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1 완결과제최종보고서 일반과제 ( ), 보안과제 ( ) ( 과제번호 : PJ007410) 음파를이용한시설재배작물병해충관리기술개발 Development of pest control techniques for greenhouse crops using sound waves 국립농업과학원 농촌진흥청 제출문 - 1 -

2 농촌진흥청장귀하 본보고서를 음파를이용한시설재배작물병해충관리기술개발에관한연구 과제의 보고서로제출합니다. 연구수행기간 : ~ 제1세부연구과제 : 음파를이용한시설재배지주요해충의발생밀도억제기술개발제2세부연구과제 : 시설재배주요식물병억제특정음파영역확인및선발제1협동연구과제 : 음파가진딧물의생리및행동에미치는영향분석및방제응용제2협동연구과제 : 스트레스음파의곤충생리교란제3협동연구과제 : 음파가작물의병충해저항성에미치는영향의분자생물학적원리규명제4협동연구과제 : 농작물병해충방제용최적음파장치연구및제작 주관연구기관명 : 국립농업과학원주관연구책임자 : 이상계연구원 : 박창규, 지창우, 이승범, 이성곤, 서은정, 이정한, 이수경, 강재연, 최누리, 이선주, 황화경, 서남열, 리팅, 정충렬, 라훌, 람잔, 박현지, 김민중, 신효섭, 정석현, 이동근, 김인덕, 양윤모, 정로덕, 이영수, 김원종, 김주섭, 백규림, 이미영제 1 세부연구기관명 : 국립농업과학원제 2 협동연구책임자 : 이상계제 2 세부연구기관명 : 국립농업과학원제 2 세부연구책임자 : 정미정제 1 협동연구기관명 : 이화여자대학교제 1 협동연구책임자 : 장이권제 2 협동연구기관명 : 안동대학교제 2 협동연구책임자 : 김용균제 3 협동연구기관명 : 한국과학기술원제 3 협동연구책임자 : 김수용제 4 협동연구기관명 : 그린테코 ( 주 ) 제 4 협동연구책임자 : 이상훈 주관연구책임자 : 이상계 주관연구기관장 : 라승용 직인 - 2 -

3 요약문 Ⅰ. 제목 음파를이용한시설재배작물병해충관리기술개발 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 온실내미소해충에의한피해증가 - 시설재배지증가에따른시설지내병해충피해증가 - 시설지내특수성으로인한연중병해충발생및발생주기가짧은문제가대두 친환경적방제필요 - 기주식물의유통과정에서시설지내침입이용이한미소해충을제거하기위한화학적방제의특성상잔류독성및약제저항성개체발생등의부작용발생 - 기존방제를대체하거나보조하여미소해충을효과적으로방제할필요성커짐 - 국가적차원에서효과적방제법을통하여작물재배자및농민들에게경제적인안정감을제공해야할필요성이대두 Ⅲ. 연구개발의내용및범위 음파에대한아메리카잎굴파리의행동반응조사및방제기법개발 - 구애노래를이용한아메리카잎굴파리유인효과검증 - 저주파음을이용한아메리카잎굴파리의행동교란효과검증 시설재배지주요작물병원균대상생장억제가능한최적음역대군선발 - 병원성곰팡이균에대한음파처리효과조사 - 세균에대한음파처리효과조사 음파에의한행동교란이진딧물발육및생장에미치는영향평가 - 최적음파를통한진딧물발육및섭식행동에미치는영향확인 - 최적음파를통한진딧물생식률에미치는영향확인 스트레스음파에대한해충의생리적스트레스기작해석 - 파방나방, 배추좀나방복숭아혹진딧물, 아메리카잎굴파리에대해서높은효율로생리억제를주는음파범위를생물검정으로결정 - 스트레스음파의본질을규명하기위해전사체분석및물질분석을통해분자생리적기작을규명 단백질분자의동역학적특성을형광수명변화를통해측정 - 생체분자의동역학적특성을측정하귀위한광학장비를구축 - 3 -

4 - 단백질분자의동역학적특성을형광공명에너지전이를통한형광수명변화를통해측정 농업해충및식물병원균방제를위한음파발생장치시제품및자동화시스템개발 - 무향시스템및음파발생장치제작하여실용화를위한음파발생경량화및내구성모듈개발 - 음파발생장치시제품및자동화시스템개발 Ⅳ. 연구개발결과 음파에대한아메리카잎굴파리의행동반응조사및방제기법개발 - 수컷의구애노래에대한아메리카잎굴파리의유인효과는나타나지않았음 - 온실에서저주파음을높은음압으로방출하였을때아메리카잎굴파리의우화율이감소함 시설재배지주요작물병원균대상생장억제가능한최적음역대군선발 - 주요식물병원균 9종 ( 곰팡이 7종및세균 2종 ) 대상생육억제최적음역대선발 - 선발한최적음역대의음파를처리한결과병원균의균사및포자, 유주자발아역제현상이관찰되었으며운동성도감소함 음파에의한행동교란이진딧물발육및생장에미치는영향평가 - Electro Penetration Graph (EPG) 를이용하여복숭아혹진딧물의섭식행동을저해하는최적음파탐색 - 섭식저해최적음파가섭식행동은감소시키나번식률에는영향을미치지못함 스트레스음파에대한해충의생리적스트레스기작해석 - 파방나방은 30 khz 이상의주파수에서전생애생리적교란을확인하였고복숭아혹진딧물과아메리카잎굴파리는고주파인 5,000 Hz에서생리적스트레스를관찰하였음 - 아메리카잎굴파리를대상으로분석한전사체연구에서지질동원호르몬의방출을증가시키는효과를나타내, 이화작용은억제하나동화작용을증가시키는형을관찰하였음 - 또한변태와관련된유전자발현을억제하고신경계및면역계유전자발현을교란을관찰함 단백질분자의동역학적특성을형광수명변화를통해측정 - FTET, Lifetime, FCS 등의형광실험을진행할수있는공초점현미경을기반으로하는광학시스템을구축 - 비발광비활성화반응의원인에삼중항상태에의한것임을 FCS를이용해밝혀냈고, 이러한비활성화반응이점성에영향을받는특성임을규명 농업해충및식물병원균방제를위한음파발생장치시제품및자동화시스템개발 - 전체흐름설계도제작및음파발생장치시제품및자동화시스템방법구축 - 4 -

5 - 음파발생장치시제품제작및농가현장적용시험시행 Ⅴ. 연구개발결과의활용계획 친환경적병해충관리기술에응용음파를통한해충의방제기술에응용 - 스트레스성음파발생장치를영농현장에적용, 친환경적병해충관리기술체계구축 - 존의방제기술과연계활용하여해충에의한피해를완화시킬수있을것으로기대함 음파에의한방제및보조를타종으로확대 - 음파자극이진딧물및아메리카잎굴파리, 파방나방에행동및생리에교란을주는것으로나타남 - 온실내에발생하는다른해충종에서도음파에의한방제보조혹은방제효과를볼수있을것으로보이며연구방법을타종에적용시켜타종에서음파가미치는영향을관찰하는데활용 음파를활용한병방제및불량환경에대한작물의방어능력을향상시킬수있음 - 원하는시기에음파를처리하여식물이보유한다양한유전자들을인위적으로발현시켜병및불량환경에저항하는자체방어기작유도가가능하여기존화학농약사용에의해야기되는문제점을해결하는데기여할수있음 - 기존화학농약사용에의해야기되는문제점을해결하는데기여할수있음음파처리를통해식물체의생육조절또는생리대사조절도가능할것으로예상되어그용도가매우다양함 FCS를통한타켓 DNA/RNA localization이라는새로운연구분야를개척함 - 이러한기술을통해음파와같은외부자극이세포혹은생명체에가해졌을때일어날수있는미시적인효과를측정할수있는중요한기술로활용가능 - 5 -

6 S U M M A R Y Title : Development of pest control techniques for greenhouse crops using sound waves Recently, pest and disease damage of crops in greenhouse have been increasing as increased of a number of greenhouse. The increasing complexity of pest and disease problems crop products under greenhouse led growers to apply intensive chemical programmes, which result in pest and pathogens becoming resistant to the most frequently used pesticides in a few years, which, in turn, increases control costs. As control costs increase, pesticide-resistance spreads and consumers become aware of the risks of pesticide-residues in fresh vegetables, a strong demand for non-chemical control methods is emerging. It is for this reason that an effective and environmentally sensitive approach to pest management is going to be need and sound waves is receive the attention as specially a low costing and effective solutions. This purpose of this studies are development of novel insect pest control technique using stress sound treatment to agricultural environment by enhancing the efficacy of current insect pest control tractics. For aggression, defense against predators and sexual behavior, 10 different of insect use acoustic signals as communication cues. In this study we have tried to explain characteristics of insect sound such as sound generation, function and its response behavior through the observation of several pest including Spodoptera exigua, Plutella xylostella, Myzus persicae, Liriomyza trifolii, which give serious economic damages on crops cultured in green houses. In reponse to various sound treatments, target insect pests were analyzed in their physiological processes in larval growth and feeding behavior, pupa-to-adult metamorphosis, and adult reproductive capacity development. The metamorphosis rate of L. trifolii under the greenhouse environment was decreased after treatment of low frequency sound (20 Hz). When aphids were exposed to the stimuli with 100 or Hz, honey dew production was most significantly reduced, and regular intervals moving occurred most significantly often and longer. In S. exigua, 30 khz or higher sound frequencies gave significant physiological stresses on immature and adult developmental stages. In M. persicae and L. trifolii, 5,000 Hz sound treatment gave a significant physiological stress. A whole transcriptome analysis was analyzed in L

7 trifolii using NGS technique, in which sound treatment induced gene expression of adipokinetic hormone signals, which suppressed catabolic gene expression, but increased anabolic gene expression. The stress sound treatment also suppressed gene expression associated with metamorphosis and singificantly altered gene expression associated with nervous and immune responses. And we constructed the system to investigate the dynamic property of the biomolecules. Using this system, We investigated the dynamic property through the lifetime analysis of the FRET. We attempt to determine the deactivation mechanism of hybridization-sensitive DNA probe using absorption and fluorescence spectroscopy and FCS technique. Additionally, we tried to use specific sounds to control pathogens by examining the growth inhibition of fungi and bacteria. When a single specific sound frequency was applied to Botrytis cinerea growing on solid medium, mycelial growth was inhibited and spore formation was reduced. 5kHz sound waves create stressful growth conditions for the fungus, which lead to the inhibition of mycelia growth and spore germination. It is possible that sound wave treatment could represent an environmentally-friendly alternative to chemical fungicides. These results shows the possibility that sound waves could be an alternative tool for pest management. And new development is specially effective solution to provide the sound waves strength per installed area for farmers and gardeners

8 목 차 제 1 장서론 1 제 2 장국내외기술개발현황 3 1 절국내기술개발현황 3 2 절국외기술개발현황 3 제 3 장연구개발수행내용및결과 6 1 절음파에대한아메리카잎굴파리행동반응조사 6 2 절저주파음에대한아메리카잎굴파리반응조사 11 3 절병원성곰팡이에대한음파처리효과 12 4 절세균에대한음파처리효과 19 5 절진딧물의행동표구축및음파에대한행동변화관찰 23 6 절스트레스음파가미치는아메리카잎굴파리의생리변화및농약감수성제고효과 29 7 절스트레스음파가미치는복숭아혹진딧물의생리변화및농약감수성제고효과 36 8 절스트레스음파처리에따른파밤나방체내생화학적변화 41 9 절발현유전체분석을통한스트레스음파에대한곤충생리에미치는영향평가 절스트레스음파를이용한해충방제기술개발 절말토즈결합단백질의수용액상에서의구조변화확인실험 절혼성결합민감 DNA 프로브의광화학적특성측정실험 Ⅰ 절혼성결합민감 DNA 프로브의광화학적특성측정실험 Ⅱ 절병 해충방제를위한음파발생장치및분석을위한모듈제작및장치개발 절음파발생장치시제품및자동화시스템 102 제 4 장연구개발목표달성도및대외기여도 106 1절목표대비대외달성도 106 2절정량적성과 107 제 5 장연구개발결과의활용계획 112 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 113 제 7 장기타중요변동사항 114 제 8 장국가과학기술종합정보시스템에등록한연구장비현황 115 제 9 장참고문헌

9 제 1 장서론 최근시설재배지증가로인하여시설지내병해충피해도함께증가하고있다. 시설지내특수성으로인해연중병해충이발생하고그주기또한매우짧아서재배작물의생육과경제성에악영향을미치기때문에이들을보다효과적으로안전하게제어하기위한제어법이필요하다. 그러므로해충개체군을조절함으로써작물재배자및농민들에게경제적인안정감을제공해야할필요성이대두되고있다. 특히응애류와진딧물류, 총채벌레류등크기가작고, 온실내에서일년에여러세대가발생되는미소해충들의피해가늘어나고있다. 이들미소해충은기주식물의유통에동반하여시설재배지내침입이용이하기때문에이러한위생및농업해충을방제하기위해주로화학적방제제들이이용되고있으나잔류독성의문제및약제의오용이나남용에의한약제저항성개체발생등의부작용도발생하고있다. 현재친환경적인음파등자연현상을활용한새로운농업기법에대한투자가크게확대되고있으나, 음파를이용한병 해충의친환경적방제에대한연구가국내에는아직미흡한상태이다. 식물에음악을들려주어생육을촉진하려는시도는 1860년경진화론을주장한찰스다윈에의해최초로시도된이래, 1950년인도의싱교수가인도의전통음악인라가를벼, 땅콩및담배에들려주어수확량증가를이룬적이있다. 이는음파가식물세포에공명현상을일으켜신진대사를자극하고음향에너지가세포분자및원형질의운동을촉진시킴에기인한것으로알려지고있다. 종래의생육촉진방법에사용된음악은주로 4,000Hz의이상의고주파를사용하는동시에오케스트라에의한심포니연주음악과유사한복잡한음악을사용하기때문에인간의청신경을자극하여스트레스를유발시키며, 인공음으로듣기에도거북하여재배자의작업능률이떨어지고식물의생육촉진효율이떨어진다는문제점을지니고있었다. 일부곤충은짝을찾는통신수단으로소리를이용하고있다. 파리목및메뚜기목의곤충에서구애노래및유인노래를이용하여상대방을유인하는것은많이알려져있다. 또한소리통신은곤충과포식자의관계에서도나타나고있다. 밤나방의경우박쥐의음파탐지신호를탐지하는청각신경을찾고이신경의전기적반응을밝혔다. 스트레스음파에대한연구는척추동물을중심으로연구되었다. 쥐의경우급성스트레스음파에대해서스트레스성무통각증 (antinociception) 을유발하는반면, 장시간스트레스음파노출에대해서는반대로만성통증 (fibromyalgin) 또는류마티스관절염을유발하여스트레스음파가신경계와면역계에해로운영향을줄수있다고밝혔다. 하지만작물병 해충방제와관련한음파연구는국내에서연구한그린음악을이용한병 해충방제이외에는거의전무하여보다집중적인연구를수행할필요가있을것으로판단되었다. 국내외모두기존의연구들은주파수의조절이나특정음악을들려줌으로써농작물의생육에어떤거시적인변화가보이는지를밝힌연구가대부분이 - 1 -

10 었다. 음파에대한해충의행동변화나살충률, 생리적원리에대한분자생물학적연구는별다른진전이없는상태이고, 아직분자생물학적관점에서이문제를다루려고한시도는거의없었다. 이에본연구는시설재배작물에발생하는병 해충의제어를위한장치를설계, 제작하여친환경적인제어기술을확보하고자하였다. 음파가주요해충의행동및생태에미치는영향을연구하여직접적으로의사소통을교란하여대상해충의방제기술을개발할수있을것으로판단되었다. 또한스트레스성고주파및저주파소리가곤충의생리작용에미치는영향을분석하고, 이를토대로스트레스음파에기인된곤충의발육상황및면역생리를연구하고자하였다

11 제 2 장국내외기술개발현황 제 1 절국내기술개발현황 작물병 해충방제와관련한국내음파연구는 그린음악 을이용한병 해충방제이외에는거의전무하였다. 농촌진흥청에서자체개발한 그린음악 을누에에들려준결과알을낳는양이최대 22% 까지증가되었고, 복숭아혹진딧물이발생한배추잎에 그린음악 을들려준결과진딧물밀도가현저히감소되었다 ( 이, 1995; 이, 1999).. 하지만 그린음악 은음파에대한해충및작물병에대한행동변화나구제적인생리변화에대한조사가미비하였다. 특정음악이농작물의생육에도움이된다는것을밝히고이에특정아미노산이관여한다는연구결과가있으나아직까지음악이어떤원리로화학작용을촉진하며이를통해생육에도움을주는지에대한연구는이루어진적은없었다. 제 2 절국외기술개발현황 국외에서는국내연구보다는좀더다양한분야에서음파에대한연구가이루어졌었다. 특정주파수에서의식물의생장에관한연구와 noise와 music이생장에미치는영향에대한연구는비교적많이되어있으나구체적인작용기작이밝혀지지는않았다. 음파에대한곤충의생리변화연구로는초음파와나방류의신경생리연구에대해서알려져있다. 박쥐류가내는초음파에대해서밤나방류인 Helicoverpa armigera는발육시기별로다양한 acetylchoniesterase 활성변이를보이며, 이는이해충의콜린신경계에대해서초음파가작용하는것을입증하여주었다 (Canadian Entomologist 140: ). 고주파를이용한나방류교미교란응용연구는고주파를이용하여짚시나방의교미교란방제에응용하고있다 (Environ. Entomol. 7: 45-52). 음파를이용한해충의방제는트랩을이용한방법이많이연구되었다. 해충을유인하여방제하는트랩은 3가지종류를들수있다. 빛을이용한트랩은많은종류의해충에적용할수있지만상대적으로적은수의개체만을유인한다. 화학물질 ( 주로페르몬 ) 을이용하는트랩은유인할수있는곤충의종류는적으나빛을이용한트랩보다는많은개체를유인하여방제할수있다. 소리를이용한트랩은다른트랩에비해가장덜알려져있는데화학물질을이용한트랩과유사하다 (Walker, 1988). 소리를이용한트랩은대상곤충의유인노래를주로이용하며경우에따라서는대상곤충의먹이나기생생물의소리를이용하기도한다. 소리를이용한트랩은 1949년에 Kahn과 Offenhauser에의해처음시도되었다. 그들은쿠바의습지에서녹음된소리를이용하여모기 (Anopheles albimanus) 를고압이흐르는스크린위로유인을하였다. 이후 Belton(1967) 과 Ikeshoji et al.(1985) 등에의해모기를유인하는소리트랩은개량되었다. 농업해충을방제하기위한최초의소리트랩 - 3 -

12 은땅강아지를방제하기위해만들어졌다 (Ulagaraj와 Walker, 1973; Walker, 1988). Sca pteriscus acletus와 S. vicinus는미국남서부에서농작물에해를끼치는곤충인데방제하기위해서실제로녹음한유인노래와유사하게모방한노래를이용하여트랩이제작되었다. 기록 (Walker, 1982) 에따르면하룻밤에최고 3,297마리 (S. acletus) 를잡기도하였고매년평균수천마리를방제하였다고한다. Forrest(1983) 의경우에는소리트랩을이용하여 Scapteriscus spp. 를방제하였고 Chukanov와 Zhantiev(1987) 는 Gryllotalpa spp. 를방제하기도하였다. 귀뚜라미과인 Teleogryllus commodus는오스트레일리아와뉴질랜드의목초지해충으로 Campbell과 Shipp(1974, 1997) 에의해소리트랩이개발되었다. 앞서의땅강아지의경우와마찬가지로 Teleogryllus commodus의소리트랩은실제유인노래와모방한노래를함께사용하였으며암컷과수컷모두잡을수있도록고안이되었다. 북미의경우에는귀뚜라미인 Gryllus속의소리트랩이만들어졌다 (Cade, 1981; Walker, 1988). G. rubens 소리트랩의경우 3년의테스트결과한해평균 8,209마리를잡기도하였다 (Walker, 1988). 채집된 G. rubens 중 44% 는수컷이었다. 농업해충을방제하기위해서천적을유인하는연구도있다. 기생파리 (Tachinid) 의경우귀뚜라미나여치의노래소리를듣고찾아온다. Cade(1981) 는귀뚜라미인 Gryllus in teger의노래소리를녹음하여기생파리 (Euphasiopteryx ochracea) 를채집하였고 Mangold (1978) 는땅강아지인 Scapteriscus acletus의노래소리를이용하여 E. ochracea를채집하였다. Walker(1989) 는 Gryllus rubens의노래소리를이용하여 3년동안매해평균 3,583 마리의 E. ochracea를채집하였다. 대부분의소리트랩은곤충의소리를증폭하여사용을하였다. 만약자연적인실제소리와비슷하게된다면소리트랩에채집되는곤충의마리수도실제자연에서의숫자와비슷하였다. 반대로녹음된소리를증폭하여사용하게되면보다많은대상곤충을채집할수있었다 (Burk, 1988). G. integer의녹음된유인노래를실제소리보다 10dB정도증폭하여사용하게되면 G. integer의암컷과 E. ochracea를보다많이유인할수있었다 (Cade, 1979). Ulagaraj와 Walker(1975) 의연구에서는 6 db을증가시킬때마다거의두배수의 S. acletus를채집한결과를보였다. 하지만많은종에서소리의강도와채집율의관계는보다면밀히조사될필요는있다. 식물에대한음파처리연구는곤충에비해상대적으로작았다. 국화에 1.4 khz의음파를 10일동안처리한결과, 식물의 callus형성과조직의분화발달과매우관련성이있는식물호르몬인 IAA와 ABA의농도가크게변화하였다 (Bouch et al. 2004). 인도의식물학자싱교수는검정말에음악을들려준결과, 세포의내용물들이마치햇빛에의해광합성을할때처럼활발하게움직이는것을관찰하였고, 인도전통음악인 라가 를벼에들려준결과벼의수확량이 25-60% 이상증수된결과를얻었다고보고하였다. 음악은식물의생장을촉진시키는효과도있지만, 최근연구에의하면건조와같은불량환경에대한저항성을증가시키는효과도있다고한다. 2003년미국서부지역에심한가뭄이왔을때, 콩재배지에음악을들려준결과, 음악을들려주지않은재배지에비해생육이 - 4 -

13 두배정도증가되었다. 본과제제안자의선행연구결과, 특정음역대의음파를처리하면식물체가보유하고있는특정유전자들의발현증폭과저하의인위적조절이가능하다는사실을증명한바있으며 (Jeong et al. 2008), 그외국외에서도유사한결과를보고된바있다 (Braam et al. 1977, 1992, Hongbo et al. 2008, Johnson et al. 1998). 향후이분야에대한연구가필요하고특히작물의생장촉진과관련된연구결과는보고된바가있으나 (Bochu et al , 2002, Chehab et al. 2009, Creath & Schwartz. 2004) 작물병방제와관련한연구는거의수행되고있지않은실정이어서이분야의연구가보다활발하게진행되어야할것으로사료된다

14 제 3 장연구개발수행내용및결과 제 1 절음파에대한아메리카잎굴파리행동반응조사 가. 음파를이용한아메리카잎굴파리 (Liriomyza trifolii) 의 EAG 반응실험파리목곤충의청각기관은더듬이의존스톤기관이므로 EAG를통해음파에대한반응을검출하였다 (Fig. 1). EAG 조사를위하여파리목구애노래와비슷한 20~1,000 Hz 사이의사인파순음을 50 Hz 간격으로노출하여 EAG 반응을조사하였다. 순음과더불어문헌조사에서조사된여러곤충의구애노래및기타날개소리를스피커로틀어주어더듬이반응을추가적으로조사하였다. 각음은 60~100 db의음압으로노출하여더듬이반응을조사하였다. EAG 반응을조사하기위해서절제된아메리카잎굴파리머리를 EAG probe 위에고정하여음파에대한반응을조사하였다. Fig 1. EAG response of Liriomyza trifolii to acoustic signals. a) EAG probe, b) excised head (virgin female), c) amplitude, d) speaker (diameter: 9 cm), e) PC computer 주요음파에대한 EAG 반응은 Figure 2와같다 (Fig. 2). 사인파순음에대한 EAG 반응은 20 Hz 이하의순음에서만관찰되었으나그외 50~1,000 Hz의주파수에서는 EAG 반응이검출되지않아순음에대해서는저주파음에대해서만반응하는것으로판단되었다. 문헌조사를통해획득한주요파리목곤충의구애노래에대한 EAG 반응을조사한결과 Cryptonevra inquilina와 Lipara japonica의구애노래에대해서만 EAG 반응이나타났었다. 하지만같은종인 L. trifolii의구애노래에대해서는 EAG 반응이나타나지않았다

15 Fig. 2. EAG response to acoustic stimulus 나. 소리에대한아메리카잎굴파리의행동변화조사 EAG 조사에서반응을보였던음을대상으로무음향실내에서아메리카잎굴파리의행동반응을조사하였다. 행동반응은컴퓨터와카메라로구성된관찰시스템을통해아메리카잎굴파리의위치를 2차원 x, y축좌표로 0.25초간격으로저장하였다. 수평위치를나타내는 x축좌표값이낮을수록아메리카잎굴파리가스피커에접근한것을나타낸다. 성충 4마리씩넣어 EAG 반응을보였던 Cryptonevra inquilina와아메리카잎굴파리의구애노래소리에노출시켜반응행동을기록하였다 (Fig. 3). 처음 2시간은구애노래에노출시키지않고다음 2시간동안구애노래를 90 db로노출시켜비교관찰하였다. 추가적으로음파에대한활동성을측정하기위해 Shannon이제시한 information entropy 값을이용하여비교하였다 (Fig. 4). 엔트로피값이높으면아메리카잎굴파리가높은활동성을나타내고낮으면활동성이감소한것으로판단할수있다. 정보엔트로피는다음과같이정의된다. 여기서 p(x i ) 는아메리카잎굴파리의 2 차원특정위치좌표에있을확률, b 는상수로 2 를사용하였다

16 Fig. 3. Observation of behavioral response of Liriomyza trifolii to acoustic signals. a) CCD carmera, b) speaker (diameter: 9cm), c) PC computer, d) test specimens Fig. 4. Information entropy and actual movement position of Liriomyza trifolii. a) response position of 4 male specimens to Cryptonevra inquilina, entropy value: 0.7. b) response position of 4 male specimens without acoustic signals, entropy value: 1.95 EAG 반응이없었던아메리카잎굴파리의구애노래를성충 4마리에게노출시켰을때, 수평위치좌표 (x축좌표 ) 와엔트로피값이처리전, 후차이가나지않았다 (Fig. 5). 수평위치값이낮으면유인효과가있는것이나본연구에서는구애노래에대한유인효과가나타나지않았으며엔트로피값도차이가나지않아구애노래에대한아메리키잎굴파리의행동변화가없는것으로판단되었다. 반면, EAG 반응이나타났던 Cryptonevra inquilina의구애노래를노출시켜행동반응을조사한결과, 여전히수평위치좌표의처리전, 후평균값은모든실험군에서차이가나지않았다. 이는 Cryptonevra inquilina의구애노래에대한아메리카잎굴파리의유인효과가없는것으로판단할수있다 (Fig. 6, a). 하지만 Cryptonevra inquilina의구애노래에대한정보엔트로피의변화는교미한암컷을제외한모든실험군에서감소하였다 - 8 -

17 (Table 1, Fig. 6, b). 본연구를통해 EAG 반응과행동반응이유사한결과를보여해 충에대한유효한음파검출에 EAG 및반응행동조사가도움이될것으로예상된다. Fig. 5. Average of horizontal position (a) and information entropy (b) of the 4 test insects with and without the courtship song of Liriomyza trifolii Fig. 6. Average of horizontal position (a) and information entropy (b) in different groups of the 4 test insects with and without the courtship song of C. inquilina (VF; virgin female, MF; mated female, VM; virgin male, MM; mated male) Table 1. Comparison of average position and entropy of the 4 test insects with and without the courtship song of C. inquilina by using analysis of variance (ANOVA, F 0.05(1),1,28 = ) virgin female mated female virgin male mated male average of x position information entropy F P F P 다. 아메리카잎굴파리소리통신연구 상기행동조사에서연구된아메리카잎굴파리의구애노래는일본에서녹음된소리로 - 9 -

18 국내의종과노래소리가차이가있을수있다. 아울러문헌조사의아메리카잎굴파리의노래소리는 EAG 반응및유인실험에서효과를보지못하였기에국내종의소리를녹음하여유인실험을할필요가있었다. 이에본연구에서는국내에서채집된아메리카잎굴파리를이용하여구애노래를녹음을하였다. 구애노래를녹음하기위하여아메리카잎굴파리성충암수각 1마리를작은플라스틱병에넣어마이크를근접시켜녹음하였다. 녹음한구애노래는차후유인효과검증실험에사용하였다. 노트북컴퓨터, 소리증폭기 (A ), 소리녹음소프트웨어 ( 곰녹음기 ), 앰프 (IPA 38), 마이크를이용하여구애노래를 wave 파일로저장하였다. 음향신호는 30% 증폭하였다. 소리샘플링레이트 (Sampling Rate) 는 22,050이며비트레이트 (Bitrate) 는 96으로설정하여녹음하였다. 아메리카잎굴파리수컷의소리를녹음한결과 200, 600, 1400 Hz 주파수대역에서피크가나타났다 (Fig. 7). 녹음된아메리카잎굴파리수컷의소리는암컷유인실험에활용하였다. Fig. 7. Recording sound of courtship of Liriomyza trifolii male 라. 구애노래를이용한아메리카잎굴파리암컷유인실험문헌조사에서파리목 ( 초파리, 모기, 깔따구 ) 곤충의수컷구애노래를이용한유인효과가보고되었다. 본연구에서는유인효과를관찰하기위해아메리카잎굴파리수컷의구애노래를틀어주고암컷 4마리를직경 9cm의아크릴케이지에넣은후위치를측정하였다. 구애노래는소형스피커 ( 이어폰, BS80i) 를이용하여 3~4 초의노래를 15초간격으로틀어주었다. 소형스피커의위치는왼쪽에두어아메리카잎굴파리암컷 4마리의수평위치 (x축좌표 (Horizontal position)) 를 0.25초간격으로 1시간동안기록하였다. x축값이낮게나올수록아메리카잎굴파리의위치가스피커에가까운위치에있음을나타낸다. 유인실험은 10반복을하였다. 전체크기가 90 mm인케이지에서음파처리전 1시

19 간동안의평균위치가 이었으나처리후 로차이가나지않았다. 수평위치 값이 0 에가까울수록수컷의소리에접근을하는것이나실험결과유인효과가없는것 으로조사되었다 (Fig. 8). Fig. 8. Average horizontal position of Liriomyza trifolii female to courtship song of male 제 2 절저주파음에대한아메리카잎굴파리반응조사 가. 온실에서저주파에따른아메리카잎굴파리우화율조사 20 Hz 저주파 (Sine wave) 음을온실에서아메리카잎굴파리번데기에 24시간씩 5일간노출하여우화율을조사하였다. 주파수발생기를통해저주파음을발생시키고이를앰프에전달하고이를다시저주파음을낼수있는스피커 (12 인치 ) 를통해온실에서저주파음을틀어주었다. 86과 67, 56 및 54 db의음압에서 100마리씩노출후 5일후우화율측정하였다. 비교실험을위해실내에서무음상태에서우화율측정하였고각실험은 5반복실험을하였다. Fig. 9. Eclosion rate of Liriomyza trifolii pupae according to different sound pressure (db)

20 86과 67, 56 및 54 db의음압에서 100마리씩노출후 5일후우화율을조사한결과무처리시 81.88% 의우화율을보였다 (Fig. 9). 음압 67 db와 56, 54 db에서도각각 79.28%, 77.8%, 82.4% 로무처리와비슷한우화율을보였다. 하지만음압이높은 86 db에서는우화율이 48.6% 로현저히감소하여저주파음이아메리카잎굴파리우화에영향을주는것으로조사되었다. 제 3 절병원성곰팡이에대한음파처리효과 가. 딸기잿빛곰팡이병 (Botrytis cinerea) 에대한음파처리병원균의생장억제에적정한음파를선발을위하여무소음챔버를특수제작하여사용하였다. 본무소음챔버는내부벽면에차음제와방음제를처리하여소음이 40dB정도가되도록제작되어, 본과제의수행에적절하였다. 다양한음역대의음파를식물병원성곰팡이에처리한결과, 특정음역대의음파처리시대조구인무처리에비해곰팡이의균사생육이현저히억제됨을관찰하였다 (Fig. 10). Con. 1kHz kHz Fig. 10. Effect of sound waves on B. cinerea mycelial growth. Agar disks (5mm in diameter) of B. cinerea were placed in the center of petri plates and treated for 5 days with sound waves of the frencies indicated

21 Fig. 11. Inhibitory effects of sound waves on B. cinerea mycelia growth. Aga disks (5 mm in diameter) of B. cinerea were placed in the center of petri plates and treated with or without (control) sound waves for times indicated. After 6 days, the diameter of mycelia was measured. A) Mycelia growth on 1/2 PDA with or without sound treatment. B) Mycelial growth profiles of B. cinerea following various duration of at different sound treatment. 상기의각음파별처리시간을 1일 5 일동안처리한결과, 2일 5 일동안처리한결과, 균사가생육을거의하지못하다가, 처리가끝난지 3일후부터서서히자라기시작하였다. 이결과로미루어잿빛곰팡이균에대한음파처리시간은 2 3일정도처리시에도충분한균사생육억제효과를얻을수있으므로 4일이상의장기간음파처리가필요하지않을것으로생각된다 (Fig. 11. A 와 B) 특정단일음파 5kHz가처리된잿빛곰팡이병균의균사를광학현미경으로관찰한결과, 대조구인무처리 (Fig. 12-A) 와비교하였을때균사의격막이두꺼워지고균사의내부가거의액포화되어균사의대부분이텅빈상태를관찰할수있었다 (Fig. 12-B). 또한균사의군데군에에산발적으로균핵을형성하기위한균사의덩어리들이관찰되었다 (Fig. 12-C). 균핵의형성이대조구인무처리보다빨리진행되는것은음파의영향으로인하여병원균의생육이불리한환경에처하게그림 4) 음파처리후잿빛곰팡이병균균사상태관찰 ( 광학현미경 ) 됨에따라생존을위한수단으로정상보다는빠르게균핵형성을유도하고있는것으로생각된다. Figure 12-D에서보여주는것과같이병원균의균사가어떤원인에의해생육이저지되고있을때볼수있는전형적인현상중의하나로균사의격막과격막사이의간격이짧은것을볼수있다. 이러한현상은병원균에화학적살균제를처리했을때도이와유사한결과를볼수있는데, 이것은균사의생장이억제되고있음을보여주는것으로생각된다. 이외에균사의내부가텅비어있고, 균사의말단은현저히가늘어지거나 (Fig. 12-E), 혹은균사의끝이부풀어오른것처럼팽창되어있는현상도관찰할수있었다 (Fig. 12-F). 이러한결과로미루어곰팡이균사생육이정상적으로이루어지지못하는것으로생각된다

22 Fig. 12. Light microscopy visualization of B. cinerea mycelia treated with or without 5KHz sound waves. Mycelia treated without sound (control) (A) and with sound (B-F). Fig. 13. Electromicrograph of B. cinerea mycelia treated for 2 days with or without 5 khz sound waves. The arrows indicated the interval between the two speta. 상기에서잿빛곰팡이병원균의균사생육억제효과가가장우수하였던 5 khz음파를잿빛곰팡이병원균에처리하고균사의생육형태를전자현미경으로관찰한결과, 그림에서보여주는것과같이대조구인무처리균사에비해음파처리시균사의모양이정상적으로자라지못하고꼬여있는모습 (Fig. 13-A) 과아울러격막과격막사이의간격이현저히좁아진것으로보아 (Fig. 13-B) 균사생육에현저히제어를받고있는것으로생각되었다. 또한균사의끝을잘라보았을때, 무처리균사는단면이매끈한것에비해음파처리된균사의단면은표면이거칠고깨끗하지못한것을볼수있었다 (Fig. 13-C). 이와같은여러현상들로미루어볼때, 음파에의해병원균의균사가정상적인생육

23 을억제받고있는것으로추정되었다. 단일음파가잿빛곰팡이병원균의포자발아에미치는영향을살펴보기위하여병원균의포자현탁액 (5X10 5 /ml) 을 1/2 PDA배지에도말하고하루동안상기와동일한 5 khz 를처리한지이틀후에포자발아정도를조사한결과, Figure 14에서보여주는바와같이대조구인무처리에비해포자발아율이현저히낮음을관찰할수있었다. 이결과에서보여주는시사점은음파가 2차감염의주원인인포자의발아를억제시키는영향도있어병의전염을감소시킬수있다는가능성을보여주고있다 (Fig. 14). Fig. 14. Inhibition of B. cinerea spore germination by sound treatment. Known concentrations of B. cinerea spore suspension ( spores/ml) were treated with 5 khz sound waves for 24 hours. 상기와동일한단일음파 (5 khz) 가처리된잿빛곰팡이병원균의균사로부터균총을취하여발아후 6주된애기장대의잎에접종한후 24 의생장상에습실처리후 3일동안키우면서병발생정도를관찰한결과, 음파가처리되지않은균사로부터취한균총을접종했던무처리에비해음파가처리된균사로부터의균총을접종하였을때, 병반면적이나병진전속도에현저한차이를보였다. 즉, Fig. 15에서보는바와같이음파가처리되지않은균사로부터얻어진균총이접종된애기장대의잎에서는거의모든잎에서심하게발병한반면, 음파가처리된균사로부터얻어진균총을접종한애기장대잎에서는발병정도와병진전속도가현저히낮은것을볼수있었다. 이와같은결과로미루어볼때, 잿빛곰팡이병원균은단일음파처리에의해대부분의병원성을상실하는것으로생각된다. Con. Sound treatment

24 Fig 15. Suppression of B. cinerea on Arabidopsis by sound treatment. 나. 시들음병 (Rhizoctonia solani) 에대한음파처리효과각종과채류나엽채류에시들음병을유발하는 R. solani의균총에다양한음파를시간대별로처리하여 2일동안생장상에서생육시킨후균사생육율을조사한결과, B와 C 음파를 1시간동안처리하였을때, 음파가처리되지않은무처리에비하여균사생육이현저히억제되는것을관찰하였다 (Fig. 16). Fig. 16. Inhibition of mycelial growth of R. solani by sound treatment. A E: 1 5 khz(1 khz interval) 추가적으로음파가균핵의형성에미치는영향을관찰하기위하여 R. solani의균사에다양한음파를시간대별로처리하여 5일동안생장상에서생육시키면서균핵의형성율을관찰하였다 (Fig. 17). E 음파를제외한 A D음파처리를 1시간동안처리했을경우, 균핵형성율이감소하는경향을보였으나, 반복간의변이가관찰되어향후보다많은반복실험이이루어져야할것으로생각된다. Fig. 17. Inhibition of scerelotinia formation of R. solani by sound treatment. A E: 1 5 khz(1 khz interval)

25 다. 고추탄저병 (Colletotrichum gloeosporioides) 에대한음파처리효과탄저병은고추를비롯해콩, 오이등기주범위가넓은병원균으로열매에주로발생하나잎에도침해하여농작물에큰피해를주는병원균의하나이다. 음파처리를통하여탄저병균의예방혹은방제가능성여부를검정하기위하여다양한음파를탄저병균의균사가접종된배지에처리한결과, Figure 18에서보는바와같이음파의종류에따라상이한결과를나타내지만전반적으로무처리에비하여균사생육이약간지연되는것을볼수있었다. 하지만상기의잿빛곰팡이병균과시들음을유발하는 R. solani에비해음파처리의효과는미미하였다. Con Fig. 18. Inhibition of 2 3 4kHz mycelial growth of C. gloeosporioides by sound treatment. 라. 역병균 (Phytopthora capsici) 에대한음파처리효과단일음파가역병균 (P. capsici) 유주자의운동성에미치는효과를관찰하기위하여유주자현탁액 (10 5 개 / ml ) 에각기다른단일음파 (0.5, 1, 2, 4, 8, 10 와 12 khz) 의 7종류의음파를스피커가설치된무소음생장상을이용하여 2시간동안처리한결과, 대조구인무처리에비하여유주자의운동성이현저히저하되는것을관찰할수있었다 (Fig. 19). Fig. 19. Inhibition of zoospore mobility of P. capsici by sound treatment. 역병균은처한환경에따라유주자낭, 후막포자, 난포자등다양한기관을만드는데,

26 특히후막포자와난포자는적합한조건이되면유주자낭 (sporangia) 을형성하게되고그안에유주자 (zoospore) 를분화시키며성숙해지면밖으로방출한다. 방출된유주자는토양의표면이나토양공극내에서이동하여기주작물의뿌리끝신장부등의지제부가까이에서발아관을내어기주작물의체내로침입하게됨으로서감염이이루어지게된다. 따라서역병균의유주자는주요한 2차감염원으로유주자의운동성과발아율은다른기주에발병을일으키게하는데주요요인중의하나이다. 운동성이뛰어난유주자일수록이동거리가길어보다넓은지역까지도달하여병을유발할수있고, 발아율이높다는것은유주자가많이생존해있다는의미이므로, 이또한감염가능성이높다는뜻이다. 본실험은단일음파처리가역병균유주자의운동성과발아율에미치는영향을관찰해보고자실시한결과, 그림에서보여주는바와같이단일음파의종류에따라다른결과를보였는데, 주파수 (Hz) 가높아질수록운동성이저하되는경향을보임으로써, 유주자운동성저하와헤르츠의높이와는정의상관관계가있는것으로나타났다. 본결과는음파처리를통하여유주자운동성을저하시킴으로써병발생을감소시킬수있는가능성을보여주었다. 단일음파가역병균 (P. capsici) 유주자의발아에미치는효과를관찰하기위하여, 상기와동일한방법으로유주자에음파를처리한결과, 대조구인무처리에비하여유주자의발아율이현저히감소되는것을관찰할수있었다 (Fig. 20). 무처리에서는유주자로부터발아관이나와균사로자라고있는것이다량관찰되었으나, 음파가처리된처리구에서는대부분의유주자가발아되지않은것으로관찰되었다. 음파가유주자의운동성에미치는영향과마찬가지로, 주파수 (Hz) 가높아질수록유주자의발아율도감소되는경향을보임으로써, 유주자의발아율저하와헤르츠의높이와는정의상관관계가있는것으로나타났다. 본결과는음파처리를통하여유주자운동성감소와동시에발아또한억제시킴으로써병발생억제효과를얻을수있을것으로생각된다. Fig. 20. Inhibition of zoospore germination of P. capsici by sound treatment. 상기실험결과유주자의운동성과발아가현저히감소되는결과를얻었으므로음파가 유주자의병원성에영향을줄수있을것으로생각되어유주자현탁액 (10 5 개 / ml ) 에각

27 기다른단일음파 (0.5, 1, 2, 4, 8, 10 와 12 khz) 를 2시간동안처리한후, 발아한지한달된오이잎에접종한결과, 접종한지 3일후부터발병이시작되어무처리에비해단일음파가처리된오이잎에서발병면적이현저히감소되었다. 상기의실험결과를농촌진흥청국립농업과학기술원등의전문기관에서사용하고있는병방제가를구하는공식에의거하여방제가를구해본결과, khz 처리시에는대조구인무처리와거의유사한발병정도를보여유주자의운동성과발아율에는차이가있었지만발병억제효과는거의없는것으로관찰되었으며, 2~8 khz 처리시에는약 47%, 그리고 10과 12 khz 처리시에는각각약 71과 78% 의병발생억제효과가있는것으로나타났다 (Table 2). Table 2. Plant disease control in cucumber by sound treatment. 방제가 : ( 무처리 - 처리 ) X 100 제 4 절세균에대한음파처리효과 가. 대장균 (Escherichia coli) 에대한음파처리효과검정예비실험으로실험실내에서가장많이사용되고있는 E. coli에대한음파처리효과를관찰하기위하여 E. coli의세포현탁액 (1x 10 8 ) 이도말된 LB (Luria Bertani) 고체배지를놓고 50 Hz에서 5 khz 까지의특정음역대의단일음파를 2시간씩처리한후 37 의생장상에옮겨 24시간배양한후세균의집단형성율을비교한결과, 대조구인무처리배지에서의집단형성율에비해음파가처리된배지에서의집단형성율이현저히저하된것을관찰할수있었다 (Fig. 21)

28 Fig. 21. Inhibition of colony formation of E. coli by sound treatment. 나. 풋마름병 ( Pseudomonas syringae) 에음파처리후생장율비교와생물정보분석각종식물에풋마름병을유발하는 P. syringae와 R. solanacearum 에다양한음파를시간대별로처리하여음파가병원균의콜로니형성율에미치는효과를관찰한결과, 두균주모두 4 khz음파를 1시간동안처리하였을때, 음파가처리되지않은무처리에비하여콜로니형성율이현저히감소되는것을관찰하였다 (Table 3). Table 3. Inhibition of colony formation of P. syringae by sound treatment. Treatment Control 4kHz Colony No 상기의결과음파에의해 P. syringae의생육이억제되는결과를보였으므로음파가병원균의유전자발현에어떤영향을주고있는지여부를분석하고자, 음파가처리된 P. syringae로부터 RNA를분리하여 RNA 생물정보분석을실시하였다 (Fig. 22). Figure 22에서보여주는바와같이다수의유전자가음파처리에의해발현이증가되거나감소하는등의발현변이를나타내었다. 본그림은분석한약 6,000여개의유전자중일부를보여주고있으며보다정밀한분석은얻어진분석데이터를토대로보다면밀하게분석해서유전자발현과음파와의관계와이로인한균의생육에미치는영향등을분석해볼예정이다. 분석결과로미루어병원세균은음파의영향을받아유전자발현양상에많은변이를보여주고있고이로인해세균의생장에도영향을미칠것으로추정된다. 상기의전사인자분석결과, 세포구성에관련된유전자 (cellular component), 분자적인기능을가진유전자 (Molecular function), 그리고생물학적과정에관련유전자 (Biological Process) 등으로크게 3가지종류로구분하여볼때, 다수유전자들의발현이감소되었으며, 증가된유전자의숫자보다감소된유전자의숫자가많은것으로보아이런유전자들이음파처리에의해 damage를받았을것으로추정되고, 그결과세균의생장이억제된결과로나타났을것으로추정된다. 이분석결과는추후지속적으로분석을하고, Real-time PCR방법등을통하여본결과를재확인하는과정이필요할것으로생각된다. 이러한일련의과정을통해음파에의해세균의증식이감소된원인을구명해낼수있을것으로생각되고, 이결과는향후실험의기초자료로활용될수있을것이다 (Fig )

29 Fig. 22. Celluar component related gene expression pattern of P. syringae and R. solanacearum by sound treatment. P: P. syringae, 10698:R. solanacearum Fig. 23. Molecular function related gene expression pattern of P. syringae and R. solanacearum by sound treatment. P: P. syringae, 10698:R. solanacearum

30 Fig. 24. Biological process related gene expression pattern of P. syringae and R. solanacearum after sound treatment. P: P. syringae, 10698:R. solanacearum. 다. R. solanacearum 에음파처리후생장율비교와생물정보분석각종식물에풋마름병을유발하는 P. syringae와 R. solanacearum 에다양한음파간대별로처리하여음파가병원균의콜로니형성율에미치는효과를관찰한결과, 두균주모두 D음파를 1시간동안처리하였을때, 음파가처리되지않은무처리에비하여콜로니형성률이현저히감소되는것을관찰하였다 (Table 4, Fig. 25). Table 4. Inhibition of colony formation of R. solanacearum by sound treatment. Treatment Control 4kHz Colony No

31 Control Sound treatment Fig. 25. Comparision of colony formation of R. solanacearum by sound treatment. 상기의결과음파에의해 R. solanacearum 의생육이억제되는결과를보였으므로음파가병원균의유전자발현에어떤영향을주고있는지여부를분석하고자, 음파가처리된 R. solanacearum 로부터 RNA를분리하여 RNA 생물정보분석을실시하였다 (Fig ). Figure 22 24에서보여주는바와같이다수의유전자가음파처리에의해발현이증가되거나감소하는등의발현변이를나타내었다. 본표는분석한약 6,000여개의유전자중일부를보여주고있으며보다정밀한분석은얻어진분석데이터를토대로보다면밀하게분석해서유전자발현과음파와의관계와이로인한균의생육에미치는영향등을분석해볼예정이다. 분석결과로미루어병원세균은음파의영향을받아유전자발현양상에많은변이를보여주고있고이로인해세균의생장에도영향을미칠것으로추정된다. 제 5 절진딧물의행동표구축및음파에대한행동변화관찰 가. 행동관찰을통한진딧물행동표구축진딧물의행동관찰을통해행동표 (ethogram) 를구축하고어떠한자극에영향을받을때이를정량적으로평가하기위한행동지표를개발하였다. 자극이없는상태에서진딧물은감로배설 (honey-dew production), 이동 (walking), 탈피 (moltin g), 도미 (wagging), 의 4가지주요한행동을보였다. 진딧물의감로배설횟수는영기가증가함에따라줄어들었다 (Fig ). 감로배설은각영기에서규칙적인간격으로발생하였다 (Table 5-1). 진딧물은탈피 (molting) 전에탈피전행동 (pre-molti ng behavior) 을보이며, 이행동은규칙적소요시간을나타내었다 (Fig ). 따라서, 감로배설은추후음파실험을평가하기위한행동지표로판단되었다

32 Fig. 26. Observation system of behavior Fig. 27. Number of honey-dew production Table 5. Descriptive statistics quantity of each behaviors HDP Wagging Moving Molting Pre-molting Duration (s) Interval (s) Frequency (/1hr) Mean SD 20, N SE 0, CV(%) Mean SD N N/A N/A SE CV(%) Mean SD N N/A N/A SE CV(%) Fig. 28. Duration pre-molting time of each nymphal stage

33 나. 음파에의한진딧물의섭식행동변화파악여러음역대 (100, 500, 1000, 5,000, 10,000 Hz) 와여러음압 (66, 78, 90 db SPL) 별음파의유무에따른진딧물의행동변화중특히섭식행동과직접적관련이있으며, 일정한간격과시간으로발생하는감로배설행동을관찰하였다. 진딧물의감로배설은음파자극시감소하였으며, 특히 100, 5000, 10,000Hz에서유효한차이가나타났다 (Fig. 29). 진딧물의도미는유효한차이가나타나지않았다. 반면진딧물의평균이동시간은음파자극하에증가하였다. 특히 10,000Hz에서진딧물의이동시간이가장많이증가하였다 (Fig. 29). 진딧물의감로배설은소리의세기에따라유효한차이가없었다. 하지만진딧물의감로배설은이동의증가와음의상관관계를나타내었다 (Fig. 30). 감로배설의감소는음파자극이진딧물의섭식행동에영향을미친다는것을시사하며, 이동의증가는감로배설행동의감소에직접적인원인이되므로감로배설의빈도감소와이동의증가에가장큰영향을주는 10000Hz의주파수가가장효과적인것으로판단된다. 음파자극유무시진딧물의 Electrical Penetration Graph (EPG) 를비교하여음파자극에따른진딧물의 stylet working을알아보고섭식행동에미치는영향을평가하였다. 서로다른섭식단계를나타내는 6 가지 EPG wave form 중 Pd, E1, E2, MLFD, np를지표로선정하였다 (Table 6)

34 Fig. 29. Observation frequency of each behaviors according to sound frequency Fig. 30. Correaltion analysis between honey-dew production and movement behavior Fig. 31. Structure of EPG system

35 Table 6. EPG wave form and feeding phase Waveform Behavior Signal on EPG A, B and C Intercellular probing Pd Intercellular probing E1 Salivation which show up before phloem sap ingestion E2 Phloem sap ingestion MLFD Longest feeding duration Longest feeding duration (E1 + E2) np No penetration into the plant 평균 MLFD는음파자극하에감소했으며특히 10,000 Hz에서가장큰감소가나타났다 (Fig. 32). 평균 Pd 시간은음파자극하에증가했으며, 특히 100Hz에서가장많이증가하였다 (Fig. 32). 평균 E2 시간은음파자극시감소했고, 특히 100 Hz, 5000 Hz, Hz에서크게감소하였다 (Fig. 32). 평균 np 시간은음파자극하에크게증가했으며, 특히 Hz의소리에서매우큰증가폭을나타내었다 (Fig. 32). 평균 Pd 발생빈도는음파자극하에증가했으며, 특히 100Hz에서가장많이증가하였다 (Fig. 33). 평균 E2 발생빈도는음파자극시감소했고, 특히 100 Hz, 1000 Hz에서크게감소하였다 (Fig. 33). 평균 np 발생빈도는음파자극하에크게증가했으며, 특히 100 Hz, 5000 Hz, Hz의소리에서증가하였다 (Fig. 33)

36 Fig. 32. Average duration time of wave form according to sound frequency Fig. 33. Observation frequency of wave form according to sound frequency 다. 최적음파가진딧물의번식에미치는영향평가진딧물의섭식을저해하는최적음파를진딧물군집에적용하여군집의번식률에미치는영향을영향평가하였다. 진딧물기주식물 ( 배추 ) 에 10마리의진딧물성체를접종한뒤아크릴케이지에넣어 24시간적응기간후음파자극 3일시행하였다 (Fig. 34). 자극에사용된음파는 EPG를통한음파자극실험을통하여얻은섭식저해최적음파인 100Hz와 10000Hz의음파를자극원으로이용하였다. 실험군별로하루에각각 1, 3, 6, 12시간의최적음파자극에노출시켰다. 모든실험군에서대조군에비하여낮은번식률을보였다 (Fig. 35). 그러나통계분석

37 결과실험군과대조군의차이는나타나지않았다 (Table 7). 실험결과, 섭식저해최적음 파는번식률에는영향을끼치지않은것으로사료된다. Fig. 34. Sound system in green house Fig. 35. Effects of sound to reproduction rates Table 7. Effects of sound to reproduction rates of green peach aphids, Myzus persicae (Sulzer) 제 6 절스트레스음파가미치는아메리카잎굴파리 (Liriomyza trifolii) 의생리변화및농약감수성제고효과 가. 연구요약본연구는아메리카잎굴파리 (Liriomyza trifolii) 의스트레스음파에대한생리과정의효과를분석했다. 굴파리유충의섭식갱도길이를통해섭식량을분석하였을때유충의먹이활동은스트레스음파에의해먹이활동이현격하게줄어들었다. 음파처리는번데기기간을늘리고우화를억제했다. 또한이차원전기영동의결과는스트레스음파처리 (5,000 Hz) 가번데기의단백질패턴변화를일으키는것으로나타났다. 또한암컷산란도음파처리에의해억제되었다. 그러나성충의주광성행동은스트레스음파에영향을받지않았다. 이러한스트레스음파는아메리카잎굴파리의살충제에대한감수성을제고시켰다. 본연구는아메리카잎굴파리의생리과정이스트레스음파에의해교란된다는결과를보여주었다

38 나. 연구목적아메리카잎굴파리 (Liriomyza trifolii) 는미국플로리다지역이원산지로알려져있으며, 1970년대이후로전세계에퍼져나가우리나라작물에까지피해를주게되었다 (Parrel la, 1987; Han et al., 1996). 이해충의피해는유충이엽육조직에터널을형성하면서식해하는것과성충의흡즙흔에의한잎피해를나눌수있다 (Parrella and Keil, 1984). 이러한작물체잎에대한아메리카잎굴파리의피해는광합성저하를유발하고, 작물체의상품성을떨어뜨리는경제적손실을알게된다 (Trumble et al., 1985), 시설재배지를중심으로발생하는아메리카잎굴파리는비교적고온에잘적응하는해충으로 7-8월에최대성충포획량을보이며, 겨울철에도온실내에서세대를형성하게된다 (Park et al., 2000., 2001). 알에서성충까지 25 에서발육기간은거베라의경우 1 6.3일, 토마토의경우 12.3일로서연중다세대를발생시켜피해는물론이고살충제에대한저항성발달이우려되고있다 (Bethke et al., 1987; Moon etal., 2002). 높은번식력과빠른생활사는이들의발생예찰및방제기술을적용하는데판단기준이되는경제적피해수준의졀정이요구되었다 (Lim et al., 2007). 아메리카잎굴파리의번식능력과약제저항성그리고시설재배지의조건의안전농산물생산에부합하기위해비화학적해충관리기술이요구되고있다 (Kim & Son, 2006). 본연구는스트레스음파를이용한아메리카잎굴파리의생존력억제를밝히고자이들의생리적변화를분석하였다. 다양한화학적및물리적자극원에대해서반응하는감각기구조가아메리카잎굴파리성충촉각에서분석되어음파와같은세로파자극원에반응하는센털형및발모양감각기의존재를제시하였다 (Shin et al., 2012). 따라서다양한주파수의음파를아메리카잎굴파리에처리하고나타나는유충섭식, 용발달및성충산란행동을대상으로그효과를규명하였다. 또한음파에따른체내생리적변화는 2차원전기영동을통해발현단백질패턴양식을비교하였다. 끝으로스트레스음파처리에따른생존력억제가살충제감수성제고로나타나는지를분석하였다. 다. 재료및방법아메리카잎굴파리는농촌진흥청국립농업과학원농산물안전성부작물보호과에서분양받았다. 전사육기간동안온도 25±1 C, 상대습도 60±10%, 광주기 16:8 h (L:D) 의조건에서유지되었다. 기주식물로강낭콩을이용하였다. 그린테코 ( 주 ) 로부터제공받은음파기기는데시벨측정기, 음파처리구 (45 90 cm), 음파송출기로구성되어있다. 아메리카잎굴파리는실내온도 25 C에서주파수는 95 db로고정하고 0, 100, 315, 630, 1000, 2000 그리고 5,000 Hz의음파에서 24시간을노출시켜생리변화를관찰하였다. 아메리카잎굴파리번데기를각각 10마리씩 3반복으로각 100, 315, 630, 1,000, 2,000, 5,000 Hz의주파수별로 24시간노출시키고일정시간동안번데기가깨어나는시기를조사하였다. 아메리카잎굴파리성충을각각 25마리씩산란통을만들어넣어두고강낭

39 콩잎에파굴이보이기시작하면강낭콩잎을기부와말단의중간부분을나누어산란위치를알아보고갱도가시작한곳을점으로나타내고기부말단으로나누어기록하였다. 이차원전기영동은 Isoelectric focusing (IEF) 과 Ettan IPGphor II IEF System (GE H ealthcare, Uppsala, Sweden) 을이용해분석했으며, 단백질량은 300 μg, Running조건은총 18시간동안으로 100 V에서 1시간처리, 500 V에서 1시간, 다시 1 kv에서 1시간, 2 kv에서 2시간 4 kv에서 2시간, 6 kv에서 1시간, 8kV에서 8시간으로총 8단계로구성되어있다. 아메리카잎굴파리유충을대상으로가해잎을살충제에침지하여살충력을분석하였다. 사용된살충제는스피노사드입상수화제 (Dongbang Agro, Seoul, Korea) 로시판되는제형을물에희석하였다. 아메리카잎굴파리유충이가해하고있는강낭콩잎을각각 10마리당 3반복으로농도별 250, 125, 62.5, 31.25, , ppm 처리후반수치사량 (LC 50 ) 을구하여적정농도 ppm을아메리카잎굴파리유충각 10마리씩 3반복으로처리하였다. 처리후매일잎이마르지않도록습도를유지시켜주고 5일동안관찰후최종살충률을조사하였다. 시험결과는백분율자료로서 arcsine 변환후 SAS(1989) 의 PROC GLM (SAS Institu te, 1989) 을이용하여 ANOVA 분석을실시하였다. 반수치사량 (LC 50 ) 은 PROBIT 분석법 (Raymond, 1985) 을이용하여산출하였다. Sigma Plot 8.0을이용하여그래프화하였다. 라. 결과다양한주파수의유화처리에따른아메리카잎굴파리유충의섭식량차이를조사하였다. 섭식량은유충의잎내부의섭식갱도길이를측정하여나타냈다. 일반적으로정지잎에비해흔들리는잎에서이러한섭식량은감소했다 (Fig. 36-A). 이러한현상을스트레스음파에따른잎의진동에유충의섭식량이영향을받을수있다는것을의미했다. 다양한주파수에노출되었을때아메리카잎굴파리의섭식량은현격한차이를보여, 5, 000 Hz이상의음파에서대조구에비해섭식량의차이를나타냈다 (Fig. 36-B). 일반적으로우화율은약 90% 로높지만, 음파처리에따라우화율이낮아져, 1,000 Hz 이상에서는대조구에비해현격하게낮은우화율을나타났다 (Fig. 37-A). 또한우화기간에도스트레스음파는영향을주어주파수가증가함에따라우화발육기간이지연되는효과를나타냈다 (Fig. 37-B)

40 (A) (B) Fig. 36. Effect of sound treatment on larval feeding activity of Liriomyza trifolii. Leaves oviposited by females were exposed to sound treatment until pupal development. (A) Vibration effect on the feeding activity. (B) Effect of sound treatment (5,000 Hz, 24 h). The feeding tunnel length was measured by an image analysis program. Each treatment was replicated 10 times. Different letters above standard deviation bars indicate significant difference among means at Type I error=0.05 (LSD test). (A) (B) Fig. 37. Effect of sound treatment on pupal development of Liriomyza trifolii. Newly molted pupae were exposed to sound treatments until adult emergence. Emergence rate (A) and pupal period (B) were measured with three replications and 10 pupae per replication. Different letters above standard deviation bars indicate significant difference among means at type I error=0.05 (LSD test) 다양한음파처리를통한아메리카잎굴파리의우화활동에미치는효과를검정하였다. 아메리카잎굴파리의우화는낮기간동안에만일어나는일일리듬성을보았다 (Fig

41 A). 또한잎의엽경에가깝게산란한것으로나타났다 (Fig. 38-B). (A) (B) Fig. 38. Effect of sound treatments on female oviposition of Liriomyza trifolii. (A) Preference of oviposition of Liriomyza trifolii. (A) Preference of oviposition site on the leaf. Leaf was longitudinal halved into proximal and distal reception from the leaf stalk. A total of 100 ovipositions were analysed. (B) Number of eggs per female was analyzed for 5 days at 25 under different sound frequencies at 95 db. Each treatment consisted of more than 10 females. Different letters above standard deviation bars indicate significant difference among means at type I error=0.05 (LSD test). Fig. 39. Effect of sound treatment (95 db, 5,000 Hz, 24 h) on pupal proteins of Liriomyza trifolii. Triangles indicate specific proteins of control and sound treatment larval, respectively. Each treatment used 200 ug proteins extracted from approximately 200 pupae. 스트레스음파는아메리카잎굴파리의산란행동에는영향을주었다 (Fig. 39). 하루중 아메리카잎굴파리암컷한마리가약 3 개의알을산란하는데스트레스음파의주파수가 증가함에따라감소한다. 5,000 Hz 노출시에는 2 개이하의산란수를기록했다

42 아메리카잎굴파리성충은높은주광성을보였다 (Fig. 40-A). 이러한주광성은 5,000 H z 의음파처리에서도변화하지않았다 (Fig. 40-B). (A) (B) Fig. 40. Effect of sound treatment (95 db, 5,000 Hz) on phototaxic behavior of adult Liriomyza trifolii. (A) Preference test of L. trifolii between dark and light chambers in each time at photophase. Each treatment used 100 adults. (B) Effect of the sound treatment on the phototaxic behavior. Each treatment used 100 adults with three replications at photophase. Different letters above standard deviation bars indicate significant difference among means at type I error=0.05 (LSD test) Fig. 41. Effect of sound treatment (95 db, 5,000 Hz, 24 h) on pupal proteins of Liriomyza trifolii. Circles and triangles indicate specific proteins of control and sound treatment larvae, respectively. Each treatment used 200 μg proteins extracted from approximately 200 pupae. 음파에따른아메리카잎굴파리의생체변화를알아보기위해비교적감수성이높았 던번데기에서 5,000 Hz 의음파를처리하고대조구에비해변화되는단백질을이차원

43 전기영동으로측정하였다 (Fig. 41). 대조구에서총 25개의단백질이검출되었으며, 처리구에서는이보다적은 8개가나타났다. 음파처리에따른특이적단백질이검출되었다. 스트레스음파가아메리카잎굴파리의살충제감수성에미치는효과가분석되었다 (Fig. 42). 유충에대해잎침지법으로분석되었을때스피노사드살충제의 ppm에서반수치사약량을나타냈다 (Fig. 42-A). 이반수치사약량을기본으로다양한음파에노출시켰을때아메리카잎굴파리는음파주파수에비례하여살충제감수성이높아졌다 (Fig. 42-B). (A) (B) Fig. 42. Effect of different sound treatments on an insecticide susceptibility of Liriomyza trifolii. Soybean leaves infested by leafminers were soaked in test insecticide suspensions. (A) Dose-mortality of spinosad on the leafminers. (B) Sound effect on the insecticide toxicity. The treated larvae were exposed to the different sound frequencies. Each treatment consisted of 10 larvae and was replicated three times. Mortality was measured at 5 days after treatment (DAT). Different letters above standard deviation bars indicate significant difference among means at Type I error=0.05 (LSD test). 마. 고찰음파처리에따라아메리카잎굴파리의생리적변화가본연구에서분석되었다. 유충은섭식행동에대해서서로다른주파수의음파가미치는영향이조사되었다. 섭식갱도의길이로분석되고섭식량은음파의주파수에비례하여감소하였다. 선행조사에서분석한진동에따른섭식량저하와비교하여아메리카잎굴파리는외부물리적요동에따라섭식활동이저해되었다고볼수있다. 아메리카잎굴파리의엽육가해는작물체생산에영향을미쳐 1마리의유충가해에의해피해잎의광합성이 43% 줄수있다가전하였다 (Trumble, 1990). 또는아메리카잎굴파리는새로나온잎보다는다자란잎에가해가높아 (Chaadler and Gilstray, 1986) 피해의심각성및상품적가치훼손에우

44 려를주고있다. 따라서음파처리에따른섭식량저하는이해충의반드시응용에직접적효과를줄수있다고볼수있다. 또한본실험결과는엽육속에있는유충이이러한음파를감지한다는것을나타내고있다. 음파처리는용발육을크게저하시켰다. 용기간을연장시키고우화율을낮추었다. 음파처리를받은용도체내단백질패턴도무처리에비해상이하다는것을나타내어아메리카잎굴파리의용도음파를직간접적으로감지하였다는것을나타내고있다. 척추동물의경우스트레스음파는 Tryptophan hydroxylase 활성을변화시켜신경계신경전달물질인세로포닌의분비량을변화시킨다고보고하였다 (Singh et al., 1990). 본연구에서보여준용발육지연및우화율저하는호르몬신호변화로유추해볼수있다. 즉, 유약호르몬의이상분비또는엑디스테로이드의분비저하는용발육의지연및우화저하를조절할수있다. 이에따른후속분석연구가진행될필요가있다. 성충시기에스트레스음파는아메리카잎굴파리가갖는주광성에는영향을주지않지만암컷의산란력에억제효과를나타냈다. 아메리카잎굴파리가광식성이지만선호하는기주가있다는증거가있어 (Wei et al., 2000), 감각기수준의산란촉각구조를살펴보면화학및물리적신호에반응하는다양한감각기구조가관잘되었다 (Shin et al., 200 6). 따라서스트레스음파는암컷아메리카잎굴파리의산란선호성및행동에음파감지감각기를통해음성적으로영향을주었을것으로사료된다. 이상의스트레스음파가아메리카잎굴파리에미치는생리적변화는응용적으로살충제감수성제고효과를기대하였고본연구는스피노사드에대해서그상승효과가입증되었다. 이러한스트레스음파의살충제감수성제고효과는약제의작용적인 Nicot onoc acetylcholine receptor에대한영향은물론이고약제대사작용의억제등으로추론해볼수있다. 이에대한후속분석연구가필요하다. 본연구는특정음파가아메리카잎굴파리의발육에스트레스도작용할수있다는것을제시하고있다. 또한이러한스트레스음파를이용하여직접또는협력방제수단으로응용이가능하다는것을보여주었다. 제 7 절스트레스음파가미치는복숭아혹진딧물 (Myzus persicae) 의생 리변화및농약감수성제고효과 가. 연구요약본연구는서로다른주파수에따른복숭아혹진딧물의약제감수성과그에따른효과를조사하려한다. 음파는 95 db로고정하고 0-5,000 Hz의주파수에전체발육기간에걸쳐서진딧물을처리했다. 음파빈도의상승에따라유충에서성충까지의발육기간을늦추고암컷의증식을감소시켰다. 또한 5,000 Hz의음파에서처리한진딧물은이차원전기영동을이용하면체내의단백질이변화하는것을알수있었다. 2,000 Hz 이상의음파에서이미다클로프리드약제에대한감수성제고효과를나타냈다

45 나. 연구목적소리를이용한통신은냄새통신과유사하게접촉또는시각에비해이용범위가비교적넓고산란의다양성및장애물처리능력에서우수한반면자극원탐지능력이떨어지고에너지비용이높은단점을갖게된다 (Alcock, 1979). 소리통신을이용하는매미류및귀뚜라미류를제외하고도나방류유충이내는찰각소리신호 (Brown et al., 2007), 나방류수컷의초음파휘파람소리 (Nakano et al., 2009), 일부노린재류가이용하는진동음 (Cokl et al., 2007) 및멸구류의마찰음등다양한곤충종류에서나타나고있다. 주변매체를두드리는진동음을제외하고나타나는곤충의소리는비교적적은체구에서발생되기에저주파보다는수백 ~ 수천 Hz의주파수범위가가장흔하다 (Michelse n and Nocke, 1974). 이렇게발생된곤충의소리는종내교미용, 경보용및천적으로부터회피용및영역선호용으로사용된다. 스트레스음파에대한연구는척추동물을중심으로연구되었다. 급성스트레스음파에대해서스트레스성무통각증 (antinociception) 을유발하는반면, 장시간스트레스음파노출에대해서는반대로만성통증 (fibromyalgin) 또는류마티스관절염을유발하게된다 (Khasar et al., 2005). 이러한원인으로서실험용쥐에게스트레스음파를처리하면뇌에존재하며신경전달물질의합성을전달하는 tryptophan hydroxylase의활성을제고시켰다 (Singh et al., 1990; Corley et al., 1992). 곤충에있어서도박쥐가내는초음파는밤나방류의회피행동을유발하는스트레스음파로작용할수있고, 이러한스트레스는곤충의신경계에존재하는아세틸콜린에스테라아제의활성변이와연관되었다 (Zha et al., 2008). 본연구는복숭아혹진딧물 (Myzus persicae) 을대상으로다양한주파수의음파를처리하여나타나는생리적변화를분석하였다. 소리의세기를일정하게유지하고 0-5,000 H z의주파수소리를진딧물전체발육단계에노출시켰다. 이후초래되는약충발육속도및성충의번식력을분석하였다. 또한스트레스음파에대한진딧물의반응정도를 2차원전기영동을이용하여전체단백질패턴분석을실시하였다. 끝으로이스트레스음파가살충제의감수성에미치는효과를분석하였다. 다. 재료및방법복숭아혹진딧물은농촌진흥청국립원예특작과학원에서분양을받아실험실내에서배추잎을기주로하여누대사육하였다. 사육조건은 25±1, 광주기 16:8h (L:D) 조건에서사육하였다. 그린테코 ( 주 ) 로부터제공받은음파기기는데시벨측정기, 음파처리구 (45 90 cm), 음파송출기로구성되어있다. 복숭아혹진딧물은 10마리 3반복으로실험이진행되었으며실내온도 25 C에서주파수는 95 db로고정하고 0, 100, 315, 630, 1000, 그리고 5,000 Hz의음파에서 24시간을노출시켜생리변화를관찰하였다. 복숭아혹진딧물약충 10마리씩 3반복으로샬레에나눠담고각주파수별 0, 100, 315,

46 630, 1000, 2000, 5000 Hz로누출을시켜주면서일정시간배추잎을교체해주면서성충까지발육기간을조사하였다. 이차원전기영동은 Isoelectric focusing(ief) 과 Ettan IPG phor II IEF System (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) 을이용해분석했으며, 단백질량은 300 μg, Running조건은 100 V에서 1시간처리후 500 V에서 1시간, 다시 1 kv 에서 1시간, 2 kv에서 2시간 4 kv에서 2시간, 6 kv에서 1시간, 8kV에서 8시간, 총 18 시간동안처리후분석했다. 각농도별로희석하여현탄액을제조하였다. 이현탁액에배추잎 (1 cm 2 ) 을 10분간침지시킨후여과지가깔린용기에서 5분간건조시켰다. 각배추잎에복숭아혹진딧물약충을 10마리씩 3반복으로처리하였으면, 주파수별 (0, 100, 315, 630, 1000, 2000, 5000 Hz) 로노출을시켜주면서 5일까지생존율을조사하였다. 시험결과는백분율을자료로서 arcsine 변환후 SAS의 PROC GLM (SAS Institute, 1 989) 을이용하여 ANOVA분석을실시하였다. 반수치사량 (LC 50 ) 은 PROBIT 분석법 (Ray mond, 1985) 을이용하여산출하였다. Sigma Plot 8.0을이용하여그래프화하였다. 라. 결과및고찰다양한음파주파수 (0-5,000 Hz) 를진딧물약충에처리한결과발육에영향을주었다 (Fig. 43). 음파의처리주파수가증가함에따라성충까지의발육기간이지연되었다. 이러한지연효과는 630 Hz이상의주파수에서대조구에비해뚜렷하게나타났다. 또한이러한스트레스음파는복숭아혹진딧물의증식율에도영향을주어 2,000 Hz이상의주파수에서는대조구에비해현저히낮은증식율을기록했다 (Fig. 44). 스트레스음파가복숭아혹진딧물의체내변화에대한영향을조사하기위해 5,000 H z의음파를처리하고대조구와비교하였다 (Fig. 45). 단백질분석은이차원전기영동을이용하였으며, 대조구의경우총 83개의단백질이검출된반면음파처리구는이보다적은 80개의단백질이나타났다. 특히음파처리구는특이적단백질이나타났다. 스트레스음파에대한복숭아혹진딧물의발육저하효과는살충제에대한감수성제고를일으킬수있다는가설을검정하였다 (Fig. 46). 이미다클로프리드살충제에대해서복숭아혹진딧물은 125 ppm (75.77 < LC < ) 의반수치사약량을나타냈다. 이반수치사약량을이용하여음파처리효과를검정하였다. 음파처리에대해 5,000 Hz 이상의음파로복숭아혹진딧물의살충제감수성을현격하게제고시켰다

47 10 Development of time (days) d bcd cd abc abc ab a ,000 2,000 5,000 Sound frequency (Hz) Fig. 43. Effect of different sound frequencies on development of Myzus persicae from nymph to adult at 25. Sound intensity was 95 db in all frequency treatments. Newly hatched nymph was exposed to the sound treatment. Each treatment was replicated three times and each replication used 10 individuals. Different letters above standard deviation bars indicate significant difference among at Type I error=0.05 (LSD test). 10 Number of progeny per female a ab abc abc abc bc c ,000 2,000 5,000 Sound frequency(hz) Fig. 44. Effect of different sound frequencies on female fecundity of Myzus persicae. Teneral adult females were exposed to different sound treatment at a constant 95dB intensity. Progeny counts were made from the number of laid eggs during treatment period (5 days at 25 ). Each treatment was replicated three times and each replication used 10 individuals. Different letters above standard deviation bars indicate significant difference among at Type I error=0.05 (LSD test)

48 90 kda ph 3 ph 10 ph 3 ph 10 Control Sound treated N=53 Control 1 36 Treated 16 9 kda Fig. 45. Effect of a sound stress (5,000 Hz, 95 db) on protein expression pattern of Myzus persicae. A cohort of M. persicae was divided into control and treatment group. The sound treatment was performed for 24 h. (A) Two dimensional electrophoresis, where triangle and circle indicate specific spots to control and sound treatment, respectively. (B) Venn diagram of the protein expression pattern of total protein spots (N=53). (A) (B) a Mortality (%) Mortality (%) c c c c c b ,000 2, ,000 2,000 5,000 Dose (ppm) Sound frequency (Hz) Fig. 46. Effect of different sound frequencies on susceptibility of Myzus persicae against imidacloprid. (A) Dose-mortality curve of M. persicae against imidacloprid without sound treatment. (B) Enhanced susceptibility of the insecticidal toxicity by higher sound frequencies. Each treatment was replicated three times and each replication used 10 larval. Different letters above standard deviation bars indicate significant difference among at Type I error=0.05 (LSD test). 제 8 절스트레스음파처리에따른파밤나방체내생화학적변화 가. 실험목적 스트레스음파처리따른파밤나방 (Spodoptera exigua) 혈장의전체단백질함량변화,

49 체내지질및탄수화물변화를분석하였다. 또한스트레스음파에대해서파밤나방중 장소화효소분비및활성에미치는영향을미치는지 2 차원전기영동 (2D) 과 PLA2 효 소활성분석을통해생리적변화를관찰하였다. 나. 실험방법유충을 1994년안동시에소재한파 (Allium fistulosum L.) 재배지에서채집한후실내에서인공사료 (Goh et al., 1991) 를먹이로파밤나방유충을누대사육하였다. 사육배양기의조건은온도 25±1, 광주기 16:8h (L:D) 이었다. 성충의먹이로 10% 의설탕물을산란상자에공급하였다. 그린테코 ( 주 ) 로부터제공받은음파기기는데시벨측정기, 음파처리구 (45 90 cm), 음파송출기로구성되어있다. 파밤나방은실내온도 25 C에서주파수는 95 db로고정하고 5,000 Hz의음파에서 24시간을노출시켜생리변화를관찰하였다. 파밤나방 5령유충 30 마리를음파 (100, 310, 630, 1000, 2000 및 5000 Hz) 에 24 시간동안노출시킨후혈림프를추출하였다. 측정시료는 1 ml의 1x Bradford 용액과 20 μl의혈장를넣은후 5 분동안상온에서반응시켜 595 nm의파장에서흡광도를측정하였다. 서로다른 bovine serum albumin (Sigma, MO, USA) 표준용액을이용하여단백질함량분석표준식을얻었다. 지질함량을분석하기위해측정시료는 100 μl의혈장과 100 μl의 chloroform : me thanol (1:1, v/v) 을 5 분동안반응시킨후 13,000 rpm에서 5 분동안원심분리를하였다. 원심분리된상층액을 95 의항온수조에서 20 분동안증발시킨후 200 μl의황산을넣고 95 의항온수조에서 10 분동안반응시켰다. 상온으로옮긴후 5 ml 의 Va nillin 용액 (600 mg vanillin, 400 ml phosphoric acid) 을첨가후 525 nm에서흡광도를측정하였다. 표준곡선은 linseed oil (0-500 μg ) 을사용하였다. 탄수화물함량분석을위해측정시료는 100 μl의혈장, 300 μl의 2% Na2SO4와 600 μl의 Methanol을첨가후 5 분동안반응시킨후 13,000 rpm에서 5 분동안원심분리를하였다. 하층액과상층액으로나누어글리코겐과당분을분석하였다. 상층액이 μl가되도록 95 의항온수조에서 50 분동안증발시켰다. 이후상온으로옮긴후하층액과상층액에각각 5 ml의 Anthrone 용액 (750 mg anthrone, 380 ml H 2 SO 4, a nd 150 ml 증류수 ) 을첨가후 625 nm에서흡광도를측정하였다. 표준곡선은포도당 (0-500 μg ) 을사용하였다. 이차원전기영동은 Isoelectric focusing (IEF) 과 Ettan IPGphor II IEF System (GE H ealthcare, Uppsala, Sweden) 을이용해분석했으며, 단백질량은 300 μg, Running조건은총 18시간동안으로 100 V에서 1시간처리, 500 V에서 1시간, 다시 1 kv에서 1시간, 2 kv에서 2시간 4 kv에서 2시간, 6 kv에서 1시간, 8kV에서 8시간으로총 8단계로구성되어있다. 파밤나방 5령유충 10 마리를음파에 24 시간동안노출시킨후중장을추출하였다

50 추출한중장에서내강과상피표피로나누어분리하였다. 상피세포는다시 PBS로 3회세척한후다시 PBS를이용하여단백질추출하였다. 내강시료는 14,000 rmp에서 5분간원심분리한후상등액을분리하여 PLA 2 효소활성측정에이용하였다. 측정시료는 20 μl의 10% bovine serum albumin, 50 mm Tris-HCl buffer (ph 7.0) 은 1,946 μl, 1 M CaCl2 12 μl, 중장시료를 20 μl섞은후마지막으로 2 μl pyrene labeled (1-hexade canoyl-2-(1-pyrenedecanoyl)-sn-glycerol-3-phosphatidyl choline) 을넣은후 10 분동안반응시켜분광형광계를이용하여측정하였다. 파밤나방 5령유충을각 55 마리씩음파 (100, 310, 630, 1000, 2000 및 5000 Hz) 에 24 시간동안노출시킨후각조직별 ( 혈구, 지방체, 소화관, 표피 ) 로 Trizol 방법을이용하여 RNA를추출하였고, 추출된 RNA는정량분석한후탈이온증류수를이용하여약 90 ng/ μl으로희석하여역전사효소 (Intron, Daejon, Korea) 를이용하여 cdna를합성하여 PCR 에이용하였다. 열충격단백질 (hsp70, 74, 83) 은특정프이머 (Wang et al, 2011) 를이용하여증폭하였다. 이때프라이머서열은 SexHsp70 : 5 -CAT GAA TCC TCG CGC ACT GC-5 ', 5'-CCT TGT CGT TCT TGA TCA CG-3', SexHsp74 : 5 -CCT ACC TGA ACA CCT C AG T-3', 5'-GGG ATC GTA GTA TTT CTG GTG-3', SeHsp83 : 5'-GCT GAC ATT AG C ATG ATT GG-3', 5'-GGC AGG TCC TCA CTG TCT AC-3' 이다. 또한 apolipophorin- III (ApoLpIII) 유전자역시특정프라이머를이용하였다. 이때프라이머서열은 5 -AT G GTC GCC AAG TTG TTC GTG-3', 5'-CTG CTT GTT GGC AGC CTC-3' 이다. 각 PCR 시료의구성은다음과같았다. cdna 1 μl, dntp 2.5 μl, 10x PCR 완충용액 2.5 μl, 프라이머각각 1 μl (25pmol/ μl ), Taq polymerage 0.5 μl, 3차증류수 16.5 μl로구성되었다. PCR 반응조건은초기 94 에서 2 분동안불활성단계를거친후, 25 반복으로증폭단계를거쳤다. 증폭과정은 94 에서 1 분동안변성단계와프라이머결합반응은 h sp70, hsp74, 83, 및 ApoLpIII 각각 53, 45, 48, 53 에서 1 분, 72 에서 1 분의사슬연장단계로구성되었다. 이후최종사슬연장단계가추가로 72 에서 10분동안이워졌다. PCR 생성물은 1x TAE (40 mm Tris-acetate, 1 mm EDTA, ph 8.0) 에서 1% 아가로즈젤로확인하였다. 다. 연구결과음파처리에따른혈림프단백질함량의변화를조사하였다 (FIg. 47). 동일한소리세기 (95 db) 에서주파수를증가시킴에따라혈중단백질함량이감소하였다. 특별히 5,00 0 Hz에서는대조구에비해 50% 의단백질을함유하는것으로나타났다. 다양한음파처리에따라파밤나방 5령충혈림프의지질함량을분석하였다 (Fig. 43). 5,000 Hz 이하의주파수에서 U형의반응을보였다. 즉, 310-2,000 Hz의범위에서혈중지질함량이낮고, 그이하또는그이상에서는대조구와유사한혈중지질함량을보였다 (Fig. 48)

51 1000 Plasma proteins (µg/ml) a b b b c d e Sound frequency (Hz) Fig. 47. Change of plasma proteins of 5th instar larvae of Spodoptera exigua in response to different sound treatments at 95 db for 24 h. Different letters above standard deviation bars indicate significant difference among means at Type I error = 0.05 (LSD test) a a a Plasma lipid (µg/ml) b d cd bc Sound frequency (Hz) Fig. 48 Change of plasma lipids of 5th instar larvae of Spodoptera exigua in response to different sound treatments at 95 db for 24 h. Different letters above standard deveiation bars indicate significant difference among means at Type I error = 0.05 (LSD test). 파밤나방의스트레스음파처리에따른혈장의전체글리코겐함량은크게변화가없지만, 5,000 Hz의음파처리에서는뚜렷이증가하는경향을보였다. 그러나혈중유리당의경우는주파수가증가함에따라크게감소하는경향을나타냈다. 파밤나방 5령충을대상으로 5,000 Hz에서 24시간노출후소화관을적출하고중장세포와중장내강을각각적출하여음파처리에따른단백질의종류를 2차원전기영동으로분리해서효과를비교해본결과음파처리에따라특이적단백질이나타났고, 또한대조구에존재했던단백질이발현되지않았다 (Fig. 49). 중장내강의경우 55개의단백질이분리되었는데, 이가운데 45개는대조구에서나타난반면, 스트레스음파처리구에서불과 29개만나타났다. 그러나 10개의단백질은스트레스음파구에서만나타났다. 스트레스음파에 24시간처리후중장상피세포및중장내강에서일어난 PLA2 효소활성변화를분석했다 (Fig. 50). 파밤나방중장상피세포의 PLA2 효소활성을측정해

52 보면 5,000 Hz 에노출되었을때 PLA2 효소활성이낮아졌다. 파밤나방중장내강의 PL A2 효소활성을측정해보면 5,000 Hz 에노출되었을때 PLA2 효소활성이감소하였 다. Sugar (µg/ml) a a a b c d e Glycogen (µg/ml) b b b b b b a Sound frequency (Hz) Sound fruency (Hz) Fig. 49. Change of plasma carbohydrates of 5th instar larvae of Spodoptera exigua in response to different sound treatments at 95 db for 24 h. Different letters above standard deviation bars indicate significant difference among means at Type I error = 0.05 (LSD test). Midgut epithelium Midgut lumen Fig. 50. Change in total protein profiles of midgut epithelium and lumen of fifth i nstar larvae of Spodoptera exigua in response to a stress sound treatment (5,000 H z, 95 db) for 24 h. Proteins were separated on two dimensional electrophoresis

53 PLA 2 activity (pmol/min/µg) a Midgut epithelium b PLA 2 activity (pmol/min/µg) 7 a b Midgut lumen Sound frequency (Hz) Sound frequency (Hz) Fig. 51. Change in enzyme activity of phsopholipase A2 (PLA2) of midgut epitheli um and lumen of fifth instar larvae of Spodoptera exigua in response to a stress so und treatment (5,000 Hz, 95 db) for 24 h. Proteins were separated on two dimensio nal electrophoresis. (A) (B) (C) (D) Fig. 52. Change in gene expressions of stress proteins in different tissues of fifth instar larvae of Spodoptera exigua in response to different sound treatments at 95 db for 24 h. HC, FB, GUT, and EPD represent hemocyte, fat body, midgut, and epidermis. (A) hsp70 (B) hsp74 (C) hsp86 (D) apolipophorin III. Expression of β -actin was analyzed to confirm the cdna preparations

54 스트레스음파처리따른파밤나방의열충격단백질 (hsp70, 74, 83) 과 ApoLpIII 유전자발현변화를분석하였다 (Fig. 52). 스트레스음파의주파수가증가함에따라 hsp70의발현이억제되었다 (Fig. 52-A). 특히지방체와소화관에서는음파처리에따라서 hsp70의발현이억제되었다. 반면에 hsp74의경우스트레스음파처리에따라발현양이증가하는것을확인할수있다 (Fig. 52-B). 또다른열충격단백질인 hsp83 유전자의발현양은스트레스음파의주파수가증가함에따라감소하였다 (Fig. 52-C). 지질운송체인 apolipo phorin III (apolpiii) 의경우크게변화가없으나, 중장의경우음파주파수가증가함에따라발현양이증가하는것을알수있다 (Fig. 52-D). 제 9 절발현유전체분석을통한스트레스음파에대한곤충생리에 미치는영향평가 가. 연구요약곤충의생리작용에스트레스를부여하는음파범위가파밤나방, 복숭아혹진딧물및아메리카잎굴파리에서보고되었다. 그러나음파스트레스음파의체내작용기작에대한의문이제기되었다. 본연구는이를해결하기위해스트레스음파처리유무에따라체내에서일어나는발현유전체를 next generation sequencing 기술로분석하였다. 아메리카잎굴파리의전체발현유전체를분석하기위해번데기발육태를이용하여대조구와처리구로구분하여음파처리하였다. 이후전체 RNA를추출하고, 이를기반으로 RNA-Seq이이뤄졌다. 대조구에서약 7.8 Gb, 처리구에서약 8.1 Gb를읽어전체약 1 6 Gb의발현유전체의염기서열분석이이뤄졌다. 이를기반으로 Trinity 프로그램을이용하여 assemble한결과대조구에서 66,548개, 처리구에서 64,422개로전체 77,553개의 contig를확보하였다. 이를기반으로기능유전체 annotation이이뤄졌으며, 전체발현체의약 45% 의 contig에대해서기능을예측할수있었다. 이를기반으로발현유전체의양적비교에서스트레스음파는우선지질동원호르몬의발현을유발하였고, 이에따라 trehalose 대사에관련된유전체의발현양이증가하였다. 또한이화작용에해당하는유전체의발현을억제시켰으며, 면역유전자들의발현을증가시켰다. 신경계에도영향을주어 GABA receptor의발현을억제하여음파처리가스트레스로곤충에작용한다는것을밝혔다. 나. 연구목적아메리카잎굴파리 (Liriomyza trifolii) 는미국플로리다지역이원산지로알려져있으며, 1970년대이후로전세계에퍼져나가우리나라작물에까지피해를주게되었다 (Parrel la, 1987; Han et al., 1996). 이해충의피해는유충이엽육조직에터널을형성하면서식해하는것과성충의흡즙흔에의한잎피해를나눌수있다 (Parrella and Keil, 1984). 이러한작물체잎에대한아메리카잎굴파리의피해는광합성저하를유발하고, 작물체

55 의상품성을떨어뜨리는경제적손실을알게된다 (Trumble et al., 1985). 시설재배지를중심으로발생하는아메리카잎굴파리는비교적고온에잘적응하는해충으로 7-8월에최대성충포획량을보이며, 겨울철에도온실내에서세대를형성하게된다 (Park et al., 2000., 2001). 알에서성충까지 25 에서발육기간은거베라의경우 1 6.3일, 토마토의경우 12.3일로서연중다세대를발생시켜피해는물론이고살충제에대한저항성발달이우려되고있다 (Bethke et al., 1987; Moon etal., 2002). 높은번식력과빠른생활사는이들의발생예찰및방제기술을적용하는데판단기준이되는경제적피해수준의결정이요구되었다 (Lim et al., 2007). 아메리카잎굴파리의번식능력과약제저항성그리고시설재배지의조건의안전농산물생산에부합하기위해비화학적해충관리기술이요구되고있다 (Kim & Son, 2006). 본연구는스트레스음파의체내생리교란에대한분자생물학적작용기작을규명하는데목적을두었다. 이를위해아메리카잎굴파리에대해서스트레스음파를처리하고체내에서일어나는발현유전체를 next generation sequencing 기술로분석하였다. 염기서열자료는기능별로구분하고이를생리적작용기작과연계하여음파의스트레스성질을분석하였다. 다. 연구방법아메리카잎굴파리는농촌진흥청농촌진흥청국립농업과학원농산물안전성부작물보호과에서분양받았다. 전사육기간동안온도 25±1 C, 상대습도 60±10%, 광주기 16:8 h (L:D) 의조건에서유지되었다. 기주식물로강낭콩을이용하였다. 그린테코 ( 주 ) 로부터제공받은음파기기는데시벨측정기, 음파처리구 (45 90 cm), 음파송출기로구성되어있다. 아메리카잎굴파리는실내온도 25 C에서주파수는 95 db로고정하고 5,000 Hz의음파에서 24 시간을노출시켜유전체분석에사용하였다. 처리된아메리카잎굴파리번데기는 Trizol 용액으로전체 RNA를추출하였다. 추출된 RNA는마크로젠회사에보내져 RNA-Seq 분석이이뤄졌다. RNASeq은 Illumina HiSe q2000의기술로분석되었다. Assembly는 Trinity 프로그램을이용하였고, 유전체의 ann otation은 BlastX를이용하여실시되었다. 라. 연구결과아메리카잎굴파리의전체발현유전체를분석하기위해번데기발육태를이용하여대조구와처리구로구분하여음파처리하였다. 이후전체 RNA를추출하고, 이를기반으로 RNA-Seq이이뤄졌다 (Table 8). 대조구에서약 7.8 Gb, 처리구에서약 8.1 Gb를읽어전체약 16 Gb의발현유전체의염기서열분석이이뤄졌다. 이를기반으로 Trinit y 프로그램을이용하여 assemble한결과대조구에서 66,548개, 처리구에서 64,422개로전체 77,553개의 contig를확보하였다. Contig의길이도최소 201 bp에서최대 18,982 b p로서 assembly가비교적잘이뤄졌다고판단되었다

56 이발현체들의유전체본체를규명하기위해이들 contig들의염기서열유사도를바탕으로 GenBank에서 BlastX를통해발현유전체들의 annotation 작업을실시하였다 (Fi g. 53). 이를바탕으로 Gene ontology (GO) 분석을하여얻은발현체들의본체를규명하였다. 대조구에서는약 46% 의 contig들이기존에알려진유전체들과상동성이있음을나타냈다 (Fig. 53-A). 처리구에서는 43% 의 contig들이기존에알려진유전체들과상동성이있음을나타냈다. 이렇게 annotation 과정이거친유전체들은크게기능군별로나누는 GO 분석단계를거쳤다. 이과정에서생물기능, 세포기능및분자기능으로대별한결과대조구와처리구사이에유사한유전체를지니고있는것으로나타났다 (Fig. 53-B). 다만생물기능군에서대조구와처리구사이에소기능분류군에서차이가있는것으로보였다. Fig. 53. Annotation and gene ontology (GO) analysis of transcripts resulted from stress sound treatment on pupae of Liriomyza trifolii. (A) Comparison of functional groups between control and treatment. (B) Comparison of subfunctional groups between control and treatment. Table 8. Summary of transcriptone analysis of Liriomyza trifolii pupae, in which RNAseq data was generated by an Illumina HiSeq2000 with 1 kb paired end sequencing method Steps Contents Control Treatment Total Sequencing Total reads (bp) 7,836,796,646 8,143,909,770 15,982,706,416 Assembly Contigs 66,548 64,422 77,553 Max length (bp) 26,771 22,494 18,982 Min length (bp)

57 음파처리에따라변화되는발현체를분석한결과 77,555개의 contig 가운데 48,731개의 contig가발현양이줄거나늘어음파처리에전체유전체가운데 62.8% 가발현양이변동된것으로나타났다 (Fig. 54). 이가운데 3,872개는음파처리에따라완전히발현이사라진것이고, 4,042개는새롭게발현이시작된것이다. 반면 122개의유전체는 10 배이상발현양이줄고, 212개는 10배이상발현양이증가했다. (A) (B) ,872 4,042 Decrease (22,440) No change (28,824) Number of contigs Increase (26,291) Completely Inhibited > 10 fold Decrease Newly Induced > 10 fold Increase Fig. 54. Comparison of transcript levels between control and treatment of stress sound (5,000 Hz, 95 db) on pupae of Liriomyza trifolii. (A) Overall view (B) Number of contigs showing major differences. (A) (B) Fig. 55. Effect of stress sound (5,000 Hz, 95 db) on adipokinetic hormone and trehalose metabolism of Liriomyza trifolii. (A) Transcript levels (B) Diagram of the impact

58 음파처리에따라개별유전자의기능별로발현양의증감을분석하였다. 일반적으로스트레스에대해서민감하게반응하는내분비가지질동원호르몬 (adipokinetic hormone: AKH) 이다. 이호르몬은지질운송을자극하는호르몬이지만, 혈당을증가시키는것으로도보고되었다. 음파처리에따라 AKH의유전자발현이새롭게나타났다 (Fig. 55). 또한 AKH이수용체인 AKHR의발현양도증가하는것으로나타났다. 즉 AKH의신호전달체계가새롭게구성된것이다. 이호르몬신호체계는이후에 glycogen phosphor ylase의발현양이증가함에따라당동원의가능성을제시했다. 음파처리는 trehalose s ynthase 유전자의발현양을다시증가하였고, 이효소작용에의해형성된 trehalose가혈장으로나갈수있도록도와주는 trehalose transporter의유전자발현이다시증가하였다 (Fig. 55-A). 즉, 스트레스음파는카디아체 (corpora cardiaca) 에서 AKH의분비를증가시켰을것이고, 다시지방체에서이호르몬에반응할수있는 AKHR이발현되어원활하게이호르몬의신호체계를구축하였을것이다. 이후곤충의혈당인 trehalose 생성하는신호와이를혈장으로보내는유전자들의발현이증가된것으로미뤄스트레스음파는혈당의 trehalose 를증가시키는쪽으로생리작용이반응했을것이다 (Fig. 55 B). 해당작용에관여하는 10개효소의유전자발현양이분석되었다 (Fig. 56). 해당작용의첫반응은 hexokinase (HK) 로서음파처리에따라발현양이감소했다 (Fig. 56-A). 다음으로 phosphoglucoisomerase (PGI) 의발현양이음파처리에따라감소했다. 또한다른효소인 phosphofructokinase (PFK), aldolase (ALD), triose phosphate isomerase (TPI), glyceraldehyde-3-phosphosphate dehydrogenase (GA3PDH), phosphoglycerate kinase (PGK), phosphoglycerate mutase (PGM), 와 pyruvate kinase (PK) 모두음파처리에따라발현양이감소했다. 그러나 Enolase (ENL) 의발현은두처리모두에서나타나지않았다. 즉, 스트레스음파는해당작용의반응전체를억제하는것으로나타났다 (Fig. 5 6-B). TCA 회로에관여하는효소와전자전달계에관여하는효소인 cytochrome oxidase의발현양이비교분석되었다 (Fig. 57. 해당작용과 TCA회로를이어주는효소인 pyruvate dehydrogenase (PDH) 의발현이음파처리에따라억제되는것으로나타나, 이두회로의연결을차단하는것이스트레스음파의효과라는것을알수있었다. 또한 TCA 에관여하는효소가운데 fumarase를제외하고 7개효소유전자가검출되었다. 이들유전자들은음파처리에따라발현양이모두감소하는것으로나타났다. 전자전달계에서가장많이발현되는것이 cytochrome oxidase (CO) 이다. CO 유전자도음파처리에따라발현양이주는것으로나타났다. 이상의결과는스트레스음파처리에따라물질대사가운데이화작용이모두억제되는것으로본연구는나타내고있다

59 (A) (B) Fig. 56 Effect of stress sound (5,000 Hz, 95 db) on glycolysis biochemical pathway of Liriomyza trifolii. (A) Transcript levels (B) Diagram of the impact. 스트레스음파처리에따라이화작용과는대조적으로동화작용의경우발현양은오히려늘어나는것으로나타났다 (Fig. 58. 포도당합성과정 (gluconeogenesis) 의경우해당작용과비교하여 3 가지비가역반응에서모두합성과정효소의발현양이증하는것으로나타났다. 따라서스트레스음파는포도당분해보다는합성방향으로생화학반응이선회하는것으로나타났다

60 (A) (B) Fig. 57 Effect of stress sound (5,000 Hz, 95 db) on TCA and electron transport biochemical pathway of Liriomyza trifolii. (A) Transcript levels (B) Diagram of the impact. Fig. 58 Effect of stress sound (5,000 Hz, 95 db) on gluconeogenesis metabolic pathway of Liriomyza trifolii

61 Fig. 59. Effect of stress sound (5,000 Hz, 95 db) on fatty acid metabolic pathway of Liriomyza trifolii. 지질합성에관여하는효소들의유전자발현양상이분석되었다 (Fig. 59). 음파처리에따라이들유전자의발현이증가하는것으로나타났다. 즉, 스트레스음파는에너지를생성하는대사의이화작용은억제하는동화작용은촉진시키는것으로본연구는나타내고있다. 소화효소에관여하는효소들의음파에대한민감도를분석하였다 (Fig. 60). 음파처리에따라트립신의발현양은크게줄어들었다. 그러나 aminopeptidase나 carboxypeptid ase의발현양은오히려늘었다. 또한지질분해효소의경우도대부분스트레스음파처리에따라감소하나면역반응과관계를갖는 PLA2의경우는오히려발현양이증가하는것으로나타났다. 스트레스음파가신경계에작용하는양상이분석되었다 (Fig. 61). 신경계작용하는유전자가운데크게증가하는유전자는 GABA receptor 유전자이다. 음파처리에따라이유전자의경우약 1.5배이상발현이증가하는것으로나타나, 스트레스음파에따라억제신경의민감도가높아질것으로예상된다

62 Fig. 60. Effect of stress sound (5,000 Hz, 95 db) on digestive enzymes of Liriomyza trifolii. Fig. 61. Effect of stress sound (5,000 Hz, 95 db) on nervous system of Liriomyza trifolii

63 Fig. 62. Effect of stress sound (5,000 Hz, 95 db) on genes associated with metamorphosis of Liriomyza trifolii. 스트레스음파처리에따라곤충의변태에관여하는유전자들이분석되었다 (Fig. 62). 번데기의경우우화하는데여러탈피행동촉진신경호르몬의작용이요구된다. 여기에는 eclosion hormone, eclosion triggering hormone, CCAP 등이필요하다. 스트레스음파는이들유전자들의발현을억제하는것으로나타났다. 또한키틴분해효소의발현양도줄이지만, 키틴합성효소의발현을증가시키는것으로나타나, 스트레스음파는지속적으로동화작용을증가시키는것으로해석된다. 특별히유약호르몬의신호에과여하는 Met 유전자의발현이크게줄어드는것을확인하였다. 즉, 스트레스음파는내분비교란을일으키는것으로해석된다

64 Fig. 63. Effect of stress sound (5,000 Hz, 95 db) on genes associated with immune system of Liriomyza trifolii. 스트레스음파에대해면역작용관여유전자의발현이분석되었다 (Fig. 63). 음파처리에따라모든면역유전자들의발현양이증가했다. 특별히 defensin의경우는수백배의발현양증가를보였다. 반면에열충격과같은스트레스에반응하는 HSP의경우는스트레스음파에대해크게반응하지않는것으로나타났다 (Fig. 64). Superoxide dismu tase (SOD) 의경우는음파처리에따라발현양이크게줄어들었다. 즉, 방어체계를만들어놓았지만, 이를대처하는스트레스관여유전자들은발현이증가하지않는생리적교란상태가스트레스음파에의해초래되었다

65 Fig. 64. Effect of stress sound (5,000 Hz, 95 db) on genes associated with physiological stresses of Liriomyza trifolii. 위의그림은스트레스음파에의해일어나는아메리카잎굴파리의생리적변화를보 여주고있다. 모든생리적작용이스트레스음파의영역에있다는것을알수있다. 제 10 절스트레스음파를이용한해충방제기술개발 가. 연구요약스트레스음파처리는파밤나방 (Spodoptera exigua) 의생리변화를유발시킨다. 이연구는초음파 ( 20 khz) 처리가파밤나방유충섭식, 용발육및성충교미행동에미치는영향을분석하였다. 초음파처리는 5령충의섭식활동을억제시켰다. 특별히 30 kh

66 z 또는 45 khz 초음파처리를받은유충은 50% 이상의섭식활동이감소하였다. 이러한초음파처리를받은유충은혈장의주요영양물질함량이변동되었다. 혈장단백질은처리초음파의주파수증가에따라감소하였다. 그러나혈당은처리초음파의주파수증가에따라증가하였다. 지질함량은 30 khz 처리까지는증가하다가이후감소하였다. 파밤나방 5령의혈구, 지방체및표피세포의세조직은스트레스관련유전자들인세종류의열충격단백질과 apolipophorin III를발현시켰다. 그러나초음파를처리할경우이들스트레스유전자들의발현이억제되었다. 초음파처리는또한용발육을억제시켜, 용기간을연장시키고성충으로우화를현격하게낮추었다. 끝으로초음파처리는성충의교미행동을억제시켜암컷의산란력을뚜렷하게낮추었다. 이러한결과를바탕으로야외포장에발생된파밤나방과배추좀나방 (Plutella xylostella) 종령에처리한결과생물농약방제효과를현격하게증가시키는효과를나타났다. 나. 연구목적일부곤충은짝을찾는통신수단으로소리를이용하고있다. 이러한소리는비교적낮은주파수를이용하는충돌음과비교적높은주파수를갖는마찰음과진동음으로나눌수있다. 충돌음은여치류 (Meconema thalassinum) 가풀잎위에앉아서뒷다리로잎표면을일정한속도로두드리면서나오는낮은주파수의소리형태가주변의같은종에게통신신호로이용되는경우이다 (Sismondo, 1980). 반면에몸의상호부위가줄과마찰편의구조를지닐때이두부위를비비면서발생되는소리는마찰음이되며, 메뚜기와귀뚜라미등많은종류의곤충이이러한소리로교신하게된다 (Haskell, 1957; Stephen and Hartley, 1995). 진동음은얇은진동막을활처럼진동시키며발생되는소리로교신하는매미류에서찾아볼수있다 (Young and Bennet-Clark, 1995). 소리를감지하는곤충의청각은물리적음파신호를전기적신호로전환하는감각기와이를뇌로이송하는신경전달과정및이에상응한행동반응으로이어지게된다. 청각수용은고막, 기계감각털, 박각시류의아랫입술수염및모기류의존스턴기관등곤충에따라다양하게존재한다 (McIver, 1985). 따라서소리발생과청각이짝을이루면서의사소통이이뤄지며, 이때소리를이용한통신은종특이적주파수와진동수를갖게된다 (Jan g, 2011). 소리통신은또한곤충과포식자의관계에서도나타나고있다. 다수의곤충류는식충성박쥐의음파탐지를감지할수있는기작을개발시켰다 (Roeder, 1967). 초음파에대한회피행동은이들곤충류에서는반사운동으로프로그램되어고막기관으로수신된초음파는박쥐인식으로감지되고다시운동신경으로연결된다 (Schulze and Schul, 200 1). 밤나방의경우박쥐의음파탐지신호를탐지하는청각신경을찾고이신경의전기적반응을밝혔다 (Payne et al., 1966). 초음파의세기에따라밤나방의회피행동은차이를보여높은자극에는땅에떨어지는행동을보이는반면낮은자극에대해서는음파근원지로부터멀어지는비행행동을보이게되며, 이때가장감각이높은주파수는

67 0 khz로보고되었다 (Miller and Surlykke, 2001). 이때초음파는소리수신자의가청범위에속하나참의사소통이라기보다는오히려정상적생리현상을교란시킬수있는스트레스음파로작용할수있다. 스트레스음파에대한연구는척추동물을중심으로연구되었다. 쥐의경우급성스트레스음파에대해서스트레스성무통각증 (antinociception) 을유발하는반면, 장시간스트레스음파노출에대해서는반대로만성통증 (fibromyalgin) 또는류마티스관절염을유발하여스트레스음파가신경계와면역계에해로운영향을줄수있다고밝혔다 (Kha sar et al., 2005). 스트레스음파가곤충생리적현상에미치는현상이파밤나방 (Spodoptera exigua), 아메리카잎굴파리, 복숭아혹진딧물에서분석되었다. 이들곤충류는모두 5,000 Hz의주파수소리에생리적반응이교란되는현상을보였다. 파밤나방의경우유충의섭식활동이둔화되고, 이에따라발육이지연되며면역활동이낮아지는현상을보였다 (Park et al., 2011a). 이들곤충류는스트레스음파에노출될경우살충제에대한내성이낮아져서살충제의방제효과를높여주는응용적효과도보여주었다. 이러한기존연구를바탕으로본연구는초음파가밤나방의일종인파밤나방에게주는생리적교란현상을분석하였다. 먼저유충과용의발육에미치는초음파의영향을분석하였다. 이후성충의교미행동에미치는초음파의영향을분석하였다. 또한본연구는초음파가생체내생화학적변화를유발하는지를밝히고자혈장영양물질의변동을조사하고스트레스관련유전자발현을분석하였다. 이를토대로본연구야외에발생된파밤나방집단에초음파를처리한결과미생물농약방제효과를현격하게증가시켰다. 다. 연구방법파밤나방유충을안동시에소재한파 (Allium fistulosum L.) 재배지에서채집한후약 18년간실내에서인공사료 (Goh et al., 1990) 를먹이로누대사육하였다. 사육배양기의조건은온도 25±1, 광주기 16:8 h (L:D) 이었다. 성충의먹이로 10% 의설탕물을산란상자에공급하였다. ( 주 ) 그린테코로부터제공받은음파기기는데시벨측정기, 음파처리구 (45 90 cm), 음파송출기로구성되어있다 (Park et al., 2011a). 분석된파밤나방은모두 5령충이고실내온도 25 C에서주파수는 95 db로고정하고 KHz의초음파에서일정시간동안노출시켜생리변화를관찰하였다. 파밤나방 5령유충을각 10 마리씩각초음파 (20-45 khz) 처리구에 24 시간동안노출시킨후, 해부하여각조직 ( 혈구, 지방체, 표피 ) 을적출하여 Trizol 용액 (Invitrogen, Carlsb ad, CA, USA) 을이용하여회사의추천방법으로 RNA를추출하였다. 추출된 RNA는정량분석한후탈이온증류수를이용하여약 90 ng/ μl으로희석하여역전사효소 (Bioneer, D aejon, Korea) 를이용하여 cdna를합성하여 PCR에이용하였다. 열충격단백질 (hsp) 가운데 hsp70, hsp74, hsp83 유전자를특정프라이머 (Xu et al., 2011) 를이용하여증폭하였다

68 이때프라이머서열은 SexHsp70은 5 -CAT GAA TCC TCG CGC ACT GC-3', 5'-CCT T GT CGT TCT TGA TCA CG-3', SexHsp74는 5 -CCT ACC TGA ACA CCT CAG T-3', 5 '-GGG ATC GTA GTA TTT CTG GTG-3', SeHsp83은 5'-GCT GAC ATT AGC ATG AT T GG-3', 5'-GGC AGG TCC TCA CTG TCT AC-3' 이다. 또한 ApoLpIII 유전자의특정프라이머를이용하였다. 이때프라이머서열은 5 -ATG GTC GCC AAG TTG TTC GT G-3', 5'-CTG CTT GTT GGC AGC CTC-3' 이다. 각 PCR 시료의구성은다음과같았다. cdna 1 μl, dntp 2.5 μl, 10x PCR 완충용액 2.5 μl, 프라이머각각 1 μl (25 pmol/ μl ), Taq polymerage 0.5 μl, 3차증류수 16.5 μl로구성되었다. PCR 반응조건은초기 94 에서 2 분동안불활성단계를거친후, 35 반복으로증폭단계를거쳤다. 증폭과정은 94 에서 1 분동안변성단계와프라이머결합반응은 hsp70, hsp74, hsp83, 및 ApoLpIII가각각 47, 45, 48, 53 에서 1 분, 72 에서 1 분의사슬연장단계로구성되었다. 이후최종사슬연장단계가추가로 72 에서 10분동안이어졌다. PCR 생성물은 1x TAE (40 mm Tris-acetate, 1 mm EDTA, ph 8.0) 에서 1% 아가로즈젤로확인하였다. 혈장단백질함량분석을하기위하여파밤나방 5령유충 10 마리를초음파 (20-45 khz) 에 24 시간동안노출시킨후혈림프를추출하였다. 추출한혈림프는 250 x g에서 5분간원심분리하여상등액혈장을얻었다. 측정시료는 1 ml의 1x Bradford 용액 (Bradford, 19 76) 과 20 μl의혈장을넣은후 5 분동안상온에서반응시켜 595 nm의파장에서흡광도를측정하였다. 정량분석의표준용액은 bovine serum albumin (Sigma-Aldrich Korea, Se oul, Korea) 을이용하여단백질함량분석표준식을얻었다. 혈장지질함량분석도상기방법대로초음파처리이후혈장시료를얻었다. 측정시료는 100 μl의혈장과 100 μl의지질추출용액 (chloroform : methanol (1:1), v/v) 을 5 분동안반응시킨후 12,500 x g에서 5 분동안원심분리를하였다. 원심분리된상층액을 9 5 의항온수조에서 20 분동안반응시킨후 200 μl의황산을넣고 95 의항온수조에서 10 분동안다시반응시켰다. 상온으로옮긴후 5 ml 의 Vanillin 용액 (600 mg Vanillin, 400 ml phosphoric acid) 을첨가후 525 nm에서흡광도를측정하였다. 표준곡선은 linse ed oil (0-500 μg ) 을사용하여지질함량표준방정식을얻었다. 혈장유리당 (free sugars) 함량분석을위해서앞서의방법대로초음파처리이후혈장시료를얻었다. 측정시료는 100 μl의혈장에 300 μl의 2% Na 2 SO 4 와 600 μl의 methanol 을첨가한후 5 분동안반응시켰다. 이후 12,500 x g에서 5 분동안원심분리를하였다. 상층액을유리당분석에이용하였다. 상층액이 μl가되도록 95 의항온수조에서 50 분동안증발시켰다. 이후상온으로옮긴후 5 ml의 Anthrone 용액 (750 mg of Anth rone, 380 ml H 2 SO 4, 150 ml 증류수 ) 을첨가한후 625 nm에서흡광도를측정하였다. 표준곡선은포도당 (0-500 μg ) 을이용하였다. 파밤나방 5령충 (2일차) 을대상으로주파수는 95 db로고정하고 0, 20, 25, 30, 35, 40 그리고 45 khz의음파조건에서 24 시간동안노출시켜섭식량차이를조사하였다. 섭식량조사시먹이는배추잎을이용하였으며, 처리전후의무게차이로산출하였다. 자

69 연감소된배추잎무게를산출하기위해동일한조건에서처리전후시간사이에감소된배추무게차이를산출하였다. 각처리는 10 마리씩 3 반복실시하였다. 용화 1 일째번데기를각각 10 마리씩 3 반복으로 25 에서각 0, 20, 25, 30, 35, 40 그리고 45 khz의주파수별로노출시키고우화될때까지의기간을측정하였다. 또한우화율도반복별로분석하였다. 갓우화한암컷 1 마리와수컷두마리를 0.2 L 원통용기 (10 cm 지름 x 10 cm 높이 ) 에 10% 설탕물과함께두었다. 이용기의윗면은망사로덮고초음파스피커에노출시켜음파처리를받을수있게하였다. 각초음파처리는 0, 20, 25, 30, 35, 40 그리고 45 khz의상이한주파수로구성되고 4 일동안처리하였다. 이후암컷당교미횟수는암컷교미낭에있는정자주머니의개수로판정하였다. 또한용기내부에산란된알수를계수하여산란력을평가하였다. 각처리는 5 반복으로분석하였다. 하우스조건의야외배추밭에 (Fig. 7A) 30 khz, 3.28 v 그리고 80 db 조건의초음파를처리하였다. 처리시간은오후 6 시이후부터다음날아침 8 시까지처리하였다. 시험에사용된배추는삼보얼갈이이며, 2월중순경발아하여, 3 월 10 일경정식하였으며, 3 월 27 일경파밤나방을처리하였다. 파밤나방은포기당 8 마리가발생했으며, 6 포기를한반복으로하였다. 농약처리는 Bacillus thuringiensis (Bt, Bayer cropscience, Gangnam gu, Korea) 를이용하였으며 200 ppm으로조제하여난괴법 3 반복으로처리하였다. 배추좀나방은포기당 15 마리발생했으며, 5 포기를한반복으로난괴법 3반복으로처리하였다. Bt 처리는파밤나방방제처리와동일했다. 처리에따른평균간비교는 SAS의 PROC GLM (SAS Institute, 1989) 을이용하여 A NOVA 분석을실시하였다. 자료의도형화는 Sigma Plot 8.0 (Systat Software, Inc., Poi nt Richmond, CA, USA) 을이용하여도식화하였다. 라. 연구결과파밤나방 5령충을대상으로초음파의유충섭식행동에미치는영향을분석했다 (Fig. 64). 종령의파밤나방은 25 에서 5 일동안지내고용화과정으로진행된다. 이시기에섭식은초기 3 일동안진행되고, 4 일째부터섭식량이줄면서 5 일째에는먹이로부터떨어지는배회행동을보이게된다 (Kim, 2012). 따라서섭식량분석은 2 일째 5령충을이용하였고, 24 시간동안상이한초음파에노출속에섭식량을비교하였다. 이때초음파의주파수가증가하면서섭식량은감소하는것으로나타났으며, 특별히 30 khz와 45 khz 처리에서는 50% 이상의섭식량감소를보였다. 초음파처리따라파밤나방혈장에존재하는전체단백질함량변화를분석한결과, 30 khz 까지는주파수에상관없이일정하게약 4% 의단백질함량을보였다 (FIg. 65). 그러나 35 khz 이상에서는혈장의단백질의함량이줄어드는것을관찰하였다. 혈장내지질은대조구에서약 0.3% 를보였으나, 모든초음파처리구에서는현격하게증가

70 하여 30 khz를처리한유충의경우는약 1.3% 로증가하였다. 그러나다시 35 khz 이상처리에서는지질함량이감소하는경향을보였다. 혈장에존재하는유리당의경우약 0.15% 를보였으나초음파처리에따라현저하게증가하여혈당이약 0.5% 를차지하였다. Feeding amount (g)/day/larva 1.8 ab 1.6 a 1.4 ab ab 1.2 ab 1.0 b 0.8 b Sound frequency (khz) Fig. 64. Effect of different ultrasound treatments (95 db) for 24 h on feeding rate of fifth instar Spodoptera exigua. Different letters above standard deviation bars indicate significant difference among means at Type I error = 0.05 (LSD test). Protein (µg/µl) a a a ab b bc c Lipid (µg/µl) d b b a b c d Sugar (µg/µl) d c bc ab a a a Sound frequency (khz) Fig. 65. Change of plasma proteins, lipid and sugars of 5th instar larvae of Spodoptera exigua in response to different ultrasound treatments at 95 db for 24 h. Different letters above standard deviation bars indicate significant difference among means at Type I error = 0.05 (LSD test). 초음파처리에따라세종류의열충격단백질과지질운송단백질인 ApoLpIII 의유전자

71 발현양상을조사했다 (Fig. 66). 조사된 4 종의유전자들은모두대조구에서발현을보였다. hsp70의경우음파처리에민감하게발현양이줄어들었다. 그러나조직별로감수성정도가달라혈구의경우모든초음파처리에서발현이감소하였고, 지방체의경우대조구에서보인약한발현이그대로유지하는경향을보였다. 또한표피세포의경우는 30 khz 이상에서발현양이크게줄어드는경향을보였다. hsp74는모든초음파처리에서세조직모두발현이억제되었다. hsp83의경우도모두초음파처리에서발현양이감소하였다. ApoLpIII는비교적초음파처리에반응하지않았으나, 표피세포는다소감소하는경향을보였다. Fig. 66. Change in gene expressions of stress proteins in different tissues of fifth i nstar larvae of Spodoptera exigua in response to different ultrasound treatments at 95 db for 24 h. HC, FB, GUT, and EPD represent hemocyte, fat body, midgut, and epi dermis, respectively. (A) hsp70 (B) hsp74 (C) hsp86 (D) apolipophorin III (ApoLpII I). Expression of β-actin was analyzed to confirm the cdna preparations. 초음파처리따라파밤나방용발육의변화를조사하였다 (Fig. 67). 처리되는초음파의주파수가증가함에따라용발육기간이지연되었다. 일반적으로 25 에서약 5 일소요되는용발육기간이 45 khz의초음파로처리할경우약 8일로증가하였다. 또한성충으로발육이뚜렷이감소하여 45 khz를처리할경우우화율이 30% 로감소하였다

72 10 a 100 Pupal period (days) b bc b b bc c Adult emergence (%) Sound frequency (khz) 0 Fig. 67. Effect of different ultrasound treatments (95 db) on pupae in their development of Spodoptera exigua. Different letters above standard deviation bars indicate significant difference among means at Type I error = 0.05 (LSD test). 성충생리현상에미치는초음파의영향을분석하기위해다양한초음파를처리하여파밤나방의교미율과이에따른산란력을분석했다 (Fig. 68). 파밤나방의교미는암컷의교미낭에존재하는정자주머니의존재및개수를중심으로파악하였다. 본연구에서이용된 0.2 L 용기에서암컷한마리와수컷두마리를유지한경우 4일동안약 2 회이상의교미를한것으로처리암컷의교미낭에존재하는정자주머니개수로판단하였다 (Fig. 68-A). 이러한교미횟수는초음파처리에따라감소하여 45 khz를처리한경우평균 0.15 회로약 10배이상감소하였다 (Fig. 68-B). 이러한초음파처리속에암컷은산란수의감소를보였다 (Fig. 68-C). 대조구의경우약 780 개의알을산란한반면, 45 khz 처리한경우 200 개이하의알을산란하였다. 야외포장에발생한파밤나방 (95% 이상종령충과나머지는 4령말유충 ) 을대상으로하여 Bt (200 ppm) 를처리 5 일후약 25% 의살충력을나타내었다 (Fig. 69-B). 반면초음파를처리한경우약 35% 의살충력을나타내었으며, Bt와초음파를함께처리하였을경우약 60% 의높은살충률을나타내는것을확인할수있었다. 배추좀나방의경우도대부분종령에대한방제효과를분석하였다 (FIg. 69-C). Bt (20 0 ppm) 를단독으로처리한경우처리 5 일후약 34% 의살충력을나타낸반면초음파를처리한경우약 37% 의살충력을나타내었으며, Bt와초음파를함께처리하였을경우약 80% 의높은방제효율을나타내는것으로나타났다

73 (A) (B) 3.5 Number of spermatophores a b bc bc bc c c (C) Sound frequency (khz) 1000 Number of ovipositions/female a ab b c d e f Sound frequency (khz) Fig. 68. Effect of ultrasound treatment on mating frequency of Spodoptera exigua. Each experiment box (0.2 L) contains one female and two male. Treatment was conducted during first four days after adult emergence. Each treatment was replicated five times. (A) Observation of spermatophores in the spermathecae of females under stereomicroscope at 50x magnification. (B) Average number of spermatophores per female. Different letters above standard deviation bars indicate significant difference among means at Type I error = 0.05 (LSD test). (C) Effect of ultrasound treatment on oviposition of Spodoptera exgua

74 (A) (B) (C) S. exigua a P. xylostella a Mortality (%) c b Mortality (%) b? b d Control Bt (200 ppm) US Bt + US 0 c Control Bt (200 ppm) US Bt + US Fig. 69. Field assay to control two lepidopteran pests. (A) Experimental layout in cabbage field in greenhouse. Ultrasound (US) treatment used a speaker emitting 30 khz at 80 db for 14 h everyday from 6 pm to 8 am. The speaker was installed at 2 m above ground. Bacillus thuringiensis (Bt) treatment used 200 ppm. Control repres ents no treatment. Each treatment was replicated three times. (B) Control efficacy ag ainst late instar larvae of Spodoptera exigua. (C) Control efficacy against late instar la rvae of Plutella xylostella. 마. 고찰스트레스음파에대한곤충의생리적변화가파밤나방을비롯하여아메리카잎굴파리 (Liriomyza trifolii) 및복숭아혹진딧물 (Myzus persicae) 에서진행되었다 (Seok et al., 2010; Park et al., 2011a,b). 분석된이들곤충에서고주파 ( 특히, 5,000 Hz) 는발육생리, 섭식행동및산란생리과정에저해를주었다. 본연구는초음파 ( 20 khz) 가파밤나방의생리적교란에미치는영향을분석하였다. 초음파는유충의섭식행동을저하시켰다. 특별히 30 khz와 45 khz에서는 50% 이

75 상의섭식행동을억제시켰다. 또한혈장내영양물질의변동을일으켰다. 초음파처리에따라단백질의함량은감소하지만, 혈당과지질의농도는감소하는경향을나타냈다. 무처리구파밤나방유충혈장에존재하는영양물질의함량을퍼센트농도로환산하여보면가장많이존재하는것이단백질이고다음으로지질그리고혈당으로이어졌다. 이러한혈장의영양물질이함량변화는초음파처리가파밤나방에게스트레스로작용하는데서기인될수있다. 스트레스에관련되어곤충에서분비되는주요호르몬은기질동원호르몬 (adipokinetic hormone: AKH) 이다 (Gäde et al., 1997). 지질과혈당을높여주는 AKH는체내이화작용을높여주는생리적변화를유발시켜스트레스에대처하게한다 (Velki et al., 2011). 파밤나방이스트레스음파에노출되면내분비기관인카디아체 (corpora cardiaca: CC) 에서는 AKH를분비하고이호르몬의작용기관인지방체로하여금이화작용을촉진시켜저장된중성지질 (triglyceride) 이나글리코겐 (glycog en) 에서 diglyceride와포도당을유리시키고, 포도당은다시곤충의혈당인 trehalose로전환되어혈림프로방출되게된다. 이러한결과로스트레스음파에노출된파밤나방은혈장의지질함량과유리당의농도가올라가는스트레스대처상태로전환되게된다. 초음파처리가운데 30 khz 이상은단백질의함량저하를유발시키는데, 이는전체적대사저하에기인되는효과를초래할수있다. 초음파스트레스에대한생리적대처능력의저하는스트레스관련유전자발현의억제와연계된다. 즉, 열충격단백질 (HSP) 은고온, 저온, 건조, 영양결핍등의요인에의해발현되는스트레스관련단백질이다 (Feder and Hofmann, 1999). 이들의본래기능은세포의단백질합성에관여하여단백질의 3차구조를정상적으로이루게하는 cha perone 역할을담당하게된다 (Hartl and Hayar-Hartl, 2002; Walter and Buchner, 200 2). 이러한열충격단백질은일반적으로네부류로분류되어분자량이 kda되는소형 HSP와분자량이 60 kda의 HSP60, 70 kda의 HSP70 그리고 83 kda의 HSP83을포함하게된다 (Xu et al., 2011). 본연구에서는파밤나방에서밝혀진 3 가지 hsp 유전자들을대상으로초음파처리에따른발현을분석하였다. 모든열충격단백질의유전자발현이초음파처리에따라억제되는것을세조직에서관찰하였다. 이와같은초음파처리에따른 hsp 유전자들의발현억제는파밤나방이스트레스에대해대처하는능력을잃게되는생리적악영향을유발하게된다. 초음파에대한스트레스민감도는 ApoL piii 유전자발현에서도나타났다. ApoLpIII는지질운송단백질의구성원으로비교적분자량이큰 ApoLp I과 II로구성된곤충의혈장지질운송체인고밀도리포포린 (high density lipophorin) 에지질이결합하여저밀도리포포린으로전환될때지질의단백질결합을견고하게하여주는역할을담당하게된다 (Weers and Ryan, 2006). 또한 ApoLp III는세균의외막에존재하는지질다당체를인식하는면역물질로도기능을담당하고있다 (Halwani and Dunphy, 1999; Halwani et al., 2000). 파밤나방에서 ApoLpIII의발현을 RNA interference로억제하여주면면역력이크게저하되고발육이억제되는현상이보고되었다 (Son et al., 2012). 초음파에의한이단백질의발현억제는지질운송

76 능력의저하및면역력감소를유발할수있다. 특별히초음파처리에따라혈장에높아진지질을운송하려면그만큼이들의면역작용에기여도는낮아져서외래병원체침입에대해서대처능력이떨어지는면역결핍으로이어질수있다 (Adamo et al., 200 8). 이러한현상은이전연구에서보여준스트레스음파처리에따른면역저하현상으로설명되어진다 (Park et al., 2011a). 초음파처리에따라용발육과성충교미행동이억제되었다. 밤나방성충의경우복부에첫마디에존재하는고막기관을통해초음파를감지하는것으로밝혀졌다 (Payne e t al., 1966). 초음파에대한회피행동은이들곤충류에서는반사운동으로프로그램되어고막기관으로수신된초음파는박쥐인식으로감지되고다시운동신경으로연결된다 (S chulze and Schul, 2001). 초음파의세기에따라밤나방의회피행동은차이를보여높은자극에는땅에떨어지는행동을보이는반면낮은자극에대해서는음파근원지로부터멀어지는비행행동을보이게되며, 이때가장감각이높은주파수는 khz로보고되었다 (Miller and Surlykke, 2001). 이러한회피반응은성충의정상적교미행동에저해를주어교미율을낮춘것으로여겨진다. 그러나용의경우어떻게초음파를감지하였는지에대해서궁금하다. 용체표면에존재하는다양한기계감각털이초음파를탐지했거나아니면용체내에발육하는성충조직의고막기관이이를감지하는가설도세울수있다. 이에대한연구가필요하다. 본연구는초음파가파밤나방으로하여금생리적스트레스음파로작용할수있다는것을유충섭식저하, 용발육지연및성충교미행동저하및체내영양물질변화로보여주었다. 그러나초음파를감지하여이러한생리및생화학적변화를유도하는경로에대해서는추후연구에서이뤄져야한다. 제 11 절말토즈결합단백질의구조변화확인실험 가. 연구요약이연구에서는결합단백질의구조변화를형광공명에너지전이 (FRET) 에의한형광수명변화측정을통해분석했다. 결합단백질은말토즈결합단백질 (MBP) 를사용하였으며단백질의 C말단에시안형광단백질 (ECFP) 와 N말단에노랑형광단백질 (EYFP) 를형광공명에너지전이현상의도너와어셉터로서작용하도록합성하였다. 이 MBP의구조변화는 ECFP의형광수명의형광공명에너지전이현상으로인한변화를이용해측정하였다. MBP에결합된 ECFP의형광수명이두개의성분을갖고있음을확인하였고, 이 MBP가말토즈에결합하여발생하는구조변화에의해 ECFP의형광수명이둘모두짧아짐을확인하였다. 또한용액상의말토즈농도가증가함에따라 ECFP의형광수명이점진적으로짧아지는현상도볼수있었다. 이결과와시뮬레이션연구를통해말토즈의농도증가로인한 MBP의구조변화가형광체의형광수명감소의주된원임임을밝혀냈다

77 나. 연구목적형광공명에너지전이현상을측정할때, 형광수명을이용한분석방법은형광의세기를기반으로하는분석방법에비해배경의형광세기 (noise) 나형광체의농도에크게관련이없다는등의여러장점을갖고있다 (Ji et al., 2007; Millington et al., 2007). 형광공명에너지전이현상이일어나면도너형광체의형광수명이짧아진다고알려져있다 (Lakowicz, 2006; Becker, 2005). 그래서형광공명에너지전이현상에의한도너의형광수명변화가도너와어셉터의거리를추정하는데주로사용된다 (Lakowicz, 2006). 많은경우도너형광체의형광수명은둘혹은다중지수모델로계산할수있다. 단일광자시간상관계수장치 (TCSPC) 는시간영역형광수명측정에서가장일반적으로사용된다. TCSPC는형광감쇠히스토그램으로부터형광수명을얻을수있다. 실험에사용한형광체는최근형광공명에너지전이실험에많이사용되고있는 ECFP 와 EYFP를사용하였다. 말토즈결합단백질은 E. coli의주변세포질단백질중하나로수송계의화학반응에관여하는단백질이다. 이단일단백질은말토즈와의결합부분을가운데가지고있고, 이부위에말토즈가결합하면구조가변하게된다 (Marvin et al., 1997; Telmer and Shilton 2003; Jeong et al., 2006; Park et al., 2009). 이때말토즈결합단백질의양끝부분은말토즈와결합함에따라서로가까워지는구조변화를겪게된다 (Tang et al., 2007). 이연구에서우리는형광공명에너지전이로인한형광수명의변화측정을통해리간드결합단백질의구조변화를조사하였다. 이를통해음파로인한단백질의동역학적변화및단백질과다른물질사이의상호작용의실시간측정실험이가능함을확인하고이를위한기본적인데이터를얻는것이목적이다. 다. 재료및방법 ECFP, MBP, EYFP를발현시키는 DNA에각각의결합을끊어주는제한효소를함께집어넣었다. 그후적절한제한효소와결합효소를사용하여 3개의단백질을결합한혼합단백질을만들었다. 이를위해 Figure 70과같은결합벡터를만든후에 E. coli BL21(DE3) 박테리아에집어넣어서단백질을발현시켰다

78 Fig. 70. ECFP: MBP: EYFP vector ECFP의형광감쇠곡선은수제공초점현미경으로부터얻었다. 이현미경은 UPlanSApo60/1.20 수침대물렌즈 (Olympus) 를사용했고, 레이저광원으로는 40MHz의반복률을가진 440nm 다이오드펄스레이저 (LDH-P -C-440B, PicoQuant GmbH) 가사용되었다. 두개의 45 다이크로익빔스플리터가사용되었는데, 그중한빔스플리터 (FF458, Semrock) 은형광신호와광원을분리하는데사용되었고, 다른한빔스플리터 (FF520) 는 ECFP와 EYFP의형광을분리하는데사용되었다. ECFP의형광을측정하기위해서 483nm 대역통과필터 (FF01-483/32, Semrock) 를앞에둔어발란체포토다이오드 (avalanche photodiode, id100-50) 를사용했고, EYFP의형광은 532 nm 대역통과필터 (FF01-532/32, Semrock) 을앞에둔같은포토다이오드를사용하였다. 포토다이오드로부터발생하는단일광자에인한펄스는광자계수기 (PicoHarp 300, PicoQuant GmbH) 에서측정된다. 샘플에서의평균레이저파워는 1uW 이하로유지했고, 공초점의크기는약 1 μm 3 다. 실험에서기계적인반응함수는 ps의해상도를갖는다. 10초간형광감쇠곡선이 TCSPC로부터기록된다. 일반적으로각각의감쇠곡선이 개의광자로부터얻어지게된다. ECFP의형광수명은 Levenberg - Marquardt 알고리즘을통해두개의지수를갖는지수모델로부터추정된다. 이모델을통해두개의형광수명성분인 와각각의크기 ( 함량 ) 인 를얻을수있다. 실험의오차는반복실험을통해얻어진표준편자를사용하였다. 이때, 평균형광수명값인 는다음의식을통해얻었다. Intensity measurements 이실험에서 ECFP 와 EYFP 를각각에너지교환의도너형광체와어셉터형광체 로사용하였다. 도너의형광세기를, 어셉터의형광세기를 라고할때, 각각의

79 형광세기는형광히스토그램의총광자의수로부터계산되었다. 도너와어셉터의 형광세기비는다음과같이계산되었다. 여기서 와 는각각보정한도너와어셉터의형광세기이다. 와 는어셉터와도너의양자수율로 0.4과 0.7의값을가진다. D는각디텍터의검출효율의비로현장비에서는 1.43이었다. 마지막으로 L은도너의형광중어셉터를측정하는디텍터로들어가는양으로약 0.28로측정되었다. 모든실험에서는유리슬라이드 (Lab-TekR, 8 chambers, 0.8 well size) 의뚜껑을덮어증발을방지한상태에서사용하였다. 슬라이드의유리면은단백질의흡착을막기위한처리를하였다. 이를위해 0.1% 소혈청알부민용액을챔버에담아 4 에서하룻밤놓아두었다. 그후슬라이드를 PBS 용액으로 10회세척한후사용했다. 실험은 2 의 ECFP:MBP:EYFP ph 7.4 PBS 수용액에서상온으로진행하였다. 라. 결과실험에앞서적합한 TCSPC의채널크기를선택하기위해채널크기를바꿔가며평균형광수명을측정하는실험을진행하였다. 4% 오차범위이내에서평균형광수명값의의미있는변화가나타나지않았다. 때문에 TCSPC의채널크기를 32ps로임의로지정하여실험하였다. 말토즈를넣지않은상태에서 ECFP:MBP:EYFP 단백질의 ECFP의형광수명을측정하였다. 그결과 ± ±, ± ± 의형광수명값을얻었다. 이값은 5번반복실험한값의평균값이며오차는표준편차값이다. 다음으로우리는용액의말토즈농도를높여가며도너 (ECFP) 의형광수명측정실험을진행하였다. 말토즈는실험전에 ECFP:MBP:EYFP 용액에섞은후챔버슬라이드글라스에올렸다. 각형광수명값은 5회반복실험하여측정하였다. 실험에서는말토즈나 ECFP:MBP:EYFP의농도에상관없이항상 2개의형광수명성분만을얻을수있었다. 그래서실험에서는 ECFP:MBP:EYFP의농도는 로고정해놓은후말토즈의농도만변화시켜가며실험하였다. Table 9에서볼수있듯이말토즈농도가증가함에따라도너의형광수명은감소함을확인할수있었다. 실험결과 1.5 mm 이하의말토즈농도에서는도너의형광수명의의미있는감소는얻을수없었다. 말토즈가없을때도너의두형광수명성분의평균은 2.5 ns였고, 말토즈농도 1.5 mm 이하에서는말토즈의농도가증가함에따라약간의형광

80 수명평균의감소를확인할수있었다. 또한위에서설명한도너와어셉터의형광세기비를계산한결과말토즈가없을때에서는약 0.17의값을가진반면, 말토즈농도가각 15, 35, 150 M일때에는약 0.23의값을가졌다. 말토즈농도 1.5mM 이상에서는도너의형광수명이현저히변화했다. 실험결과 100 mm 농도의말토즈가있을때에는말토즈가없을때에비해대략 30% 정도의형광수명감소가확인되었다. 도너와어셉터의형광세기의비도뚜렷한변화를보였다. 말토즈농도가각 0, 1.5, 10, 25, 50, 100 mm일때, 형광세기의비는 0.17, 0.29, 0.30, 0.33, 0.38, 0.45로증가함을확인하였다. 마지막으로각형광성분의크기인 는말토즈농도에따른큰변화를나타내지는않았다. Table 9. Lifetime analyses for MBP in relation to various concentrations of maltose 마. 고찰실험결과에서얻어진두개의형광수명성분은일반적으로 CFP 계열의형광체에서가정되고있다 (Millington et al., 2007; Villoing et al., 2008). 그래서많은연구자들은두개의지수모델을 CFP 형광체의형광수명을추정하는데사용한다. Rizzo 등 (2004) 은 CFP의두형광수명성분이각각 1.2 ns, 3.6 ns라고하였고, Millington 등은 3.04 ns, 1.36 ns라하였다. CFP와 YFP가단백질등에연결될경우단백질의구조에중간형태가있으면 2개이상의형광수명성분이나올때가있다 (Marvin et al., 1997). 우리실험결과에서는항상 2개의형광수명성분을갖는다는것을확인하였기에 MBP의경우열린구조와닫힌구조의단 2개의구조만존재함을확인하였다. 1.5 mm 이하의말토즈농도에서형광세기의비에큰변화가없음은다른연구결과와같다 (Jeong et al, 2006). 실제로 10mM 정도부터말토즈와결합에의한 MBP의구조변화가나타나기시작한다는연구결과도있다 (Park et al., 2009). 우리는말토즈의농도가증가함에따라형광수명은감소하고형광세기의비는증가함을확인하였다. 이전에도말토즈농도증가에따른형광세기비의증가는보고되었으나그이유는설명되지않았다 (Jeong et al., 2006; Park et al., 2009). ECFP:MBP:EYFP에서말토즈농도의증가에따른도너의형광체의형광수명감소및형광세기비의증가에대한한가지가능한설명은말토즈에의한 MBP의뭉

81 침현상이다. 이뭉침현상이형광체사이에서에너지전이를일으켜위와같은현상을가능하게할수있다. 하지만우리실험결과, 이러한뭉침 MBP 사이의뭉침현상은발견되지않았다. 다른가능성은말토즈로인한일부 MBP의구조변화때문에발생하는단백질내의 FRET 현상이다. 이현상을확인하기위해우리는 Visual C++ 프로그램을이용해형광수명에대한시뮬레이션을실시하였다. 기본적으로 MBP가열린구조와닫힌구조의 2가지구조만가지고있다고가정하여형광수명을 2종류로만잡고시뮬레이션하였다. 열린구조의경우말토즈가없을때의형광수명값인 1.1 ns 와 3.4 ns를사용하였다. eke힌구조에대해서는말토즈 100mM 농도일때의형광수명값을사용하였는데, 이는말토즈와 MBP의해리상수가 1.2 M이기때문에이농도에서결합이포화상태일것이기때문이다. 각형광수명의크기 ( 전체에서차지하는비율 ) 는전체실험의평균값인 0.39와 0.61을사용하였다. 시뮬레이션결과는 Figure 71과같다. 시뮬레이션데이터와실험데이터가잘일치하는것을그래프를통해확인할수있다. 이를통해앞에서가정한열린구조와닫힌구조 2가지구조모델이잘적용됨을알수있다. 이연구를통해 MBP라는생체분자의수용액상태에서의구조변화라는동역학적특성을 FRET에의한형광체의형광수명변화를통해서측정할수있었다. 이를통해음파에의한생체분자의동역학적영향을측정할실험의자료로서활용할수있는데이터를얻을수있었다. Fig. 71. Simulated and experimented ECFP lifetime components in relation to the maltose concentrations. The ECFP lifetime values were measured at ph7.4 and 20 C with a hannel idth of 32ps for maltose concentrations of 0, 1.5, 10, 25, 50, and 100 mm. The simulated lifetime values are for the ECFP:MBP:EYFP participantrates in

82 FRET of 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, and 90%. 제 12 절혼성결합민감 DNA 프로브의광화학적특성측정실험 Ⅰ 가. 연구요약이연구에서는정상상태흡광및발광분광법 (steady state absorption and fluorescence spectroscopy) 를사용하여혼성결합민감 DNA 프로브 (hybridization - sensitive DNA probe) 의불활성화메커니즘을확인하였다. 시아졸오렌지와 2,2 -Methylenebis(N-alkylbenzotiazole) 이 DNA 프로브의뉴클레오타이드와공유결합으로연결되어있다. 형광체의비발광불활성화현상은일반적으로전자에의해유도된메틴브릿지의이성질체화반응 (isomerization) 때문이라고여겨지고있다. 비슷한점성을가지지만서로다른분자량을지닌용매들 ( 수크로즈, 글루코즈, 글리세린 ) 에서진행한실험은형광체의비발광불활성화현상에점성이중요한영향을미침을보여준다. 이때, 높은점성에서볼수있는형광체의큰양자수율은단순확산모델로설명할수있다. 이선형관계는형광체의형광세기에영향을주는다이머를형성하면서깨지게된다. 나. 연구목적최근형광체의발광여부를통해온-오프스위치로사용될수있는혼성결합민감 DNA 프로브가새로합성되었다 (Ikeda and Okamoto 2008; Ikeda et al., 2009). 이 DNA 프로브는타겟 DNA와상보적으로민감하게결합할수있게디자인되어있다. 이때프로브에붙어있는형광체는프로브의타겟과의결합여부에따라서로다른형광세기를갖게된다. 이러한형광세기변화의광화학적특성과형광체의비발광불활성화현상의자세한원리는아직밝혀지지않았다. 우리는형광체의형광감소에대해더이해하기위해흡광및발광분광법을이용해여러종류의용액에대해서실험을하였다. 프로브의피리미딘염기에붙어있는두형광체는초승달모양의구조때문에쉽게 H - aggregation을만든다. 유동적인유기사슬에의해연결되어있는형광체의발광은주로엑시톤의상호작용과광자에의해유발된이성질체화반응에의해조절된다 (Fürstenberg et al., 2006). 이형광체의양끝을잇는메틴브릿지가 전자에의해빛이흡수된후에회전하게된다. 이연구의목적은새로합성된 DNA 프로브의주된소광원인을다양한용액에서의스펙트럼분석을통해알아보는것이다. 엑시톤상호작용모델은형광체가다이머를형성했을때발광이줄어들것이라예상하지만, 광자에의한이성화작용소광모델은발광의감소현상이용매의점성과분자량의변화에더큰영향을받을것으로예상한다 (Sauerwein et al., 1992)

83 Fig. 72. Schematic diagram of the energy level and fluorophore conformation of the probe before and after hybridization with target 형광체사이의 H - aggreagation 형성은특별한에너지상태를만든다 (Fig. 68) [17]. 두개의에너지상태중낮은에너지상태에서전이다이폴모멘트가더많거나적게되고, 그결과낮은에너지상태의진동자강도가감소하게된다. 바닥상태에서여기상태로의전이는결맞는다이폴상호작용 (in-phase dipole interaction) 에의해일어난다. 그래서다이머를형성한형광체의흡수스펙트럼은모노머상태의형광체에비해파란색쪽으로쉬프트가일어나게된다. DNA에서염기들은거의같은평면에존재하고, 이평면과같은평면구조를갖는형광체는그염기서열사이로들어갈수있다. 만약다이머를형성하는형광체가 DNA 사이로들어가게된다면다이머구조보다는모노머구조를더많이갖게된다. 실험에사용한종류의형광체가다이머를형성하면소광현상과함께약 정도의흡광의쉬프트가일어난다. 따라서흡광스펙트럼을조사하면형광체의구조를확인할수있다. 시아닌계열형광체의여기상태에서는탄소-탄소결합에서여기상태를비활성화시키는비틀림회전이일어난다 ( 광유도이성화현상 ). 이회전현상은같은 ph, 이온조건아래에서용매의점성이나분자량등에의해그정도가결정된다. 용매의분자량이클수록용매와형광체의충돌은덜효과적이고비틀림회전도더작다. 용액의점성이높아짐에따라메틴브릿지의비틀림회전이저해되기때문에형광체의양자수율은커지게된다 (Carlsson et al., 1994). 형광체의용액의분자량이나점성에영향을받는광화학적특성을이해하는것은다른생체내에서형광체의발광및흡광측정을통해세포내의상태변화를실시간으로확인할수있는방법이된다. 이러한형광체가 DNA 와같이합성되어있는프로브의경우기존의단일형광체와는달리세포내의상황변화 ( 점성변화, 이

84 온농도변화 ) 등에대해더많은변화를가질수있으며, 이를이용하면그동안알 지못했던세포내의변화들을측정할수있게된다. 다. 재료및방법 Fig. 73. Chemical structure of D436, D514 흡광및발광스펙트럼은 Infinite M200 microplate reader(infinites200 PRO series, Tecan Group Ltd) 을사용하여측정하였다. 실험에사용한샘플의온도는기계에포함된온도조절장치를이용해 20 로고정하였다. 프로브의농도는 0.4 M, 타겟의농도는 0.5 M로고정하였다. 흡광스펙트럼은프로브가없을때측정한값을이용해보정하였다. 또한발광신호의경우배경노이즈에비해 100배이상의크기를가졌다. 모든샘플은 100 mm의 NaCl을포함하고있다. 형광의측정은 과 의흡수파장인 405 nm와 470 nm에서측정하였다. 각형광스펙트럼은파장에대한용액의굴절률과흡수상수에의해보정되었다. 형광의양자수율은에탄올용액에서의 coumarin 343 형광체와비교하여적정하였다 ( ). 프로브와타겟은실온에서 24 시간이상반응시켜둘사이의결합반응이모두이루어진후실험에사용하였다. 라. 결과 Figure 74와 75의 (A) 는각각타겟이있을때와없을때, 프로브의흡수스펙트럼을보여준다. 타겟과의결합전에는프로브에붙어있는형광체가모노머와다이머의두가지상태로존재할수잇다. 그래서흡수피크도각각의구조에대해두개존재한다. 잘알려져있는사실과같이다이폴피크가모노머피크에크게겹쳐서존재하는것을확인할수있다. 그래프에서타겟과의결합에의해형광체의구조가모노머로바뀜에따라흡수피크가장파장쪽으로이동함을확인할수있다. 이결합은또한형광스펙트럼을단파장쪽으로이동시키며좀더좁은폭을갖게만든다 (Fig. 74, 75의 (B)). D514의엑사이테이션스펙트럼은타겟과의결합전에서

85 로다른두구조 ( 모노머, 다이머 ) 를갖고있음을분명하게보여준다. Figure 76의 (C) 는방출파장이증가함에따라다이머구조가나타남을보여준다. 반면 D436의경우방출파장에따른엑사이테이션스펙트럼의변화가보이지않았다 (Fig. 76 (A)). 이것은타겟과의결합전후의발광파장이크게겹치기때문으로보인다. Fig. 74. (A) Absorption spectra of the fluorophore in D436 in water; the probe without targe (black), with targe(red) (B) Fluorescence spectra of the fluorophore in D436 in water; the probe without target (black), with target (red) (C) Absorption spectra of the fluorophore in D436 in water (black), metanol 91% (red) and DMSO 94% (blue) (D) Fluorescence spectra of the fluorophore in D436 in water (black), methanol 91% (red) and DMSO 94% (blue)

86 Fig. 75. (A) Absorption spectra of the fluorophore in D514 in water; the probe without targe (black), with targe(red) (B) Fluorescence spectra of the fluorophore in D514 in water; the probe without target (black), with target (red) (C) Absorption spectra of the fluorophore in D514 in water (black), metanol 91% (red) and DMSO 94% (blue) (D) Fluorescence spectra of the fluorophore in D514 in water (black), methanol 91% (red) and DMSO 94% (blue). Figure 77의 (B) 와 (C) 의엑사이테이션스펙트럼이방출파장의변화에영향을받지않는다는것에서확인할수있듯이 D436과 D514 모두타겟과의결합후에는모노머구조로만존재한다. 0.1 M NaCl 수용액에서의피크모양과양자수율은이전에보고된결과와비슷하다. 타겟과의결합후 D436과 D514의형광세기는자유로운형광체에비해약 4.2배와 24.3배증가했다. 타겟과의결합으로인한양자수율의증가는엑시톤상호작용의감소나메틴브릿지의회전감소로인한것으로알려져있다. 타겟과결합하지않은프로브의발광스펙트럼이결합한프로브에비에더퍼져있다 (Fig. 78, 79 (B)). 이는결합된프로브에비해결합하지않은프로브의경우형광체가더많은구조를갖기때문에나타나는것으로설명할수있다. 타겟과의결합후의양자수율의증가는흡수스펙트럼의장파장쪽으로의이동과발광스펙트럼의단파장쪽으로의이동현상과같이일어난다. 이는 DNA의염기사이로형광체가들어가는것이 DNA간의뭉침현상을막아주기때문이라고할수있다. Figure 77과 78은메탄올과 DMSO 같은유기용매에서 D436과 D514의흡수및

87 발광파장을보여준다. H-aggregation이소수성상호작용에의해주로일어나므로, 유전율이작은유기용매에서는이현상이일어나지않을것이다. 유기용매에서흡수피크의장파장으로의이동과양자수율의감소가발행하였다. 이것은엑시톤상호작용모델이예측하는것과는반대임을알수있다. 형광체의모노머의형태는양자수율의증가를동반하지않는다. 광유도이성화현상은유기용매에서의양자수율감소를설명할수있다. 이현상은용매의분자량변화에의한형광체의회전에의한영향으로설명할수없다. DMSO가세종류의샘플중가장큰점성을갖고있지만, 다이머에비해모노머구조에서메틴브릿지의회전이더잘일어나기때문에양자수율은물에비해 4분의 1 수준이다. 상대적으로작은점성에서의형광체의분리로인한회전감소의저하가양자수율의원인으로생각된다. Figure 77은수크로즈와글루코즈, 글리세린의농도를바꿔가면서측정한점성에대한양자수율의관계를측정한실험결과이다. 이런용질의함량이증가함에따라프로브에붙어있는형광체가모노머를형성하는비율이증가한다. 이는주변환경의유전율감소에의해형광체간의소수성상호작용이방해받기때문이라고추정된다. Figure 77의 (A) 에서점성이높은영역의결과는단순확산모델 (Oster and Nishijima, 1956) 혹은 modified Smoluchowski model (Bagchi et al., 1983) 로설명할수있다. 단순확산모델에서회전에의한비발광불활성화의속도상수는온도변화가없을시, 점성에비례하게된다 (, 는상수 ). Figure 77의 (A) 결과는높은점성영역에서의형광의점성에대한영향의중요성을보여주고있다. 용액의점성이감소함에따라점성의변화가양자수율의변화에미치는영향이줄어든다. 형광체가모노머일때와다이머일때의양자수율에대한점성의영향이다를수있기때문에다이머의증가에의해단순확산모델에의해예상된선형관계와는다른결과가나오게된다. 낮은점성영역에서는모노머에비해다이머구조를갖는프로브의형광체가더강한형광을보이게된다. 하지만일정점성을넘으면다이머에의한방해보다는메틴브릿지의회전을막는효과가더커지게된다. D436의경우서로다른용액이더라도점성이같으면같은양자수율을보이는데, 이는모노머와다이머의비율이각용액에서서로비슷하기때문이다 (Fig. 9). 낮은점성영역에서 D514의경우 D436에비해모노머와다이머의비율이더크게나왔다. 이것은 Figure 78의 (B) 에서볼수있듯이점성의변화에대한양자수율의변화가더서서히일어나는것을설명한다. D514의경우낮은점성영역에서의서로다른용액에대한서로다른양자수율변화율은이러한서로다른모노머와다이머의비율로설명할수있다. Figure 77, 78의 (B) 에서모노머의비율이증가함에도양자수율이증가한다는것은높은점성에서다이머효과보다는용액에의한효과가더크다는사실의증거가된다. 높은점성에서모노머가증가함에따라, D514의양자수율은용질에상관없이같은값으로수렴한다

88 Fig. 76. Excitation spectrum (A) the fluorophore in D436 in water before hybridization; (B) the fluorophore in D436 in water after hybridization; (C) the fluorophore in D514 in water before hybridization; (D) the fluorophore in D514 in water after hybridization Fig. 77. Plot of the reciprocal viscosity of the solutions versus quantum yield of the (A) the fluorophore in D436; (B) the fluorophore in D

89 Fig. 78. Comparison of absorption spectra of the fluorophore in D436 and the fluorophore in D514 in different solute species with the similar viscosity. Absorption is normalized by the maximum at short wavelength 마. 고찰이연구를통해새로이합성된 DNA 프로브의광화학적특징을용매의종류와용매에녹아있는용질의종류에대해확인하고, 그러한특성이나타나게된원인을분석할수있었다. 이를통해이프로브의활용가능성을향상시켜앞으로의실험에사용될때의기초자료및근거로사용할수있는결과를얻었다. 이러한연구는앞으로음파가생체내부에어떠한영향을미치는지분자생물학적인연구를진행할때의실험도구로사용될수있다. 제 13 절혼성결합민감 DNA 프로브의광화학적특성측정실험 Ⅱ 가. 연구요약표적 DNA나 RNA에선택적으로결합하는혼성화민감 (hybridization-sensitive) DNA/RNA 프로브의광화학적특성을형광상관함수분광법 (Fluorescence Correlation Spectroscopy) 을통해분석하였다. 이프로브는타겟과결합하면양자수율이 20배이상커지는데, 이것은프로브의이성질체화반응 (isomerization) 이타겟염기에의해방해받기때문인것으로알려져있다. 상관함수데이터의마이크로초시간영역에서과도적암상태 (transient dark state) 가측정됨을확인할수있었다. KI, 점성, 산소 scavenger에의해변화되는양상을통해해당암상태가전자의삼중항상태 (triplet state) 에의해만들어진다고추측해볼수있었다. 또한암상태의비중이타겟의농도에의해매우민감하게변화한다는특성으로부터, FCS를통한타겟 DNA/RNA localization이라는새로운연구분야를기대할수있게되었다. 이러한 DNA 프로브의광화학적연구를통해음파가세포내의물질들에미치는영향을확인하는실험에필요한기술을개발할수있었다. 나. 연구목적

90 최근일본오카모토박사그룹에의해표적 DNA나 RNA에선택적으로결합하는프로브가개발되었다 (Ikeda and Okamoto, 2008). 이프로브는엑시톤상호작용 (excitoni c coupling) 에의해그발광특성이결정되기때문에, ECHO (Excitonic Hybridization - senstive Oligonucleotide) 프로브로명명되었다. 이프로브의발광은주로형광체의 methine bridge의회전에의해결정된다는사실이알려져있다. 일반적인화학적환경에서형광체의삼중항상태는측정하기가어려운데, 이것은일반적인시아닌형광체의경우에, 삼중항상태로전이할확률자체가일반적으로매우작기때문인것으로알려져있다, 해당프로브의경우에타겟분자가존재하지않는순수물에서양자수율이시아졸오렌지단독으로존재할때에비해매우크다. 이것은올리고머에결합된두시아졸오렌지간의어떤상호작용에의해이성질체화반응이억제되기때문인것으로추측된다. 이와같이이성질체화반응이억제되면여기상태의전자는상대적으로삼중항상태로전이할확률이높아지는데, 이를형광상관함수분광법을통해확인할수도있을것이다. 이와같이형광상관함수의특성을밝히게되면, 해당프로브의광화학적발광원리에대한이해의폭을넓힐수있을뿐아니라, 이런특성을이용해세포내미세환경이나타겟분자의존재를측정하는데에도활용할수있을것으로기대한다. 다. 재료및방법측정시샘플의농도는 FCS 측정시 5 nm, steady state 스펙트럼측정시에는 0.5 μ M로고정되었다. FCS 측정시에는데이터의 S/N를높이기위해, 용매의점성을글리세린을통해 2.5 cp로증가시켜실험을진행하였다. 형광상관함수분광법 (FCS). 샘플이내는형광의상관함수는 LSM710 공초점현미경에장착된 Confocor 3 장비로수행하였다. 514nm의여기파장을가진 Ar 레이저를 C-Achromat 수침대물렌즈로집광시켜형광체의전자를여기시켰다. 레이저의투과율은 80% 로고정하였고, 이때레이저의파워는 190μW (154kW/cm 2 ) 였다. 여기레이저는 50/50 광선분산기를통해두갈래로나뉘어진후두 APD 측정기로동시에측정되었다. 핀홀의반지름은 1AU (Airy Unit, 36μm) 로고정되었고, 투과필터의파장영역은 530~610nm로하였다. Steady state 분광법. 샘플의양자수율을구하기위해서 Infinit M200 마이크로플레이트장비를사용하였다. 내장온도조절기를통해샘플의온도를 20 로고정하였고, 표준형광체로는 Coumarine343을이용하였다. 라. 결과및고찰 Figure 79 (A) 에서도식적으로나타낸바와같이, 프로브에는두형광체 (thiazole orange) 가올리고머가운데부분에화학적으로결합되어있다. 이두형광체는프로브와타겟간의결합반응전에는약한빛을발하다가, 타겟과의결합반응후에강한세기의형광빛을발하게된다. Figure 94 (C) 는해당프로브의구조를간략하게표현

91 한것이다. Figure 79 (E) 는두형광체의화학구조를보여주고있다. Figure 79 (B) 는일반적으로받아들여지고있는시아닌형광체의에너지구조에대한도식적인표현이다. 전자가빛을받아바닥상태 (S 0 ) 에서첫번째여기상태 (S 1 ) 으로전자구조의변화를겪게되면, 전자는형광발광, internal conversion, 이성질체화반응, intersystem crossing 등의경로를거쳐비활성화된다. 특히상당히많은시아닌형광체의경우에, 이성질체화반응이형광세기를결정하는주요경로임이잘알려져있다. 특히시아졸오렌지와같은짧은메틴브릿지를가진시아닌의경우에이성질체화반응의영향이더크다고알려져있는데, 이는열적으로안정된보통상태에서이성질체상태로전이하는과정에존재하는활성화에너지가메틴브릿지의길이가짧을수록작아진다는연구결과로부터이해할수있는점이다. 이성질체화반응이나형광발광현상이 intersystem crossing에비해훨씬빠른광물리학적과정이라고가정하고, 적절한 effective intersystem crossing rate (k ISC = k ISC *S 1 /(S 0 +S 1 +P)) 를도입하면, Figure 79 (B) 는 Figure 79 (D) 와같은에너지구조로단순화시킬수있다. 이와같이단순화된에너지상태 (two state energy model) 은논의를간결하게도와주며, 실제로실험결과를비교적잘설명해준다는것이본연구에서밝혀졌다. Fig. 79. (A) Schematic representation of a dye conformation of the probe, D 514, before and after hybridization with target. (B) S 0,S 1,andT 1 denote the ground singlet, first excited singlet, and triplet states, respectively, of the thermodynamically stable conformation of the dye. P 0 and P 1 are the ground singlet and first excited singlet states of photoisomer

92 (C) Schematic representation of base sequence and the dimeric fluorophore, D 514,of the probe. (D) Two energy states model. (E) Chemical structure of D 514 Fig. 80. Fraction of triplet state versus the laser excitation intensity. The average laser power at the sample was adjusted to 80% laser transmission. The laser power with 80% transmission was 190µW (154kW/cm 2 ) at the out put of an objective lens. FCS를통해, 형광상관함수의수마이크로초영역에존재하는감쇄곡선은전자의삼중항상태에의한과도적암상태인것으로생각되는데, 본연구에서그이유를실험적으로규명하였다. Figure 80은레이저의입사파워에따른 FCS 측정을통해얻은삼중항상태의 k ISC 와 k T 값의피팅결과이다. 레이저파워가증가할수록여기되는전자의개수가늘기때문에 effective intersystem crossing 반응상수가자연스럽게증가하게된다. 반면, 삼중항상태의비활성화율은큰변화없이상대적으로적은증가만을갖기때문에전체적으로암상태의함량은증가하고 relaxation time은감소하게된다

93 Fig. 81. FCS curves of the sample with the addition of potassium iodide versus lag time. Transit time (t D ) of each samples are 145±6, 146±7, and 152±8 μs for 0.5, 1.5, and 15mM KI concentration, respectively. 위결과는과도적암상태가아이오딘화칼륨의첨가에따라감소하는모습을보여주고있다. 이는해당암상태가삼중항상태에서기인한다고가정하면잘설명이된다. 요오드화이온은약한전자주개 (donor) 로알려져있고, 전자전이반응을통해삼중항상태가 quenching될수있다는것은잘알려진사실이다. 물론칼륨이온의 heavy ion effect에의해 intersystem crossing이증가될것이지만, 실험결과는요오드화이온의전자전이에의한 quenching효과가더많은것을보여주는것으로생각할수있다. 같은일가이온인염화나트륨의첨가에의해서해당암상태가영향을받지않는다는것으로부터, 형광체에대한반대이온에의한정전기적영향등은무시할수있을것으로생각된다. Figure 82는점성에따른암상태의변화를보여주고있는데, 점성이증가함에따라암상태의비율이점차적으로증가하고, relaxation time도점차커짐을알수있다. 형광체의양자수율은점성에따라증가한다 (Table 10). 정확하게알수는없지만, 전자의삼중항상태는용매에녹은산소분자에의해 qeunching될수있다는사실로부터, 해당암상태가삼중항에의한것이라고가정하면, 실험결과를잘설명할수있다. 산소분자의바닥상태는삼중항상태인데, 삼중항상태두개가결합해서순간적인복합체가형성되면, 전자스핀사이의상대적인배치로인해전체스핀이단일항상태로존재할수있고, 이를통해스핀보존의법칙을위배하지않고형광체의삼중항상태가바닥상태로비활성화될수있다. 이때복합체를형성하기위해서형광체와산소분자가물리적충돌을해야하고, 이로인해, 해당비활성화는점성증가에따라감소하게될것임은자명하다실제산소분자가형광체의삼중항상태의 quenching에영향을주는지확인하는보강실험을산소제거제를이용해수행하였다. Figure 82는산소분자를제거하는것으로알려진아황산나트륨의농도에따른해당암상태의변화를보여주고있다. 변화의폭이크지는않지만, 아황산나트륨농도의증가에따라해당암상태의함량과 relaxation time이동시에커지는것은해당암상태가산소분자에의해 quenching될수있다는것을뒷받침해준다

94 Fig. 82. FCS curve of the sample with the addition of the sodium sulfite, oxygen scavenger versus lag time. Transit time (t D ) of each samples are 153±4, 160±8, and 165±10 μs for 0, 1, and 2.5 mm sodium sulfite, respectively Figure 83은프로브와상보결합하는표적 DNA의농도에따른실험결과이다. 해당암상태는표적 DNA의농도가증가함에따라급격히증가하는데, 이역시해당암상태가삼중항상태에서비롯되었다고가정하면쉽게설명될수있다. Table 10에서보다시피, 타겟과결합하면프로브의양자수율이증가하게되는데, 이는여기전자의이성질체화반응이상당부분억제되었다는의미이다. 이때이성질체상태로전이하지못한전자는상대적으로삼중항상태로전이할확률이커지게되고이로인한암상태의함량은증가하고암상태의 relaxation time이감소를하게된다. 이와같이해당암상태의민감한변화는 RNA/DNA localization실험에 FCS의암상태를이용할수있음을보여준다. 일반적으로 mirna와같이짧은타겟과프로브가결합하게되면그확산시간의변화는상당히작아서 FCS로정확히측정하기가매우어려운데, Figure 79에서와같이암상태가작은타겟농도에의해서도민감하게변화한다면, 짧은길이를가지고적은양으로존재하는타겟 DNA/RNA의 localization에 FC S를이용할수있을것으로보인다. 이성질체화반응의경우, 점성의변화나타겟의존재에의해이성질체화반응과반대이성질체화반응이동시에같은영향을받는다. 즉프로브의형광체가타겟과결합하여이성질체화반응이방해를받으면, 반대이성질체화반응도동시에방해를받게된다. 이로인해이성질체상태의비율은타겟의존재에의해민감하게변화하기어려울것으로예상된다. 하지만삼중항상태는타겟과의결합이후 effective intersystem cros sing만증가하게되며, 기본적으로삼중항상태의비활성화가크게영향을받진않을것으로예상할수있기때문에, 해당비율의큰변화를기대할수있다. 이것은삼중항상태의전자를이용한세포미세환경분석및 DNA/RNA localization에중요한의미를가질것으로기대된다

95 Fig. 83. FCS curve of the sample with the addition of the target DNA versus lag time. Table 10. Fluorescence quantum yield of the probe in glycerin-water mixtures 제 14 절병 해충방제를위한음파발생장치및분석을위한모듈제 작및장치개발 본개발은공동연구 ( 국립농업과학원, 이화여자대학교, 국립안동대학교, 한국과학기술원 ) 를함에있어반드시필요한외부의소음을차단하여저음속에서병, 해충이음파의반응에따라변화하는상태를연구개발할수있도록주파수에따라작물별, 생육단계별음파개발과이에맞는농업해충과식물병원균의제어를위한장치제작개발함으로써작물에적용되는다양한환경에견딜수있는시스템을개발하였다. 그리하여작물에발생하는여러해충과식물병원균을억제하여고품질작물의생산증대의효과를기대할수있을뿐아니라, 음파발생장치모듈제작및장치를개발함으로써친환경적인병 해충발생을억제시킬수있는기술을개발하였다. 가 ) 병 해충방제를위한음파무향실설계 음파무향실은외부의소음에영향을받지말아야되고내부자체내에서의음파

96 발생시반사파의영향을받지않아야함 특정단일파장이발생되고있을때반사파의영향을받을경우각각다른여러개의파장이발생되므로정확한실험을할수없음 반사파의억제는필수적인웻지높이에의해관련되므로기본적인환경이갖추어진음파무향실을설계 규격 - 방음판넬 : 스틸구조 100T 방음판넬 22장 - 방음도어 : 개구부 중도어 - CABLE SLEEV: 50ø, 2개소 - 내부조명시설 : 30W 1개소 - 내부전원 : 220V 접지콘센트 1개소 - 흡음웻지 : L, 난연 PU FOAM - 제진베이스 : Rubber Mount 내부상승바닥 : 스틸그라우팅구조 - 하한주파수 (CUT OFF FREQUENCY): 250Hz - 암소음도 ( 무향실내 ): 하한주파수 250Hz이상의주파수대역에서암소음 20dB(A)±1(A) 이하 병 해충방제를위한음파무향실설계도 (Fig. 84, 85) Fig. 84. Anechoic room blueprint

97 Fig. 85. Anechoic room blueprint (section) - 모든소음발생이병 해충에미치는반응및결과를측정하기위해병 해충전용무향실을 (25dB이하) 갖추고주파수, 음압크기등을변경, 다양한특성분석을할수있도록되어있음 - 조립공법설계에의한제품으로설치할위치에서바로조립이가능하며이전설치시해체및재조립이용이함.( 접착제를사용않는웻지부착공법 ) - 벽체는100mm/THK의방음판넬이 100mm의공기층을두고이중으로설치되며천정은 100mm/THK의방음판넬이 100mm의공기층을두고이중으로설치되는다블월구조로서 500HZ에서 -60dB(A) 이상의매우높은차음성능을가짐 - 판넬이분체도장처리되어장기간부식이나변형이없음 - 방진 Rubber Mount를이용한제진베이스를기초로하여조립되므로구조체진동등으로인한 2차소음유입을효과적으로차단하여줌 - 마그네틱패킹을장착한스틸방음도어가이중으로설치되어방음성능이우수하며도어의개폐가매우용이하고단방향개폐방식으로공간효율이높음 나 ) 병 해충방제를위한음파발생장치장치 DATA 측정 Main 검사장치시스템구성도 - 해충의음파에대한반응신호를실시간으로파악하고데이터를수집하는구성 - Test 시료는시설재배작물을설치하고작물의해충을접종하여카메라를통해관찰함 - 음파발생제어부 ( 컴퓨터, 증폭기 ) 와음파발생기 ( 스피커 ) 로구성 (Fig. 82) - 증폭기사양 출력 50W 2(8Ω, THD0.1%) 주파수응답 ±3dB 20Hz ~ 45kHz

98 입력감도 1kHz 200mV ±5mV T.H.D 1kHz 0.1% S/N 88dB 톤조절 베이스 100Hz ±10dB / 트레블 10kHz ±10dB 전원 AC 220V 60Hz ±10% 음파발생시스템 size mm Fig. 86. Sound waves system diagram 음향발생스피커의음파값 - 증폭기를통한스피커의음역대범위는그래프와같이 20Hz~20kHz로설정할수있는스피커를제작하여실험을수행 - 음량발생의음량은 60~100dB로설정 - USB Devices의구성 Fig. 87. Usb device is composed of usb carrier and channel module. This module is connected to a camera and extremly sensitive microphone, collect behavior and

99 sound of insects. 음파무향실소음측정치결과 현장명 ( 설치장소 ) 국립농업 과학원 무향실내부암소음 Test 1 Test 2 Test 3 외부소음 20.3 db(a) 20.5 db(a) 19.8 db(a) 60~63dB(A) < 무향실기본제원 > - 구조 : 조립식반무향실 - 외부크기 : 2280 x 2280 X 2310(H) - 내부크기 : 1000 X 1000 X 1000(H) - 방음구조 : DOUBLE Wall Acoustic Panels 단위 : db 주파수 (Hz) 평균치 k 2k 4k 8k 16k 소음도 db(a) Test Test Test 측정장비 : 1/1옥타브밴드실시간주파수분석소음측정기 ( SC-30 / SPAIN ) 측정일자 : JULY. 1. 측정자 : 김인덕 ( 그린테코 ) 다 ) 음파의크기와방향에따른음파의확산범위설정 ( 안동대시스템설치 ) 1 안동대연구실내시스템설치협동과제팀인안동대의 스트레스성음파가곤충생리에미치는영향분석및방제응용 에적용가능한병 해충방제를위한초음파무향실설계 (Fig. 84) 및음파발생시스템을개발제작또한하우스내에초음파시스템을설치하여기초실험에활용 초음파발생컨트롤장치설정은 scan rate는 20,25,30,35,45KHz로 sample 5sets를설정하여, 초음파발생컨트롤 wave를발생하여초음파발생장치를통해초음파스피커를구동하고이에반응하는곤충의움직임을관찰해움직임이포착될때초음파발생부에서발생되는 wave를감지하여데이터를저장구축 초음파증폭기를통해구동되는음파의음역대는 20KHz-45KHz로설정하여실험을실행 출력단인 ultra Speaker unit를고역 (20KHz-45KHz미만) 에작동되도록설계제작 초음파무향실웻지크기와하한주파수설정실험단일초음파발생시반사파가

100 발생되므로반사파가발생되지않도록설계제작 주파수비교실험설계도간이형, 6개제작 (Fig. 89) - 소형 Speaker unit를방음장치를갖추어 6개를제작하여동시에 6조건을실험할수있게설계 - 방음판넬 : 목재 - 내부출력 : 20W*6개 - 흡음웻지 : 달갈형 - 내부상승바닥 : 스틸그라우팅구조 - 규격 크기 : 외부 (W D H)600 mm 600 mm 800 mm내부 (W D H)490 mm 490 mm 690 mm 마감상태 : 외부-분체도장처리된스틸방음판넬내부-흠음웻지 45mm/L 내부흡음률 : 중심주파수 20,000Hz 이상에서흡음률 0.99이상 Fig. 88. Sounder control blueprint. 하한주파수와웻지길이와의관계

101 웻지크기 (cm) 주파수 (hz) ,000 웻지길이 L=λ/4, λ=340m/f, 음속 :340m, f: 주파수 하한주파수 :20,000Hz, 웻지길이 :4.5cm ( 웻지사진 ) ( 완성된사진 ) Fig. 89. Wedghes and finished products. 초음파소형무향실소음측정치 현장명 ( 설치장소 ) 안동대학교 무향실내부암소음 ( 평균치 db) Sample1 Sample2 Sample3 Sample4 Sample5 외부소음 35dB 86dB 35dB 36dB 38dB 60~63dB(A) 측정주파수 : 50Hz-45Khz 초음파측정장비명 : PAC( Portable Analyzer Chassis) 회사명 : LINEARX 모델명 : LINEARX. M51 측정일자 : Aug 20 측정자 : 김인덕 ( 그린테코 ) - 모든소음발생이병 해충에미치는반응및결과를측정하기위하여병 해충전용 무향실을 (40dB이하) 갖추고주파수, 음압크기등을변경하여다양한특성분석을할수 있도록되어있음 2 안동대시설하우스내시스템설치 시설재배작물의병 해충의제어를위한초기스크리닝을위해간이로설치한시 스템이초음파를발생시키는부분과증폭부분으로구성되어져있음 (Fig. 90)

102 초음파발생부와측정하고자하는물체 ( 곤충 ) 의거리를 1-10m 에서음압 100dB 까 지가변할수있는초음파발생시스템구축 ( 시설하우스출력부설치 ) ( 초음파발생시스템 ) Fig. 90. Installation of power output section and ultrasonic system 현장명 ( 설치장소 ) 안동대학교 출력부로부 터 1m 지점 ( 시설하우내내의출력 db) 출력부로부 출력부로부 출력부로부 터 2m지점 터 3m지점 터 4m지점 출력부로부 터 5m 지점 외부소음 95dB 94dB 93dB 89dB 88dB 60~63dB(A) 측정주파수 : 35Khz 초음파측정장비명 : PAC( Portable Analyzer Chassis) 회사명 : LINEARX 모델명 : LINEARX. M51 측정일자 : JUN 20 측정자 : 정로덕 ( 그린테코 ) 초음파측정치 라 ) 음파의크기와방향에따른음파의확산범위설정 ( 이화대시스템설치 ) 협동과제팀인이화여대의 음파가짓딧물의생리및행동에미치는영향분석및방제응용 에실험할수있도록음파발생장치를설계제작하여제공하였다 (Fig. 91). 시설재배작물의병 해충의제어를위한초기스크리닝을위해간이로설치한시스템이초음파를발생시키는부분과증폭부분으로구성되어져있고저주파가가능하도록설계제작하여스피커를연결구축 초음파발생부와측정하고자하는물체 ( 곤충 ) 의거리를 1-10 m에서음압 100 db까지가변할수있는초음파발생시스템구축 저주파와오디오의설계로특정단파를발생시켜물체 ( 곤충 ) 의거리를 1-10 m에서음압 100dB까지가변할수있는음파발생시스템구축제공하고곤충의움직임을관찰

103 ( 해충시험포트 ) ( 농업해충및식물병원균방제를위한음파발생장치 ) Fig. 91. Test pot and echo sounders for pest control Table 11. Base frequencies system standard 내용 규격 POWER PEAK 800W RMS 400W CONE MATERIAL ELECTROPLATE INJECTION VOICE COIL SIZE 2-1/2 EFFICIENCY 1 WATT/1 METER 94dB FREQUENCY RESPONSE 25Hz-4000KHz IMPEDANCE 4 Ohm MOUNTING DEPTH 6-1/8 마 ) 음파의크기와방향에따른음파의확산범위설정 ( 농업과학기술원설치 ) 협동과제팀인농과원의 음파를이용한시설재배주요해충의발생밀도억제기술개발 에적용가능한병 해충방제를위한초음파발생시스템을설계및제작하였다. 또한하우스내에초음파시스템을설치하여기초실험에활용하였다.(Fig. 92) 시설재배작물의병 해충의제어를위한초기스크리닝을위해간이로설치한시스템이초음파를발생시키는부분과증폭부분으로구성되어져있고저주파가가능하도록설계제작하여스피커를연결구축 (Fig. 92) 초음파발생부와측정하고자하는물체 ( 곤충 ) 의거리를 1-10m에서음압 100dB 까지가변할수있는초음파발생시스템구축 저주파와오디오의설계로특정단파를발생시켜물체 ( 곤충 ) 의거리를 1-10 m 에서음압 100dB까지가변할수있는음파발생시스템구축제공하고곤충의움직임을관찰 초음파와저음파등주기적시간을가지고변화할수있는시스템구축 음파및초음파경량화와내구성을위한 power부, 음파및초음파발생부, 증폭부, 컨트롤부, 컨트롤확인가능부, 출력부등소형화일체화하여시스템구축

104 ( 농과원시설하우스내설치 ) ( 농업해충및식물병원균 방제를위한음파발생장치 ) Fig. 92. Installation of echo sounder in house for the greenhouse. Table 12. Echo sounder system standard for pest control 내용 규격 PEAK POWER HANDLING 300W MAGNET STRUCTURE 75 OZ EFFICIENCY 1W/1M 92DB IMPEDANCE 4 OHM FREQUENCY RESPONSE 20HZ-22KHZ MOUNTING DEPTH 3-1/4" 2-1/2"(64mm) MYLAR CONE MIDRANGE 바 ) 병 해충방제를위한혼합음파모듈개발및최적음역대개발소정의방향을향해음파를초음파에실어음악을재생하는지향성스피커가식물을향해음악을발생시켜서상기식물의생육을촉진시키고병충해를방지하였다. 음파는 1Hz 내지 3KHz의주파수범위를가지며, 초음파는 20KHz 내지 45KHz의주파수범위를가지고발생하는초음파는 65 내지 100dB의음압이다. 지향성스피커는시설하우스안에설치되고지향성스피커를통해출력된초음파는진행중공기인매질의비선형성에의해가청대역의음성신호로재생하였다. 소정의방향을향해음파를초음파에실어음악을재생하는지향성스피커 ; 및상기음파를실은초음파에상응하는신호를발생시켜서상기지향성스피커에전송하는웨이브발생장치를포함하여상기식물의생육을촉진시키고병충해를방지하는식물재배장치이다. 소정의방향을향해음파를초음파에실어음악을재생하는지향성스피커가식물을향해음악을발생시켜서상기식물의생육을촉진시키고병충해를방지하였고음파는 1Hz 내지 3KHz의주파수범위를가지며초음파는 20KHz 내지 45KHz의주파수범위와 65 내지 80dB 발생

105 지향성스피커는시설하우스안에설치되며지향성스피커를통해출력된초음파는진행중공기인매질의비선형성에의해가청대역의음성신호로재생 Fig. 93을참조하면, 웨이브발생장치 (110) 는음파를실은초음파를발생하고, 초음파에실린음파는스피커 (a) 를통해식물에게전달됨여기서, 음파는그주파수가 1Hz- 3KHz이며, 초음파의주파수는 20KHz-45KH 또한, 음파가실린초음파의음압 (db) 은넓은작물재배면적과좁고긴시설하우스에적합하도록그크기가 65-80(dB) 됨스피커 (a) 에서발생하는초음파및음파의음압은 80(dB) 이고, 거리 L, 약 35m 지점 (c) 에서는음압이 65(dB) 로작아진다. 최대도달거리 (b) 에서는그크기가미약하게측정되었다. 음파를초음파에실어전달하면, 방향성이있는음파를생성함 여기서, 초음파의지향성을이용한스피커는, 음파를초음파로진폭변조하는방법을사용할수있다. 이러한스피커의출력신호는매질의비선형성에의하여전달과정에서사람이들을수있는가청대역의음파로재생하였다. 따라서이러한초음파음원은음파를멀리보냄 또한점선으로그려진부분 ( 상, 하 (W) 10m / 좌, 우 (L) 40m 정도 ) 이음파및초음파음압영역이며가장자리에서약 65(dB) 의음압을측정하여음파와초음파의주파수및음압의조절을통해식물을효과적으로재배하는환경을조성 Fig. 94는식물재배장치가시설하우스내에설치된도면시설하우스 (e) 는현재보급권장되고있는 1-2W형 (600평) 시설하우스시설하우스 (e) 내에스피커 (a) 에서발생하는음파를실은초음파의범위 (b, c) 는도면과같이음압 (65-80dB) 에상응하여발생 따라서좁고긴시설하우스 (e) 의고른음압분포를위해웨이브발생장치 (210) 와연결된소정의개수, 예를들면, 8개의스피커 (a) 를배치해서넓은시설하우스 (e) 내에서작물에게적정음압 (db) 을들려줌 초음파의음압은시설하우스 (e) 의구조에상응하여되고음파가미치는범위는초음파가도달하는거리의약 1/2로정해질수있으며, 이를고려하여초음파는시설하우스 (e) 의길이보다더멀리도달하도록그음압이정해짐 음파는스피커앞에서 1 내지 2m 거리에서가장크게들릴수있으므로, 8개의스피커 (2, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18) 를 2 내지 4m 간격으로이격되어배치됨 8개의스피커 (2, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18) 가웨이브발생장치 (210) 에연결된구조는 Fig. 3-3과같이, 시설하우스 (1) 의내부에도 1에서상술한음파를실은초음파의영역 (5, 7, 8, 9) 을가진 8개의스피커 (2, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18) 가설치되었다. 음압의경우서로바라보는스피커는서로 40m 내지 60m 이격되어설치됨 이경우스피커 (2, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18) 에서출력되는음파의도달범위가시설하우스 (1) 내에존재하도록그배치를조절되었다. 즉, 스피커 (2, 12, 13, 14, 15, 1 6, 17, 18) 에서발생한음파가소정의음압이하로작아지는거리까지의범위가시설하우스 (1) 내에존재하면, 외부에소음이발생하지않음

106 또한, 1-2W형보다면적이넓은시설하우스의경우스피커를음파및초음파라인이형성하는면적에맞게설치하였다. 스피커 (12) 와스피커 (13) 는서로반대방향으로 4~5m 간격을두고배치함. 웨이브발생장치 (210) 는음파를실은초음파에상응하는신호를발생시켜서상기지향성스피커에전송함 음파는단일음파또는복합음파된다. 음파는, 1Hz 내지 3KHz의주파수범위중에서선택된주파수를가지며, 65 내지 80dB의음압을가지는제2 음파와, 20kHz 내지 45KHz의주파수범위중에서선택된주파수를가지며, 제1 음파의주파수와다르며, 65 내지 80dB의음압을가지는제2 음파를포함 Fig. 93. Blueprint of plants cultivation device to include ultrasonic sounder Fig. 94. Blueprint of plants cultivation device to include ultrasonic sounder (greenhouse)

107 Fig. 95. Blueprint of a great plants cultivation device to include ultrasonic sounder 사 ) 음파발생장치의실용화를위한음파발생경량화및내구성모듈개발 협동과제 ( 안동대, 이화여대, 농과원 ) 측에무향시스템및음파발생시스템을개발제작 적용함으로서실용화를위한음파발생경량화및내구성모듈개발할수있었다. 초음파발생장치사양. 출력 20W 5( THD0.1%) 주파수응답 ±3dB 20,25,30,35,45kHz 입력감도 1kHz 200mV ±5mV 전원 AC 220V 60Hz ±10% 크기 초음파발생장치 size : (W D H)490 mm 490 mm 690 mm 초음파및최적 (1-3Khz, 20Khz-45Khz) 음역대설계제작

108 Fig. 96. Sound wave circuit blueprint 주파수발생을 sine wave로발생하여 IC에의해서 CR 회로망를조합하여위그림 1과같이설계되어변형률 0.1이하의안정한 Sine wave가얻을수있다. C와 R을변형시켜음파발생을 0.01Hz에서 50Khz까지주파수를얻을수있다. 또한음압은최대100 db까지조절할수있게설계하였다 (Table 13). Table 13. Sound wave circuit standard 내 용 규 격 Rated Noise Power 5.5Vp-p Rated Long Max. Power 30Vp-p Rated Frequency Range KHz Operating Frequency 20±5KHz Rated Sensitivity 100dB Fig. 97. Frequency feature

109 출력발생주파수특성은 Fig. 97과같은 Data를얻을수있다. 측정장비회사명 : LINEARX PAC( Portable Analyzer Chassis) 모델명 : LINEARX. M51 제품을간소화하여음파발생및초음파발생부와음압의크기조절부및확인부동작시간변경가능한제어부각종회로보호부전체회로조정가능한컨트롤부등설계제작 아 ) 음파발생장치를이용한농업해충유인성포획장치개발해충이유인되는음파의음역대를파악하여특정주파수설정또는음악을들려줌으로써유인된해충을포집하여방제하는 해충유인성포획장치 를개발하였다. 가 ) 설계도 (Fig. 98) 시험명 : 호박꽃과실파리담배가루이유인율측정. 케이지 SIZE : 1) 1000m/m(W) x 1000m/m(D) x 500m/m(H) - 4EA 2) 970m/m(W) x 110m/m(D) x 500m/m(H) - 4EA 시험목적및방법 : 케이지내부로해충물을투입한후특정음파를넣어서각음파별로유인성분포도를측정함 (Fig. 99.) Fig. 98. Attracting trap blueprint

110 Fig. 99. Attracting trap 제 15 절음파발생장치시제품및자동화시스템 가 ) 전체흐름설계도 Fig Development flowchart for practicalization

111 Fig A large output department 위흐름도 (Fig. 100) 는실용화를위해도면을정리하였다. 음파발생부는적정음파및 초음파를발생하는회로이고 LED Control 부는전체동작을제어화하고확인조정할 수있도록설계되어있다. 나 ) 음파발생장치시제품및자동화시스템방법특정주파수의초음파를발생시키는초음파발생장치가식물의재배지에상기초음파를발생시켜서초음파의주파수는 20 khz 또는 45 khz가되고초음파의세기는 60 내지 80dB이고시설하우스안에설치하였다. 초음파발생장치는복수이며, 서로바라보는초음파발생장치는 40m 내지 60m 이격이다. 초음파를발생시키는초음파발생장치가식물의재배지에초음파를발생시켜서주파수는 20 khz 또는 45 khz인것을발생 초음파의세기는 60 내지 80dB인것을시설하우스안에설치하고초음파발생장치는복수이며, 서로바라보는초음파발생장치는 40m 내지 60m 이격 Fig. 6-3 및 Fig. 6-4를참조하면, 하우스조건의야외배추밭에 30 khz, 3.28v 그리고 80 db 조건의초음파를처리하였다. 초음파발생장치는복수이며, 서로바라보는초음파발생장치는 40m 내지 60m 이격되어설치하였다. 처리시간은오후 6 시이후부터다음날아침 8 시까지처리하였다. 시험에사용된배추는삼보얼갈이이며, 2월중순경발아하여, 3 월 10 일경정식하였으며, 3 월 27 일경파밤나방을처리하였다. 파밤나방은포기당 8 마리가발생했으며, 6 포기를한반복으로함 Fig. 100을참조하면, 초음파발생장치 (600) 의구성도이다. 초음파발생장치 (60 0) 는초음파발생부 (610), 전원공급부 (620), 장치지지부 (630), 타이머 (640), 작동제어부 (650), 제어유닛 (660) 으로구성 초음파발생부 (610) 는다양한원리로초음파를발생시키지만초음파발생부 (610) 는고주파교류전류를역압전효과에의하여기계적인진동으로전환하여초음파를발생

112 시킨다. 전원공급부 (620) 는초음파발생장치 (600) 에필요한전원을공급하며, 전류의형태는교류또는직류가됨 장치지지부 (630) 는초음파발생장치 (600) 를시설하우스의내부에결합하기위한구성요소가된다. 장치지지부 (630) 는볼트와너트의결합구조를포함되며, 초음파발생장치 (600) 를비닐하우스의프레임에상기볼트와너트의결합구조에의하여결합 타이머 (640) 는초음파발생동작의시간을재기위해포함하였고, 작동제어부 (65 0) 는타이머 (640) 의시간값을이용하여초음파발생부 (610) 의동작시간을제어함 제어유닛 (660) 은초음파발생부 (610), 전원공급부 (620), 장치지지부 (630), 타이머 (640), 작동제어부 (650) 가서로연동하면서자신의고유한기능을수행하도록각기능부를제어함 또한, Fig. 102를참조하면, 야외포장에발생한파밤나방 (95% 이상종령충과나머지는 4령말유충 ) 을대상으로하여 Bt (200 ppm) 를처리 5 일후약 25% 의살충력을나타내었다. 반면초음파를처리한경우약 35% 의살충력을나타내었으며, Bt와초음파를함께처리하였을경우약 60% 의높은살충률을나타내는것을확인함 또한, Fig. 103를참조하면, 배추좀나방의경우도대부분종령에대한방제효과를분석한결과이다. Bt (200 ppm) 를단독으로처리한경우처리 5 일후약 34% 의살충력을나타낸반면초음파를처리한경우약 37% 의살충력을나타내었으며, Bt와초음파를함께처리하였을경우약 80% 의높은방제효율을나타내는것으로나타남 부호의설명 600 : 초음파발생장치 610 : 초음파발생부 620 : 전원공급부 630 : 장치지지부 640 : 타이머 650 : 작동제어부 660 : 제어유닛 Fig Block diagram of ultrasonic device

113 다 ) 음파발생장치시제품및자동화시스템제작사진병 해충방제를위한음파발생장치 음파의부품소재개발및확산범위설정 모듈개발및최적음역대개발 경량화및내구성모듈개발 농업해충유인성포획장치개발 농업해충및식물병원균방제를위한음파발생장치시제품및자동화시스템을개발농가에적용시켰다 ( 그림6-3). ( 최적음파및초음파발생부 ) ( 음파및초음파증폭부 ) ( 음파및초음파컨트롤부 ) ( 음파및초음파컨트롤확인부 ) ( 음파발생장치시제품내부 ) ( 음파발생장치및출력장치시제품 ) Fig Echo sounder development prototype