해하는농도 (IC 50 ) 는 ethyl acetate 처리구 μg/ml, hexane 처리구 μg/ml, methanol 처리구 1.3 mg/ml, butanol 처리구 1.9 mg/ml 이었다. 따라 서 었다. ethyl acetate 돌나물의 추출물의간암세포성장억제효과가가장우수한것으로사료되 ethyl acetate 추출물이간암세포성장억제뿐만아니라세포사 멸효과도나타낼것으로기대되었으므로, ethyl acetate 추출물을처리한후인간 간암세포주의세포사멸을경시적으로측정하였다 (Fig. 18). 일반적으로세포는사 멸했을때, 핵이노출되거나응집하는것으로알려져있다. 따라서 DNA 사이에삽 입될수있는물질인 propium iodide (PI) 로염색한후, PI의형광 intensity를 FACS 를이용하여측정하였다. Fig. 18에서와같이배양 48시간동안대조구에서의세포사 멸은관측되지않았으나 료되었다. ethyl acetate 처리구에서는세포사멸이일어나는것으로사 돌나물추출물처리에의한간암세포주사멸현상이핵의손상에의한것 인지를측정하기위하여 hoechst 33342로세포주를염색하고 DNA의손상정도를현 광현미경을이용하여관측하였다 (Fig. 19). Hoechst 33342는 DNA의 adenine과 thymin 결합사이에끼어들어가자외선 351~364 nm 에서형광을발현하는물질이다. 따라서세포사멸에의해핵이손상되었다면 hoechst 염색에의하여핵의모양은응 축되거나심한경우는점모양으로관측되는것으로알려져있다. Fig. 19에서와같 이 48시간배양한 HepG2 세포는 morphology (B) 가정상적이고핵의모양도일정한 모양을유지하며선명한형광을발현하고있다 (A). 반면에돌나물추출물을처리하 여 48시간배양한세포는 morphology (D) 에서도정상적인 monolayer를형성하지못 하고있을뿐만아니라핵이응집되어있으며 때문에형광의발현양도매우낮았다 (C). DNA 나선을제대로유지하지못하기

97 Fig. 17. Inhibitory effects of S. sarmentosum extracts on the growth of human hepatoma cell line, HepG2 in MTT assay. IC 50 values were calculated from six times experiments. Results are presented mean ± S.D. (n=6). MeOH; methanol extract of S. sarmentosum, Hex; hexane extract of S. sarmentosum, EA; ethyl acetate extract of S. sarmentosum, BuOH; butanol extract of S. sarmentosum

98 Fig. 18. Determination of necrotic cell death in human hepatoma cell line, HepG2 treated with ethyl acetate extract of S. sarmentosum and stained with PI using FACS for 48 hrs

99 Fig. 19. Determination of necrotic cell morphology in HepG2 treated with ethyl acetate extract of S. sarmentosum using confocal and light microscopy (x40) on 48 hrs incubation. A/B; normal HepG2, C/D; S. sarmentosum extract treated HepG

100 따라서돌나물의 ethyl acetate 추출물을처리한 HepG2 세포의사멸현상의 원인은돌나물추출물이간암세포주의핵을손상시키기때문인것으로사료되었다. 세포자살현상의초기단계에서는세포막의구조가변형되면서정상적인상 태에서는세포내부에만존재하던 phosphatidylserine 같은인지질이세포외부로노 출하는것으로보고되고있다. Annexin V는 calcium dependent phospholipid binding protein 으로특정조건하에서세포표면에칼슘이온이많을경우 phosphatidylserine에선택적으로 binding affinity가높아지므로세포외막의 PS 노출 에대한민감한표시제이이다. 반면에 PI는 apoptosis 초기단계의세포막을통과할 수없으므로 annexin V에대한양성반응과 PI에대한음성반응은세포자살초기단 계로, annexin V와 PI에모두양성반응인것은세포자살및세포사멸이일어난것으 로, 두가지물질에대해모두음성반응인것은살아있는세포로판정되고있다. 돌나물의 ethyl acetate 추출물처리에의한세포사멸현상이세포성장속 도를증가시켜일어나는세포괴사현상인지또는돌나물추출물처리에의한세포 자살현상 (apoptosis) 인지를관측하기위하여돌나물추출물을처리한 HepG2 세포 를 annexin V와 PI로이중염색한후 FACS를이용하여 fluorescence intensity를측 정하였다 (Fig. 20). Fig. 20에서와같이대조구는 72시간까지세포괴사및세포자살 이거의일어나지않고있다. 반면에돌나물추출물처리구에서는 24시간배양시약 50% 정도의세포만이살아있고각각약 17% 정도의세포가 apoptosis 또는 necrosis 과정으로이행된것이관찰되었다. 배양시간이길어지면서세포의 apoptosis 또는 necrosis 현상이가속되어 48시간배양시약 40% 정도의세포가 apoptosis 를나타내었고, 72 시간배양시에는거의모든세포 (92.75%) 가 apoptosis를 거쳐괴사되었거나또는다른기전을거쳐괴사된것으로관측되었다. 괴사된세포인지초기 apoptosis 과정에있는세포인지를측정하기위하여 돌나물추출물을처리한 HepG2 세포를 acridine orange와 ethidium bromide 용액으 로이중염색하여형광현미경으로 morphology 를관측하였다 (Fig. 21~23). 괴사된세 포는 ethidium bromide 에염색되어밝은오렌지색의형광을나타내고, 살아있는세 포 (early apoptotic cell) 는 acridine orange에염색되어밝은초록색의형광을나타 내게된다. Fig. 21D에서와같이대조구는배양 48시간에도초록색의형광을나타내 고있으므로살아있는세포로사료되었고, 이러한결과는 annexin V-PI staining 후 의 FACS 결과와도일치하였다. 돌나물추출물을처리한후 48시간이경과한후에는

101 Fig. 20. Apoptosis was measured by flowcytometry analysis of Annexin V-FITC double-labeled cells, HepG2 treated with ethyl acetate extract of S. sarmentosum for 48 hrs. LL; viable cell, LR; early apoptotic cell, UR; late apoptotic cell or necrotic cell. EA; ethyl acetate extract of S. sarmentosum treated group

102 Fig. 21. Morphological change of nuclear chromatin in HepG2 was viewed under a fluorescence microscopy (X100) on 24 (upper) and 48 hrs. (bottom). A; viable cell were stained with acridne orange at 515 nm, B; morphology under light microscopy, C; dead cell were stained with ethidium bromide at 495 nm, D; overlap with A and C

103 Fig. 22. Morphological change of nuclear chromatin in HepG2 treated with S. sarmentosum extract was viewed under a fluorescence microscopy (X100) on 72 hrs. A; viable cell were stained with acridne orange at 515 nm, B; morphology under light microscopy, C; dead cell were stained with ethidium bromide at 495 nm, D; overlap with A and C

104 세포의모양이불규칙해지고세포의염색도오렌지색을많이발현하고있는것으로 미루어세포의괴사가진행되는것으로사료되었다 (Fig. 21). 배양 72시간돌나물 추출물처리구에서는 acridine orange에약하게염색되었고 acridine orange와 ethidium bromide Fig. 22). 염색한것을중첩시켰을때는살아있는세포는관측되지않았다 Apoptosis가진행됨에따라핵의 DNA는세포질내의 endonuclease에의해 nucleosome 사이에서절단되고 180부터 200 bp 배수의다양한길이를지닌 DNA 조각이발생하는것으로보고되고있다. Fig. 23에서와같이대조구는배양시간이 경과하여도단일 band의 DNA 만관측되었으나, 돌나물추출물을처리한세포주는 배양시간이경과할수록 DNA 분절의개수가증가하였다. Fig. 23. DNA fragmentation in S. sarmentosum extract treating HepG2 for 48 hrs incubation. 2% agarose gel electrophoresis of DNA

105 따라서돌나물추출물이 apoptosis 기전에어떠한영향을미치는지를알아 보기위하여 apoptosis 기전의 key enzyme으로알려진 caspase 3 및 caspase 6, 7, 9의발현양을측정한결과는 Fig. 24 와같다. Fig. 24에서와같이대조구에서는 caspase 가관측되지않은반면, 돌나물추출물처리구에서는 caspase 3, 7, 9의발현 이관찰되었다. Caspase 6 은돌나물추출물처리구에서도발현되지않았다. Caspase 이외에 apoptosis에관련된단백질의발현양을 RT-PCR로측정한결과는 Fig. 25과 같다. Fig. 25 에서와같이, Bax 및 Bcl-2는대조구와돌나물추출물처리구에서모두 발현된반면, p53과 p21 은돌나물추출물처리구에서만발현되었고, PARP는대조구 및돌나물처리구모두에서관측되지않았다. 기존에보고된 cellular apoptosis mechanism (Fig. 26) 과돌나물추출물처 리구에서 caspase 3, 7 및 9의발현이관측된것을고려하면돌나물추출물은세포 막의특정 ligand에결합하거나또는 apoptosis을유발할수있는 ligand, 즉 Fas ligand, Apo2/Apo3 ligand 또는 TNF-alpha receptor 를자극하는것으로추정되었다. 상기 ligand/receptor는 procaspase 8을 caspase 8 로전환시킨다. 활성화된 caspase 8 은 apoptosis의 key enzyme인 caspase 3과 capspase 7을각각활성화시켜세포질 내에서 caspase dependent apoptosis 가일어나도록유도하게된다. 또한활성화된 caspase 3은세포질내에존재하는 caspase 9를활성화하여 apoptosis 를유발시킨다. 그러나돌나물추출물처리구에서 caspase 6의발현은관측되지않았으므로돌나물 추출물은 caspase substrate의 cleavage를거쳐 apoptosis를유도하지는않는것으로 사료되었다. 돌나물추출물처리구에서 PARP는발현되지않았으므로 PARP 활성화 에의해 DNA fragmentation 이일어나지않는것으로사료되었다. 돌나물추출물처 리시관찰되는 DNA fragmentation은미토콘드리아막의 Bax 및 Bcl-2의활성화와 관련된것으로사료되었다. 즉, Bax 및 Bcl-2가활성화되어미토콘드리아내부에존 재하는 MMP 를활성화시키고, MMP에의해세포질내에서의 apoptosis를촉진시키 는것으로사료되었다. 또한 MMP는세포질내의 Endo G 또는 Alf를핵내로유입 시켜이들에의해핵내의 DNA fragmentation 을촉진시키는것으로사료되었다. MMP에의해 DNA fragmentation이유발되면이들을복구하기위한 feedback 기전 으로핵내의 p53 및 p21이활성화되고 p53에의해세포질의 Bax 및 Bcl-2가활성 화되어전술한바와같은 apoptosis 가일어난것으로사료되었다

106 Fig. 24. Determination of caspase 3, 6, 7, and 9 expressions in S. sarmentosum extract treating HepG2 on 24 hrs incubation. Fig. 25. Expressions of apoptosis related proteins in S. sarmentosum extract treating HepG2 on 24 hrs incubation

107 Fig. 26. Cellular apoptosis pathway

108 5) 간기능개선및간암억제작용이강화된제품의개발 한국의알코올소비는세계최고의수준이며, 간암이나간경변으로인한사 망이한국인의주요사망원인이되는등음주로인한사회경제적및보건학적폐해 는엄청나며이는증가추세에있다. 과다한알코올섭취는신체의거의모든부분 에영향을미쳐서간질환, 위염, 췌장염, 고혈압, 중풍, 식도염, 당뇨병그리고심장병 등많은질환을일으키는것으로보고되고있다. 최근보건복지부산하한국보건사 회연구원이실시한국민건강영양조사결과에의하면, 국내 20 세이상성인의경우, 술마시는날은 1달평균약 8 일로서, 남자는약 11 일, 여자는약 4일정도인것으로 나타났고, 이때만취횟수는주 1회이상이약 4.7% 정도, 1개월에 1 내지 3회가 약 10.7% 정도, 3개월에 1 내지 3회가약 13.2% 인것으로조사된바있으며, 이는 국민건강의측면에서상당히우려할만한수준이다. 이와같이, 현대인들은그정도 가지나쳐인체내에서감당할수없을정도로알코올을과량섭취하고, 그로인한 부작용인갈증, 전신권태, 피로감, 기억상실, 복부팽만감, 소화불량, 구토설사, 비타 민결핍등의숙취현상으로고생하는경우가많고, 알코올중독에걸릴위험성도 그만큼증가하고있는실정이다. 이와같은숙취현상은간세포와체내에축적된알 코올 (alcohol) 및아세트알데하이드 (acetaldehyde) 의작용에의해발생하는것으로 알려져있다. 특히, 아세트알데하이드는음주후두통을수반하는대표적인화학물질 로서 WHO 에서도그자체의독성을경고한바있다. Fig. 27. Oxidative analysis of ethanol

109 술의주성분인에탄올 (ethanol) 은신체적, 정신적으로인체에미치는효과 가매우다양하고광범위하여그대사과정과독성발현특성에대한많은연구가 진행되고있다. 섭취된에탄올은소화관을통해흡수되어섭취후 20 ~120분사이 에최고혈중농도에도달한다. 흡수된 ethanol은간을비롯한모든장기들에서대사 되는데일부 ( 약 10%) 는호흡을통하여또는소변및땀으로배설된다. 정상적인상 태에서소량의알코올을섭취할경우간장내로들어온에탄올은세포 알코올탈수소효소 (alcohol dehydrogenase, ADH) 와알데하이드탈수소효소 cytosol 내의 (aldehyde dehydrogenase, ALDH) 의작용에의해아세테이트 (acetate) 로전환되고, 이는순환 계를통해간세포밖으로배설되어진다(Fig. 27). 이중특히에탄올의최초대사산물 인아세트알데하이드는에탄올에비해반응성이매우높고독성이강하여알코올성 간장애의주원인물질로밝혀진바있다. 아세트알데하이드는세포내에너지생성 기관인미토콘드리아의호흡을방해하고산화적인산화반응을억제하며, 막단백질 및콜라겐단백질과도결합하여항체를생성하기도하고, 면역학적으로세포독성을 나타내며간세포분비단백질의방출기구를저해하는것으로밝혀진바있다. 또한, 아세트알데하이드는미오피브로블라스트 (myofibroblast) 의콜라겐합성을촉진하여 간섬유화와간세포의변성종대를일으키며, 생체내거대분자와반응하여어덕트 (adduct) 를형성하기도한다. 또한, 인체로섭취된알코올에의해서간내에중성지 방이축적되기도한다. 간에서의중성지방축적은지방산합성이증가되기보다는알 코올에의한지방산산화억제가중성지방축적의중요인자로작용하는것으로알려져 있다. 간에서의중성지방축적은간의대사장애를반영해주며, 계속적인중성지방축 적은결국섬유조직의증식및간세포의손상을초래하기도한다. 이와같은알코올 대사의결과, 지방산이많이만들어져간에지방이축적되는데이를알코올성지방 간이라고한다. 이알코올성지방간은특히만성간질환으로진행하는경우가많은 데, 알코올성간염의 10-15% 가, 간경변증의 8-20% 정도가알코올성지방간과관련 있는것으로보고된바있다. 간내에는아세트알데하이드뿐만아니라각종약물 및지방대사산물과과산화지질의대사과정, 그리고 C-C 결합의산화적절단으로생 체에극히유해한것으로알려진여러종류의알데하이드가생성된다. 알데하이드를 포함한알데히드의산화에관여하는주효소인 aldehyde dehydrogenase 는간, 콩팥, 심장및위를포함한많은장기와조직에널리분포하고, cytosol, mitochondria 및 microsome 에도존재하여폭넓은기질특이성을보이며, 각종알데하이드에대응할 수있는약물대사효소의성격을지니고있다. 따라서, 어떤요인에의하여간내 aldehyde dehydrogenase 활성에변화가오게되면, 이는활성알데하이드의해독및 물질대사에중요한영향을미치는것으로알려져있다. 이과정에서알콜과알데하

110 이드는간세포와뇌세포에손상을입히고, 구토및두통을유발시키며, 심하면오한 이나복통이유발되며, 이러한생리적현상이숙취의원인이되는것이다. 그리고 alcohol dehydrogenase 등이부족한사람의경우에는간기능에더많은부담을주 고정상적인대사작용이방해되어숙취를일으키는현상이더욱심해지게된다. 특 히, ALDH 는알데하이드가저농도이더라도산화를개시하는 Ⅱ형과, 아세트알데하 이드가고농도로되지않으면작용을하지않은 Ⅰ형이있으나, 동양인은일반적으 로 Ⅱ형 ALDH가결핍또는부족하기때문에아세트알데하이드산화가느리고따라 서산화되지않은아세트알데하이드및에탄올의유독작용에의하여정상적인신진 대사가방해받아여러숙취현상을느끼게되는것이다. 따라서, 알코올섭취로인한숙취를제거하고혈중알코올농도를감소시킬 수있는제제를개발하기위해생약제재또는인공제재를단독또는혼합하여제조 된드링크류가다수개발되고있으며, 민간에서는북어국이나콩나물국등이숙취해 소에자주이용되고있다. 그러나, 최근까지도알코올숙취를해소시킬수있는의약 품은개발되어있지않은상태이며, 숙취해소용음료가숙취해소제로서사용되고있 으며, 현재국내를중심으로다수의제품이출시되고있는실정이다. 이외에간장보 호제가음주후간장보호용으로이용되고있다. 본연구에서는전술한바와같이돌 나물추출물이에탄올섭취로유발되는간손상을회복시키는효과가우수하였으므 로돌나물즙을이용하여숙취해소음료를개발하고자하였다. 돌나물추출물이 ADH와 ALDH 활성에미치는영향을측정하였다. 즉, 50 μg/ml의농도의돌나물추출물을대조구와비교하여 ADH와 ALDH 활성에미치는 영향을측정하였다. Fig. 28에서와같이 methanol 및 butanol 추출물은 ADH 및 ALDH 효소활성을유의적으로증가시키는것으로나타났고, ethyl acetate 추출물은 ADH 활성보다 ALDH 효소활성을증가시키는것으로나타났다. 반면에 hexane 추 출물은 ADH 및 ALDH 효소활성을대조구보다저하시키는것으로관측되었다. 따라 서알콜분해를촉진시키는성분은극성용매에추출되는것으로사료되었고, in vivo 실험에서는 methanol 및 butanol 추출물을투여한 group에서의알콜분해속도 가빠를것으로예측되었다

111 Fig. 28. Relative activities of alcohol dehydrogenase (ADH) and acetaldehyde dehydrogenase (ALDH) treated with S. sarmentosum extracts. The concentration of S. sarmentosum extracts were 50 μg/ml. ADH, p = in ALDH. Post hoc test was Scheffe' test. p = in 돌나물추출물중에서극성용매추출물에의한 ADH 및 ALDH 활성이증 가하였으므로돌나물을마쇄하여얻은돌나물즙및각각의돌나물추출물과 ethanol을백서에경구투여한후경시적으로혈액을채취하여혈액내의 ethanol 도를측정한결과는 Fig. 29 와같다. Ethanol 만을투여한대조구에서의혈중 ethanol 농도는 ethanol 투여후 1 시간일때가장높은농도를나타내었고투여시 간이길어지면서그농도가점점감소하였다. 돌나물즙 (SJ) 투여구에서의혈중알 콜농도는전실험기간동안대조구보다유의적으로낮았으며, 특히알콜투여후 2 시간이지났을때에는대조구보다약 2.3배정도낮은혈중 ethanol 농도를나타내어 농

112 돌나물의 ethanol 을분해하는효과가용매추출물보다우수한것으로사료되었다. ADH 활성을증가시키는 methanol 추출물은알콜투여후 2시간이지났을때그효 과가최대로나타나는것으로사료되었고, butanol 추출물은알콜투여후 3시간경 과시혈중 ethanol 농도를감소시키는효과가우수하였다. Hexane 및 ethyl acetate 추출물의투여구에서도대조구보다유의적으로낮은혈중 ethanol 농도를나타내었 으나돌나물즙투여구또는극성용매추출물투여구보다그효과가높지않았다. 따라서혈중 ethanol 을분해하는효과는돌나물즙 > 극성용매추출물 > 비극성 용매추출물순으로감소하는것으로사료되었다. Fig. 29. The concentration of blood ethanol from rats treated with S. sarmentosum extracts. The concentration of S.extracts were 1.5 mg/ml. EtOH; ethanol treating group, SJ; S.juice, MeOH; methanol extract, BuOH; butanol extract, EA; ethyl acetate extract, Hex; hexane extract. p = at 1 hr, p = at 2, 3, and 4 hrs, respectively. Post hoc test was LSD test

113 돌나물추출물과 ethanol을경구투여한후혈중 acetaldehyde 농도를경시적 으로측정한결과는 Fig. 30 과같다. 대조구에서는 ethanol 투여후 2시간에경과되 었을때혈중 acetaldehyde 농도가최대치를나타내었고, 그후에는점차감소되는 경향을나타내었으나실험종료시까지상당히높은 acetaldehyde 농도를유지하였다. 반면에돌나물추출물투여구에서는 ethanol 투여후 1시간경과시에도혈중 acetaldehyde의농도가대조구의약 50% 정도만을나타냈으며실험시간이경과하면 서혈중의 acetaldehyde 농도는빠르게감소하였다. 특히돌나물즙투여구에서는 ethanol 투여 4시간경과후에는혈중 acetaldehyde가거의남아있지않은것으로 관측되었다. 따라서돌나물추출물은 ethanol을 acetaldehyde로분해시키는 ADH 활성을 증가시켜혈중 ethanol 을빠르게분해시킬수있을뿐만아니라, ethanol에서전환되 는독성물질인 acetaldehyde 를빠르게분해시키는것으로사료되었다. 따라서돌나물 추출물과알콜을동시에섭취할경우, 혈중알콜농도및 acetaldehyde의농도가감 소될것으로사료되었다. 전술한바와같이 acetaldehyde는알콜섭취후에나타나는 숙취현상의원인물질이다. 돌나물추출물을섭취함으로써 acetaldehyde가빠르게 분해되기때문에알콜섭취에따른숙취현상도감소할것으로사료되었다. 백서를대상으로한실험결과를기준으로하여사람을대상으로한숙취해 소실험을시행하였다. 즉, 20대남자 10 명, 여자 5명을대상으로돌나물즙섭취전 과후의혈중 ethanol 및 acetaldehyde 농도의변화를측정하였다. Fig. 31에서와같 이, 돌나물즙을섭취전의혈중 ethanol 및 acetaldehyde 농도의변화경향은동물 실험결과와유사하였다. 즉, 알콜섭취후 1시간경과후에가장높은혈중 ethanol 농도를나타내었고이후실험시간이경과하면서혈중 ethanol 농도는점차감소하였 다. 혈중 acetaldehyde 농도도혈중 acetaldehyde 농도의변화경향과유사하였다. 돌 나물즙을알콜을마시기전에섭취한실험에서는알콜만을섭취했을때보다전시 간대에서유의적으로낮았다. 따라서알콜섭취전에돌나물 ( 즙/ 추출물) 의섭취는 알콜섭취로인한혈중 ethanol 및 acetaldehyde의농도를유의적으로감소시키는것 으로확증하였다

114 Fig. 30. The concentration of blood acetaldehyde from rats treated with S. sarmentosum extracts. The concentration of S.extracts were 1.5 mg/ml. EtOH; ethanol treating group, SJ; S.juice, MeOH; methanol extract, BuOH; butanol extract, EA; ethyl acetate extract, Hex; hexane extract. p = at 1 hr, p = at 2, 3, and 4 hrs, respectively. Post hoc test was LSD test. Table 6. Variables and experimental design levels. Independent Design Range and levels variables variables S.(g/dL) A Red gin (mg/l) B Rice (mg/l) C Angelica (mg/dl) D Green citrus (mg/l) E

115 Fig. 31. Changes of blood ethanol and acetaldehyde concentrations in ethanol with/ without S. sarmentosum juice administered human. Significant differences were detected in ethanol determination, p = at 1 hr, p = at 2 hrs, and p = at 3 hrs. Significant differences were detected in acetaldehyde determination, p = at 1 hr, p = at 2 hrs, and p = at 3 hrs. Paired t-test was performed. 이상의결과를기준으로하여돌나물추출물이첨가된숙취해소음료를개 발하였다. Tables 6~7에서와같이돌나물추출물을기본으로하여숙취해소효과가 있는것으로알려진청피, 홍삼박, 당귀및상황쌀을첨가하여 32개의숙취해소음료 를제조한후 9명의 panel을대상으로하여관능검사를 2 회실시하였다 (Table 7)

116 Table 7. Rotatable central composite design and results of the optimization for making hepatoprotetive drink. std order A B C D E Data 1 Data 2 1-1* A; S. sarmentosum, B; red gin, C; rice, D; Dangui (Angelica gigas), E; Chengpi (Citrus unshi). *; coded value. Data 1/2; mean from 2 times sensory tests

117 Table 7의결과를 design expert program으로분석하여모델적합성을검 정한결과, 모델에대한 ANOVA 값은 p = 로유의적인결과를얻었고, Fig. 32 와같은 contour map 을얻을수있었다. Fig. 32의 contour map을충족시키는 10개 의 solution 을구할수있었다 (Table 8). Table 8의 solution으로음료를제조하여 관능검사를실시한결과관능검사치가우수한 5개의 solution 을선정하였고, 이들 5 개의 solution 에대하여쓴맛, 향기, 전체적인맛을측정하게하였다(Fig. 33). 가장 관능검사치가높은것을이용하여음료를제조하였고 출원중이다. (Fig. 34), 이에대한특허를 Fig. 32. Acquired contour map from the optimization experiment of making hepatoprotective drink using S. sarmentosum extract. p =

118 Table 8. Acquired solutions from the optimization experiment of making hepatoprotective drink. Fig. 33. Sensory test of acquired solutions from the optimization test

119 Fig. 34. Pilot product for the prevention of hangover using S. sarmentosum extract. 나. 돌나물의항산화및면역활성물질의분리ㆍ동정과효과탐색및제품개발 1) 항산화및면역활성물질의분리및동정 돌나물추출물 subfraction의 DPPH radical scavenging 효과를측정한결과 는 Fig. 35 와같다. Fig. 35에서와같이 ethyl acetate 추출물의 subfraction E4의항 산화활성이가장우수하였다. subfraction E4로부터의순수물질분리는전술한바와 같이진행하였으며, 항산화활성이가장높은물질은 quercetin 으로확인되었다. 또한돌나물추출물 subfraction의면역활성효과를측정한결과는 Fig. 36 과같다. Fig. 36에서와같이 ethyl acetate 추출물 subfraction 5의면역활성이가장 우수하였다. 따라서 subfraction E5로부터면역활성이높은물질을순수분리동정하 였다. Fig. 37에서와같이 subfraction E5는 TLC plate 상에서자외선 254 nm 파장 하에서청색으로관측되며, FeCl 3 를분무했을때양성반응으로나타내며 10% H 2 SO 4 를분무하고가열시진한갈색으로발색되었다

120 Fig. 35. Antioxidative activities of subfractions from S. sarmentosum extracts using DPPH assay. Control; ascorbic acid, A; methanol extract, B; hexane extract, C; ethyl acetate extract, D; butanol extract

121 Fig. 36. Nitric oxide synthase activities in LPS stimulated RAW264.7 cell. Control; L-NMMA, A; methanol extract, B; hexane extract, C; ethyl acetate extract, D; butanol extract

122 Fig. 37. Thin layer chromatogram of subfraction E5 from S. sarmentosum ethyl acetate extract. band) FT-IR spectrum에서 3330 cm -1 (OH), 1671, 1526 (aromatic carbon, double 등의흡수대를나타내어방향족화합물인것으로사료되었다 39에서와같이본화합물은분자량 178 인것으로확인되었다. (Fig. 38). Fig. 1 H-NMR spectrum의 δ 6.96 ( 1 H, s), 6.73 ( 1 H, s) 에서각각 singlet으로나 타나 H-8과 H-5의수소가 meta coupling 하고있음을확인하였고, δ 7.83 ( H, d) 과 6.10 ( 1 H, d) 의 singnal은 cis 형태의 alkene 수소로서 coumarin 계로추정되었다 (Fig. 40). 또한 13 하였으므로본화합물은 C-NMR spectrum을 library의 data 비교하여각각의 signal이일치 esculetin 인것으로최종동정하였다 (Figs. 41~42). 1 Fig. 38. IR spectrum of subfraction E5 from S. sarmentosum ethyl acetate extract

123 Fig. 39. GC-MS spectrum of subfraction E5 from S. sarmentosum ethyl acetate extract. Fig H-NMR spectrum of subfraction E5 from S. sarmentosum ethyl acetate extract. Fig C-NMR spectrum of subfraction E5 from S. sarmentosum ethyl acetate extract

124 Fig. 42. Structure of esculetin. 취하여 2) 돌나물및돌나물추출물이백서에서의항산화관련효소활성에미치는영향 백서에돌나물추출물을 4주간섭취시킨후희생하여간조직및혈액을채 Figs. 43~48과같이항산화능을평가할수있는것으로알려진효소활성도 등을측정하였다. 이들그림에서와같이항산화능을평가하는지표에따라돌나물 추출물의항산화능도다르게나타남을알수있다. 그러나전반적으로돌나물추출물투여구에서높은항산화능을보이고있으 며, 양성대조구인 tocopherol 또는 ascorbic acid와유사하거나보다더우수한항산 화능을나타내었다. 돌나물추출물에함유된 polyphenol 함량을측정한결과는 Fig. 48 과같다. Fig. 48 에서와같이, methanol 추출물과 ethyl acetate 추출물에서 polyphenol 함량이 높게나타났다. 이는 methanol 추출물투여구가전반적으로높은항산화능을나타낸 것과일치하는결과이었다

125 Fig. 43. Radical scavenging effects of S. sarmentosum solvent extract in rat. MeOH; methanol extract administerd group, Hexane; hexane extract administerd group, EA; ethyl acetate extract administerd group, BuOH; butanol extract administerd group

126 Fig. 44. Peroxide values of S. sarmentosum solvent extract in rat. MeOH; methanol extract administerd group, Hexane; hexane extract administerd group, EA; ethyl acetate extract administerd group, BuOH; butanol extract administerd group. Fig. 45. Superoxide dismutase activities of S. sarmentosum solvent extract in rat. MeOH; methanol extract administerd group, Hexane; hexane extract administerd group, EA; ethyl acetate extract administerd group, BuOH; butanol extract administerd group

127 Fig. 46. Thiobarbituric acid values of S. sarmentosum solvent extract in rat. MeOH; methanol extract administerd group, Hexane; hexane extract administerd group, EA; ethyl acetate extract administerd group, BuOH; butanol extract administerd group. Fig. 47. Xanthin oxidase activities of S. sarmentosum solvent extract in rat. MeOH; methanol extract administerd group, Hexane; hexane extract administerd group, EA; ethyl acetate extract administerd group, BuOH; butanol extract administerd group

128 Fig. 48. Total polyphenol contents of S. sarmentosum solvent extract. MeOH; methanol extract, Hexane; hexane extract, EA; ethyl acetate extract, BuOH; butanol extract. 3) 돌나물및돌나물추출물이면역활성에미치는영향 대식세포인 RAW cell line에돌나물의각용매추출분획을첨가하고 48 시간배양하였을때의대식세포생존율 (relative cell viability, %) 을측정하였다 (Fig. 49). 돌나물추출물을 625 μg/ml로처리할때까지 cell viability에는변화가없 었다. 그러나 625 μg/ml 이상의농도로돌나물추출물을처리하였을때는농도의 존적으로 cell viability 가감소하였다. Cell viability 는용매별로차이를나타내었으나, 에틸아세테이트추출분획과부탄올추출분획간에유의적인차이는관측되지않았 다. 모든돌나물용매추출분획을 500 μg/ml 로처리하였을때, 세포독성 (cytotoxicity) 이나타나지않았으므로, 이후의면역활성시험에는 500 μg/ml을최고 농도로하여시험하였다. 대식세포인 RAW cell lines에 LPS (lipopolysaccharide) 또는돌나물 용매추출분획을첨가하고 2일간배양한후에생성된 nitric oxide의양을측정한 결과는 Fig. 50 과같다. Fig. 50 에서와같이, 모든용매추출분획첨가구에서 nitric oxide 를생성하였다. Methanol 추출분획과 butanol 추출분획처리구에서의 nitric

129 oxide 의생성양은유의적인차이를나타내지않았다. 반면에 hexane 추출분획및 ethyl acetate 추출분획처리구는 butanol 추출분획보다약 2배정도많이 nitric oxide 를생산하였다. Fig. 49. Viability of RAW264.7 cells after treatment with S. sarmentosum solvent extracts. MTT assay was performed to determine viability of cells after treatment with each solvent extract for 48 h. Data represent the mean ± S.D. with eight experiments. MeOH; methanol, Hex; hexane, EtOAc; ethyl acetate, BuOH; butanol

130 Fig. 50. Effects of S. sarmentosum extracts on the nitric oxide production in RAW cell lines. Values are the mean ± S.D. in experiments more than eight times. MeOH; methanol, Hex; hexane, EtOAc; ethyl acetate, BuOH; butanol. LPS 농도가 0.1~0.4 μg/ml일때에방출되는 nitric oxide의양은 Figs. 5 1~54 와같다. LPS 농도가 0.1 μg/ml 일때, nitric oxide 의양은약간증가하였다. 그러나 methanol 추출물, hexane 추출물및 ethyl acetate 추출물에의해생성되는 nitric oxide 의양이감소되었다. Butanol 추출물은 0.1 μg/ml LPS에의해유도되는 nitric oxide 의양을감소시키지못하였다. 다음으로돌나물추출물및 LPS 처리가 RAW 세포에서의 inducible nitric oxide synthase (inos) 발현에미치는영향을알아보기위하여 Western blotting 을실시하였 다 (Fig. 55). Fig. 55 에서와같이, LPS 처리에의해발현되는 inos 단백질은돌나물추출물 에의해그생성양이감소되는것으로확인되었다

131 Fig. 51. Production of nitric oxide in LPS and methanol extract of S. sarmentosum induced RAW cell lines. RAW264.7 cells were plated in 96-well plate at a density of /ml and incubated with different concentration of LPS (lipopolysaccharide). Fig. 52. Production of nitric oxide in LPS and hexane extract of S. sarmentosum induced RAW cell lines. RAW264.7 cells were plated in 96-well plate at a density of /ml and incubated with different concentration of LPS (lipopolysaccharide)

132 Fig. 53. Production of nitric oxide in LPS and ethyl acetate extract of S. sarmentosum induced RAW cell lines. RAW264.7 cells were plated in 96-well plate at a density of /ml and incubated with different concentration of LPS (lipopolysaccharide). Fig. 54. Production of nitric oxide in LPS and butanol extract of S. sarmentosum induced RAW cell lines. RAW264.7 cells were plated in 96-well plate at a density of /ml and incubated with different concentration of LPS (lipopolysaccharide)

133 Fig. 55. Effects of S. sarmentosum extracts on inducible nitric oxide synthase expression in RAW cell lines. Top; 8% SDS-PAGE gel, Bottom; Wextern blot analysis, 1; marker, 2; methanol extract and LPS, 3; methanol extract, 4; hexane extract and LPS, 5; hexane extract, 6; ethyl acetate extract and LPA, 7; ethyl acetate extract, 8; butanol extract and LPS, 9; butanol extract, 10; standard, LPS; lipopolysaccharide. The RAW264.7 cell lines were cultured with S. sarmentosum extracts, and with or without LPS, 1 μg/ml

134 4) 항산화및면역활성관련단백질의탐색 돌나물추출물이항산화및면역활성과관련된단백질의발현에미치는영 향을조사한결과는 Figs. 56~57 과같다. 면역활성은대식세포주인 RAW cell line 에, 항산화활성은백서에고지방식을급여하고돌나물의용매추출분획을처리 하여단백질변화를측정하였다. 돌나물용매추출분획을처리하였을때대조구에 비해단백질발현양이증가하였다. 돌나물추출물처리에의해변화된단백질의발 현양상중항산화와관련된것은 glutathione peroxidase, glutathione reductase의 발현이증가되었고, 면역기능과관련된단백질중에서는 COX2의발현이증가된것 이관측되었다. Fig. 56. Two-dimensonal gel electrophoresis from S. sarmentosum treated RAW cell lines using IPG strip ph 4~

135 Fig. 57. Two-dimensonal gel electrophoresis from S. sarmentosum treated RAW cell lines using IPG strip ph 6~

136 5) 항산화및면역활성이강화된제품의개발 전술한바와같이돌나물추출물이항산화및면역활성을증가시키는것으 로나타났다. 따라서돌나물추출물이첨가된젤리를제조하였다. 젤리 (jelly) 는고 대부터섭취하여온음식으로과채류의즙 (juice) 에당과겔화제를혼합하여농축, 성형하여제조한다. 경제가발전하면서식생활이다양화되고고급화됨에따라디저 트식품으로서의젤리소비가증가하고있으며, 이에따라젤리원료에대한연구도 증가하고있다. 최근에는건강지향의식생활이일반화되고, 질병예방및건강에도움 을주는식품및식품소재에대한관심이증대되면서기능성식품의개발도증가하 고있다. 또한천연식품소재유래의색소활용과동시에기능성분의강화효과를기 대하는가공식품의개발도이어지고있다. 돌나물 (S. sarmentosum Bunge) 은돌나물과에속하며비타민 C, 철분및칼 슘등의영양성분을많이함유하고있는산채류이다. 돌나물은골다공증에유효하고, 간기능개선능이있는것으로보고되고있으나, 저장성이낮고이를이용한가공식 품이없어부가가치가매우낮은식품이다. 따라서본연구에서는생식으로한정되 어있는돌나물의이용률과부가가치를높이고돌나물추출액을첨가하여천연의색 을부여한젤라틴젤리를제조하고, 그식품영양학적특성을평가하였다. 대조구와돌나물즙을첨가 (0.5~3%) 한젤리의당도는 15.3~15.8 Brix로유 의적인차이를나타내지않았다. 이는돌나물즙을젤리에첨가함으로써젤리의당 도에영향을주지않기때문으로사료되었다. 돌나물젤리의 ascorbic acid 함량을측정한결과는 Fig. 58 과같다. Fig. 58 에서와같이, 대조구에서관측되지않았던 ascorbic acid는돌나물즙의첨가량에비 례하여그농도가증가하였다. 식품에함유된 ascorbic acid는제품에서의안정성이 중요한문제점으로알려져있다. 따라서돌나물젤리를제조하여 4 에서 15일간저 장하면서 ascorbic acid 함량변화를측정하였다 (Fig. 59). Fig. 59에서와같이 2% 이상의돌나물즙을첨가한젤리의 ascorbic acid 함량은저장 15일까지초기함량의 90% 이상을유지하였다. 그러나돌나물즙의첨가량이낮을수록저장기간이증가되 면서돌나물젤리에함유되어있는 ascorbic acid 농도는저장초기에비해크게감 소하였다. 따라서 2% 이상의돌나물즙을젤리제조시에첨가하는것이 ascorbic acid 함량을유지하는데효과적인것으로사료되었다. 일반적으로 ascorbic acid가결 핍되면잇몸출혈및염증을유발하는것으로알려져있고, 또한최근의연구에의 하면 ascorbic acid 는콜레스테롤저하작용, 면역증강작용및세포증식억제작용을 하는것으로보고되고있다

137 우리나라의경우, 흡연자를제외한전연령층에서 ascorbic acid의섭취량은 권장량을충족하는것으로조사되었으나, 성인남성흡연자의경우권장량의약 75% 정도만을섭취하는것으로보고되었다. 흡연자는비흡연자와동일한양의 ascorbic acid를섭취하여도혈청내 ascorbic acid 수준은비흡연자에비해낮으므 로, 정상의혈청수준을유지하기위해서는비흡연자보다더많은양의 ascorbic acid 를섭취해야하는것으로보고되고있다. 더욱이젊은여성과청소년층에서의흡 연율은급증하고있는추세이며, 이들은성장과흡연에따른대사를위해다량의 ascorbic acid 가필요하다. 젤리는청소년및젊은여성들이선호하는식품형태이며, 열량이낮아간식으로의이용도가높은식품이다. 따라서돌나물젤리는젊은층흡 연자들에게필요한영양소인 료되었다. ascorbic acid를공급할수있는효과적인식품으로사 돌나물젤리의적정산도를측정한결과는 Fig. 60 과같다. Fig. 60에서와같 이돌나물즙의첨가량이증가할수록적정산도는낮아지는것으로나타났다. 이는 돌나물즙의첨가량이증가할수록젤리에함유된 ascorbic acid 돌나물즙에포함된유기산의양이증가하기때문으로사료되었다. 돌나물젤리에함유된양이온농도를측정한결과는 양이증가하는것과 Fig. 61 과같다. Fig. 61에서와같이돌나물즙을첨가함으로써칼슘은대조구보다 4~28배까지증가하였 다. 2001년국민건강영양조사에의하면영유아및청소년층에서의칼슘섭취량은권 장량의 60~75% 범위로매우낮게나타났으며, 여성노인층에서는권장량의약 55% 정도만을섭취하고있는것으로나타났다. 이와같이칼슘은우리식생활에서섭취 량이권장량에비해가장미흡한영양소로, 칼슘의섭취를증가시키려는노력들이 있어왔다. Fig. 61에서와같이돌나물즙의첨가량에비례하여젤리에포함된칼슘함 량이증가되었다. 따라서돌나물즙첨가젤리는칼슘의섭취를증가시킬수있을것 으로사료되었다

138 Fig. 58. Ascorbic acid concentration of jelly treated with S. sarmentosum extracts. Fig. 59. Stability of ascorbic acid concentration in S. sarmentosum jelly at

139 Fig. 60. Titratable acidities of jelly treated with various S. sarmentosum extracts. Fig. 61에서와같이대조구에없었던철분은각각 0.023~1.031 mg/100g ( 젤 리건조중량) 을함유하는것으로분석되었다. 한국인의철분영양상태는 WHO가 정하는기준으로판정했을때, 10세이상인구의 2.6~23.1% 가빈혈이며, 특히 65세 이상의노년층에서의빈혈이심각한것으로보고되었다. 철분은헤모글로빈의구성 분으로산소운반및에너지대사에필수적이며효소의촉매인자로이용되는등체 내에서중요한역할을한다. 따라서철분결핍성빈혈은작업수행, 행동과지능발달, 감염에대한저항능력및체온조절능력등에영향을미치는것으로알려져있으며, 경제여건과관계없이전세계적으로발생빈도가높은공중보건문제로서우리나 라의경우전통적으로철분섭취량이부족한형편이다. 따라서철분섭취를증가시 키기위해식품에철분을강화시키려는노력들이있어왔다. 돌나물즙첨가젤리는 별도의공정이나특별한노력없이철분의섭취를증가시킬수있는것으로사료되었 다

140 Fig. 61 에서와같이돌나물즙의첨가량이증가할수록나트륨함량은대조구 에비하여약간증가되었고, 대조구에서관측되지않은칼륨은 0.042~2.688 mg/100g ( 젤리건조중량) 을함유하는것으로분석되었다. 대조구에서도나트륨함량이높은 것은젤리제조시사용된젤라틴때문인것으로사료되었다. 나트륨과칼륨은세포 액에들어있는주요양이온으로체내삼투압유지, 수분및산염기평형등의항상 성유지, 신경및근육세포의흥분과자극전달조절, 심장박동유지에중요한역할 을한다. 특히칼륨은과잉의식염섭취로인해유발된고혈압에대해보호기능이 있어고혈압환자의식이에칼륨섭취량을증가시키도록권장되고있으나, 일반적으 로식품의가공공정중에나트륨함량은증가되는반면에칼륨함량은감소되는것 으로보고되고있다. 그러나 Fig. 61에서와같이돌나물즙을첨가함에따라나트륨 함량은미비하게증가하였으나칼륨함량은매우많이증가하였다. Fig. 61. Mineral concentrations of jelly treated with S. sarmentosum extracts

141 따라서돌나물즙첨가량이많은젤리에서의나트륨증가량은영양학적으로 문제되지않을것으로사료되었다. 상기서술한바와같이젤리제조시돌나물즙을 첨가함으로써, 영양소강화등별도의공정을거치지않고도 ascorbic acid, 칼슘, 철 분및마그네슘등의영양소섭취를증가시킬수있는것으로사료되었다. 돌나물젤리의색도를측정한결과는 Table 9 와같다. 대조구에비해돌나 물즙의첨가량이많아질수록명도값 (L value) 은유의적으로감소하였다. 이는대조 구가투명한젤리를형성하는반면에돌나물젤리에서는돌나물즙의첨가에의해 젤리의색이짙어지기때문으로사료되었다. 또한녹색도 (-a value) 와황색도 (b value) 도돌나물즙첨가량이증가할수록유의적으로증가하였으나, 돌나물즙 2% 첨 가구와 3% 첨가구간에유의적인차이는관측되지않았다. 돌나물즙의첨가량이 증가할수록젤리의 hardness와 gumminess가감소하는것은젤리제조시사용된젤 라틴의특성때문인것으로사료되었다. 즉, 젤리제조시에사용되는젤라틴은 ph 4.8 과 ph 5.2의 isoioninc point 를지닌양친밀성단백질로, ph 5에서최소의점도와최 대의겔형성능을나타내며, sol 상태의 ph 에따라겔형성능이달라지게된다. Table 9. Hunter color values of jelly with various concentration of S. sarmentosum extracts. Concentration of S. sarmentosum extracts (%, v/v) L value a value b value Control 48.96±1.85 a -1.93±0.12 a 6.19±0.84 a ±0.82 b -5.95±0.25 b 14.88±1.26 b ±0.68 c -8.24±0.17 c 20.41±1.07 c ±0.89 d -9.58±0.21 d 21.41±1.01 cd ±1.52 e -9.62±0.23 d 22.98±0.89 d Different superscript letters in the same column show significant differences at p < 0.05 by 1-WAY ANOVA and Fisher's protected least-significant differences (LSD) test

142 Fig. 62에서와같이돌나물즙의첨가량이증가할수록 sol 상태의 ph가낮 아지는것으로나타났다. 대조구와 0.5~1% 돌나물즙첨가구간에는유의적인차이를 나타내지않았으며, 이는돌나물즙첨가젤리의 hardness 측정결과와일치하였다. 또한돌나물즙의첨가량이증가할수록젤리 (sol 상태) 의 ph가유의적으로감소하 였다. 이는돌나물즙을첨가할수록 ascorbic acid의함량이증가하는것과일치하는 결과이다 (Fig. 58). 즉, 돌나물즙의첨가량이증가할수록돌나물젤리에함유된 ascorbic acid 의양이증가하면서젤리 (sol) 의 ph 가감소하였으며, 이에따라젤리 (gel 상태) 의 hardness 도감소한것으로사료되었다. 또한돌나물즙에포함된다량 의유기산들도 ph 가감소하는데영향을미친것으로사료되었다. 20대의훈련된관능검사요원 12명으로돌나물젤리의관능검사를실시한 결과 (Table 10, Fig. 63), 단맛은 3.33± 0.19~3.71±0.88 점으로대조구및돌나물즙첨 가구간에유의적인차이를나타내지않았고, 이는당분석결과와도일치하였다 (p = 0.889). 전술한바와같이돌나물즙의첨가량이증가할수록 ascorbic acid 함량과 적정산도가증가하였으나, 관능검사에서는대조구와돌나물즙첨가구간에신맛 (3.63±0.36~3.93±0.71 점) 에대한유의적인차이를나타내지않았다 (p = 0.063). Flavor 평가는대조구가 3.35±1.51점인것에비하여 0.5% 돌나물즙첨가구는 3.46±1.37 점, 1% 첨가구는 3.52±1.29 점, 2% 및 3% 첨가구는평균 3.53점의관능특성 을나타내어돌나물즙의첨가량이증가할수록젤리의 = 0.061). flavor 특성도증가하였다 (p 그러나보다유의적인결과를얻기위해서는돌나물즙의첨가량과 젤리 의 flavor 특성에대한기계적인분석이뒷받침되어야할것으로사료되었다. 관능검 사에서유의적인차이를나타낸항목은 Table 11 과같다. Table 11 에서와같이, hardness 는돌나물즙의첨가량이증가할수록관능특성이감소하였고, 이는젤리의 물성측정결과와일치하였다. 투명도 (transparency) 는대조구에비해돌나물즙의 첨가량 (~2%) 이증가할수록젤리에대한선호도 (appearance, palatability) 가증가하 였다. 외관, 색및전체적인맛에서는돌나물즙을 2% 첨가하였을때가장높은선 호도를나타내었다. 관능검사후, 패널간의토론과정에서돌나물즙의첨가량이증 가할수록쓴맛이증가하였다고지적하였다. 따라서돌나물즙을 3% 첨가한군에서 의 palatability 가감소한것은쓴맛이증가한때문으로사료되었다

143 Fig. 62. phs of jelly (sol state) treated with S. sarmentosum extracts. Table 10. Texture properties of jelly with various concentration of S. sarmentosum extracts. S. sarmentosum concentration, % (v/v) Control Hardness ±23.99 a ±18.83 a ±11.36 ab ±12.89 b ±20.52 c Gumminess 92.61±12.87 a 93.49±10.14 a 88.02±10.28 b 86.64±16.12 b 68.40±11.34 c Adhesiveness ± ± ± ± ±24.83 Springiness 0.981± ± ± ± ±0.274 Cohesiveness 0.449± ± ± ± ±0.042 Chewiness 91.25±33.27 a 98.79± ± ± ±21.25 Resilience 0.094± ± ± ± ±0.025 Different superscript letters in the same row show significant differences at p < 0.05 by 1-WAY ANOVA and Fisher's protected least-significant differences (LSD) test. Significant differences were not detected in adhesiveness, springness, cohesiveness, chewness, and resilience. Therefore, post-hoc tests were not performed in adhesiveness, springness, cohesiveness, chewness, and resilience. p values were 0.048, 0.038, 0.161, 0.139, 0.264, 0.246, and for hardness, gumminess, adhesiveness, springiness, cohesiveness, chewness, and resilience, respectively

144 Table 11. Sensory properties of jelly treated with S. sarmentosum extracts. S. sarmentosum concentration, % (v/v) Control Appearance 2.77±0.01 a 3.20±0.56 a 3.61±0.49 ac 4.57±0.23 b 4.17±0.08 bc Hardness 4.03±0.20 a 4.03±0.37 a 3.63±0.37 b 3.43±0.32 bc 3.40±0.41 bc Transparency 2.83±0.49 a 2.93±0.54 a 3.10±0.52 a 3.91±0.27 b 4.30±0.17 b Color 2.27±0.49 a 3.11±0.54 ac 3.50±0.52 bcd 4.61±0.27 b 4.27±0.17 bd Palatability 2.23±0.29 a 3.03±0.49 b 3.61±0.48 b 4.87±0.13 bc 4.63±0.26 bc Different superscript letters in the same row show significant differences at p < 0.05 by 1-WAY ANOVA and Fisher's protected least-significant differences (LSD) test, respectively. p values were 0.03, 0.05, 0.05, 0.01, and 0.01 for appearance, hardness, transparency, color, palatability, respectively. Fig. 63. Jellys with various concentration of S. sarmentosum juice

145 을 다. 지질대사및혈행개선물질의분리ㆍ동정과효과탐색및제품개발 1) 지질대사및혈행개선물질의분리ㆍ동정 돌나물추출물이지방세포의분화에미치는영향을측정하고자 MC3T3-L1 insulin을처리하여비만세포로유도할때돌나물추출물의효과를 oil red O staining 으로측정하였다 (Fig. 64). Fig. 64에서와같이돌나물추출물을투여한지 방세포에서의지방구크기는대조구에비하여유의적으로작았다. 따라서돌나물에 의해지방세포의크기가증가하지는않는것으로사료되었다 (Table 13). Fig. 65 및 Table 13에서와같이지방세포의성장을억제하는효과는 ethyl acetate 추출물이가장높았고, ethyl acetate 추출물의 subfraction 중에서는 subfraction E1 의효과가가장우수하였다. 따라서 ethyl acetate subfraction E1으로 부터지방세포성장을억제하는물질을순수분리하여동정하였다. Subfraction E1 은 10% H 2 SO 4 를분무하고가열시갈색으로발색되었다. band) FT-IR spectrum에서 3438 cm -1 (OH), 1648, 1524 (aromatic carbon, double 등의흡수대를나타내어방향족화합물인것으로사료되었다 67에서와같이본화합물은분자량 180 인것으로확인되었다. (Fig. 66). Fig. 1 H-NMR spectrum의 δ 7.04 ( 1 H, s), 6.97 ( 1 H, s) 및 6.77 ( 1 H, d) 에서나타 난 signal은 H-2와 H-6이 meta coupling 하고있는것으로사료되었고, H-6과 H-5 가 ortho coupling하고있는 3,4-dihydroxylation pattern 의구조로사료되었다. δ 7.43 ( 1 H, d) 과 6.15 ( 1 H, d) 의 singnal은 trans 형태의 alkene 수소로서 3,4- dihydroxycinnamic acid 계로추정되었다 (Fig. 68). 또한 13 C-NMR spectrum을 library의 data 비교하여각각의 signal이일치 하였으므로본화합물은 caffeic acid 인것으로최종동정하였다 (Figs. 69~70)

146 Fig. 64. Oil red O staining of adipocytes treated with S. sarmentosum extracts. A; control, B; ethyl acetate extract, D; butanol extract Table 13. Size of adipocytes treated with S. sarmentosum extracts. Control MeOH Hex EA BuOH p value ±41.39 a ±13.06 b ±11.88 b ±15.85 b ±29.17 b 0.001* *1-WAY ANOVA and LSD post-hoc test

147 Fig. 65. Relative inhibitory effects of S. sarmentosum extracts on the growth of adipocytes. A; methanol extract, B; hexane extract, C; ethyl acetate extract, D; butanol extract

148 Fig. 66. IR spectrum of subfraction E1 from ethyl acetate extract of S. sarmentosum. Fig. 67. GC-MS spectrum of subfraction E1 from ethyl acetate extract of S. sarmentosum

149 Fig H-NMR spectrum of subfraction E1 from ethyl acetate extract of S. sarmentosum. Fig C-NMR spectrum of subfraction E1 from ethyl acetate extract of S. sarmentosum. Fig. 70. Structure of caffeic acid

150 2) 돌나물및돌나물추출물이지질대사, 비만및혈행개선에미치는영향 지방전구세포에돌나물추출물을첨가하고지방세포로의분화를측정한결 과는 Fig. 71 과같다. Fig. 71에서와같이돌나물추출물의첨가는지방세포의분화 를억제하는것으로나타났다. 지방세포분화억제효과는돌나물추출물의양이늘 어날수록증가하였으나, ethyl acetate 추출물첨가구에서분화억제효과가가장높 았다. Ethyl acetate 추출물을첨가하여 MC3T3-L1 세포가지방세포로분화되는것 을 50% 억제시키는농도 (IC 50 ) 는 μg/ml 이었다. Adopogenesis는 myocytes, osteoblasts 또는 adipocytes를형성할수있는 mesenchymal stem cells에서시작하는 multistage process 이다. Pluripotent mesen chymal stem cell의운명을결정짓는요인으로 BMP 가관여한다고알려져있으며, 이는어떠한수용체와결합을하느냐에따라지방세포로분화하기도하고골세포로 분화하기도한다. 지방전구세포 (preadipocyte) 가지방세포 (adipocyte) 로분화하는데에는여 러가지전사인자들이작용을하는것으로알려져있으며이에대한연구는많이진 행되어왔다. 지방전구세포가분비하는 IGF-I, Glucocorticoid 와같은 adipogenic inducers들에의해분화가유도되면분화초기전사인자로 C/EBP beta와 C/EBP delta가발현되고이는 cascade 반응으로 C/EBP alpha와 PPAR gamma를발현시 킨다. 이두전사인자는지방세포분화를이끄는주된전사인자로서서로가서로의 발현을증가시키게되고이렇게과량발현된 C/EBP alpha와 PPAR gamma 는 ap2나 adiponectin과같은 adipocyte specific genes을발현시켜형태학적으로나세포 의기능적으로변화되어진 adipocyte 를형성하게된다. PPAR는 nuclear receptor superfamily에속하는 member로 alpha, beta(delta 로도불림), gamma 등 3 isotype 이있다. PPAR는 endogeneous ligand인 fatty acid와그 derivatives에의해활성화되며 lipid와 glucose 대사에관여하는 pathway의 transcriptional regulation 에관여한다. 이 3 isotype은 lipid 대사의대체 적인작용에있어서는서로유사한점이많으나나름대로의특이한역할을한다. 즉 PPARα는 fatty-acid catabolism (beta-oxidation of fatty acid) 을촉진하 고, gluconeogenesis와 ketone body 생성을촉진한다. PPARγ는 adipocyte 분화, white adipose tissue 내에지방의저장, brown adipose tissue 내에서에너지산화 (dissipation) 등의중요한역할을담당한다

151 PPAR δ의지방대사에서의역할은아직연구중에있으며, 오히려세포의증 식, 분화및생존에깊이관여하여 carcinogenesis와관련이깊은것으로알려져있 다. 이중 PPAR α가지방대사와가장밀접하게관련되어있다. PPARα는대사작용 이활발하게일어나는조직들, 즉, 간, 심장, 신장, 골격근, brown fat 등에분포하며, PPARα인 fibrate (fenofibrate, clofibrate gemfibrozil) 는혈중 triglyceride 을낮추고, HDL 을높이며, LDL 도다소낮추는약리작용을한다. 또한 LXRα을자극하여 ABCA1, ABCG1, ABCG5, ABCG8을활성화시켜콜레스테롤 efflux 를촉진한다. 한편콜레스테롤이동의 acceptor 로작용하며, HDL-cholesterol의주성분인 apoa-i, apoa-ii의생성을간에서촉진하며간내 free cholesterol의 cholesterol ester 생성에관여하는 ACAT (acyl-coa:cholesterol acyltransferase) 를억제한다. PPARγ는 macrophage, fibroblast, lymphocyte, dendritic cell, 지방세포등에서주로 발현되며, 상피세포로는대장에서나타나는것으로알려져있다. triglyceride, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol에작용은 PPARα에비해다소약하나 LXR α, ABCA1 등의 receptor 에미치는영향은유사한것으로알려져있다. 따라서지방전구세포에돌나물추출물을처리하였을때의유전자들의발현 양을측정하였다. Fig. 72 에서와같이돌나물추출물 (50 μg/ml) 을처리하였을때, PPAR-gamma 의발현이감소하였음을알수있었다. 즉, butanol 처리구에서는 PPAR-gamma 의발현이감소하였고, ethyl acetate 처리구에서는거의발현하지않 은것으로나타났다. 이러한경향은 C/EBP-alpha 및 ap2 발현을측정한것에서도 유사하였다. 돌나물추출물의처리농도가 50 μg/ml 인것을고려하면, ethyl acetate 처리구는지방전구세포가지방세포로전혀분화되지않았던것임을알수있었다. 백서에 Table 14와같이콜레스테롤식이를급여하여비만및고지혈증을 유발하였다. 돌나물의동결건조한분말을 1.5~4.5% 첨가하여돌나물이비만및고지 혈증에미치는영향을측정하였다 (Fig. 73). Fig. 73에서와같이돌나물건조분말을 공급받은실험구에서의체중증가량은대조구와유의적인차이를나타내었다 (p = 0.001). 고지방식에의해대조구의체중증가량은매우놓았던반면, 돌나물분말공 급실험구에서는돌나물분말급여량이많을수록체중증가량이감소하였다

152 Fig. 71. Inhibitory effects of S. sarmentosum extracts on the propagation of adipocyte, MC3T3-L1. Preadipocyte was propagated with insulin, inhibitory tests were performed MTT assay and oil red-o staining. Fig. 72. Adipogenesis related gene expression in MC3T3-L1 treated with S. sarmentosum extracts. C; control, M; methanol extract, H; hexane extract, B; butanol extract, E; ethyl acetate extract. All cells were incubated with 50 μg/ml of extracts for 48 hrs after insulin treatments

153 Table 14. Experimental groups and compositions of basal and experimental diet. (g/kg diet) Ingredients Control Experimental group Casein DL methionine 3 3 Corn starch Sucrose Cellulose powder Mineral mixture Vitamine mixture Choline bitartarate 2 2 Lard Cholesterol Sodium cholate S. sarmentosum extract* *Lyophilized S. sarmentosum powder (1.5~4.5%) was used in this study. 돌나물분말실험구에서체중증가량이적었던것이식이섭취량감소에따 른것인지를측정하기위하여식이섭취량을조사하였다 (Fig. 73B). Fig. 73B에서와 같이대조구및돌나물실험구에서의식이섭취량에는유의적인차이가관측되지않 았고, 오히려돌나물실험구에서의식이섭취량이약간높은것으로나타났다 (p = 0.648). 일반적으로 40% 정도의고지방식을백서에공급하면다량의지방첨가로인 하여백서의식이섭취량이감소하는것으로알려져있다. 그러나돌나물분말을같 이공급함으로써고지방투여로인한식이량감소를완화시킨것으로사료되었다. 식이섭취량과체중증가량의상관성을알아보기위하여 food efficiency ratio (FER) 를측정한결과는 Fig. 73C 와같다. Fig. 73C에서와같이돌나물실험구에서의 FER 은돌나물분말의공급양이많을수록감소하였으나대조구에서의표준편차가매 우심하여대조구와돌나물실험구간에통계적으로유의한차이를나타내지않았다 (p = 0.153). 그러나돌나물실험구에서는식이섭취량이대조구보다많았음에도체중 이증가되지않았고, 이러한이유로 FER 도대조구보다낮았다

154 Fig. 73. Administered effects of S. sarmentosum powder on the increase of body weight, food intake, and FER in high fat diet rats for 4 weeks. A; gained body weight, B; food intake per a day, C; food efficiency ratio. C; control, L; 1.5 g/kg/day powder, M; 3.0 g/kg/day powder, H; 4.5 g/kg/day powder of S. sarmentosum

155 고지방식과돌나물급여가체중에미치는영향을좀더자세히관측한결과 는 Fig. 74 와같다. Fig. 74에서와같이실험시작시의체중은실험구간에유의적 인차이를나타내지않았다. 그러나 4주간의고지방식으로대조구의체중이실험개 시때보다약 2배정도증가된반면에돌나물급여구에서는대조구보다유의적으로 낮은체중을나타내었다 (p = 0.002). 이러한경향은돌나물분말의섭취량이많을수 록체중의증가폭이낮았다. 이는전술한바와같이돌나물급여가 FER을낮추기 때문인것으로사료되었다. Fig. 74. Effects of S. sarmentosum powder on changes of body weight in high fat diet rats for 4 weeks. C; control, L; 1.5 g/kg/day powder, M; 3.0 g/kg/day powder, H; 4.5 g/kg/day powder of S. sarmentosum. 실험종료시백서를희생하여고지방식과돌나물급여가혈중지질조성에 미치는영향을측정하였다 (Figs. 75~76). Fig. 75에서와같이대조구는고지방식의 급여로인하여 total cholesterol, TG 및 LDL 농도가돌나물실험구보다유의적으로 높았다. 반면에돌나물실험구에서는고지방식을실시하였음에도불구하고대조구보 다높은 HDL 농도를나타내었다. TG 및 LDL 농도를감소시키고, HDL의농도를

156 Fig. 75. Effects of S. sarmentosum powder on the blood lipid composition in high fat diet rats for 4 weeks. C; control, L; 1.5 g/kg/day powder, M; 3.0 g/kg/day powder, H; 4.5 g/kg/day powder of S. sarmentosum

157 증가시키는효과는돌나물의건강기능성을크게향상시키는것으로사료되었다. 특 히 Fig. 76 에서와같이동맥경화지수 (AI) 가대조구의경우정상적인수치보다 2배 이상증가된반면에고농도의돌나물섭취구에서는고지방식을실시하였음에도 AI 가정상적인수치를나타내었다. 따라서돌나물의섭취는고지방식으로유도되는고 지혈증및이와관련된만성질병들인고혈압, 동맥경화증및당뇨병의발생을억제 시킬수있을것으로사료되었다. Fig. 76. Effects of S. sarmentosum powder on HTR and AI in high fat diet rats for 4 weeks. C; control, L; 1.5 g/kg/day powder, M; 3.0 g/kg/day powder, H; 4.5 g/kg/day powder of S. sarmentosum. HTR; HDL cholesterol/ Total cholesterol, AI (Atherosclerosis index); (total cholesterol HDL cholesterol)/hdl cholesterol

158 Fig. 77. Effects of S. sarmentosum powder on activity of lecithin cholesterol acyltransferase (LCAT) in serum of hyperlipidemic rats fed the experimental diets for 4 weeks. C; control, L; 1.5 g/kg/day powder, M; 3.0 g/kg/day powder, H; 4.5 g/kg/day powder of S. sarmentosum. Fig. 78. Effects of S. sarmentosum powder on lactate dehydrogenase (LDH) activity in serum of hyperlipidemic rats fed the experimental diets for 4 weeks. C; control, L; 1.5 g/kg/day powder, M; 3.0 g/kg/day powder, H; 4.5 g/kg/day powder of S. sarmentosum

159 Fig. 79. Effects of S. sarmentosum powder on alkaline phosphatase (ALP) activity in serum of hyperlipidemic rats fed the experimental diets for 4 weeks. C; control, L; 1.5 g/kg/day powder, M; 3.0 g/kg/day powder, H; 4.5 g/kg/day powder of S. sarmentosum. 고지방식과돌나물분말을투여한백서의혈액내단백질변화를측정한결 과는 Figs. 77~79 와같다. Figs. 77에서와같이돌나물분말을고지방식과같이급여 함으로써 LCAT 활성이증가됨을알수있었다. 간과소장에서합성되는 HDL은 apoe, apoc, 인지질로구성되며, 유리콜레스테롤의대부분은 lecithin: cholesterol acyltransferase (LCAT) 에의해에스테르화된다. LCAT는간에서기원되는효소이 지만혈장에서작용한다. LCAT의기질로는 HDL3 가알려져왔는데, 이는인지질의 함량이높아서유리콜레스테롤의효과적인수용체로서역할을할수있고, apoa-i 이 LCAT에의한에스테르화를촉진시켜주로 esterified cholesterol을함유하는 mature HDL2 입자로변화되어간으로이동되어 SR-BI수용체를통해간에흡수되 어완전분해되든지 hepatic lipase에의해 HDL2의중성지방과인지질을가수분해함 으로써 HDL2를 HDL3 로전환되어재활용되기도한다. VLDL과 LDL의유리콜레스 테롤도 LCAT 의기질이될수있다. LCAT는중성지방이풍부한물질의분해에도 역할을하는데, 이는지단백의안쪽지질은 triglyceride lipases의작용에의해서감

160 소되는동안 LCAT가표면에서유리콜레스테롤과 lecithin을동량제거함으로써일 어난다. Fig. 77에서와같이돌나물의급여로인해증가된 LCAT 활성화에의해돌 나물처리구에서의 TG 및 total cholesterol 농도가대조구보다낮았던것으로사료 되었다. Fig. 78은 lactated dehydrogenase (LDH) 활성을측정한결과이다. LDH는 체내의당이분해되어에너지로변할때작용하는효소의하나로, 여러조직세포 중에함유되어있으므로세포가파괴되면혈중 LDH 농도는증가하게된다. 혈중 LDH 는악성종양, 간질환, 심장질환, 혈액질환등에서고활성을보이는경우가많으 므로이들질환을스크리닝하는데유용한항목으로이용되고있다. Fig. 78에서와 같이고지방식으로인해혈청내의 LDH가증가되었으므로다량의고지방식으로인 해간세포가손상된것으로사료되었다. 반면에돌나물분말투여구에서는대조구보 다상대적으로낮은 LDH 활성을나타내었다. 따라서돌나물투여는고지방식으로 인해유발되는간손상을억제시키는것으로사료되었다. 이상의결과로부터고지방식으로인해간손상이유발된것으로추정하여비 알콜성지방간의혈액지표인 alkaline phosphatase (ALP) 활성을측정한결과는 79 와같다. Fig. 79에서와같이대조구에서의 ALP 활성이매우증가된것이확인되 었다. 따라서예측했던바와같이대조구에서는고지방식으로인하여지방간이진 행되고있음을알수있었다. 또한간조직내의지방양을측정한결과도이를뒷받 침해주고있다 (Table 15). 대조구간조직의총지질양, total cholesterol 및 TG의농 도가돌나물분말투여구보다매우높은것으로나타났다. 그러나돌나물분말투여 구에서의간조직에축적된지방양및혈청의 ALP Fig. 농도는대조구보다상대적으로낮 았고, 이러한결과로부터돌나물이비알콜성지방간을예방하는효과가있을것으로 사료되었다. 비알콜성지방간질환은우리나라에서비만환자및대사증후군환자가 증가하면서그유병률도꾸준히증가하고있는추세로보고되고있다. 따라서돌나 물의섭취를증가시킴으로써간기능을보호할수있을것으로사료되었다

161 Table 15. Liver total lipid, total cholesterol and triglyceride in rats fed experimentat diets. (mg/g) Group Total lipid Total cholesterol Triglyceride C ± ± ±3.15 L ± ± ±5.12 M 97.81± ± ±1.65 H 92.43± ± ±3.19 C; control, L; 1.5 g/kg/day powder, M; 3.0 g/kg/day powder, H; 4.5 g/kg/day powder of S. sarmentosum. PMA로자극시킨 HL 60 세포를이용하여돌나물분획에대하여 ICAM 1/LFA 1 매개성세포접착저해활성을조사하였다. Fig. 80 에서와같이, 무처 리구의 HL 60 세포는 48 시간후아무런형태적변화가관찰되지않았으나(Fig. 80D), 최종농도 25 nm PMA를처리한실험군에서는완전한 homotypic aggregation 이관찰되었다 (Fig. 80A). 25 nm PMA와함께 anti ICAM 1 mab (25 ng/ml) 를 처리한실험군에서는세포응집이완전히저해됨을관찰할수있었다 (Fig. 80B). 결과는 HL 60 세포의 homotypic aggregation이 ICAM 1/LFA 1 매개성임을나타내 고있으며, 돌나물추출물이세포접합인자의활성을저해하는것으로사료되었다. 지질대사에관여하는 apo A I, Lp(a), CETP 활성을측정한결과는 이 Table 16 과같다. Table 16 에서와같이대조구 ( 고지방식급여) 에비하여돌나물분말투여 구에서현저히낮은수치를나타내었다. 따라서돌나물분말은고지방식으로유도된 비정상적인지질대사를정상수준으로회복시킬수있을것으로사료되었다

162 Fig. 80. PMA induced ICAM 1/LFA 1 mediated aggregation of HL 60 cells. A; stimulated after 48 hours with 25 nm PMA, B; the presence of 25 ng/ml anti ICAM 1 mab, C; ethyl acetate extract of S. sarmentosum, D; control

163 Table 16. Plasma apo A I, Lp(a) concentrations and CETP activities of deer antler extracts treated groups. Group Apo A I (g/l) Lp(a) (mg/dl) CETP (%CE transfer) C 1.71± ± ±1.86 L 1.52± ± ±2.76 M 1.49± ± ±3.55 H 1.31± ± ±2.11 Lp(a); lipoprotein a, CETP; cholesteryl ester transfer protein, C; control, L; 1.5 g/kg/day powder, M; 3.0 g/kg/day powder, H; 4.5 g/kg/day powder of S. sarmentosum. Lipoxygenase (LPO) 는 non-heme을함유한 dioxygenase로불포화지방산에 산소를도입시켜 hydroperoxy acid 를생성하는효소이다. 동물생체중의 LPO는혈 소판또는백혈구내에존재하는 arachidonic acid 를산화시킨다. 혈소판의 12-LPO 는세포활성화에관여하는 12-hydroperoxyeicosatetraenoic acid 의형성에, 백혈구 내에존재하는 5-LPO 는천식, 알레르기, 염증등의매개체인 leukotriene 의형성에, 15-LPO는 5-LPO 존재하에새로운매개체인 lipoxin의형성에각각관여하는효소 이다. 따라서 LPO 의활성증가는세포염증을촉진시키는것으로보고되고있다. Fig. 81에서와같이돌나물추출물은 LPO와의반응시간이증가하면서 LPO 활성을 억제하는효과가증가하였다. 따라서돌나물은 LPO 활성을억제하는효과가있는 것으로나타났고, 돌나물에의해혈행을개선시키고세포의염증반응을억제하는 효과가있는것으로추정되었다. 그러나기존에보고되어있는 LPO 억제제보다는 돌나물이 LPO 를저해하는효과는크지않은것으로나타났다

164 Fig. 81. Relative inhibitory effects of S. sarmentosum extracts on the lipoxygenase activity. MeOH; methanol extracts, Hex; hexane extract, EA; ethyl acetate extract, BuOH; butanol extract

165 3) 지질대사및혈행개선기능이강화된제품의개발 돌나물분말이고지방식으로유도된비만/ 고지혈증/ 비알콜성지방간질환에 대한효과가우수하였으므로돌나물분말을이용하여돌나물차를개발하였다 (Fig. 82). Fig. 82. Sedum Tea, the product using S. sarmentosum powder

166 4. 결 론 가. 돌나물의간기능개선및간암억제물질의분리ㆍ동정과효과탐색및제품개발 Ethyl acetate 추출물로부터간기능개선및간암억제화합물은 tetrahydroxyflavonol (quercetin) 인것으로동정되었다. 사염화탄소를백서에경구투 여급성간독성을유발한결과, 돌나물의 methanol, hexane, ethyl acetate, butanol 추출물은 silymarin (control) 보다체중당간중량의증가폭이유의적으로낮았다. GOT (Glutamate oxaloacetate transaminase, AST; Aspartate aminotransferase), GPT (Glutamate pyruvate transaminase, ALT; Alanine aminotransferase) 활성에서 도 methanol 추출물을제외한 hexane, ethyl acetate, butanol 추출물이 silymarine 투여군에비하여보호효과가높았다. 돌나물의 methanol, hexane, ethyl acetate, butanol 추출물은사염화탄소로인한간손상을재생시키는데효과적이었으며, 특히 methanol 추출물을투여한백서의간조직에서는세포의괴사가관찰되지않아그만 큼세포재생속도가빨라져, 양성대조물질인 silymarine 보다우수하였다. 돌나물의 methanol, hexane, ethyl acetate, butanol 추출물은 ethionine 및 ethanol에의한지방 간유도를유의적으로억제하였고, 특히 hexane 및 ethyl acetate 추출물의지방간 억제효과가매우우수하였다. 인간간암세포주인 HepG2 세포의성장에미치는돌나물추출물의 IC 50 은 ethyl acetate μg/ml, hexane μg/ml, methanol 1.3 mg/ml, butanol 1.9 mg/ml으로 ethyl acetate 추출물의간암세포성장억제효과가가장우수하였다. HepG2 세포에돌나물의 ethyl acetate 추출물을처리한후, 72시간배양시에는거의 모든세포 (92.75%) 가 apoptosis를거쳐괴사되었거나또는 necrosis 과정으로이행 되었다. 돌나물즙및각각의돌나물추출물과 ethanol을백서에경구투여한후경 시적으로혈액을채취하여혈액내의 ethanol 농도를측정한결과, 알콜투여후 2시 간이지났을때에는대조구보다약 2.3배정도낮은혈중 ethanol 농도를나타내어 돌나물즙의 ethanol 을분해하는효과가용매추출물보다우수하였다. Ethanol을투 여한백서에돌나물의 methanol 및 butanol 추출물은 ADH 및 ALDH 효소활성을 유의적으로증가시켰으며, methanol 추출물은알콜투여후 2 시간후에, butanol 추 출물은 3시간후에혈중 ethanol 농도를감소시키는효과가우수하였다. 백서에 ethanol 경구투여전에돌나물즙과추출물을투여한후혈중 acetaldehyde 농도를 경시적으로측정한결과, 돌나물추출물투여구에서는 1시간경과시혈중 acetaldehyde의농도가대조구의약 50% 였으며, 시간이경과하면서빠르게감소하

167 였다. 돌나물즙투여구에서는 ethanol 투여 4시간경과후에는혈중 acetaldehyde가 대부분감소하였다. 인체에서도알콜섭취전에돌나물즙과추출물의섭취는혈중 ethanol 및 acetaldehyde 의농도를유의적으로감소시켰다. 이에따라돌나물추출물을주원료로하여숙취해소효과가있는것으로 알려진청피, 홍삼박, 당귀및상황쌀을첨가하여돌나물숙취해소음료를제조하였 으며, 특허출원중에있다. 나. 돌나물의항산화및면역활성물질의분리ㆍ동정과효과탐색및제품개발 돌나물의 DPPH radical scavenging 효과를측정한결과, ethyl acetate 추출 물의 subfraction E4 의항산화활성이가장우수하였으며, 항산화활성이가장높은 물질은 quercetin 으로동정되었다. ethyl acetate 추출물 subfraction 5의면역활성이 가장우수하였다. 돌나물의면역활성은 ethyl acetate 추출물 subfraction 5에서가장 우수하였으며, 이물질은 coumarin 계의 esculetin 인것으로확인되었다. 백서에돌나물추출물을 4주간섭취시킨후희생하여간조직및혈액을채 취하여효소활성도를측정한결과, 돌나물추출물투여구에서양성대조구인 tocopherol 또는 ascorbic acid 와유사하거나보다더우수한항산화능을나타내었다. 특히돌나물 methanol 및 ethyl acetate 추출물에서 polyphenol 함량이높게나타났 으며, 이는 methanol 추출물투여구가전반적으로높은항산화능을나타낸것과일 치하였다. 대식세포인 RAW cell lines에 LPS (lipopolysaccharide) 또는돌나물 용매추출분획을첨가하고 2일간배양한후에생성된 nitric oxide의양을측정한 결과, LPS 농도가 0.1 μg/ml 일때, methanol, hexane 및 ethyl acetate 추출물에의 해생성되는 nitric oxide 의양이감소되었다. 또한 LPS 처리에의해발현되는 inos 단 백질은돌나물추출물에의해그생성양이감소되는것을 Western blotting 으로확인하였다. 백서에고지방식을급여한후돌나물추출물처리에의해변화된단백질의 발현양상은항산화와관련된 glutathione peroxidase, glutathione reductase의발현 이증가되었고, 면역기능과관련된단백질중에서는 COX2 의발현이증가되었다. 돌나물즙(juice) 에당과겔화제를혼합하여농축, 성형하여젤리를제조하 였으며, 돌나물젤리에는돌나물즙(juice) 의참가농도에따라칼슘, 철분, 칼륨, ascorbic acid 및유기산등의함량이증가되었다. 또한식이선호도는돌나물즙 (juice) 을첨가할경우가장높았으며, 녹즙으로이용할경우돌나물소비를촉진할 수있을것으로기대되었다

168 다. 지질대사및혈행개선물질의분리ㆍ동정과효과탐색및제품개발 돌나물추출물의지방세포의성장을억제하는효과는 ethyl acetate subfraction E1 의효과가가장우수하였으며, 지방세포성장을억제하는물질을순 수분리한결과, caffeic acid 인것으로동정되었다. 돌나물의 ethyl acetate 추출물을첨가하여지방전구세포 MC3T3-L1이지방 세포로분화되는것을 50% 억제시키는농도 (IC 50 ) 는 μg/ml 이었다. 유전자들 의발현양을측정한결과, PPAR-gamma는 ethyl acetate 추출물을첨가시거의발 현되지않았다. 백서에콜레스테롤식이에돌나물의동결건조한분말 1.5~4.5% 첨가 할경우, 돌나물분말급여량이많을수록식이섭취량이대조구보다많았음에도체중 증가량이크게감소하였다. 돌나물분말투여구에서 total cholesterol, TG 및 LDL 농도및동맥경화지수 (AI) 가대조구보다유의하게감소하였고, 간조직에축적된지 방양및혈청의 ALP 농도도대조구보다상대적으로낮았다. 따라서돌나물의섭취 는고지방식으로유도되는비알콜성지방간을예방하는효과가있고, 고지혈증과이 와관련된고혈압, 동맥경화증, 당뇨병등의발생을억제시킬수있을것으로기대되 었다. 돌나물추출물은 Lipoxygenase (LPO) 와의반응시간이증가하면서 LPO 활성 을억제하여혈행을개선시키고세포의염증반응을억제하는효과가있으나, 기존 에보고되어있는 LPO 억제제보다는효과가높지않았다. 돌나물분말이고지방식으로유도된비만, 고지혈증, 비알콜성지방간질환에 대한효과가우수하였으므로돌나물분말을이용하여돌나물차를개발하였다

169 제 3 절돌나물의성분분석및건강기능성돌나물제품의 안전성및안정성평가 1. 서 언 돌나물 (Sedum sarmentosum Bunge) 은돌나물과에속하는다년생초본으로 비타민 C 와칼슘함량이높아식품재료로서의가치가높을뿐만아니라, 약리효과 가뛰어나다. 한방에서는석상채( 石上採 ), 수분초( 垂盆草 ), 불갑초( 佛甲草 ), 석련화( 石 蓮花 ) 등으로불리고, 청열소종의효능이있어인후염과만성간염의치료에이용되 며, 해독작용도뛰어나독충이나해충에물렸을때환부에붙이기도한다. 민간에서 약리효과가있다고알려져있는데, 최근돌나물추출물의항암효과및간염, HIV에 도효과적이라는연구가국내외적으로활발하게이루어지고있다(He 등, 1998; Park 등, 2002; Woo 등, 1997; 김등, 2004). 이러한기능성식품에는비타민 A, C, E, flavonoids, anthocyanins, carotenoids, tanic acid 등의항산화물질이풍부하게들어있어활성산소가생기는 것을막고노화를억제시키거나, 각종암및질병을예방하는데도움이된다 (Cameron 등, 1979; Sen, 1955). 최근이러한기능성물질이많이함유된식품재료를 이용하여기능성식품으로개발하여산업화하려는연구가많이이루어지고있다. 돌 나물은독특한맛과향을가지면서항산화활성및생리활성효과가높을뿐만아니라, 우리 나라에서는어느지역에서나생산이가능한건강야채로서건강음료재료로서도적합하지 만( 김등, 2002), 이를산업화하려는적극적연구는미흡한실정이다. 이에따라돌나 물의무기성분, 기능성영양성분및향기성분분석과항산화활성및생리활성등을다각도 로검정하여기능성식품으로개발할필요가있다. 따라서본연구는돌나물을재료로음료, 젤리, 차등의제품개발에영향을 미치는돌나물체내의수분과회분, 환원당및비타민 A, C 를정량하고조지방, 조 단백의함량측정과향기및향미성분분석등을수행하고, 개발된돌나물제품에서 급성및아급성독성과유전독성, 세포독성시험과세포막안정화시험및간독성지 표효소의활성도, 아급성독성시험후의조직검사등을수행하고자한다. 또한생 산된제품의성상, 중량( 용량) 편차, 확인시험, 함량시험, 보존제시험, 미생물오염시 험, 중금속시험및 ph, 알코올도수등을분석하고자한다

170 2. 연구방법 가. 돌나물의주요성분분석 1) 돌나물의수분및무기성분분석 가) 수분및회분정량 수분함량은적외선수분측정기를이용하여측정하였다. 회분정량은 1g의 돌나물시료를항량을구한도가니에넣고 550 에서 4시간동안회화한후 200 로 온도가내려가면데시케이터에서방냉한후평량하였다. 항량이될때까지회화, 방 냉, 평량을반복하여함량을구하였다. 나) 무기성분분석 시료 1g에질산 20ml 을비이커에넣고서서히가열하여, 갈색증기의발생이 끝나고비이커속의액이 5ml 정도되면 c-hclo 4 를 20ml 가하여무색이될때까지 가열하여냉각시킨후초순수로비이커의분해액을씻어 100ml로정용하여여과한 후유도플라즈마원자방출분공법 (ICP-AES: Optima 3300DV, Perkin-Elmer Instruments, USA) 로분석하여무기성분을정량하였다. 2) 돌나물의영양성분분석 가) 조지방 -soxhlet 추출장치이용 분말시료 2g을원통여지에넣고탈지면으로입구를막아 105 에서 2시간 건조시켜데시케이터에서방냉시킨후 soxhlet 추출관에넣고수기에 2/3정도의 ether를넣고 65 에서 8 시간가열추출하였다. 추출후 soxhlet관을분리하여원통 여지를꺼내고 ether를수기에모두회수하여 evaporator 에서감압농축한후. 105 오븐에서 1시간건조한후데시케이터에서방냉하여수기의항량이도달할때까지 반복하여조지방의항량을구하였다. 나) 조단백 - michro Kjeldahl 장치이용 분말시료 1g, 분해촉매제(K 2SO 4 : CuSO 45H 2O 9:1) 2g, 황산 20ml을켈달플 라스크에넣고 500 에서 3시간동안분해한후증류수로희석하여 250ml로정용하 여시료분해액으로사용하였다. 30% NaOH와시료분해액 10ml을넣고증류하여 0.1N H 2SO 4 용액에암모니아가스를포집한후잔존하는황산을 0.1N NaOH로적정 하여조단백질양을구하였다

171 다) 환원당정량 환원당에의해 DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) 가환원되어생성된 3-amino- 5-nitrosalicylic acid 의흡광도를측정하여당을정량하였다. 시료용액 1ml에 DNS시 약 2ml을넣고 10분간끓인후냉각하여 550nm 에서흡광도를측정하였다. 시료의 당농도는 0.2% glucose 표준용액 standard 곡선에서계산하였다. 라) 비타민 A 정량 돌나물분말시료 1g을검화플라스크에넣고 50% KOH 3ml과 20ml의 ethyl alcohol을넣고 80 항온수조에서 30분간환류냉각하여검화시킨후즉시찬물로 냉각한후분액깔대기에옮겨벤젠 100ml을가하여강하게진탕한후 1N KOH 용 액 100ml 을넣고다시한번진탕한후물층을버렸다. 계속해서 0.5N KOH를넣고 페놀프탈렌지시약으로홍색이나타나지않을때까지진탕하여물층을버린다. 분액 깔대기의벤젠층을탈수시킨후소량의 ascorbic acid를넣어산화를방지하고 50ml 의벤젠층을취해진공농축하여클로로포름 1ml 에녹여시료용액으로하였다. 클로 로포름을 blank로하고시료용액 0.3ml, 클로로포름 0.3ml을 tube에넣고클로로포름 에녹인삼염화안티몬 2ml을넣어혼합한후바로 620nm에서흡광도를측정하였 다. 마) 비타민 C정량 산화형비타민C는 DNP용액과작용하여정량적으로적색의 osazone을형성 한다. 이것에황산용액을가해정색이되는것을이용하여비타민 C 를정량하였다. 돌나물분말시료 5g을막자사발에넣고 4ml의 5% 메타인산과적당량의해사를넣 고잘마쇄하여 5ml 의물을넣고원심분리한후상층액을시료용액으로하였다. 3개 의시험관에시료용액 2ml 을넣고(a. 총비타민 C 용,b. dehydroascrobic acid 용, c. 맹검 용) thiourea용액 2ml 을가하였다. a, b의시험관에 DNP 용액을각각 1ml씩넣고 3 7 에서 3시간반응한후얼음물속에넣고 85% 황산을 5ml씩넣고 c의시험관에는 DNP 용액 1ml을넣은후실온에서 30분방치한후 540nm에서흡광도를측정하였 다. 총비타민 C 량(mg/100g)= C1 A S 량 dehydroascrobic acid (mg/100g)=c2 A S

172 환원형비타민 C 량 = 총비타민 C량 - dehydroascrobic acid량 C1 : 시험관 a의비타민 C량 C2 : 시험관 b의비타민 C량 A : 조제시료용액(ml), S : 시료채취량(g) 3) 돌나물의향기성분분석 돌나물의생체중을측정하고 diethyl ether로 3회추출하고이들 ether 추출 물을무수 Na 2SO 4 로탈수시키고다시 40 이하에서감압농축하여 vial에옮겨 1 ml 까지재농축하여 GC와 GC/MS 의분석시료로사용하였다. 나. 돌나물제품의안전성및안정성평가 1) 돌나물음료의안전성및안정성평가 돌나물숙취해소음료를시료로하여반복독성시험, 항돌연변이원성검정, 소화기세포에대한세포독성시험, hemolysis test, 동물실험을통한간독성유발시 험을식품조사기준에따라실시하였다. 또한실온에저장시 3 개월간제품의성상, 중 량편차, 증발잔류물, 성분확인, 품질특성에대한변화와대장균, 녹농균, 살모넬라균, 황색포도구균, 일반세균, 진균등의미생물오염을 1 개월간격으로조사하였다. 2) 돌나물젤리의안전성및안정성평가 돌나물젤리를시료로하여반복독성시험, 항돌연변이원성검정, 소화기세 포에대한세포독성시험, hemolysis test, 동물실험을통한간독성유발시험을식품 조사기준에따라실시하였다. 또한 4 냉장저장에따른제품의성상, 중량편차, 증 발잔류물, 성분확인, 품질특성에대한변화와대장균, 녹농균, 살모넬라균, 황색포도 구균, 일반세균, 진균등의미생물오염을 3, 7, 10 일째에조사하였다. 3) 돌나물차의안전성및안정성평가 돌나물차를시료로하여반복독성시험, 항돌연변이원성검정, 소화기세포 에대한세포독성시험, hemolysis test, 동물실험을통한간독성유발시험을식품조 사기준에따라실시하였다. 또한실온에저장시 6 개월간제품의성상, 중량편차, 증 발잔류물, 성분확인, 품질특성에대한변화와대장균, 녹농균, 살모넬라균, 황색포도 구균, 일반세균, 진균등의미생물오염을 2 개월간격으로조사하였다

173 3. 결과및고찰 가. 돌나물주요성분 1) 돌나물의수분및영양성분 채집지역및부위별돌나물의수분및영양성분을분석하였다 (Table 1). 수분함량은개화기보다영양생장기에높은경향을보였는데, 영양생장기에는 % 로수분함량이높았으며, 개화기에는 % 의범위를보였다. 조회분 과조지방은영양생장기에다소높았으나, 조단백질은차이를보이지않았다. 따라서 지역수집종간회분, 조지방, 조단백질함량간에유의적인차이는없었다. Table 1. Contents of water content, crude protein, crude fat, and crude ash between vegetative and flowering stage in local strains of S. sarmentosum. Local Water content crude ash crude fat crude protein Material strain (%) (%) (%) (%) Vegetative growth stage Wanju Stem 95.27± ± ± ±0.03 Gunsan Stem 97.01± ± ± ±0.18 Keumsan Stem 95.41± ± ± ±0.31 Bucheon Stem 93.15± ± ± ±0.01 Pocheon Stem 92.78± ± ± ±0.05 Wando Stem 98.93± ± ± ±0.01 Flowering stage Wanju* Stem 89.05± ± ± ±0.12 Gunsan* Stem 86.23± ± ± ±0.09 Keumm Bucheon Pocheon Wando Stem Flower stock Stem Flower stock Stem Flower stock Stem Flower stock * Non-flowering strains ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

174 또한돌나물을채집지역별로분리하여돌나물내에함유된무기이온의함 량을측정한결과는 Table 2 와같다. 각지역수집종마다무기이온의농도가다르 게함유되어있음을알수있었다. 금산( 꽃대), 군산( 줄기), 완도( 꽃대) 에서분석된칼 슘의농도가다른시료들보다매우높은것으로나타났다. 부천( 꽃대), 봉동( 줄기), 군산( 줄기) 의인의함량이높았고, 부천( 꽃대), 완도( 꽃대), 봉동( 줄기) 의나트륨함량 이높은것으로분석되었다. 철분함량은군산, 완도, 금산시료에서높게분석되었 고, 칼륨함량은완도, 부천, 군산시료에서높게나타났다. 나트륨과인은우리나라 식이에서부족하지않을뿐만아니라섭취량이많을경우다른영양소의흡수를방 해할수있으므로이들의함량이높다하여우수한계통이라고판단하기는어려웠다. Table 2. Contents of inorganic elements between vegetative and flowering stage in local strains of S. sarmentosum. Local Material strain Vegetative growth stage Inorganic elements (mg/100g edible portion) Ca P Fe Na K Wanju Stem 95.27± ± ± ± ±0.03 Gunsan Stem Keumsan Stem Bucheon Stem Pocheon Stem Wando Stem Flowering stage Wanju* Stem Gunsan* Stem Keumm Bucheon Wando Stem Flower stock Stem Flower stock Stem Flower stock Pocheon Stem * Non-flowering strains

175 그러나우리나라식이섭취조사에서전통적으로섭취량이부족한칼슘과철분의함 량이높은돌나물이우수한것으로생각되었다. 또한우리나라에서는나트륨의과잉 섭취가문제시되고있다. 대부분의영양학자들은나트륨을과잉섭취할수록칼륨의 섭취량도증가시킬것을권장하고있다. 따라서칼륨, 칼슘, 철분의함량이높은금 산( 꽃대), 완도, 군산시료가우수한계통인것으로사료되었다. 2) 돌나물의영양성분 돌나물의영양성분을분석한결과는 Table 3 과같다. 환원당함량은일반 시료와돌나물시료간에유의적인차이가나타나지않았다. Ascorbic acid 함량은 일반시료에비하여군산( 줄기) 시료의함량이높았고, beta-carotene 함량은일반 시료에비하여군산시료에서높게분석되었다. 이상의무기이온및영양성분을분 석한결과를종합하면여러지역에서채취한돌나물시료중 군산 시료가가장우 수한자원인것으로판단되었다. 3) 돌나물의향기성분 돌나물의향기성분을분석한 GC chromatogram은 Fig. 1 과같다. 총 16종의 향기성분이분리되었고, 이를 GC-MS 를통해동정하였다 (Table 4). 제품생산에영 향이있는풀냄새를내는것으로알려진방향성분들이다수동정되었고, pungent한 물질도 2 개가동정되었다. 돌나물의향기성분은대부분 pyrazine 및이들유도체인 것으로사료되었다. Fig. 1. Chromatogram of volatile compounds from S. sarmentosum

176 Table 3. Variation of nutritive contents between vegetative and flowering stage in local strains of S. sarmentosum. Local strain Material Reducing sugar (g/100g) Vitamin C (mg/100g) β-carotin (mg/100g) Vegetative growth stage Wanju Stem 1.14± ± ±21.7 Gunsan Stem 1.16± ± ±30.8 Keumsan Stem 1.16± ± ±29.3 Bucheon Stem 1.17± ± ±21.8 Pocheon Stem 1.14± ± ±26.1 Wando Stem 1.18± ± ±25.2 Flowering stage Wanju* Stem 1.12± ± ±46.6 Gunsan* Stem 1.17± ± ±24.8 Keumm Stem Flower stock 1.13± ± ± ± ± ±37.2 Bucheon Stem Flower stock 1.14± ± ± ± ± ±34.3 Pocheon Stem Flower stock 1.19± ± ± ± ± ±29.1 Wando Stem Flower stock 1.13± ± ± ± ± ±34.9 * Non-flowering strains

177 Table 4. Identified volatile compounds from S. sarmentosum. No. R.T. * Compounds Characteristics pentanol grassy green hexanol green, grass-like ethyl acetate ethereal, fruity, brandy-like odor Internal standard ** pyrazine pungent, greeny ethyl pyrazine greeny hexanal leafy ,3-Dimethyl-5-ethyl pyrazine green, beany ,6-Diethyl pyrazine green. bell pepper-like ethyl butyrate fruity, pineapple, banana, ethereal ethyl isovalerate fruity, apple on dilution odor hexenol grassy, leaf, metalic ethyl valerate fruity, apple odor hexyl butyrate fruity, heavy odor allyl-2-ethyl butyrate oily-fruity odor butyl benzothiazole medicinal, slight pungent 나. 간기능개선및간암억제작용이강화된돌나물제품( 숙취해소음료) 의 안전성및안정성평가 간기능강화및숙취해소음료를시료로하여제품의안전성평가를실시한 결과는 Tables 5-19 와같다. 반복독성시험, 항돌연변이원성검정, 소화기세포에대 한세포독성시험, hemolysis test, 동물실험을통한간독성유발시험을시행하였다. Tables 5-19 에서와같이시제품은모든안전성실험에서안전한것으로확인되었고, 동물실험종료후의조직검사에서도정상조직과다른점을발견할수없었다. 따라 서본연구에서개발된돌나물을이용한간기능강화및숙취해소음료의섭취는인 체에독성을유발하지않는안전한제품인것으로사료되었다. 또한 Table 20의안 정성평가에서실온에저장시 다. 3개월간제품의품질이변하지않는것으로사료되었

178 Table 5. Repeated toxicity test of S. sarmentosum extract adding beverage. Groups Negative control S. sarmentosum beverage Items Male(n=6) Female(n=6) Male(n=6) Female(n=6) Initial weight 201.0± ± ± ±10.21 Final weight 290.0± ± ± ±13.87 Weight gain 89.0± ± ± ±10.22 Mean food intake 26.3± ± ± ±1.79 Mean water intake 36.5± ± ± ±2.7 FER 0.24± ± ± ±0.01 Table 6. Repeated toxicity test of S. sarmentosum extract adding beverage (major organs). Group Negative control S. sarmentosum beverage Organs Male(n=6) Female(n=6) Male(n=6) Female(n=6) Liver 9.172± ± ± ±0.813 Spleen 0.719± ± ± ±0.019 Thyroid gland 0.017± ± ± ±0.006 Brain 1.626± ± ± ±0.027 Heart 1.053± ± ± ±0.073 Kidney L 1.063± ± ± ±0.029 R 1.162± ± ± ±0.085 Lung L 0.481± ± ± ±0.005 R 0.967± ± ± ±0.034 Adrenal L 0.024± ± ± ±0.005 Grand R 0.023± ± ± ±0.009 Testis/ L 1.733± ± ± ±0.011 Ovary R 1.728± ± ± ±

179 Table 7. Repeated toxicity test of S. sarmentosum extract adding beverage (urine). Group Negative control S. sarmentosum beverage Parameters Male(n=6) Female(n=6) Male(n=6) Female(n=6) Excretion 19.03± ± ± ±5.16 ph 8.5± ± ± ±0.21 Glucose( mg/ dl) 15.60± ± ± ±11.09 Protein( mg/day) 95.40± ± ± ±12.34 Blood Negative Negative Negative Negative Microscopy Negative Negative Negative Negative Ketone* 0.60± ± ± ±0.12 Bilirubin Negative Negative Negative Negative Nitrite Negative Negative Negative Negative Table 8. Repeated toxicity test of S. sarmentosum extract adding beverage (plasma). Group Negative control S. sarmentosum beverage Parameters Male(n=6) Female(n=6) Male(n=6) Female(n=6) Protein(g/ dl) 5.35± ± ± ±0.31 BUN( mg/ dl) 15.32± ± ± ±3.02 Glucose( mg/ dl) 120.5± ± ± ±9.15 Cholesterol( mg/ dl) 88.33± ± ± ±10.81 Bilirubin( mg/ dl) 0.10± ± ± ±0.03 Creatinine( mg/ dl) 0.50± ± ± ±0.01 Na(m mol/ l) ± ± ± ±1.05 K(m mol/ l) 41.50± ± ± ±5.42 Cl(m mol/ l) 95.83± ± ± ±

180 Table 9. Repeated toxicity test of S. sarmentosum extract adding beverage (EDTA-blood). Group Negative control S. sarmentosum beverage Parameters Male(n=6) Female(n=6) Male(n=6) Female(n=6) RBC(*10 3 mm 3 ) 7.09± ± ± ±0.28 WBC(*10 3 mm 3 ) 8.70± ± ± ±1.18 HCT(%) 50.00± ± ± ±0.85 Hb(g/ dl) 14.17± ± ± ±0.74 MCV(μ 3 ) 70.33± ± ± ±1.24 MCH( μg) 19.83± ± ± ±0.25 MCHC(g/ ml) 28.33± ± ± ±0.47 Platelet(*10 5 mm 3 ) 9.21± ± ± ±0.45 Reticulacyte(%) 5.73± ± ± ±0.45 Neutrophil Seg(%) 13.00± ± ± ±5.04 Lymphocyte(%) 79.67± ± ± ±3.59 Monocyte(%) 4.83± ± ± ±1.46 Eosinophil(%) 1.50± ± ± ±1.01 Table 10. Repeated toxicity test of S. sarmentosum extract. Groups Negative control S. sarmentosum extract Items Male(n=6) Female(n=6) Male(n=6) Female(n=6) Initial weight 203.0± ± ± ±10.49 Final weight 287.0± ± ± ±13.03 Weight gain 84.0± ± ± ±12.22 Mean food intake 27.3± ± ± ±1.69 Mean water intake 37.3± ± ± ±3.1 FER 0.33± ± ± ±

181 Table 11. Repeated toxicity test of S. sarmentosum extract (major organ). Group Negative control S. sarmentosum extract Organs Male(n=6) Female(n=6) Male(n=6) Female(n=6) Liver 9.387± ± ± ±0.774 Spleen 0.721± ± ± ±0.048 Thyroid gland 0.016± ± ± ±0.003 Brain 1.673± ± ± ±0.025 Heart 1.046± ± ± ±0.043 Kidney L R 1.053± ± ± ± ± ± ± ±0.099 Lung L R 0.485± ± ± ± ± ± ± ±0.041 Adrenal L 0.025± ± ± ±0.001 Grand R 0.024± ± ± ±0.002 Testis/ L 1.725± ± ± ±0.009 Ovary R 1.782± ± ± ±0.009 Table 12. Repeated toxicity test of S. sarmentosum extract (urine). Group Negative control S. sarmentosum extract Parameters Male(n=6) Female(n=6) Male(n=6) Female(n=6) Excretion 23.42± ± ± ±2.41 ph 8.5± ± ± ±0.27 Glucose( mg/ dl) 13.54± ± ± ±10.27 Protein( mg/day) 90.47± ± ± ±22.58 Blood Negative Negative Negative Negative Microscopy Negative Negative Negative Negative Ketone* 0.40± ± ± ±0.52 Bilirubin Negative Negative Negative Negative Nitrite Negative Negative Negative Negative

182 Table 13. Repeated toxicity test of S. sarmentosum extract (plasma). Group Negative control S. sarmentosum extract Parameters Male(n=6) Female(n=6) Male(n=6) Female(n=6) Protein(g/ dl) 5.25± ± ± ±0.18 BUN( mg/ dl) 15.98± ± ± ±3.56 Glucose( mg/ dl) 123.5± ± ± ±23.22 Cholesterol( mg/ dl) 89.35± ± ± ±14.76 Bilirubin( mg/ dl) 0.08± ± ± ±0.05 Creatinine( mg/ dl) 0.50± ± ± ±0.06 Na(m mol/ l) ± ± ± ±2.63 K(m mol/ l) 43.57± ± ± ±10.45 Cl(m mol/ l) 96.82± ± ± ±1.94 Table 14. Repeated toxicity test of S. sarmentosum extract (EDTA-blood). Group Negative control S. sarmentosum extract Parameters Male(n=6) Female(n=6) Male(n=6) Female(n=6) RBC(*10 3 mm 3 ) 7.14± ± ± ±0.35 WBC(*10 3 mm 3 ) 8.73± ± ± ±1.67 HCT(%) 49.76± ± ± ±2.31 Hb(g/ dl) 14.21± ± ± ±0.88 MCV(μ 3 ) 71.11± ± ± ±2.13 MCH( μg) 20.03± ± ± ±0.33 MCHC(g/ ml) 29.74± ± ± ±0.95 Platelet(*10 5 mm 3 ) 9.07± ± ± ±0.49 Reticulacyte(%) 5.68± ± ± ±1.97 Neutrophil Seg(%) 14.70± ± ± ±4.87 Lymphocyte(%) 80.24± ± ± ±5.38 Monocyte(%) 4.95± ± ± ±0.63 Eosinophil(%) 0.98± ± ± ±

183 Table 15. Antimutagenic test of S. sarmentosum extract. Sample H 2O Extract Extract P o s i t i v e control S9 mix Dose ( μg/plate) Number of revertant colonies per plate (mean±s.d.) TA98 TA100-24± ± ±2 114± ± ± ± ± ± ± ±5 153± ± ± ± ± ± ± ±0 143± ± ± ± ± ±69 a 772±97 b + 873±39 c 1408±82 c Positive control agents: a 4-Nitroquinoline-1-oxide(0.5 μg/plate), b Sodium azide(0.5 μg /plate), c 2-Aminoanthracene(0.4 μg/plate) Table 16. Cytotoxicity test of S. sarmentosum extract. Cell lines Liver Extract L; low concentration, H; High concentration, n=8. Intestine L control Table 17. Inhibition H effect of S. sarmentosum 100 extract on gastrointestinal 100 cancer MeOH L cell lines ± ±6.83 H 99.54± ±.2.87 Hex L 99.98± ±2.87 H 97.28± ±1.98 EA L 97.32± ±1.87 H 99.38± ±3.82 BuOH L 98.33± ±1.73 H 96.21± ±

184 Product Cell lines MKN-45 HT-29 control L I L I 28.59± ± ± ±.3.26 L I L I L I 39.99± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±1.32 MKN-45; human gastric cancer cell line, HT-29; human colon cancer cell line, L; live yeast cell diluted in phosphate buffered saline, I; inactivated at 95 for 30 min, n=8. Table 18. Hemolysis test of S. sarmentosum extract adding beverage. S. sarmentosum beverage 100% 50% Hemolysis ± ± The degree of hemolysis was obtained from standard curve (y = x , R 2 =0.9999)

185 Table 19. Hepatotoxicity test of S. sarmentosum extract adding beverage. Group Untreated control S. sarmentosum beverage Parameters Male(n=6) Female(n=6) Male(n=6) Female(n=6) GOT(U/ l) 73.17± ± ± ±8.69 GPT(U/ l) 41.50± ± ± ±17.26 ALP(U/ l) 1.17± ± ± ±0.55 Table 20. Stability of S. sarmentosum extract adding beverage. 시험항목제조초기 1개월후 2개월후 3개월후 연녹색, 황갈색, 제조 초기의제조 초기의제조초기의음 성상변화 흑갈색등돌나물음료색에추출액의색을화가없음 변음료색에 가없음 변화료색에 없음 변화가 띔 중량편차 130± ± ± ±2.5 증발잔류물 0.3± ± ± ±0.01 성분확인 TLC plate band 확인 대장균불검출불검출불검출불검출 녹농균불검출불검출불검출불검출 미생물 살모넬라균불검출불검출불검출불검출 오 염 황색포도구균불검출불검출불검출불검출 일반세균 2x10 2 / ml 3.2x10 2 / ml 3.5x10 2 / ml 3.3x10 2 / ml 진균 25/ ml 30/ ml 29/ ml 28/ ml

186 Fig. 2. Histology of S. sarmentosum extract treating rat