工學碩士學位請求論文 미백소재탐색을위한 SPR 기반의 MITF 와 E-box 결합저해제스크리닝을위한방법개발 Development of SPR Based Screening System for MITF-E-box Binding Inhibitor as Depigmenting

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예솔 조
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1 工學碩士學位請求論文 미백소재탐색을위한 SPR 기반의 MITF 와 E-box 결합저해제스크리닝을위한방법개발 Development of SPR Based Screening System for MITF-E-box Binding Inhibitor as Depigmenting Agent 2012 年 2 月仁荷大學校大學院生物工學科 ( 生物工學專攻 ) 孫萬基

2 工學碩士學位請求論文 미백소재탐색을위한 SPR 기반의 MITF 와 E-box 결합저해제스크리닝을위한방법개발 Development of SPR based screening system for MITF-E-box binding inhibitor as Depigmenting Agent 2012 年 2 月指導敎授金殷基 이論文을工學碩士學位論文으로提出함 仁荷大學校大學院生物工學科 ( 生物工學專攻 ) 孫萬基

3 Development of SPR based screening system for MITF-E-box binding inhibitor as Depigmenting Agent by Manki Son A THESIS Submitted to the faculty of INHA UNIVERSITY In partial fulfillment of the requirements For the degree of MASTER OF SCIENCE Department of Biological Engineering February 2012

4 이論文을孫萬基의碩士學位論文으로認定함 年 2 月主審 : 副審 : 委員 :

5 요약 피부색은피부에존재하는멜라닌에의해서결정된다. Tyrosinase는멜라닌합성과정에서가장중요한역할을하는효소인데, MITF (Microphthalmia-associated transcription factor) 라는전사인자에의해서발현이조절된다. MITF는 bhlh-zip의구조를갖는전사인자로 E-box (CATGTG) 라는특정염기서열에결합함으로써유전자의발현을조절한다. 이번실험에서는 MITF와 E-box의결합을저해하는물질을찾기위해만들어진 DNA칩을이용하여둘사이의결합을분석하였다. 분석에는 SPR (surface plasmon resonance) 기술을사용하였다. 이는광학을이용한실시간비표지분석방법으로금속표면위에고정화되는물질의양을측정하는것이다. 대조군과의비교및돌연변이와의비교를통하여두물질이특이적으로결합하는것을확인하였으며, 농도변화에따른결합력의차이를분석하였다. 또한이러한실험을통하여실제로저해제를선별할수있는지확인하였다. 이러한연구는추후기존의방법보다빠르고정확하게피부미백제를탐색하는데활용될것이다. I

6 ABSTRACT Skin color is determined by the amount of melanin present. Many enzymes have a relationship in melanin synthesis. Especially, tyrosinase is well known as key enzyme for melanin synthesis. MITF (Microphthalmiaassociated transcription factor), a bhlh (basic helix-loop-helix) transcription factor with a leucine zipper, is a key protein in regulation of the pigmentation process in melanocytes. Binding of the MITF to E-box induces transcription of several genes associated with pigmentation, including the tyrosinase gene. The purpose of this study is to evaluate the interaction of MITF with respective DNA binding site (E-box, CATGTG) by SPR (surface plasmon resonance). SPR, a label-free gold chip based DNA-protein interaction assay was used to evaluate the interactions. The MITF showed almost a twice higher resonance signal after binding with E-box, when compared to mutated E-box. We have also evaluated various parameters to stabilize the assay conditions and to reduce the false signals. We anticipate that evaluation of interaction provide a quantitative, comparative, high-throughput screening of MITF inhibitors, which will help to develop an effective methodology of screening of potential depigmenting agent. II

7 CONTENTS 요 약. Ⅰ ABSTRACT....Ⅱ CONTENTS....Ⅲ 1. INTRODUCTION Melanin synthesis process PKA pathway in melanogenesis 기존연구방법들의문제점 Virtual screening system Surface plasmon resonance OBJECTIVES MATERIALS AND METHODS MITF 단백질의발현및정제 E-box DNA oligomer의합성 E-box DNA chip의제작 Surface plasmon resonance analysis III

8 4. RESULTS Optimization of DNA hybridization Specificity of MITF and E-box Comparison of MBP and MBP-MITF Comparison of E-box and mutant E-box Kinetics of MITF and E-box Single-cycle kinetics of MITF and E-box Multi-cycle kinetics of MITF and E-box Inhibitory effect of chemicals on MITF and E-box CONCLUSIONS REFERENCE 27 IV

9 1. INTRODUCTION 1.1. 멜라닌합성과정 멜라닌합성은자외선, 스트레스, 호르몬등에의해서유도된다. 멜라닌세포 (melanocyte) 내의소기관인멜라노좀 (melanosome) 에서생성되는멜라닌은각질형성세포 (keratinocyte) 로이동되며, 멜라닌색소의양에의해피부색이결정된다. 멜라닌색소는흑갈색의 Eumelanin과적갈색의 Pheomelanin으로나뉘어진다. 멜라닌합성에서 key enzyme으로알려져있는 tyrosinase에의해서 tyrosine이멜라닌색소로합성되는과정중첫단계가시작된다. ( 그림 1) Tyrosinase 이외에도 Tyrosinase related protein 1 (TRP1), Tyrosinase related protein 2 (TRP2) 도멜라닌색소합성과정에서사용되는데, 이세효소모두 MITF (Microphthalmia associated Transcription Factor) 라고하는전사인자에의해서발현이조절된다. [1, 2, 3, 4, 5] 1

10 Fig. 1 Skin pigmentation pathway 2

11 1.2. PKA pathway in melanogenesis 멜라닌색소합성기전중 PKA pathway는 α-msh (melanocyte stimulating hormone) 가 melanocyte의세포막에있는 MC1R (melanocortin-1 receptor) 에결합함으로써시작된다. α-msh가 MC1R에결합하면 adenylyl cyclase가활성화되고, 활성화된 adenylyl cyclase에의해 ATP가 camp (cyclin AMP) 로전환된다. 증가한 camp에의해서 PKA가활성화되고, 활성화된 PKA에의해서 CREB가 CRE (CREB binding element) 에결합하여 MITF를발현시킨다. 발현된 MITF는다시핵안으로들어가서 tyrosinase의 promoter에존재하는 E-box (CATGTG) 라는특정염기서열을인식하고결합함으로써 downstream gene의발현을유도한다. ( 그림 2) [6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14] 3

12 Fig. 2 MSH-MC1R regulation of pigmentary genes 4

13 1.3. 기존연구방법들의문제점 현재제품화되어사용되고있는미백소재들은대부분 tyrosinase의활성을저해하는물질들로멜라닌합성을저해하고있다. 기존미백기능성원료로잘알려진것들은 hydroquinone, arbutin, kojic acid, vitamin c 등이있다. 이중 hydroquinone은뛰어난미백활성을갖고있지만발암물질로가능성이있기때문에의사의처방이없이는사용이불가능하다. 이외에도 kojic acid, vitamin c 등도안전성과안정성에대한문제점이대두되고있기때문에새로운미백소재의개발이필요한실정이다. 이번연구는 tyrosinase의활성을직접적으로저해하는것이아니라 tyrosinase의발현을조절함으로써멜라닌합성을저해할수있도록 tyrosinase의발현을조절한다고알려져있는 MITF를 target으로선정하였다. 기존의실험방법들역시주로 tyrosinase 활성을측정하는세포실험이주를이루고있다. 이러한실험들은시간이오래걸리고, 비용이높으며, 메커니즘이불분명하다는단점이있다. 따라서새로운고속스크리닝방법의필요성을느껴본연구를진행하였다. 5

14 1.4. Virtual screening system 선행연구와마찬가지로연세대학교분자설계연구소와공동연구를 통해 MITF 와 E-box 의결합저해제를선별하였다. 분자설계연구소에 서컴퓨터시뮬레이션프로그램인 CERIUS Ⅱ 를이용하여 MITF 와 E-box의 binding site를 target으로하여그부분에결합할수있는 27 개의화합물을예상하였다. ( 그림 3) 선행실험으로부터결합저해후보물질하나를선별하였으며, 이는 EMSA, western blot, melanin & MTT assay를통하여검증하였다. ( 그림 4)[15] 본연구에서는이러한후보물질을사용하여새로운스크리닝방법에적용함으로써, 그가능성을확인하였다. 6

15 Fig. 3 Virtual screening system Fig. 4 {1-[2-(4-Chloro-phenoxy)-ethyl]-1H-benzoimidazol-2-ylsulfanyl}-acetic acid 7

16 1.5. Surface plasmon resonance 본연구의 MITF와 E-box 결합분석에는 SPR (surface plasmon resonance) 를사용하였다. ( 그림 5, 6) [16] SPR이란광학적원리를이용한실시간비표지, 분석기술로금속표면위에화학물질을이용하여 target molecule을고정화시키고, 또다른 target molecule을 flow함으로서일어나는프리즘의빛굴절률변화에의해값을갖게된다. 이는비표지기술임에비용이저렴하고, 실험시간이짧으며, 보다민감하고실시간데이터를얻는데서오는 kinetics 분석이가능하다는장점이있다. 이번실험에서는 E-box DNA를고정화시킴으로써 MITF와의결합을측정하였다. 8

17 Fig. 5 Typical set-up for an SPR biosensor Fig. 6 A typical binding cycle observed with an optical biosensor 9

18 2. OBJECTIVE 멜라닌색소합성과정중, key enzyme으로알려진 tyrosinase를직접적으로저해하는것이아닌발현을저해함으로써멜라닌합성을저해할수있는소재를찾기위해 tyrosinase의발현을유도한다고알려져있는 MITF와 E-box의결합을억제하는화합물을찾고자하였다. 기존의연구방법을보완할수있는보다저렴하며, 짧은시간안에수행가능한, 민감하고메커니즘특이적인스크리닝방법을구축하고자하였다. 선행연구를통하여선별된결합저해물질을이용하여그가능성을확인하였으며, MITF와 E-box의결합분석에는 SPR 기술을사용하였다. 10

19 3. MATERIALS AND METHODS MITF 단백질의발현및정제 Escherichia coli BL21 (DE3) 에분리및정제를위해 MBP (maltose binding protein) 을 tagging 하여만들어진벡터를 transfection 하였다. (Bioprogen, Korea, 그림 7) 배양에사용된배지는 LB (10% tryptone, 5% yeast extract, 5% NaCl) media으로 50ppm의 ampicillin을첨가하여 37, 200rpm 조건에서 OD 이될때까지배양한후, 1mM의 IPTG를첨가하여 induction 하였다. 동일조건에서 5시간의추가배양후수확하였다. 수확한세포를 6000rpm, 4, 15분조건으로원심분리한후 PBS를사용하여두번세척하였다. 이를다시 PBS에 lysis시켜 sonication 한후 12000rpm, 4, 15분조건으로원심분리하여상등액을실험에사용하였다. 분리및정제를위해 MBP excellose column (Bioprogen, Korea) 을사용하였으며, 10mM의 maltose를사용하여 elution 하였다. 정제된단백질을 SDS-PAGE 로분석, 다음과같은결과를얻었다. ( 그림 8) 11

20 Fig. 7 Construction of DNA vector Fig. 8 Results of SDS-PAGE analysis 12

21 3.2. E-box DNA oligomer 의합성 실험에사용된 DNA는 gold chip에고정화하기위해 forward primer 의 5 말단을 amine으로 modification 하였으며, gold 표면으로부터의적정높이확보를위해 10개의 thymine을추가하였다. ( 표 1) Forward와 reverse primer를 10 µm의농도로섞어준후, 5분동안끓여 double strand로합성하여사용하였다. Competition assay에는 native form의 E-box DNA와 2개의 sequence를 mutation한 DNA를사용하였다. ( 표2) 모든 DNA는 Bioneer에서구입하여사용하였다. 13

22 Forward Reverse 5 -NH 2 -TTTTTTTTTTCTCACGCCCCCGGCATGTGGCC-3 5`-GGCCACATGCCGGGGGCGTGAG-3 Table 1 Design of DNA oligomer (E-box : CATGTG) Native Mutant 5`-CTCACGCCCCCGGCATGTGGCC-3 5`-CTCACGCCCCCGGCTTGAGGCC-3 Table 2 Sequence of competitor DNA 14

23 3. 3. E-box DNA chip 의제작 금속표면을 Piranha solution (H 2 SO 4 75%, H 2 O 2 25%) 으로 60 에서 15분간 washing한후, 1mM의 11-Mercapto-undecanoic acid (SIGMA) 를에탄올에녹여실온에서 12시간이상반응시킨다. 반응이끝난 gold chip을 ddh 2 O로 washing한후, N 2 gas로 blowing한다. 세척이끝난표면을 0.2M N-(3-Dimethylaminopropyl)-N`-ethylcarbodiimide hydrochloride / 0.05M N-Hydroxysuccinimide (SIGMA) 를혼합하여실온에서 15분간반응시킨다. 이후 10µM의 amine modification 된 double strand DNA를실온에서 2시간동안반응시키고, 잔기에는 1mM의 amine modification된 PEG (2K) (DOJINDO) 를 1시간동안반응시킨다. ( 그림 9) Fig. 9 Schematic diagram of E-box DNA chip 15

24 3.4. Surface plasmon resonance analysis 실험에는 MiCoBioMed의 SPR nano를사용하였다. ( 그림 10) Light source는 785nm LD, detector 는 2D CMOS이며, gold chip은프리즘타입의 10 x 10 x 3.54 (mm) 크기이다. Running buffer로는 1X PBS ( 바이오세상 ) 를사용하였으며, 유속은 10 µl/min을사용하였다. Fig. 10 Principles of SPR nano 16

25 4. RESULTS Optimization of DNA hybridization 표면에고정화되는 DNA의적정농도를선별하기위해단백질의농도를 1 µm로동일하게하고, 바닥에고정화시키는 DNA의농도를다르게하여 SPR signal을분석하였다. 결과 10 µm 이상의농도에서는 response의변화가크지않은것을확인하였고, 이후실험에서는 DNA의농도를 10 µm로고정하였다. ( 그림 11) Fig. 11 Response of DNA hybridization 17

26 4.2. Specificity of MITF and E-box Comparison of MBP and MBP-MITF 제작된 chip 상에서 E-box와 MITF가특이적으로결합하는지보기위해대조군으로 1.0 mg/ml의 BSA, binding partner인 1 µm의 MBP를선정하여 1 µm MBP-MITF와의 response를비교하였다. 결과 MBP- MITF가기타단백질보다월등히높은 signal을보임으로서 MITF가 E-box와특이적으로결합하는것을확인하였다. ( 그림 12) Fig. 12 Comparison of MBP-MITF with MBP, BSA 18

27 Comparison of E-box and mutant E-box 표면에고정화된 DNA의 20배농도 E-box DNA와 mutant E-box DNA를각각 MITF와 4 에서 30분동안 pre-incubation한후 signal을비교하는 competition assay를수행하였다. 결과 E-box DNA를 competitor로사용하였을때는 signal이현저하게줄어드는것을볼수있었지만, mutant E-box의경우, competitor를사용하지않았을때와유사한 signal을보이는것을확인하였다. 이에 MITF와 E-box가특이적으로결합하는것을확인하였다. ( 그림 13) Fig. 13 Competition assay of MITF and E-box, mutant E-box 19

28 4.3. Kinetics of MITF and E-box Single-cycle kinetics of MITF and E-box 하나의 chip을이용하여 MITF의농도를 0.25 µm부터 8.00 µm까지증가시키며 flow하여어떤농도범위에서상호작용하는지확인하고자하였다. 결과 response 변화량은 4 µm과 8 µm 사이에서포화되는것을확인할수있었다. ( 그림 14, 15) 20

29 Fig. 14 Dose response of MITF using single chip Fig. 15 Response differences from 0.25 µm to 8.00 µm 21

30 Multi-cycle kinetics of MITF and E-box 여러개의 chip을이용하여 MITF의농도를 0.25 µm부터 8.00 µm까지변화시키며 SPR signal을분석하였다. 결과농도에비례하는증가수치를얻을수있었다. ( 그림 16) 이러한결과를바탕으로 steady state kinetic analysis룰수행한결과, 다음과같은수식에의해 k a (association rate constant) 5.5 x 10 3 M -1 s -1, k d (dissociation rate constant) s -1, K A (steady state association constant) x 10 6 M -1 를구할수있었다. ( 그림 17) Fig. 16 Dose response of MITF using Multi chip 22

31 (A) (B) (C) Fig. 17 Steady state kinetic analysis of MITF and E-box dr/dt=k a C(R max -R)-k d R (A) At equilibrium, dr/dt=0 R eq /C=K A R max -K A R eq (B) (A) rearranged to : dr/dt=kacr max -(kac+k d )R S=k a C+k d (C) 23

32 4.4. Inhibitory effect of chemicals on MITF and E-box 선행연구를통해선별된결합저해후보물질이제작된 chip 상에서스크리닝가능한지확인하기위해대조군 compound #4와후보물질 compound #17을각각 MITF와 4 에서 30분간 pre-incubation한후 flow하였다. 결과 candidate compound #17만이 MITF와 E-box의상호작용을저해하는것을확인하였다. ( 그림 18) 또한농도에따른 inhibition을분석한결과 604.8nM의 IC 50 value를얻을수있었다. ( 그림 19) 24

33 (A) (B) Fig. 18 Inhibitory effect of chemicals on MITF and E-box (A) Compound #4, (B) Compound #17 Fig. 19 IC 50 value of compound #17 25

34 5. CONCLUSIONS 1. MITF 단백질과 E-box DNA 의상호작용을분석할수있는 SPR 기반의 E-box DNA chip 을구축하였다. 2. 제작된 chip 상에서 MITF 단백질과 E-box DNA 가특이적으로 상호작용하는것을확인하였다. 3. 제작된 chip 상에서 MITF 단백질과 E-box DNA의 kinetics 분석을수행한결과 k a (association rate constant) 5.5 x 10 3 M -1 s -1, k d (dissociation rate constant) s -1, K A (steady state association constant) x 10 6 M -1 를얻을수있었다. 4. 제작된 chip 상에서선행연구에의해선별된 compound #17 의 결합저해효과를확인하였으며, IC 50 value 604.8nM 을구할수있었다. 5. 따라서 E-box DNA chip 은미백소재탐색을위한 MITF 단백질과 E-box DNA 의결합저해제스크리닝방법으로사용될수있다. 26

35 6. REFERENCES 1. Bertolotto C., Abbe P., Hemesath T. J., Bille K., Fisher D. E., Ortonne J. P., Ballotti R. (1998) Microphthalmia gene product as a signal transducer in camp-induced differentiation of melanocytes. Cell Biol. 142: Saito H, Yasumoto K, Takeda K, Takahashi K, Yamamoto H, Shibahara S. (2003) Microphthalmia-associated transcription factor in the Wnt signaling pathway. Pigment Cell Res.16(3): Amae S, Fuse N, Yasumoto K, Sato S, Yajima I, Yamamoto H, Udono T, Durlu YK, Tamai M, Takahashi K, Shibahara S. (1998) Identification of a novel isoform of microphthalmia-associated transcription factor that is enriched in retinal pigment epithelium. Biochem Biophys Res Commun. 247: Udono T, Yasumoto K, Takeda K, Amae S, Watanabe K, Saito H, Fuse N, Tachibana M, Takahashi K, Tamai M, Shibahara S. (2000) Structural organization of the human microphthalmia-associated transcription factor gene containing four alternative promoters. Biochim Biophys Acta. 1491: Yasumoto K, Amae S, Udono T, Fuse N, Takeda K, Shibahara S. (1998) 27

36 A big gene linked to small eyes encodes multiple Mitf isoforms: many promoters make light work. Pigment Cell Res. 11(6): C. J. Cooksey, P. J. Garratt, Edward J. Land, Stan Pavel, C. A. Ramsden, Patrick A. Riley and Nico P. M. Smit. (1997) Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase. J Biol Chem. 272(42): Aroca, P., García-Borrón, J. C., Solano, F. and Lzano, J.A. (1990) Regulation of mammalian melanogenesis. I: Partial purification and characterization of a dopachrome converting factor: dopachrome tautomerase. Biochim Biophys Acta. 1035(3): Fitzpatrick, T.B., Becker, S.W. Jr, Lerner, A.B., and Montgomery, H. (1950). Tyrosinase in human skin: demonstration of its presence and its role in human melanin formation. Science. 772, CHHAJLANI, V. & J.E.S. WIKBERG.. (1992) Molecular cloning and expression of the human melanocyte stimulating hormone receptor cdna. FEBS Lett. 309: MOUNTJOY, K.G., L.S. ROBBINS, M. MORTRUD & R.D. CONE. (1992) The cloning of a family of genes that encode the melanocortin receptors. Science. 257: Anthony J. Thody. (1999) alpha-msh and the regulation of melanocyte 28

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