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1 발간등록번호 NIER NO. 최종보고서 / 바이오디젤연료사용에따른 미세먼지 (PM2.5) 의환경성 평가연구 국립환경과학원

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3 발간등록번호 NIER NO. 최종보고서 / 바이오디젤연료사용에따른 미세먼지 (PM2.5) 의환경성 평가연구 국립환경과학원

4 제출문 국립환경과학원장귀하 본보고서를 바이오디젤연료사용에따른미세먼지 (PM2.5) 의 환경성평가연구 사업의최종보고서로제출합니다 연구기관 : 호서대학교환경공학과연구수행기간 : ~ 연구책임자 : 이장훈연구원 : 권혁구연구보조원 : 권문주김힘찬

5 최종보고서 바이오디젤연료사용에따른 미세먼지 (PM2.5) 의환경성 평가연구 2013 년 11 월 호서대학교

6 요약문 1. 사업개요 사업명 : 바이오디젤연료사용에따른미세먼지 (PM2.5) 의환경성평가연구 주관 : 국립환경과학원 ( 교통환경연구소 ) 사업기관 : ~ 연구목적및결과 Ⅰ. 연구필요성및목적 국제암연구소는디젤엔진배기가스를암발생개연성이있는발암물질 2A 등급에서암발생에충분한증거가있는물질등급인 1 등급으로상향조정하였음. 특히디젤분진은환경중미세먼지 (PM2.5) 의양을증가시키는요인이되고있으며, 경유차량에서배출되는미세먼지가전체대기미세먼지의 23% 를차지하여주된오 염원으로알려져있음 (USEPA, 2000). 우리나라는 2012 년부터대기 환경기준에 PM2.5 가신설되었으며, 이에따라바이오디젤을연료 로사용하는경유자동차에서배출되는미세먼지에대한건강위해 성평가자료가필요함.

7 본과제에서는바이오디젤을사용하는경유자동차엔진에서발생되는미세먼지, 가스상물질등다양한오염물질들에대한배출특성을알아보고그중바이오디젤분진에흡착되어존재하는 PAH류에대한오염도와인체발암위해성평가를수행하였음. Ⅱ. 연구목적 바이오디젤혼합비율별주행모드에따라발생되는경유자동차의미세먼지 (PM2.5) 의배출특성평가와미세먼지에의한폐암발생등위해성평가를통해바이오디젤자동차에의한대기오염개선정책및국민의삶의질을향상시키고자함. Ⅲ. 연구방법 바이오디젤경유자동차미세먼지에대한건강위해성연구자료조사 미세먼지포집, PM2.5량측정 미세먼지중유기성물질추출, 휘발성물질및 16개의 PAH류분석 PAH-TEQ산정및흡입노출에의한인체발암위해성평가수행 호흡기관련인체위해성평가를위한표적세포등을활용한유전적 (Genetic) 및후생유전적 (Epigenetic) 평가

8 Ⅳ. 연구결과 PHAs물질 : 디젤 (BD) 및바이오디젤 (BD5%, BD10%, BD20% 및 BD100%) 을사용하여 DPF가장착되지않은 ETS 및 ESC모드에서포집된미세먼지 (PM2.5) 를분석한결과 ETC모드인경우 Naphthalene, Acenaphthene, Flourene, Phenathrene, Fluoranthene, Pyrene이검출되었고이중 Naphthalene, Flourene, Phenathrene은모든시험혼합유에서검출되었으며, Acenaphthene, Fluoranthene, Pyrene은 BD100에서는검출되지않았다. 각각측정된 PAH농도에대한합계 ( PAHs) 는 BD, BD5, BD10, BD20 및 BD100에서각각 , , , 및 mg /g로나타났다. ESC모드의결과는 BD0에서 Naphthalene, Acenaphthene, Flourene, Phenathrene, Fluoranthene, Pyrene이측정되었고, BD100인경우에는 Naphthalene, Flourene, Phenathrene만이검출되었다. PAH류의농도에대한총합산량즉 Total-PAH류 ( PAH류) 는 BD, BD,5, BD10, BD20 및 BD100에서각각 , , , 및 mg /g로조사되었다. 가스상물질 : 자동차배기가스의대표적규제기준항목인 CO, THC(total hydrocarbon), CO 2 및 NOx을측정한평균값은 CO와 HC는 BD 함량증가에따라감소하였고, NOx는 BD 함량증가에따라영향을받지않는경향을보였음. 휘발성물질 (VOC): BD 함량증가에따라 Benzene 농도는증가되었으나 Toluene 과 Ethylbenzene 농도는감소되었음. Benzene 농도의증가는 BD 성분인 FAME 가연소환경에서방향족으로전환된것이원인으로판 단되었음.

9 미세먼지유기성추출물의유전독성 (Genotoxicity) 및발암성평가 : 미세먼지유기성추출물에의한유전독성평가로 CHO-K1 cell에서 CBMN, CA, COMET assay를수행한결과바이오디젤함량이높아짐에따라세포독성이나타나지않았고염색체손상 ( 소행형성 ), 염색체이상이유의적으로감소하는것으로나타났으나 DNA damage 시험에서는바이오디젤함량에따른감소효과가뚜렷하게나타나지않았음. 미세먼지의유기성추출물질을이용한유전독성을평가한결과유전독성및발암성은일반디젤보다감소됨을확인할수있었으며발암물질로분류되어있는 PAH류가바이오디젤을연료로사용한경우현저하게감소하였고 BaP 독성당량치를결과위해성이없는것으로조사되었다. 배출미세먼지에흡착되어있는 PAH측정및인체위해성평가 : PAHs 분석값과 B(a)P의독성등가치 (B(a)P-TEQ ) 를이용한개인초과발암위해도평가시저감장치미부착된 ETC와 ESC모드에서 BD0, BD15, BD10, BD20 및 BD100에서각각 0.000μg-TEQ/g으로나타났음. 위해성종합평가 : 본연구는미세먼지로인한위해성을평가하기위하여많은양의미세먼지가필요하여미세먼지 (PM2.5) 를저감장치없이반복적인시험을통해서포집하여평가한결과이고자동차에서배출되어대기중으로확산되는것등을충분히고려되지않은제한적노출평가조건에서위해성평가를수행한결과임. 따라서바이오디젤경유차량에서배출되는배기가스에대한정확한인체위해성을평가하여규제기준설정및정책반영에활용되기위해서는저감장치부착에따른저감효율, 타이어마모분진, 도로재비산먼지등에대한다양한변수를고려하여종합적평가가이루어져야할것으로판단됨.

10 3. 기대효과및활용방안 바이오디젤의사용에따른경유자동차에서발생되는미세먼지 (PM2.5) 배 출특성평가와미세먼지에의한폐암발생등위해성평가를통해자동차 에의한대기오염개선정책에활용. - x -

11 목차 1. 연구사업명 : 1 2. 연구의배경, 목적및필요성 연구의배경 연구필요성 연구의목표 7 3. 연구내용및방법 연구내용 연구방법 연구결과 바이오디젤의특성과바이오디젤및저감장치사용에따른경제성평가 바이오연료에대한국 내외정책및바이오디젤의인체위해성에관한연구동향 바이오디젤혼합비율별경유자동차의미세먼지및유해오염물질배출특성 바이오디젤자동차에서발생되는미세먼지의인체위해성영향 바이오디젤자동차미세먼지에대한독성시험결과정책활용 결론 경유차량에서배출되는배출가스의배출특성 바이오디젤차량에서배출되는미세먼지유기성추출물의독성평가 바이오디젤차량에서배출되는 PAH류의인체발암위해성평가 기대성과및활용방안 기대성과 활용방안 참고문헌 부록 92 - i -

12 List of Figures Fig. 1. Genetic and epigenetic/ non-genotoxic toxicity mechanisms in lung cancer 11 Fig. 2. Genotoxicity test 12 Fig. 3. Sampling system of diesel exhaust particulate matter 16 Fig. 4. Sample(PM2.5) collection system 16 Fig. 5. ETC mode 17 Fig. 6. ETC mode 17 Fig. 7. CHO-K1 cells 24 Fig. 8. BEAS-2B cells 24 Fig. 9. Comet assay to identity DNA damage 25 Fig. 10. Comet image analysis software 26 Fig. 11. In vitro Cytochalasin B micronucleus test for identifying chromosomal damage 27 Fig. 12. Micronucleus test observation 28 Fig. 13. Molecular structure of diesel and biodiesel 33 Fig. 14. CO 2 life-cycle of soybean biodiesel 34 Fig. 15. Characteristics by the component of Biodiesel 36 Fig. 16. Voc mass concemtration in ETC mode 62 Fig. 17. Voc mass concemtration in ESC mode 63 Fig. 18. VOCs mass concentration in ETC 66 Fig. 19. VOCs( BTEX) mass concentration in ETC 66 Fig. 20. VOCs mass concentration in ESC 68 Fig. 21. VOCs( BTEX) mass concentration in ESC 68 Fig. 22. Cell viability in CHO-K1 cells exposed to the soluble organic extract (SOE) of particulate matter (PM2.5) 69 Fig. 23. DNA breakage in CHO-K1 cells exposed to the soluble - ii -

13 organic extract (SOE) of PM2.5 by using by the comet assay 70 Fig. 24. Effects of oxidant modulators on MN formation by the soluble organic extract (SOE) of PM2.5 in CHO-K1 cells 72 Fig. 25. Cytotoxicity of soluble organic extract was evaluated by the Crystal Violet method 75 Fig. 26. The number of transformed colonies in BALB/c 3T3 A cells 76 - iii -

14 List of Tables Table 1. Proposed list of mobile source air toxics 3 Table 2. Diesel vehicle engine index 15 Table 3. Contents of 16 PAHs 20 Table 4. GC-MSD analysis conditions(phas) 21 Table 5. GC-MSD analysis conditions(voc)f 23 Table 6. Economic evalution by BD blending ratio(dpf(-)) 37 Table 7. Economic evalution by equipped with DPF 37 Table 8. Emissions level of Diesel city bus - CNG city bus 38 Table 9. Laws and regulations in relation to biodiesel 40 Table 10. Policy and tendency in relation to biodiesel 43 Table 11. Health effect of biodiesel 47 Table 12. M2.5 mass concentration in ETC, ESC equipped without DPF 55 Table PAHs compounds and carcinogen classification 56 Table 14. Total PAHs and b(a)p-teq in ETC without DPF 58 Table 15. Total PAHs and b(a)p-teq in ESC without DPF 59 Table 16. Characteristics of regulated emissions in ETC mode without DPF (g/kwh) by BD blending ratio 61 Table 17. Characteristics of regulated emissions in ESC mode without DPF (g/kwh) by BD blending ratio 63 Table 18. VOCs mass concentration in ETC equipped without DPF 65 Table 19. VOCs mass concentration in ESC equipped without DPF 67 Table 20. The chromosome aberration in CHO-K1 cell exposed to soluble organic extract (SOE) of PM iv -

15 Glossary 유전적 (Genetic) : 유전성을가진형상또는과정을나타내는형용사. 후생유전적 (Epigenetic) : DNA 의염기서열이변화하지않는상태에서이루어지는유전자발현. apoptosis : 세포자살. 세포가유전자에의해제어되어죽는방식의한형태로세포의괴사나병적인죽음인 necrosis( 자살 ) 와는구별된다. apoptosis는발생과정에서몸의형태만들기를담당하고성체에서는정상적인세포를갱신하거나이상이생긴세포를제거하는일을담당함. BEAS-2B cell : immortalized human bronchial epithelial cell line, 기관지상피세포. CBMN assay (in vitro cytokinesis block micronucleus assay) : 염색체이상반응을평가하는분석방법, In vitro 소핵시험. Comet assay : Single cell gel electrophoresis assay; 단일세포전기연동법. 어떠한물질에의해서세포가손상되면 DNA가닥이쪼개지게되고그파편이떨어져나오게되고세포가손상된부분을복구하지못하면 DNA에서떨어져나온파편이자유롭게움직이므로이러한현상을이용하여한쪽방향으로쏠리게하여 DNA손상을확인할수있는분석방법. - v -

16 DNA손상시험 : DNA손상은환경적인요인뿐만아니라정상적인대사활동중에도발생하는활성산소, 외부환경으로부터가해지는이온화방사선 (ionizing radiation; IR) 등과같은내부및외부의다양한 DNA 손상인자에의해세포하나당매일 1,000개에서 1,000,000개정도의속도로염기자체에화학적인변형 (chemical modification) 이일어남. 이러한손상정도는 Single cell gel electrophoresis assay (comet assay) 를통하여확인할수있음. ELISA : 효소를표식자로하여항원항체반응을이용한항원또는항체량측정방 법을일반적으로효소면역분석법으로총칭함 genotoxicity test : 유전독성테스트. 화학물질이나방사선등에의해 DNA가변화를받아그것이자손에전해져장애가나타난다. 유전독성테스트는이러한 DNA를변하시키는물질을테스트하는것. In vitro 소핵시험 : In vitro micronucleus assay; 세포를이용하여염색체의구조적이상 (clastogenic) 및수적이상 (aneugenic) 을일으키는물질을측정하는시험법으로써 interphase 세포의세포질에존재하는소핵을측정함. CHO-K1세포의경우에는 cytochrome P450이결여되어있다고알려져있는세포임. in vitro chromosome aberration assay : In vitro 염색체이상시험. 시험물질에의한염색체의구조적이상을측정하기위한시험법으로써일반적으로포유동물세포인 Chinese Hamster Lung (CHL), Chinese Hamster Ovary (CHO) 세포를사용함. - vi -

17 in vitro cell transformation assay : 세포형질전환분석시험방법 Micronucleus test : 미소핵검사. 세포분열시에주핵인딸핵에들어있지않고세포질내에독립된염색체혹은염색체단편을형성하는소핵을지표로하는변이원성시험법의일종. p53( 유전자 ) : 세포가무질서하게증식하거나돌연변이를일으키는것을막는역할을하는유전자. 세포의이상증식을억제하고암세포를사멸하도록유도하는역할때문에항암유전자라부름. p53-dependant apoptosis : p53 유전자의존성세포사멸. Western blotting : 단백질 ( 항체 ) 탐침을이용하여특정단백질을감지하는방법. - vii -

18 1. 연구사업명 : 바이오디젤연료사용에따른미세먼지 (PM2.5) 의환경성평가연구 2. 연구의배경, 목적및필요성 2-1. 연구의배경 디젤엔진에서발생되는유해물질 디젤엔진에서배출되는입자상오염물질중입경이작은수백나노미터이 하의입자 (nanopaticles) 는높은확산계수 (diffusion coefficient) 와넓은비표 면적으로인해호흡기에유입될경우에잠재적위험성이매우높음. 수많은대기오염물질이그종류와오염정도가파악이되지않는실정이며, CO, THC, NOX, CO2, PM 이외에매우다양하고인체에미치는영향이복잡하고이러한오염물질은폐는물론각종인체기관에질병을야기할수있음. 폐, 위, 피부를통해흡수될수있는공기중의 PAHs는흡입후기관지점액층을지나폐를통해흡수됨. 일반적으로 PAHs는세포의지질및물에구획을갖고침투확산을통해폐에도달할수있는지질화합물로서이후낮은혈중농도에서혈액과결합체를형성하여폐에서다른장기로재분배됨. 위에서의흡수는 PAHs를포함한지방성식품의섭취를통해이루어지고벤 - 1 -

19 조피렌 (Benzo[a]pyrene; BaP) 의경구섭취후위장관에서의흡수율은일부기 름에의해증가함. PAHs는지용성화합물이기때문에수동적확산작용및세포의지질과물로의분배작용에의해폐에도달할수있음. 혈중낮은농도에서 PAHs의탄화수소가혈액과결합하여폐에서다른장기로재분배되는데이때확산이속도결정단계가됨. 흡수속도는옥탄올 / 물분배상수때문에 PAHs 종류에따라다양하고본질적으로위에스며든모든벤조피렌은지방용해성화합물의섭취를통해흡수됨. 벤조피렌의경구섭취후위장관에서의흡수율은일부유지 ( 옥수수유등 ) 에의해향상되고 PAHs의피부흡수기전은대부분층을통한수동적확산작용에의함. 전세계디젤수송차량은 30% 이상 ( 공해발생50% 이상차지 ) 이며 Transient cycle 로작동된대형디젤엔진에서발생하는입자상오염물질의구성성분은 Carbon (41%), Unburnt Fuel(7%), Unburnt oil (25%), Sulfate/Water (14%), Ash and other (13%) 로이들중많은성분은휘발성이며, 1) 가스상 (Table 1) 으로존재하거나 2) 고체상입자에응축 (condensation) 하거나 3) 새로운입자로핵화 (nucleation) 함. 미국 EPA에따르면디젤기관으로부터배출되는연소물은환경적인측면에서도시대기중미세먼지 (PM2.5) 의주요배출원이되고있음. 따라서이러한디젤미세분진 (Diesel exhaust particles, DEP) 은넓은비표면적을가지고있어다양한발암및돌연변이원성물질들을흡착하는것으로알려져있음. 이러한배출물질로는 hydrocarbons (aliphatic 또는 aromatic), hydrocarbon derivatives, polycyclic aromatic hydrocarbons(pahs), PAH derivatives, heterocyclic compounds 및 heterocyclic derivatives 등이대표적인물질로보고되었음. 따라서배출물질들은인체에대한독성이커서세포돌연변이, - 2 -

20 암등을일으키고있으므로주요한환경관리대상물질임 (table 1). Table 1. Proposed list of mobile source air toxics Acetaldehyde Diesel exhaust MTBE Acrolein Ethylbenzene Naphthalene Arsenic compounds Formaldehyde Nickel compounds Benzene n-hexane Polycyclic organic matter 1,3-Butadiene Lead compounds Styrene Chromium compounds Manganese compounds Toluene Dioxin/Furans Mercury compounds Xylene 특히, 입자상오염물질의대기중농도가높은대도시지역에거주하는민감 한개체군 ( 어린이, 노약자, 호흡기및심폐관련질환자 ) 에게매우위험한것 으로보고되고있음. 폐저부 (peripheral lung) 로깊게흡입될수있는미세먼지 PM2.5는호흡기관에대해병리학적영향을미치는특성을가지고있으며, 역학적연구들을통하여미세먼지농도의증가와질병률 (morbidity) 및사망률 (mortality) 의증가와관련이있다는것이알려지고있음. 특히호흡성입자크기의디젤분진은폐암과만성폐질환의원인물질이라고알려짐

21 디젤엔진연료로서의바이오디젤 바이오디젤은압축착화형디젤엔진의연료로서훌륭한물성을가지고있으 며, 특히바이오디젤중의메틸에스터가석유계디젤에비해윤활성을 66% 향상 시켜엔진의마모를감소시켜수명증대에기여함. 바이오디젤은물리적특성이기존의디젤과비슷하고높은세탄가에의하여착화성이우수하고바이오디젤의물리화학적특성중낮은점도를가지는것이가장큰특징이며, 이는엔진의수명향상, 펌프효율및연료분사효율향상등에기여함. 바이오디젤은석유계디젤보다분해속도가 4배나빨라, 유해물질의축적에의한환경오염을저감하는측면에서매우유리하고분자구조내에산소를포하고있어탄화수소의배출과미세먼지의배출량을저감할수있는장점이있으며호기성또는혐기성조건에서 21~28일이면완전히분해됨. 상업용바이오디젤은배기가스량이석유계디젤의 75~83% 수준이며, 일산 화탄소 46.7%, 분진 66.7%, 미연소탄화수소 45.2% 를더적게방출하고방향족 성분이낮아발암물질의배출도미미함

22 정부정책과기후변화협약 정부에서는저공해자동차보급, 연료품질기준강화및운행자동차배출가스관리 강화와같은 수도권대기환경개선을위한특별법 제정하여교통오염원을관리하고 있으며, 대체에너지개발및이용보급촉진법제정으로개발을권장함. 또한 수도권대기환경관리기본계획 을수립하여 2014년수도권대기질개선목표를설정하였으며, 환경부에서는바이오디젤의국내보급정책을채택하여, 전국적인사용을권장함으로서심각한도심공해문제해결과 CO2 저감을동시에이루려는노력을추구하고있음. 폐식용유및폐자원을이용한바이오디젤생산으로토양및수질오염방지효과를 기대할수있고연간천억원대의에너지비용절감효과및 40 만톤이상의 CO2 저감 달성을기대함. 바이오디젤 1 톤당 2.2 톤의 CO2 를저감할수있는효과가크므로 1992 년리우환경 회의와 1997 년교토협약에의한이행을완수하기위해바이오연료가큰역할을할 것으로기대됨

23 2-2. 연구필요성 대기오염물질중 PM2.5 는호흡기질환에많은영향을미치는초미세먼지이 며미세먼지 10 mg/m 3 증가할때마다사망률은 0.6% 증가되는것으로알려 져있음. 200 년도 USEPA, Heath Assessment document for diesel engine exhaust 자료에따르면경유차량에서배출되는미세먼지 (PM2.5) 가전체대기미세먼 지 (PM2.5) 의 23% 를차지함. 디젤먼지가폐암발암성물질로분류되고있으나정확한독성메커니즘에 대한정보가제한적임 년부터대기환경기준에 PM2.5 가신설됨에따라경유자동차에서발생 되는미세먼지에대한규제관리정책에활용될건강위해성평가자료요구됨 디젤분진의돌연변이원성또는발암성과관련하여분진중 PAHs 가그원 인물질로알려져있으며다양한독성을유발하는것으로보고됨. 대기먼지에흡착된발암성 PAHs 의경우백만분의 1 이상의발암위해도가 평가되어어느정도위험성을제시하고있음. 현재까지대부분의연구가염증반응에대해주로이루어지고있으며폐암 관련연구의경우에도폐암세포중심으로이루어져정상세포에서의독성 메커니즘연구가필요함

24 바이오디젤을사용한엔진의경우탄화수소, 일산화탄소, 분진, 이산화황 등의배출이감소되나, 질소산화물의배출은증가하는것으로알려졌으나 배출가스저감에대한사후평가및인체위해성평가가미비함. 현재까지바이오디젤의원료물질과에스테르분자구조 ( 이중결합수와사슬길이 ) 가배출오염물질에미치는영향에대한연구는다양하게이루어졌지만, 바이오디젤을사용한자동차로부터발생한미세먼지와폐암독성관계에대한규명이명확하게이루어지고있지않음. 본과제에서는 2012년부터대기환경기준에 PM2.5가신설됨에따라미세먼지에대한건강위해성평가를통한향후정책도입에대한자료를얻기위하여미세먼지의유기성추출물에대한유전적 (Genetic) 및후생유전적 (Epigenic) 평가방법을통해바이오디젤자동차미세먼지의폐암관련독성영향을규명하고, 그기전을명확히이해고자바이오디젤혼합비율별 (0%, 5%, 10%, 20%, 100%) 경유자동차에서발생되는미세먼지의특성및흡착되어있는오염물질들의배출특성을평가하고자하였음 연구의목표 바이오디젤혼합비율별주행모드에따라발생되는바이오디젤자동차의 미세먼지 (PM2.5) 배출특성평가와미세먼지에의한폐암발생등위해성 평가등자료제공을통해정책수립시위해성관점이반영되도록하고자함

25 3. 연구내용및방법 3-1. 연구내용 경유및바이오디젤차량에서발생하는미세먼지 (PM2.5) 에의한위 해성영향국 내외자료조사 연구목적 : 바이오디젤사용자동차로인해발생되는미세먼지및인체위해성흡착물 질등의호흡기및발암관련국 내외연구자료를수집 정리함. 연구내용 : 바이오디젤경유자동차에서발생하는미세먼지에흡착된 PHAs 등유해물질에의해유도되는폐암관련인체위해성을평가하기위하여국 내외연구논문및보고서등을수집 정리하여본과제수행에활용함. 연구방법 1 바이오디젤자동차배출가스에서발생되는유해물질들을조사하고인체노출을통한암발생및미세먼지에부착된유해물질에의한폐독성관련영향및폐암관련위해성평가자료를조사함

26 바이오디젤혼합비율별경유자동차의미세먼지및유해오염물질 배출특성평가 연구목적 : 바이오디젤혼합비율별 (0%, 5%, 10%, 20%, 100%) 경유자동차배기가스에서발생하는미세먼지량을측정하고, 흡착되어있는유해화학물질을분석하여운전조건및차량별오염도를비교 평가함. 연구내용 : 운전모드 (ETS, EST) 에따라바이오디젤경유차동차배기가스에서발생하는미세먼지를포집및측정하고흡착되어있는유해화학물질 (PAH류) 을분석하여운전모드에따른오염도를비교 평가함. 연구방법 1 미세분진의포집 바이오디젤을사용하는경유자동차에서운전모드 (ETS 및 ESC) 에따라발생되는미세먼지 (PM2.5) 를포집함. 2 미세먼지중유기성물질추출 포집된미세먼지에흡착되어있는발암물질들을추출하기위해디클 로로메탄으로미세먼지를추출함. 3 미세먼지량측정및인체위해성관련유해물질분석 GC-MASS 의 SCAN mode 를이용한 PAH 류를분석함

27 경유자동차에서의미세먼지에의한호흡기관련인체위해성영향평가 연구목적 : 바이오디젤경유자동차에서발생하는미세먼지의호흡기관련인체독성영향을평가하기위해폐암세포주를이용하여유전적 (Genetic) 및후생유전적 (Epigenetic) 독성영향을확인하고그기전을규명하고자함. 연구내용 1 유전적독성영향을평가하기위하여바이오디젤경유자동차미세먼지에포함된유해물질을유기성추출과정을통하여분리한시료를햄스터난소암조직 (CHO-K1 cells) 및사람정상폐세포 (BEAS-2B cells) 에노출시킨후 DNA 및염색체이상을 comet assay 및 micronucleus test를통해확인함. 2 후생유전적독성영향평가는폐암발생및억제에중요한역할을담당하는 p53을보유하거나억제시킨세포 (pifithrin-α처치) 를활용하여바이오디젤경유자동차에서발생한미세먼지의활성산소생성에의한 DNA 산화적손상을규명하고자함 (Fig. 1). 연구방법 1 호흡기관련인체위해성평가를위한표적세포등을활용한유전적 (Genetic) 및후유전적 (Epigenetic) 평가 유전독성 평가는 Comet assay 를이용한 DNA 손상확인및 Micronucleus test 로 Chromosome 손상을확인함 (Fig. 2)

28 Fig. 1. Genetic and epigenetic/ non-genotoxic toxicity mechanisms in lung cancer. 산화적손상에의한유전독성평가는 DNA산화적손상측정, 활성산소생성측정및 Antioxidant관련유전자발현을확인함 후생유전적독성평가믄 p53관련 apoptosis 확인및 p53-dependant apoptosis 관련유전자를확인하여평가함 2 경유자동차미세먼지에의한인체위해성관련성활용도및연구분야 외국에서의미세먼지에의한호흡기및급 만성인체위해성평가자료활용을통한정책반영사례조사 미세먼지인체위해성관련외국의연구동향및국내적용성제시

29 Fig. 2. Genotoxicity test

30 3-2. 연구방법 경유및바이오디젤차량에서발생하는미세먼지 (PM2.5) 에의한위 해성영향국 내외자료조사 경유및바이오디젤배기가스중에존재하는미세먼지 (PM2.5) 의국내외인체위해성에대한선행연구를문헌조사등을통해수집정리함. 호흡기독성영향에대한유전적 (Genetic) 및후생유전적 (Epigenetic) 평가에활용할자료들을조사함으로써바이오디젤경유자동차에서발생되는미세먼지에대한폐암위해성영향평가에활용하도록함. 1) 자동차로인한인체위해성관련주요위해물질영향조사 : 경유및바이오디젤사용에따른경유자동차배출가스에서발생되는각각의유해물질들을조사하고각유해물질들의대기로의확산및인체노출을통한폐관련독성영향에대한자료조사 2) 미세먼지위해성관련국내외연구자료조사 : 경유및바이오디젤사용에 따른경유자동차배출가스에서발생되는미세먼지의폐암관련위해성평가 관련국내 외연구자료를조사 3) 유해오염물질에의한인체위해성영향조사 : 경유및바이오디젤사용에 따른경유자동차배출가스에서발생되는미세먼지에흡착되어있는유해오염 물질들의폐암관련인체위해성영향에대한국내 외연구자료를조사

31 바이오디젤혼합비율별경유자동차의미세먼지및유해오염물질 배출특성평가 1) 바이오디젤혼합비율별사용한경유자동차에서운전모드 (ETC, ESC) 에따라 발생되는미세먼지 (PM2.5) 포집및배출특성분석 바이오디젤경유자동차미세먼지배출특성 - 경유자동차에서배출되는입자상물질의물리 화학적특성은엔진의연 소실에서발생되어배출되면서변화하며탄소류는불완전연소또는윤활유 등의흡착에의해성장하게됨. - 디젤엔진에서처음배출되는입자는일반적으로 nuclei mode로서그크기가 0.03μm이하인탄소물질로구성되어있고, 배기시스템에서온도에따라산화와응집에의해특성이크게변하게되고일부입자는배기관벽에열열동력 (thermophoretic force) 에의해침착됨. - 이들경유자동차엔진에서의입자형성및침착등은배출되는시점에서의온도에따라서크게달라지기때문에엔진의사용연수, 바이오디젤의혼합비율별, 운전조건등에의해서입자의배출정도와크기분포특성에큰영향을미치게됨. - 본과제에서는 DOOSAN DL08S (4.5ton 트럭엔진 ) 을사용하여바이오디젤 함량별사용에따른미세먼지를포집하고흡착된유해물질을분석하였음 (Table 2)

32 Table 2. Diesel vehicle engine index 제품명 : DOOSAN DL08S (4.5ton 트럭엔진 ) 엔진형식 직렬, 4사이클, 수냉식과급및공기냉각방식 연소실형식 직접분사 실린더경 x 행정 108(4.25) x 139(5.47)mm(in.) 총배기량 7.640(466.22)lit.(in3) 압축비 16.5:1 최대출력 최대토크 배기규제 199kW(270PS) 980N.m(100kg.m) /2200rpm /1200rpm Euro Ⅳ 221kW(300PS) 1127N.m(115kg.m) /2200rpm /1200rpm Euro Ⅳ 250kW(340PS) 1421N.m(145kg.m) /2200rpm /1200rpm Euro Ⅳ 바이오디젤경유자동차배출미세먼지포집방법 - 본과제에서는바이오디젤을사용하는자동차에서시동시발생되는미세먼지를포집하기위해자동차배기구에포집기를연결하여미국 EPA에서규정하고있는 50 이하의온도를유지하는상태를유지시키기위한 dilution system에따라포집하였음. - Dilution tunnel 을통과한디젤배기가스는연결되어있는 cyclone 에의해 PM2.5 만따로포집하여연구에사용하였음 (Fig. 3)

33 Fig. 3. Sampling system of diesel exhaust particulate matter - 바이오디젤사용에따른미세먼지는국립환경과학원교통환경연구소에서보유하고있는엔진동력계를이용하여운전모드별 (ESC 및 ETC) 발생되는미세먼지 (PM2.5) 를포집하였음 (Fig. 4.). - 시험은규제시험방법에따라시험엔진을온도 20 ~ 30 및습도 50% 로제어된시험실에서 6시간이상소킹후한국과유럽에서규제모드로사용하는 ETC모드 (Fig. 5), ESC 모드 (Fig. 6) 를사용하여측정하였음. Fig. 4. Sample(PM2.5) collection system

34 Fig. 5. ETC mode Fig. 6. ESC mode

35 2) 포집된경유자동차미세먼지추출및인체위해성관련유해물질분석 포집된바이오디젤경유자동차미세먼지의포집및유기성물질추출 < 포집한미세먼지의보관 > - 미세먼지포집장치로포집한미세먼지는전처리하기전에미생물의오 염을방지하기위해 methylene chloride(dcm) 가담긴 500ml 유리병에서 4 를유지시켜보관함. < 미세먼지의유기성물질추출 > - 바이오디젤분진중에함유되어있는유용성물질을 Lewtas 등 (1990) 의 방법을수정한방법에의해추출. 테프론필터에포집된디젤미세분진은 DCM 에 현탁시키고 30 분간 2 회 sonication 하여 crude 추출물을얻음. - 원인화학물질분석이요구되는경우필요에따라 acid-base-neutral 분획및 silica column chromatography 를이용하여극성 [hexane추출분획, DCM/hexane(1:1) 추출분획, DCM 추출분획, DCM/MeOH(1:1) 추출분획, 및 MeOH 추출분획 ] 에따라 5개의분획시료를얻음. - 증발건조된추출시료는각각 PAH 류분석에사용및 DMSO 에녹인후 폐암독성평가에사용하였음

36 바이오디젤미세먼지에흡착된유해물질분석 < 유해물질분석 > - 미세먼지의유기성추출시료에서 16개의대표적인 PAH류 (Table 3) 를 GC-MS 로분석하였음. 디젤미세먼지를포집한전단및후단필터를 Dionex 사의용매가속추출기 (ASE 200) 의 11ml Extraction Cell 에넣고빈공간이많을경우추출시 error가발생할수있으므로빈공간을규조토로채워추출을하였음. - ASE는고온, 고압에서 Sample 추출을진행하는데온도 100 와압력 2000psi 상태에서약 10~15분간 Dichlormethane으로약 20ml 추출하였음. 추출한시료는자외선에의해 PAHs가해리되지않도록알루미늄호일등으로 Collection Vial를잘감싸주었음. - 추출액은회전감압농축기 (Rotary evaporator) 에서약 1ml 정도로농축한후시료보정을위해 Hexane 2~3ml를넣고최종 1ml로농축하였음. 농축된시료는 Agilent사의 Vial에담고내부표준물질을주입한후에분석하도록하였다. Table 4에 GC/MSD의분석조건을나타내었음

37 <PAH 류의기기분석 > - 미세먼지의유기성추출시료에서 PAH류 (acenaphthene, anthracene, benz(a)- anthracene, benzo(b)fluranthracene, benzo(k)fluranthracene, carbazole, chrysene, dibenz(a,h)anthracene, fluranthene, naphthalene, pyrene, phenanthrene 등 ) 를 GC-MS로분석하였음. Table 3. Contents of 16 PAHs No. Compounds No. Compounds 1 Acenaphthylene 9 Chrysene 2 Acenaphthene 10 Dibenzo(a,h)anthracene 3 Anthracene 11 Fluoranthene 4 Benz(a)anthracene 12 Fluorene 5 Benzo(b)fluoranthene 13 Indeno(1,2,3-cd)pyrene 6 Benzo(k)fluoranthene 14 Naphthalene 7 Benzo(ghi)perylene 15 Phenanthrene 8 Benzo(a)pyrene 16 Pyrene <AhR agonist 인 PAH 류의 EROD-microbioassay 분석 > - EROD 는 CYP1A 계열의효소로서 ethoxyresorufin 이 EROD 에의해형광을 띄는 resorufin 으로대사되는성질을이용하여측정하는기법임. - BEAS-2B(human normal lung epithelial cell line) 및 H4IIE(Rat hepatoma cell line) 세포에미세먼지추출시료를처치한후형성되는 resorufin 의형광을 fluorescence spectrophotometer (excitation 530nm, emission 588nm) 로측정하고 10-9 M 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p- dioxin(tcdd) 의

38 EROD 값을 100% 로하여미세먼지시료의 EROD 활성값과비교한 TIR 과 TCDD 와 미세먼지시료의 EROD 값에대한용량 - 반응의상대적인비를이용하여독성 등가치인 Bio-TEQs 로환산하여기기분석된 PAH 류에 I-TEQ 와비교분석함. Table 4. GC-MSD analysis conditions(phas) Method EPA TO-13A Instrument Analysis condition Model Agilent 7890A / ALMSCO Bench TOF-dx Colum HP-5MS (30m 0.25mm 0.25um) Rate /min Value Hold Time min Run Time min Column temp GC/TOF-MS Colum flow 2.5ml/min Inlet Heater 280 Split Ratio 10:1 Injection volme 1ul

39 3) 기타인체위해성관련유해물질분석 CO, THC, NOx 및 CO 2 분석 - 엔진동력계를이용하여운전모드별 (ESC 및 ETC) 발생되는 CO, THC, NOx 및 CO 2 를분석. 배출가스측정장치 (Horiba사, MEXA-7100) 는경유엔진의배출가스중 CO, THC, NOx, CO 2 를분석할수있는장치로서, 분석원리는 CO 및 CO 2 가비분산적외선분석법 (NDIR, Nondispersive Infrared), THC는열식불꽃이온화검출기법 (HFID, Heated Flame Ionization Detector), NOx는화학발광법 (CLD, Chemiluminescence Detector) 을사용함. VOC 분석 - 엔진동력계를이용하여운전모드별 (ESC 및 ETC) 발생되는 1,3-butadiene, benzene, toluene, ethylbenzene, m,p,o-xyelene 및 stylene을 GC-MSD에의해분석. 채취된시료는 6개의시료주입구가있는 Air-Sever 장치에테들백을주입하여열탈착시스템 (Unity Thermal desorber) 을사용하여저온농축함. 열탈착시스템장치를통한시료농축및전처리과정은 Purge & Trap 법을거치면서 Nafion Dryer를통해수분을제거하며시료물질을저온농축. 채취된시료는 TD의 cold trap -15 에서 VOCs성분을저온농축흡착시키고, 농축된시료를 300 로가열탈착하여 GC/MSD로주입 분석. Table 5에시료의전처리조건과 GC/MSD의분석조건을나타냄

40 Table 5. GC-MSD analysis conditions(voc) Instrument Analysis conditions Purge Prepurge Time(ml/min) 3 Trap Prepurge Time(ml/min) 0.2 Sample Flow Sample Flow Rate(ml/min) 20 TD Trap Low Temp( ) -10 Trap Desorb Trap High Temp( ) 300 Trap Hold Time(min) 5 Split Flow(ml/min) 10 Model Varian CP-3800 / Saturn 2200 Column DB-1 ( 60m X 0.32mm X 5.00um ) Temp( ) Rate( /min) Hold(min) Total(min) GC/MSD Column Temp Column Flow MS scan range 2.5ml/min 45 ~ 350amu

41 경유자동차에서의미세먼지에의한호흡기관련인체위해성영향평가 평가 1) 산화적스트레스에의한바이오디젤미세먼지시료의유전독성 (Genetic) 미세먼지의유전독성평가 < 세포주 > - 사람의폐정상세포 (human normal bronchial epithelial cell) 인 BEAS-2B 세포와햄스터난소세포 (chinese hamster ovary cell) 인 CHO-K1 세포를유전독 성평가에이용함 (Fig. 7, 8). Fig. 7. CHO-K1 cells Fig. 8. BEAS-2B cells

42 <Comet assay 시험 : Single cell gel electrophoresis (DNA 손상확인 )> - Singh 등 (1991) 의방법을변형시킨 alkaline(ph 13) 조건에서 CHO-K1 및 BEAS-2B 세포를이용하여미세먼지유기성추출시료를세포에처치하고 24 시간정도배양한후 DNA 손상을확인하였음 (Fig. 9). Fig. 9. Comet assay to identity DNA damage - Ethidium bromide(2 μg /ml) 로염색된손상된 DNA는한슬라이드당 100개의세포를형광현미경 (Leica DMLB; excitation filter nm, barrier filter 590nm) 에서 400배율로관찰하고 auto image analysis system(komet version 5.0; kinetic imaging LtD. UK) 을통해정량분석함 (Fig. 10)

43 Fig. 10. Comet image analysis software - DNA 손상의정도는 Olive tail moment(tail distance percentage of DNA in tail) 를이용하여나타냄. <in vitro cytokinesis-block micronucleus test(cbmn assay)> - in vitro 소핵형성시험을통하여미세먼지에부착된유해물질추출시료에대한염색체이상유발 (clastogen 및 aneugen) 에대한독성을평가하였음. - 1 cycle의유사분열이유도되어야만형성되는소핵의특성에따라세포분열이한번유도된세포만을확인하여실험하기위해세포분열마지막단계인세포질분열즉 cytokinesis를 block시키는 cytochalasin B를처치하여실험을수행하였음. - 8-well chamber slide에 well당배양액양은 200ml 로하여세포가약 개로되도록한후 cytokinesis 를 block 시킬수있는 cytochalasin B(cyt-B, 3μg /ml) 를배양액에처리하여 24시간동안부착시키고, 준비된시료는 vehicle농도가 0.1% 가넘지않도록시료를배양액에희석하여처치하였음. - 배양이완료된세포는 PBS (Phosphate buffered saline) 로두번세척하고

44 1% sodium citrate로 4 에서 5분간처치한후건조시켜 1% acetic acid가함유되어있는 methanol로 20분간실온에방치하여고정하였음. - 슬라이드를건조시킨후 RNAse(0.01mg/ml in 2 SSC) 로 37 에서 5분간배양하고이 slide를 2 SSC와증류수로각각세척하고건조시킨후 5% Giemsa로 20분간염색한후형성된소핵을 uplight microscope을이용하여 emulsion oil을처치한후 400 magnification에서관찰및계수하였음.(fig. 11, 12). - 실험의정확성을기하기위해적어도시료처치농도당각 2well씩실험하였고농도당 1,000개의세포를관찰하였음. - 소핵시험의양성판정은용량반응성이있고음성대조군에비해 3배이상의소핵형성이관찰되며염색후의세포밀도가대조군에비해 25% 이상감소되지않는경우로하였음. Fig. 11. In vitro Cytochalasin B micronucleus test for identifying chromosomal damage

45 Fig. 12. Micronucleus test observation 2) 미세먼지의후생유전적 (Epigenetic) 독성평가 미세먼지의 p53 관련폐암독성평가 < 세포주및세포독성평가 > - 미세먼지의 p53 의존적폐암독성평가를확인하기위해 BEAS-2B 세포와 p53 단백 억제제인 pifithrin-α 를처치한 BEAS-2B 세포를이용함. 이들세포에처치된미 세먼지의세포독성차이를 WST-1 assay 를통해분석함

46 <p53 의존성 apoptosis 확인 > - 미세먼지의 p53의존성 apoptosis 를확인하기위해미세먼지를세포에각각 6~72시간동안노출시킨후유도된 apoptosis를 apoptotic nucleosome 을선택적으로측정하는 cell death detection ELISA kit(roche Diagnositic) 를이용하여측정함. - 후생유전적독성영향을평가하기위해폐암발생및억제에중요한역할을담당하는 p53을보유하거나억제시킨세포 (pifithrin-α처치) 에서의 apoptosis 유도를비교 평가하여 p53 유전자의관련성을규명하였음. <p53 에관련된유전자발현확인 > - 미세먼지를 24시간노출시킨세포에서 total RNA 및단백질을추출한후 p53, bax, bcl-2, caspase 및 MDM2 등관련유전자들의 real-time PCR을수행하여 mrna 발현정도를확인하고 western blotting을통해단백발현양을측정함. 3) 바이오디젤경유자동차미세먼지에의한인체위해성관련성연구를통 한정책활용 < 외국의연구동향및정책조사 > - 외국에서의바이오디젤미세먼지에의한호흡기및급만성인체위해성 평가자료활용을통한정책반영사례를조사함. - 미세먼지위해성관련외국의연구동향분석을통해국내적용성을제시함

47 4. 연구결과 4-1. 바이오디젤의특성과바이오디젤및저감장치사용에따른 경제성평가 바이오에너지생산, 보급및기술개발동향 가. 수송용바이오연료의종류와특성 바이오에너지는광합성유기물 ( 주로식물체 ) 와유기물을소비하여생성되는바이오매스 (Bio Mass) 를직접또는생화학적및물리적변환과정을통해액체, 가스, 고체연료나전기 열에너지형태로이용하는것을의미함. 바이오에너지의활용방법으로는액체상태로변환시킨바이오에너지로바이오에탄올및바이오디젤등이있으며, 바이오매스를이용한전기생산, 열, 화학제품및차량고체연료등이있음. 1세대바이오연료인수송용바이오연료는식용작물을원료로사용하며이미관련기술이개발되어상용화된연료임. 그러나원료가식용작물이므로세계식량시장에혼란을초래하고도덕적문제를야기함. 바이오디젤은정유사에서생산되는경유와물성이달라바이오디젤전용엔진이외에는경유와의혼합비용이제한되고사용된식물의종류에따라바이오디젤의물성도차이가난다는점이바이오디젤확대사용에장애요인으로작용함

48 나. 바이오에너지보급 고유가및기후변화협약에따라신재생에너지의보급이늘어나고있으며특히수송용바이오연료로서휘발유에대체가능한신재생연료의필요성이크게높아지고있음. 자원공급의제한성을갖는화석연료의가격이계속상승하고, 식용유기물인경우식량원료로서공급제한및가격상승등지속적공급에불안정한요소가많음이지적되고있음. 바이오디젤은높은생산비용에도불구하고환경친화성이좋고신재생에너지라는장점때문에 EU를중심으로생산량이급격히증가하고있음. 선진국의경우수송부분에사용된에너지에의한온실가스증가율이가장높으므로수송부문에서의이산화탄소저감노력이매우중요한실정임. 따라서바이오연료가되는식물이자라는과정에서이산화탄소를흡수하므로전주기공정측면에서보면석유계연료에비해이산화탄소저감효과가크다고평가되고있음. EU에서는 2003년5월에 EU Directive 2003/30/EC를발효하여 2005년에자동차연료의 2%, 2010년에 5,75%, 2020년에 20% 를바이오연료로대체하기로목표를설정한바있으며, 2020년전세계자동차의바이오연료사용량은약 7% 전망로전망함. 독일, 이탈리아, 미국, 프랑스등은공공부문의바이오연료사용을의무화하였으며, 영국은신재생수송용연료의무화제도 (Renewable Transport Fuel Obligation) 를시행하여모든수송용연료공급자들은매년신재생수송용연료의주어진양을의무적으로판매해야하고미이행시다른회사로부터인증서를구입하거나 "Buy-out Price" 를지불해야함

49 다. 바이오에너지생산기술 바이오디젤은주로대두등전분질계바이오매스나동물성유지로부터생산하는기술이보편적이며생산공정은회분식과연속식이있음. 우리나라에서대부분채택하고있는회분식공정은간단하여투자비가적고품질관리가용이한반면생산성이떨어져소규모 (500~20,000톤) 공정에적합함. 반면연속식은디젤유생산성이높은장점이있지만투자비가크고운전이정밀해야한다는단점이있음. 바이오매스로부터수송연료를생산하는국내기술수준은전체적으로상업화전단계인현장실증단계의수준인것으로평가되며, 바이오에탄올과바이오디젤생산기술은현장실증단계의기술수준을보임. 바이오디젤은 2000년부터기술개발이시작되었으나국산화율이 77% 정도에이를정도로가장높은기술발전단계를보임. 바이오디젤의품질관리를위해품질기준을만들고국내차량을대상으로한실증운전도수행되고있음 바이오디젤의특성 바이오디젤이란유채유, 대두유, 팜유등의식물성기름, 우지와같은동물성지방, 폐식용유등다양한재생가능한자원을촉매존재하에메탄올과반응시켜생성하는지방산메틸에스테르로서순도가 95% 이상인것을말하며일반경유와물리화학적특성이유사하므로경유에대체또는혼합하여압축착화디젤엔진에사용할수있음. 혼합비율에따라 'BD2'( 바이오디젤 2%+ 경유 98%), BD10'( 바이오디젤 10%+ 경유 90%), BD20'( 바이오디젤 20%+ 경유80%) 이라함. Fig. 13과같이바이오디젤은크기가일정하고경유에는없는산소를포함하고있어연소를촉진시켜대기오염물질을저감시킬수있다

50 Fig. 13. Molecular structure of diesel and biodiesel 바이오디젤생산공정 - 바이오디젤의생산공정 ( 아래그림참조 ) 은반응기, 생성물의분리를위한침 강조, 정제및증발단계등으로구성 바이오디젤제조공정 - 바이오디젤의제조공정은회분식과연속식으로나뉘며회분식 ( 아래그림참조 ) 은소규모공정에, 연속식은대규모공정에사용 - 연속식의경우 Henkel 공정과 CD 공정이있음

51 현행경유와비교하여바이오디젤의장점을살펴보면, 1 재생가능한식물자원 ( 바이오매스 ) 에서생산되므로에너지자원의고갈문제가없고, 폐식용유등의폐자원을활용할수있음. 2 바이오작물의재배에서바이오디젤의생산및차량이용에이르기까지전주기 (life-cycle) 에서볼때에차량연료사용에따라서배출된이산화탄소는바이오작물의육성과정에서식물의광합성작용으로회수되므로그의순배출량은없음 (Fig. 14). Fig. 14. CO 2 life-cycle of soybean biodiesel

52 3 산성비의주범인 SOx를배출하지않고, 함산소연료 ( 산소 10% 이상함유 ) 이므로 PM이나 CO, HC 등디젤엔진의유해배출가스를저감. 4 세탄가가경유보다높아서압축착화엔진에그대로적용이가능하며, 경유에소량혼합하여사용하는경우에는엔진의개조가필요없고출력이나연비변화도거의문제시되지않음. 5 액상연료이기때문에기존의연료인프라를그대로활용할수있음. 6 윤활성이좋기때문에경유의초저황화에따른윤활성저하의대응책으로사용할수있음. 7 독성이적고, 생분해도가높아서유출시환경오염이적음 (3주이내에 90% 이상분해 ). 바이오디젤의단점으로는, 1 연료의안정성이경유에비해좋지않기때문에적절히제조또는관리되지않으면산가나수분함량의증가등연료품질의악화에기인하여엔진연료계금속부품의부식또는손상을유발할수있고, 연료분사인젝터의막힘이나실린더내카본퇴적의증가를유발할수있음. 2 경유에비해유동점이높기때문에한냉시의시동성악화를유발할수있음. 3 연료계통의일부고무재료등을열화시킬수있으므로고농도로사용하는경우에는재질변경이필요함. 바이오디젤은원료작물에따라서 Fig. 15과같이저온유동점 ( 포화지방산영향 ) 과산화안전성 ( 불포화지방산영향 ) 에영향을받지만바이오디젤은국내자급이가능한재생가능한바이오매스자원또는폐식용유를유효활용하여자동차연료의주류를점유하는석유계연료를대체할수있고지구온난화가스인이산화탄소와대기오염물질인 PM, HC, CO 등유해배출가스를크게저감할수있기때문에에너지원의다양화, 기후변화협약의대응, 대기환경

53 의개선등을위하여각국에서보급을확대하고있는유망한대체에너지원임. 또한온실가스배출량감축의일환으로바이오디젤을사용한만큼국가온실가스배출량에서삭감해주므로향후바이오디젤사용량이증가될것으로예상됨. Fig. 15. Characteristics by the component of Biodiesel 바이오디젤및저감장치사용에따른경제성평가 배출되는오염물질을저감하기위해서바이오디젤, 배출가스저감장치, 연료품질기준강화, 배출허용기준강화등다양한방법을사용하고있음. 본연구에서다루고있는바이오디젤과배출가스저감장치사용에따른경제성을 Mike Holland 등이제시한비용으로평가해해보면 Table 6에보는바와같이경유대신 BD10을사용하면 BD0 사용시배출되는오염물질을처리하는비용보다 328원의비용편익이발생하며 BD20을사용하면 842원의비용편익이발생함. 여기서산출된값이 1대에대한편익이므로여기에대형자동차등록대수를적용한다면더많은비용편익이발생함을알수있을것임

54 Table 6. Economic evalution by BD blending ratio(dpf(-)) 1) 인구 100 만기준 (EC), 1 =1,155 원 : PM 408,137 원 /kg, NOx 6,554 원 /kg, HC 3,276 원 /kg, CO 2,820 원 /kg, 배출량결과는본연구에서시험한결과를사용또한 Table 7에서보는바와같이배출가스저감장치를사용하면부착전에 1,896원에서 805원으로 1,091원의비용편익이발생하였고 BD10을사용하고저감장치를부착하면 1,568원에서 968원으로 600원의비용편익이발생하였음. 따라서바이오디젤과저감장치를같이적용한다면더많은비용편익이발생함을알수있었음. Table 7. Economic evalution by equipped with DPF

55 시내버스에서주로사용되고있는 CNG 연료와경유에대해오염물질을자동차오염물질배출량산정모드중국토해양부에서조사한 2008년도수도권시내버스평균차속인 21.2km/h와비슷한 NIER-6모드 ( 평균차속 19.9km/h) 를이용하여국립환경과학원교통환경연구소에서 2012년도에평가한결과를 Table 8에나타내었음. Table 8. Emissions level of Diesel city bus - CNG city bus CNG 시내버스가경유버스에비해 HC 와 CH 4 을제외한모든물질에서적게 배출되었으며 CO 2 는비슷함수준으로조사되었음

56 국내바이오연료의보급확대방안 국내의바이오연료보급활성화를위해서는우선, 연차별보급목표를설정하고이를이행하기위한구체적인보급계획마련이필요함. 개도국중심의자동차보급이더욱확대될것으로전망됨에따라연료사용량증가할것이며, 기후변화대책의일환으로바이오연료사용이전세계적으로확대될것으로보임에따라바이오연료수입에불확실성이수반될것이므로국내산바이오연료의이용확대를기본시책으로하여바이오연료의국내공급비중증대및해외조달분의공급안정성정책으로바이오연료의수급안정성을제고해야함. 우리나라의경우 BD20과 BD100에대한품질기준및시험방법이있으나, 유럽과같이통일되고보완된바이오연료품질기준제정및표준화가필요함. 유럽의경우난방용바이오디젤 (EN14213) 과차량용바이오디젤 (EN14214) 로구분하여규격화하고있으며미국의경우바이오에탄올에 ASTM D4806 규정함. 기존연료에비해공장도가격이높아가격경쟁력이낮고, 국내생산업체의생산기술및시장규모도미흡하여국내시장규모확대및바이오연료생산업체의기술력증대등을통한가격하락을유인하기위하여세제지원및재정투자등바이오연료보급확대를위한인센티브제도도입이필요함. 우리나라의경우바이오연료보급과관련된법규로는바이오디젤시범보급및이용을위한산자부고시와 석유및대체연료사업법 의품질기준항목개정, 수입판매부과금의징수등에관한고시등이있음. 일본의경우바이오연료제조와관련된법규정비는제조규모에따른소방법, 배수처리규모에따른하수도법및노동안전위생법, 산업폐기물처리법, 지방세법등이있으며, 바이오디젤자동차와관련해서도로운송차량법 ( 차량검사 ) 와지방세법등이정비되고있음. 우리나라의바이오디젤보급촉진과관련된법규현황은 Table 9와같음

57 Table 9. Laws and regulations in relation to biodiesel 관련법률 관련조항 주요내용및개정사항 ( 예시 ) 대기환경보전법 -제작차의배출허용기준 -법제31조, 시행규칙 현재바이오디젤사용시에도동일기준이적제67조별표20 용되고있음 -법제41조, 시행규칙 -자동차연료또는첨가제의제조기준제103조별표30 바이오디젤에대한구체적인기준마련필요 -국가및지방자치단체의책무 ( 폐기물적정처리 ) -법제4조 지자체의폐기물적정처리의무및폐기물처 폐기물관리법 -법제44조의2제1항제6호, 리에대한연구 개발지원시행규칙 -폐기물의재활용용도및방법 ( 폐식용유 ) 제46조제3항별표11의2 폐식용유의바이오연료재활용에대한구체 적인내용추가필요 -재활용가능자원의분리수거 ( 폐식용유수거 ) 폐식용유분리수거에대한구체적방안마련 필요 -법제13조자원절약과촉 -자금등의육성 ( 재활용산업 ) -법제31조진에관한법률 바이오연료의원료에대한개발및보급관련 -시행규칙제2조5항별표1 자금마련 -폐식용유를사용하여제조한유류 BD품질기준에적합하여야함 -법제6,11, 18, 19, 37조, -결격사유(BD20의석유정제업등록 ) 시행령제23조, 28조, 39조, -조건부등록(BD5(0.5%) 의등록 ) 41조등 -수입 판매부과금의징수등에관한고시 석유및석유대 -법제29조제5호 -유사석유제품의제조등의금지 ( 이용 보급 확 체연료사업법 -법제31조제2항, 제3항, 대할필요가있다고인정될경우예외 ) 제4항 -시행규칙 -석유대체연료의품질기준고시 (BD20, BD100) 제36조제1항별표7제2호 -석유대체연료의품질검사방법및절차등 -시행규칙제37조제4항 -석유대체연료의성능평가기준등고시 -바이오에너지등의기준및범위 -법제2조, 시행령제2조신에너지및 -신 재생에너지사업에의투자권고및신 재생 -법제12조재생에너지에너지이용의의무화등 -법제17조, 시행령제22조개발 이용 보급 -신 재생에너지발전가격의고시및차액지원 -시행령제19조촉진법 -신 재생에너지의이용 보급의촉진 -시행규칙제2조2 -바이오에너지설비 ( 바이오디젤, 바이오매스등 ) -주유취급소의위치 구조및설비의기준위험물 -법제5조제4항, 시행규칙 BD20에대한지정주유소설치를할경우에안전관리법제37조별표13 해당 -경유및이와유사한대체유류의세율교통에너지 -법제2조제1항제2호 바이오디젤에대한세율조정필요 (50% 감세환경세법율적용등 ) -재정지원및유가보조금지원화물자동차 -법제29조제1항, 제2항 화물차량에대한바이오디젤보급시유가보운수사업법조금대체방안마련필요 -석유류에대한특별소비세또는교통 에너지 환 조세특례제한법 -법제111조 경세의면제 농업및군용등의조세특례뿐만아니라바 이오디젤사용시특례기준마련필요 관계부처환경부환경부환경부산자부산자부행자부건교부산자부환경부건교부재경부

58 4-2. 바이오연료에대한국 내외정책및바이오디젤의인체위해성 연구동향 바이오연료및디젤차량에대한국내외정책동향 최근기술의발전과환경오염에대한관심이높아지고바이오디젤, 바이오에탄올등신재생에너지에대한보급과기술투자및경쟁력확보를위한정책이활발히시행되고있다. 바이오디젤사용을위한국내외바이오디젤도입정책동향을 Table 10에나타내었다. <EU 정책 > 유럽연합에서는 1990년대바이오연료에대한생산과사용이시작되었으며많은유럽국가에서상당히확장되었다. 프랑스를중심으로바이오디젤혼합유가주로버스와트럭의연료로사용되었으며, 스웨덴, 독일, 오스트리아등많은국가에서바이오디젤차량을대상으로보급하기시작하였다 년도에도입된유럽의경유품질기준 (EN590) 에따르면 2005년과 2010년에자동차연료사용비율을각각 2% 와 5.75% 까지경유에바이오디젤혼합사용을하였으나, 2020년까지 20% 까지혼합비율을하도록하는등바이오연료사용에대한정책은더욱강화될것으로보인다. < 일본정책 > 일본은바이오디젤연료사용을농업용트렉터에한정하였으나, 2006 년바 이오디젤생산을늘리면서관공서차량과청소차량으로까지확대하였고, 사용방식도 BD20 및 BD100 까지허용하였다

59 < 미국정책 > 미국은바이오디젤에관한연구및보급에대한체계적인정책을수립하고자 1992년에설립된 NBB(National Biodiesel Board) 를설립하였으며, 1997 년미국환경보호청에서미세먼지중 PM2.5를대기환경기준에포함하는등강화된규제를시행하는한편 2020년까지미국총디젤유의 30% 를바이오연료로대체하기로한바있으며국회에서는청정법률에따라 2000년도에바이오디젤을청정에너지로지정하였다. < 국내정책 > 국내에서는 2001년도에바이오디젤을차량용에너지로의사용에대한타당성조사를하여 2002년 5월부터시법사업및제도를개정하여바이오디젤을공식적으로사용하였다. 산업자원부에서제정한 바이오디젤시범보급사업추진에관한고시 및 BD20이 석유사업법 및 대기환경보전법경유품질기준 에따라적합하다는판정에따라수도권과전라북도에서바이오디젤 20% 혼합유를청소차량등에보급하였다. 2006년 석유및석유대체연료사업법시행령 개정으로동년 7월에아시아최초로바이오디젤상용화를시작하였다. BD20의경우겨울철저온시동성문제및연료계부품제작사들의품질보증거부등의문제로최대 BD5% 까지제한하여모든경유차량에서사용가능하도록하였고, BD20은자가정비와자가주유업체의버스, 트럭에서만사 용하도록하였다 년에는 바이오디젤중장기보급계획 을수립하였고 2009 년도에는 폐자원및바이오매스에너지대책 수립및 2010 년에 범부 처바이오에너지 R&D 추진전략 을발표하여바이오디젤의사용확대를위한 정책을지속적으로실시하고있다

60 Table 10. Policy and tendency in relation to biodiesel 국가 정책동향 도입추진경과 2001년 : 바이오디젤도입타당성검토 2002년 : 시범사업및제도개정 - BD20은 석유사업법 대기환경보전법경유품질기준 에적합판정 - 청소차량등에사용승인 2002년 ~2005: BD100의시범보급사업 ( 산업자원부 ) 2006년 : 석유및석유대체연료사업법시행령 개정 - 아시아최초로바이오디젤상용화개시 (2006년 7월 ) - BD5 : 모든경유차량사용가능 - BD20 : 자가정비와자가주유업체의버스, 트럭만사용제한 2007년 : 바이오디젤중장기보급계획 수립 2009년 : 폐자원및바이오매스에너지대책 수립 2010년 : 범부처바이오에너지R&D 추진전략 발표 한국 사용현황 BD 년 : 4.6 만kl사용, 2007 년 : 5.8 만kl사용 BD 년 : 20 kl사용, 2007 년 : 47 kl사용 중장기계획 BD 년에 0.5% 를시작으로매년 0.5% 씩높임 - 중장기적으로 5% 까지높이도록추진함 BD20 - 자가정비시설의의무완화, 외부위탁정비계약도허용 - 공공기관용차량 ( 청소차량, 트럭등 ) 에보급

61 유럽연합 바이오연료생산 - 유럽연합전체수송연료의 2.6% 에해당하는양생산 (2007년) 바이오연료공급계획 년 : 수송연료의 5.8% 년 : 수송연료의 10% 미국 바이오연료생산 - 바이오디젤83만kl (2006년), 바이오에탄올 35백만kl (2008년) - 미국전체수송연료의 4~5% 에해당하는양생산 년목표 : 1억3천kl생산 바이오연료공급계획 년 : 석유소비의 15% 대체 년 : 석유소비의 30% 대체 재생가능연료혼합의무화제도 시행중 (2005년부터) 바이오디젤 (BD) 사용방식 - 경유 80% + 바이오디젤20% - 관공서차량, 대형트럭, 공공버스 일본 바이오연료생산 - 바이오디젤1,500kl생산 (2006년) 바이오연료공급계획 년 : 일반차량을대상으로 E3시험보급 바이오디젤 (BD) 사용방식 - 바이오디젤100% - 경유 80% + 바이오디젤20% - 관공서차량, 청소차량 중국 바이오디젤생산 년목표 : 200만톤생산계획 재생가능에너지공급계획 년 : 10% 공급 년 : 16% 공급

62 독일 바이오디젤 (BD) 사용방식 - 바이오디젤 100% : 승용차, 대도시버스, 대형트럭 - 경유 95% + 바이오디젤 5% : 일반경유차량 프랑스 바이오연료공급계획 년 : 전체수송연료대비 2% 년 : 전체수송연료대비 7% 년 : 전체수송연료대비 10% 바이오디젤 (BD) 사용방식 - 경유 70% + 바이오디젤30% : 도심버스, 관공서차량 - 경유 97% + 바이오디젤3% : 일반경유차량 바이오연료의사용 수송연료로사용되는비중 년 : 2~3%, 2030 년 : 3~5% 을차지할것으로전망함 생산량 바이오디젤생산량 년기준 : EU 61%, 미국 16% 바이오에탄올국제 년기준 : 미국 47.8%, 브라질 41.5% 에너지기구바이오디젤혼합비율 일반적인차량 - 바이오디젤5% 미만혼합사용 특수운행차량 ( 관공서차량, 청소차량등 ) - 바이오디젤20~100% 혼합사용

63 미세먼지의인체위해성에관한연구동향 1998년도에인체건강에영향을주는미세먼지 (PM) 를측정하고자하는세계연구네트워크를미국, 영국, EU에서제안되어국제연합의 FRPE(Group de Rapporeteurs sur la Pollution et l Enegie) 내에서활동을시작하였다. 일본은 PM의계측법이나건강영향에대하여논의하기위하여 2001년 4월부터 JSAE( 일본자동차기술회 ) 에 PM 계측평가부문위원회가구성되어활동하고있으며, 국토교통성과환경성이후원하고, 자동차공업의, 연구기관, 대학, 계측기관계자등이참여하여나노입자와관련된국내의정보를집약하고, 제안하는장으로서역할을하고있다. 경제산업의지원하에있는 apan Clean Air Progrma Ⅱ에서는자동차로부터배출되는나노입자를포함한극미세먼지의배출실태나평가법의검토에더하여미립자의대기를시물레이션모델의개발을목적으로각종조사, 연구를실시하고있다. 1998년 Caterpillar Inc. 에서는대두유를디젤엔진연소에적용하여, 상용디젤을사용한경우에비해 HC의배출은많이줄어드나, 전부하상태에서 P.M. 의배출은다소증가한다고보고한바있다. Southewet Research Institute에서는바이오디젤의배출물특성을연구하여 EURO-5의대응가능성에대해연구를하고있으며, University of Wisconsin-Madison의 Engine Research Center에서는바이오디젤을모델링하기위한증발모델과, 연소메커니즘을개발하고 2009년부터 Department of Energy의지원으로바이오디젤을비롯한내연기관대체연료에대한연구원 GM, ford, Toyota를비롯한자동차제작사들과공동으로연구를진행하고있다. Table 11에바이오디젤사용에따라발생하는유해물질의건강위성영향을제시하였다. 이러한주변상황에맞추어국내에서는적적한대응및향후관련기준설정을위하여 2004년 12월환경부주관으로관련국내전문가들이모여 KPMP(Korea Particle Measurement Program) 의발족회의가이루어졌으며본회의에서는 KPMP의목적, 조직, 위원장선출, PMP Inter-lab test, 제1회

64 Table 11. Health effect of biodiesel associated exposures Health Effect Respiratory morbidity; carbon monoxide short term Cardiovascular morbidity; Neurological effects; and Mortality. long term Neurological effects; and Birth outcomes and developmental effects. nitrogen dioxide short term Impaired host-defence systems and increased risk of susceptibility to both viral and bacterial infections after NO2 exposures inflammation, particularly in the more sensitive subgroups such as children or asthmatics; Increased airway responsiveness to specific allergen challenges An association of respiratory effects with indoor and personal NO2 exposures in children at ambient concentration levels An association between short-term ambient NO2 concentrations and increased emergency department visits and hospital admissions for respiratory causes, especially asthma. long term decrements in lung function, asthma, respiratory symptoms

65 including decreased lung function, increased respiratory symptoms, and pulmonary short term inflammation increase all-cause and cardiorespiratory particulate matter mortality cardiovascular causes (PM10-2.5) a causal relationship between chronic PM exposure and respiratory morbidity long term cardiopulmonary mortality cardiovascular morbidity lung cancer mortality including decreased lung function, as well short term as increases in respiratory symptoms, airway injury and inflammation, and airway ozone hyper-responsiveness lung function growth in children, asthma long term development, respiratory mortality, and morphological changes in the respiratory tract Irritation of respiratory tract, skin and eyes short term Degenerative changes in the olfactory/respiratory epithelia acetaldehyde Exacerbation of asthma. long term Tissue damage in the respiratory tract Carcinogenesis in respiratory tract (animals)

66 Irritation of respiratory tract, skin and eyes Effects on lung function short term Effects on behaviour and performance, motor activity Allergic responses and/or asthma formaldehyde Adverse effects on respiratory epithelium (particularly hyperplasia and metaplasia), cell death and evidence of irritation and long term inflammation Carcinogenesis in nasal tissues (nasopharyngeal cancer) Allergic responses and/or asthma short term Developmental effects (fetal anomalies in mice) Carcinogenicity by inhalation - (lymphohaematopoietic cancers in 1,3-butadiene humans long term - variety of tumours in animals acrolein short term long term Genotoxicity of 1,3-butadiene metabolites Reproductive effects - gonadal atrophy in mice Upper respiratory tract irritation Decreased body weight and pulmonary function, as well as histopathological changes in the nose, airways and lung (animals) Upper respiratory tract irritant Histopathological effects in respiratory tract (animals)

67 Blood and bone marrow toxicity Immunotoxicity (animals) short term Neurotoxicity (high exposures: animals/humans) Developmental and reproductive toxicity - high exposures : animals benzene Blood and bone marrow toxicity Neurotoxicity (occupational/humans) Carcinogenicity long term - acute myelogenous leukemia in humans exposed occupationally and various tumours in animals Genotoxicity (clastogen) polycyclic aromatic hydrocarbons short term long term Carcinogenicity Genotoxicity in in-vitro and in vivo test systems (related to benzo[a]pyrene and 7,12-dimethylbenz[a]anthracene ) PMP Forum의개최에대한협의가구체적으로논의된바있다. 또한환경부협조하에교통환경연구소, 한국기계연구원, 자동차부품연구원, 한국에너지기술연구원, 자동차성능시험연구소, 한국과학기술연구원등연구기관으로구성된연구그룹과자동차제작사들로이루어진자동차공업협회를구성하여미세먼지에대한환경오염및위해성연구를수행하고있다

68 바이오디젤에관한연구동향 <Emissions of Regulated Pollutants and PAHs from Waste-cooking-oil Biodiesel- fuelled Heavy-duty Diesel Engine with Catalyzer> - 이연구는특정연료소비를분류하여조사하고바이오디젤혼합의타당성을평가하였다. 촉매와 HDDEs에서규제문제와 PAHs의배출량은폐식용유바이오디젤연료를계산하고비교하였다. 실험에서는 ULSD/WCOB( 폐식용유로부터만든바이오디젤 ) 조합은 PM, HC, 그리고 CO 배출은적었지만 CO2과 NOx 배출은 ULSD와비교하여증가했다. ULSD/WCOB 조합을사용하는것은 ULSD를사용하는것보다 PAH를14.1% 에서 53.3% 까지 PM은 6.80% 에서 15.1%, HC는 6.76% 에서 23.5%, 그리고 CO는 0.962% 에서 8.65% 감소시킬수있으나, CO2는 0.318에서 1.43% 그리고 NOx 는 0.384에서 1.15% 증가시킨다. 이결과는 WCOB가연소효율은증가시키고, PM, HC, 그리고 CO배출은감소시킨다. 바이오디젤의비율이높을수록 WCOB 내에 PAH가없기때문 PAH 배출이감소한다. BSFC는바이오디젤이낮은발열량을갖는결과로바이오디젤혼합을위해더높았다. <Particle-bound PAHs and Particle-extract-induced Cytotoxicity of Emission from a Diesel-generator Fuelled with Soy-biodiesel> - 이연구는석유디젤과대두바이오디젤이공급되는디젤발전기에서입자바인딩의 PAHs 및배출입자추출물에의한세포독성을표현하였다. 두개의검체는 D100 대신 S20 바이오디젤의사용은효과적으로 PAH( %), BaPeq( %) 그리고크기가다른 PM의농도 ( %) 로감소하였다. 연료만을사용한것은발전기에 1 m의직경을가지고있는 PM 의약 ¾가되는나노입자를배출하였다. 첨가가되

69 거나안되거나, 다양한직경과 PM의유기용매추출물을기반으로 S20 바이오디젤사용은 (67 % 의평균과 18-96% 로 ) D100는보다 U937에덜세포독성있다. 따라서대두바이오디젤 (S20) 는디젤발전기및 PM-관련된세포독성에서 PM의배출을줄이기위해화석디젤로대체역할을할수있다. <PM, Carbon, PAH, and Particle-Extract-Induced Cytotoxicity of Emissions from a Diesel Generator Fueled with Waste-Edible-Oil-Biodiesel> - 이결과는, D100 에비해, W20 을사용하여효과적으로 PM ( % ), 미립자 EC ( % ), 미립자 OC ( % ), 전체 PAHs ( %), 그리고엔진부하의디젤발전기에서방출되는모든크기의입자에관계없이총 BaPeq ( %) 를낮출수있는것으로나타났다. PM ( 81.3 % ) 의감소는폐호흡축적모드입자 ( PM0.1-1) 에서더높았다. PM10 방출의감소는주로축적모드입자 ( 88.7 % ) 에의해기여하였다. 3kW급엔진부하에 D100 또는 W20 를사용에도불구하고 no engine load 와비교하여 PM PM 는, 크기의 PM 의 OC 내용이모두감소하였다. 하지만 EC 내용물각각 % 와 % 의증가했다. 연료의 loading 관계없이, PM 배출은단일모달분포를나타냈으며서브마이크론크기범위 ( μm ) 을정점을보였다. 또한, 유기용매입자추출물 U937(μg 의 PM 당 ) 에대한세포독성은다른크기의입자에비해나노 (PM ) 와미세 ( PM ) 입자가높았다. D100 에비해, W20 를사용하면특히나노초미세입자 ( 감소 = 32-46% ), 3 kw급엔진부하에서 U937 모든크기의입자에서추출물 ( μg 의 PM 당 ) 에대한세포독성을줄일수있다고하였다

70 <The Effect of Palm Biodiesel Fuel on the Performance and Emission of the Automotive Diesel Engine> - 이연구는엔진실험에서엔진성능 ( 토크, 전력, 특정연료소비 ) 및오염물질의배출을팜바이오디젤혼합에디젤엔진실행의동작비교측정하였다. CO, HC의배출입자는바이오디젤혼합의증가와함께크게감소하였다. HC 배출의급격한감소가 20 % 혼합 (B20) 에서시작하였으며, 입자방출의감소는 10 % 혼합 (B10) 에서매우급격했다. 바이오디젤혼합이순수석유디젤원료와비교하였을때낮은 NOx 배출, 높은토크와힘을보여주었다

71 4-3. 바이오디젤혼합비율별경유자동차의미세먼지및유해오 염물질배출특성 바이오디젤을혼합비율별사용한경유자동차에서주행모드에따 라발생되는미세먼지 (PM2.5) 포집및배출특성분석 1) PM2.5 포집및측정결과 경유및바이오디젤 (BD0%, BD5%, BD10%, BD20%, BD100%) 을사용하 여 DPF 를부착하지않은 ETC 모드와 ESC 모드에서배출되는배기가스중 에포함 미세먼지를 cyclone 과미세먼지 sampler 를이용하여 20 회이 상반복측정하여누적포집하였다. 먼지포집량은경유 (BD) 및바이오디젤 (BD5%, BD10%, BD20%, BD100%) 을사용하여 DPF 를미부착한 ETC 모드에서 BD 는포집한평균값 0.05g/kwh, BD5, 10, 20 은포집한평균값이모두 0.04g/kwh 이였으며, BD100 인경우에는 0.03g/kwh 이였다. DPF(-) ESC 에서는 BD0, 5, 10 인경 우모두포집한평균값은 0.03g/kwh 이였으며, BD20 과 BD100 에서는 0.02g/kwh 로조사되었다 (Table 12). 따라서 BD 가증가할수록 PM2.5 발생량은유의적으로감소하는것으로나 타났다

72 Table 12. PM2.5 mass concentration in ETC, ESC equipped without DPF BD % ETC모드 (g/kwh) ESC모드 (g/kwh) 포집된경유자동차미세먼지중인체위해성관련유해물질분석 1) 디젤분진에흡착된 16 종의 PAHs 분석결과 디젤분진은 1μm이하의표면적이넓은매우작은입자로이러한특성에의해다양한화학물질들이흡착하게된다. 국제암연구소 (IARC) 에서는 2012년 6월 12일에발암물질 2A로분류 (1998년) 했던경유자동차에서의배기가스를 1로상향조정발표하였다. 디젤분진의돌연변이원성또는발암성과관련하여서는분진중함유된 PAH류가그원인물질로서알려져있으며연소과정중이들물질로부터산화성및질산성 PAH류등다양한물질이생성됨으로써보다복잡한독성을발현하게되는것으로보고되고있다. 디젤분진에함유된방향족화합물에의해발생되는 PAH류는발암물질로분류되어있는규제대상물질들로대표적인 16가지종류가있다. 분석된 PAH류에대한발암성정도를 IARC의발암성분류법에따라 Table 13에표시하였다

73 Table PAHs compounds and carcinogen classification 경유중에함유된방향족화합물에의해발생되는 PAH류에대해 BD 함량별그리고 DPF 미부착에대해 ETC모드및 ESC모드로포집된미세먼지를 Dichloromethane (DCM) 으로추출한후 16개의 PAH 물질들을 GC-MASS를통해분석하였다

74 2) 디젤분진에흡착된 16 종 PAH 류에대한 PAH-TEQ 산정 디젤 (BD) 및바이오디젤 (BD5%, BD10%, BD20% 및 BD100%) 을사용하여 DPF가장착되지않은 ETS 및 ESC모드에서포집된미세먼지를 DCM 으로추출한후대표적인 16개의 PAH류물질들을 GC-MASS를통하여분석하였다. DPF를부착하지않은 ETC모드의결과는 BD0에서 Naphthalene, Acenaphthene, Flourene, Phenathrene, Fluoranthene, Pyrene이측정되었고, BD5 에서 Naphthalene, Flourene, Phenathrene, Fluoranthene, Pyrene, 이측 정되었으며, BD10 에서는 Naphthalene, Acenaphthene, Flourene, Phenathrene, Fluoranthene, Pyrene, 이측정되었다. 또한 BD20 에서는 Naphthalene, Acenaphthene, Flourene, Phenathrene, Fluoranthene, Pyrenedl 측정되었으며, BD100인경우에는 Naphthalene, Flourene, Phenathrene만검출되었다. 각각측정된 PAH농도에대한합계 ( PAHs) 는 BD, BD5, BD10, BD20 및 BD100에서각각 , , , 및 mg /g로나타났으며, BD 함량증가에따라 BD100에서상당한감소를보였다 (Table 14). DPF를부착하지않은 ESC모드의결과는 BD0에서 Naphthalene, Acenaphthene, Flourene, Phenathrene, Fluoranthene, Pyrene이측정되었고, BD5 에서는 Naphthalene, Flourene, Phenathrene, Fluoranthene, Pyrene 이 측정이측ㅈ정되었으며, BD10에서는 Naphthalene, Acenaphthene, Flourene, Phenathrene, Fluoranthene, Pyrene이측정되었고, BD20에서는 Flourene, Phenathrene, Fluoranthene, Pyrene이측정되었다. BD100인경우에는 Naphthalene, Flourene, Phenathrene만이검출되었다. PAH류의농도에대한총합산량즉 Total-PAH류 ( PAH류) 는 BD, BD,5, BD10, BD20 및 BD100에서각각 , , , 및 mg /g로나타나발암물질로분류되어있는 PAH류가바이오디젤을연료로사용한경우현저하게감소하는것을확인할수있었다 (Table 15)

75 Table 14. Total PAHs and b(a)p-teq in ETC without DPF ChemicalMaterial Carcin ogen TEFa group Base-Diesel 0% ppm b(a)p- TEQ Base-Diesel 5% b(a)p-t ppm EQ Bio-Diesel 10% b(a)pppm TEQ Bio-Diesel 20% b(a)p-t ppm EQ Bio-Diesel 100% ppm b(a)p- TEQ Naphthalene 2B Acenaphthylene 4 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Acenaphthene ND ND ND ND Fluorene Phenanthrene Anthrancene 3 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Fluoranthene ND ND Pyrene ND ND Benz(a)anthracene 2A ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Benzo(a)pyrene 1 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Benzo(g,h,i)perylene 3 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Chrysene 3 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Benzo(b)fluoranthene 2B ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Benzo(K)fluoranthene 2B ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Dibenzo(a,h)anthracen e 2A ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Indeno(1,2,3-cd)pyrene 2B ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PAH a PAHs toxic equivalency factor with respect to BaP (Nisbert ICT, LaGoy PK. Toxic equivalency factors (TEFs) for polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). Regul Toxicol Pharmacol;16: ) b ND: Not Detected

76 Table 15. Total PAHs and b(a)p-teq in ESC without DPF ChemicalMaterial Carcin ogen TEFa group Base-Diesel 0% ppm b(a)p-t EQ Bio-Diesel 5% ppm b(a)p- TEQ Bio-Diesel 10% b(a)p-t ppm EQ Bio-Diesel 20% ppm b(a)p- TEQ Bio-Diesel 100% b(a)pppm TEQ Naphthalene 2B ND ND Acenaphthylene ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Acenaphthene ND ND ND ND ND ND Fluorene Phenanthrene Anthrancene ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Fluoranthene ND ND Pyrene ND ND Benz(a)anthracene 2A 0.1 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Benzo(a)pyrene 1 1 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Benzo(g,h,i)perylene ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Chrysene ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Benzo(b)fluoranthene 2B 0.1 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Benzo(K)fluoranthene 2B 0.1 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Dibenzo(a,h)anthracene 2A 1 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Indeno(1,2,3-cd)pyrene 2B 0.1 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND PAH a PAHs toxic equivalency factor with respect to BaP (Nisbert and LaGoy, 1992) b ND: Not Detected

77 3) PAH-TEQ 산정과위해성평가결과 대형경유차량에서배출된미세먼지의크기는나노입자정도의매우미세한입자이기때문에폐포까기유입이매우용이하다. 따라서이러한미세먼지에부착되어있는 PAH류또한폐포에유입이가능하여독성을유도할가능성이있다. 따라서위해성평가를수행할필요가있다고판단되었다. 유해성확인은 US EPA자료, IARC자료, 및 Wang 등 (2011) 의논문을근거로하여수행하고자한다. Wang 등 (2011) 은대기분진에흡착되어있는 PAH에대한인체위해성평가를수행함에있어검출된각각의 PAH류에대한위해성평가를하는것이아니라 PAH류분석치를 Benzo(a)pyrene(BaP) 독성당량치로환산한 B(a)P-TEQ치의합을이용하였다. 따라서본연구에서도 Table 18과 Table 19에서각 PAH류분석한결과를 BaP독성당량치로환산된값을활용하여위해성평가를수행하였다. 또한검출된 PAH류가미세먼지에흡착되어존재하므로인체위해성평가는흡입 (inhalation) 노출에의한평가로수행되었다. BaP 독성당량치를 BD, BD5, BD10 BD20 및 BD100에서 DPF 미부착한 ETC모드와 ESC모드상태에서계산한결과모두 0.000μg /g으로나타났다

78 4-4. 바이오디젤자동차에서발생되는미세먼지의인체위해성영향 가스상규제물질분석결과 BD 함량증가와 DPF 부착미부착에따른 Carbon monoxide(co), Total hydro carbon(thc), Nitrogen oxide(no X ) 및 Carbon dioxide(co 2 ) 측정 결과 ETS 모드인경우 BD0 는 CO, NO X HC, 및 NMHC 의값이각각 1.60, 0.11, 0.10 및 0.10g/kwh, BD5는 1.40, 0.11, 0.10, 0.10g/kwh, BD10 은 1.40, 0.11, 0.10, 0.10g/kwh, BD20은 1.20, 0.11, 0.10, 0.10g/kwh이었으며, BD100에서는각각 0.40, 0.13, 0.10, 0.10g/kwh 이었다 (Table 16, Fig. 16). Table 16. Characteristics of regulated emissions in ETC mode without DPF (g/kwh) by BD blending ratio BD % CO Nox*102 HC NMHC vs ETC mode, **p<

79 Fig. 16. Voc mass concemtration in ETC mode ESC모드인경우에는 BD 함량증가에따라 HC와 MNHC는영향이없는것으로보였으며, NOx의경우 BD 함량증가에따라영향을받지않았으나오히려증가하는경향을보여주었다. 이는 DPF 내입자상물질이누적되면서배압으로인한배기가스온도증가에의한것으로판단된다 (Table 17, Fig. 17)

80 Table 17. Characteristics of regulated emissions in ESC mode without DPF (g/kwh) by BD blending ratio BD % CO Nox*102 HC NMHC Fig. 17. Voc mass concemtration in ESC mode

81 휘발성물질 (VOCs) 분석결과 자동차배출가스중휘발성물질로는 1,3-butadiene, benzene, toluene, ethylbenzene, styrene, m,p-xylene 및 o-xylene이있으며이들중 1,3-Butadiene 및 benzene의경우 1급발암물질로분류되어규제관리가우선시되는물질이다. 본연구에서일반디젤연료 (BD0) 과바이오디젤 (BD5, BD10, BD0 및 BD100) 사용시발생되는휘발성물질들을비교분석하였다. BD 함량증가와 DPF 미부착한 ETS모드에서발생하는휘발성물질을비교분석한결과위해성이큰 Benzene, Toluene, Ethylbenzene 및 Xylene 에대해 BD 함량증가에따라서감소하는것으로조사되었다. 특히 Ethylbenzene과 Xylene의경우 BD0보다 BD5부터상당히감소하는경향을보였다 (Table 18, Fig. 18, Fig. 19)

82 Table 18. VOCs mass concentration in ETC equipped without DPF BD Benzene Toluene Ethylbenzene m,p-xylene o-xylene ±0.22 (n=3) 17.49±4.93 (n=3) 6.06±3.07 (n=3) 5.88±3.09 (n=3) 5.71±3.48 (n=3) ±0.21 (n=3) 12.92±1.33 (n=3) 2.69±0.09 (n=3) 2.40±0.13 (n=3) 1.88±0.15 (n=3) ±0.50 (n=3) 10.76±2.30 (n=3) 2.35±0.31 (n=3) 2.02±0.16 (n=3) 1.72±0.43 (n=3) ±0.10 (n=3) 5.53±0.75 (n=3) 1.41±0.24 (n=3) 1.61±0.28 (n=3) 1.21±0.30 (n=3) ±0.05 (n=3) 4.63±0.29 (n=3) 1.03±0.15 (n=3) 0.96±0.19 (n=3) 0.71±0.19 (n=3) n : Number of samples NE : Not Evaluate Values are significantly different from BD (**p<0.01, *p<0.05) or different from date in the absence of BD10 (##P<0.01, #P<0.05)

83 Fig. 18. VOCs mass concentration in ETC Fig. 19. VOCs( BTEX) mass concentration in ETC

84 반면, ESC모드에서발생하는휘발성물질을비교분석한결과 Benzene 및 o-xylene은일반디젤에비해바이오디젤에서유의적으로발생저감효과가나타났고 toluene 및 ethylbenzene의경우에는특히 BDd20과 BD100에서현격히저감되는경향이나타났다. 따라서디젤연료에바이오디젤을섞을수록휘발성물질이점점감소되는것으로판단되었다 (Table 19, Fig. 20, Fig. 21). Table 19. VOCs mass concentration in ESC equipped without DPF BD Benzene Toluene Ethylbenzene m,p-xylene o-xylene ±0.31 (n=3) 8.43±7.49 (n=3) 1.21±0.49 (n=3) 0.92±0.22 (n=3) 0.59±0.01 (n=3) ±0.06 (n=3) 5.79±0.12 (n=3) 0.75±0.11 (n=3) 0.65±0.14 (n=3) 0.54±0.21 (n=3) ±0.02 (n=3) 4.54±0.98 (n=3) 0.64±0.07 (n=3) 0.46±0.05 (n=3) 0.36±0.03 (n=3) ±0.01 (n=3) 1.30±0.27 (n=3) 0.29±0.01 (n=3) 0.25±0.01 (n=3) 0.22±0.01 (n=3) ±0.00 (n=3) 1.17±0.14 (n=3) 0.21±0.04 (n=3) 0.15±0.03 (n=3) 1.11±0.02 (n=3) n : Number of samples NE : Not Evaluate Values are significantly different from BD : *p<0.05 vs BD

85 Fig. 20. VOCs mass concentration in ESC Fig. 21. VOCs( BTEX) mass concentration in ESC

86 바이오디젤미세먼지의유전독성 (Genetic) 평가 a. CHO-K1 cell 의세포독성 디젤 (BD0%) 및바이오디젤 (BD10%, BD20%, BD100%) 에서포집한디젤분진을 DCM으로추출한후그추출물에대해 WST-1 assay로 CHO-K1세포에서의독성을관찰한결과 Fig. 22에서보는바와같이대조군의세포생존율 100% 로보았을때 BD10, BD20 및 BD100에서는각각 , , 및 % 로나타났으며대조군에비해유의적인차이는나타나지않아세포독성이없는것으로판단되었다. Fig. 22. Cell viability in CHO-K1 cells exposed to the soluble organic extract (SOE) of particulate matter (PM2.5). The cells were plated in a 96-well plate in regular growth medium. After 24 h in 5% CO 2 incubation, the cells were treated with the Vehicle control (dimethyl sulfoxide), MMC (mitomycin C), BD, BD10, BD20 and BD100 for 24 h. The assay were carried out as described in Materials and Methods. The results are expressed as mean ± S.D. of five separate wells for each samples

87 b. DNA 손상 DNA손상을관찰하기위하여시료양이매우적은환경시료에서 DNA손상을확인할수있는우수한방법으로현재널리사용되고있는 OECD guideline 에 draft되어있는 In vitro comet assay 실험방법을사용하였다. 바이오디젤 BD 함량별시료를 DCM으로추출한후그추출물을 Chinese Hamster Ovary cell(cho-k1 cell) 에노출시켜 DNA 손상을관찰하여 Fig. 23에나타내었다. 바이오디젤분진시료를이용하여 In vitro comet assay를수행한결과양성대조군으로사용된 hydrogen peroxide(h 2 O 2 ) 의경우대조군에비해유의적 ( ** P<0.01) 인 DNA손상이증가되었고, 디젤및바이오디젤시료의경우도대조군에비해유의적 ( ** P<0.01) 으로 DNA손상이있는것으로조사되었다. Fig. 23. DNA breakage in CHO-K1 cells exposed to the soluble organic extract (SOE) of PM2.5 by using by the comet assay

88 Hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) was used as positive control. Cell were incubated with BD, BD10 BD20 and BD100 or H 2 O 2 in RPMI supplemented with 5% FBS. The assays were carried out as described in the Materials and Methods section. The results are expressed as mean ± S.D. of five separate experiments for each samples the olive tail moment(%dna in tail distance between centers of mass). Values are significantly different from the control (CON): **p<0.01. c. 소핵형성 바이오디젤시료에대한염색체손상은 in vitro cytokinesis-block micronucleus test를통해관찰하였다. 그결과 Fig. 24에서와같이양성대조군으로사용된 Methyl Methane Sulfonate(MMS) 의경우에대조군에비해유의적 ( ** P<0.01) 으로소핵형성이증가하는것으로확인되었으며 BD0에서도또한대조군에비해유의적 ( ** P<0.01) 으로염색체손상이증가함을확인할수있었다. 그러나 BD10, BD20 및 BD100 처치군의경우에는대조군에비해소핵형성이유의적으로증가하지않았으며 BD0에비해유의적 ( ## P<0.01) 으로염색체손상이감소됨을확인할수있었다. 따라서바이오디젤이염색체손상을감소하는효과가있는것으로판단할수있었다

89 Fig. 24. Effects of oxidant modulators on MN formation by the soluble organic extract (SOE) of PM2.5 in CHO-K1 cells. The cell exposed to cytochalasin B was treated with Methyl Methane Sulfonate (MMS, 50μg / ml ), BD, BD10, BD20 or BD100 in RPMI supplemented with 5% FBS. The assays were carried out as described in the Materials and Methods section. The results are expressed as mean ± S.D. of four separate experiments for each samples the MN frequency per 1000 cell. Values are significantly different from control (CON) : ** P<0.01 and higher than MMS : ## P<0.01. d. 염색체이상 바이오디젤시료에대한염색체이상은 in vitro Chromosome Aberration assay를통해관찰하였다. 염색분체결손 (chromatid gap, ctg), 염색분체절단 (chromatid breakage, ctb), 염색분체교환 (chromatid exchange, cte), 염색체결손 (chromosome gap, csg), 염색체절단 (chromosome breakage, csb) 및염색체교환 (chromosome exchange,

90 cse) 의염색체이상유무를측정하였으며, 결과는 Table 29에나타내었다. 염색체이상물질인양성대조군 Mitomycin(MMC) 는 67개만이정상을나타내어양성의염색체이상을나타내었으며 BD0에서는 4개의 chromatid gap, 1개의 chromatid exchange, 1개의 chromosome gap, 1 개의 chromosome breakage를제외하고 93개모두정상을나타내었으며, BD10에서는 2개의 chromatid gap, 1개의 chromosome gap, 3개의 chromosome breakage를제외하고 95개모두정상을나타내었다. BD20 에서는 2개의 chromatid gap, 1개의 chromatid exchange, 2개의 chromosome gap를제외하고 97개모두정상을나타났으며, BD100에서는 2개의 chromatid gap, 1개의 chromatid exchange, 1개의 chromosome gap를제외하고 98개모두정상을나타내었다. 통상자연발생의염색체이상평균출현율은 3% 를초과하는일이거의없으므로 5% 미만의염색체이상평균출현율을음성으로판정한다. BD, BD10, BD20 및 BD100을노출시킨 CHO-K1 세포에서염색체이상비율은 Table 20에서보는바와같이 7%, 5% 3% 및 2% 로나타났다. 따라서바이오디젤이염색체이상을감소하는효과가있는것으로판단할수있었다

91 Table 20. The chromosome aberration in CHO-K1 cell exposed to soluble organic extract (SOE) of PM2.5 1) 2) Mitomycin C (Positive control) Explanation of aberration ctg: chromatid gap; ctb: chromatid breakage; cte: chromatid exchange; csg: chromosome gap; csb: chromosome breakage; cse: chromosome exchange; nor: normal

92 유기성추출물의독성평가 a. BALB/c 3T3 A cell 의세포독성 디젤시료유기성추출물노출시킨 BALB/c 3T3 A31 에서의세포독성을 Crystal violet 법을이용하여측정하였다. Fig. 25 에서보는바와같이대조군 에비해세포독성이나타나지않았다. Fig. 25. Cytotoxicity of soluble organic extract was evaluated by the Crystal Violet method. Cells were incubated with BD0, BD10, BD20 and BD100 in RPMI supplemented with 5% FBS. The assay were carried out as described in Materials and Methods. The results are expressed as mean ± S.D. of three separate wells for each samples