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1 보안과제 ( ), 일반과제 ( ) / 공개 ( ), 비공개 ( ) R&D / 2013M2A2A 최종보고서 주관연구기관 / 한국원자력의학원 1

2 미래창조과학부귀하 본보고서를 방사선에의한혈관 - 간엽세포전이조절을통한방사선치료효율증진 기술개발 ( 개발기간 : ) 과제의최종보고서로 10 부를제 출합니다 주관연구기관명 : 한국원자력의학원 ( 대표자 ) 최창운 ( 인 ) 주관연구책임자 : 이윤진 미래창조과학부훈령제 35 조에따라보고서열람에동의합니다.

3 보고서요약서 과제고유번호 2013M2A2A 해당단계연구기간 3 년단계구분 (1단계)/ ( 총 1단계 ) 중사업명 방사선기술개발사업 연구사업명 세부사업명 방사선의학기술개발 대과제명 연구과제명 세부과제명 방사선에의한혈관-간엽세포전이조절을통한방사선치료효율증진기술개발 해당단계참여연구원수 총 : 14 명내부 : 3 명외부 : 11 명 해당단계연구개발비 정부 : 431,000 천원민간 : 천원계 : 431,000 천원 연구책임자 총연구기간참여연구원수 총 : 14 명내부 : 3 명외부 : 11 명 총연구개발비 정부 : 431,000 천원민간 : 천원계 : 431,000 천원 연구기관명및소속부서명 한국원자력의학원 참여기업명 국제공동연구 상대국명 : 상대국연구기관명 : 위탁연구 연구기관명 : 한국파스퇴르연구소 연구책임자 : 서행란 요약보고서면수방사선에의한폐암 ( 비소세포폐암 ) 치료에있어서, 폐혈관내피세포의간엽세포로의변이 (Endothelial to mesenchymal tarnsition: EndMT) 현상 88페이지규명과혈관내피세포특이적유전자변형마우스를이용하여 EndMT 조절에의한방사선종양저항성조절능을규명하였음. 또한방사선에의한종양혈관의 EndMT 조절에의한종양미세환경의변화를규명하였음. High contents screening시스템을통해, 신약재창출을기반으로방사선유도 EndMT 조절인자를타겟으로하는후보약물을 Phenomic 스크리닝시스템을이용하여효율적으로도출하였음. 이러한연구는방사선치료효율증진기술개발의새로운 Strategy를제공, 도출된약물을중심으로한방사선치료기술개발의전임상후보물질도출을위한실용화연구기반을구축하였음. 2

4 코드번호 D-01 연구의 목적및내용 폐암 ( 비소세포폐암 ) 의방사선치료저항성극복을위하여, 방사선에종양폐혈관내피세포의간엽세포로의변이 (Endothelial to mesenchymal tarnsition: EndMT) 현상에대한구체적인작용기전및저항성과의상관관계를규명하고, 이를기반으로 EndMT 조절인자를타겟으로하는후보약물을스크리닝함으로써방사선치료효율증진기술개발의기반을구축하고자함. 또한, 다양한방사선폐암치료조건의동물모델및임상샘플을이용한 EndMT 타겟약물의유용성검증및임상적용가능성을극대화하고자함. 1 차년도 1. Ras 활성화와 p53 변이를갖는조건부돌연변이마우스를이용한자발적폐암 ( 비소세포폐암 ) 의동물모델구축과방사선반응성관찰 2. 구축된자발적폐암모델에서 EndMT 에의한 CAF (Cancer-associated fibroblast) 의역할규명 3. Syngeneic murine tumor ( 동종생쥐암 ) 모델에서방사선저항성과방사선에의한 EndMT 현상과의상관관계규명 4. in vitro 종양혈관내피세포의방사선반응성분석모델구축및방사선유도 EndMT 조절기전규명 5. 발굴된방사선유도 EndMT 조절인자를기반으로 High content screening (HCS) 기법을이용한약물스크리닝을위한시스템구축 연구개발성과 2 차년도 1. 자발적폐암동물모델에서방사선조사에따른비소세포암의반응성 (regression, regrowth) 과 EndMT 와의상관관계규명 2. 규명된방사선유도 EndMT 조절기전을기반으로종양폐혈관내피세포에서 EndMT 조절인자발굴 3. High content screening HCS 기법을이용한방사선유도 EndMT 조절선도물질검출 4. 동물모델에서방사선조사방법에따른 EndMT 현상규명및 EndMT 조절인자의임상적적용성타진 ) 3 차년도 1. 방사선유도 EndMT 조절선도약물의효능연구와종양치료방사선민감제로써의유용성검증 2. 선정된후보약물의활용가능성을임상적유용성을갖는방사선폐암치료동물모델에서확인 3. EndMT 현상의임상적유용성검증 연구개발성과의활용계획 ( 기대효과 ) 방사선에의한 EndMT 기전연구는새로운방사선의학연구분야로본연구진에의해최초로보고되었으며, 세계적수준의선도적연구개발가능성이매우높음 임상 ( 시험 ) 단계에진입한기존약물을중심으로 방사선에의한 EndMT 조절약물을발굴함으로써, 새로운의학용도발명을통한지적재산권확보및단기간내의경제적효과창출 최근방사선및항암치료병용약물로임상단계에진입한신생혈관억제제의한계점을극복, 새로운방사선병용치료요법제시가능 방사선에의한 EndMT 조절인자는 EndMT 와관련성이보고된다양한장기의섬유화및암줄기세포, 암전이등의제어기술로도활용가능함 방사선에의한정상혈관손상보호기술은방사선치료부작용경감뿐아니라, 방사선사고에대비한생물학적대비책으로직접활용가능 중심어 (5개이내 ) 폐혈관내피 - 간엽세포변이 방사선치료부작용 방사선치료저항성 비소세포폐암 High content screening 3

5 코드번호 D-02 Purpose& Contents In this study, we aim to get recovered from radioresistance of lung cancer (Non small cell lung cancer) after radiotherapy. We investigate the relation between radioresistance and regarding the transition of Endothelial to mesenchymal (EndMT) associated with radiation-induced vasculature. Based on the results, we establish the foundation of development in technology which enables us to screen candidate drugs targeting EndMT regulators, finally contributing to improvement of cancer radiotherapy. 1st year 1. Establishment of spontaneous primary lung tumor model using genetically engineered mice having activated K-ras and p53 mutation. 2. Establishment of animal models with radioresistant lung tumors. 3. The relation between radioresistance and EndMT-associated CAF (Cancer-associated fibroblast) in radiotherapy 4. The regulatory mechanism of radiation-induced EndMT in vivo and in vitro. 5. Establishment of High content screening system to discover the candidate drugs regulating radiation-induced EndMT. Results 2nd year 1. Identification of the radiation-induced EndMT regulators, based on the mechanism of radiation-induced EndMT. 2. Establishment of High content screening system to discover the candidate drugs regulating radiation-induced EndMT. 3. Screening of drug candidates using high content screening system. 4. Comparison of EndMT between conventional and hypofractionated high-dose radiotherapy. 3rd Year 1. Identification of Compounds as Radio-sensitizer in lung cancer 2. Evaluation of drug effects in vivo animal models on radiation therapy 3. Clinical evaluation of EndMT regulators in radiotherapy. Expected Contribution Preoccupying intellectual property rights through elucidation of regulators of radiation-induced EndMT. Expansion of our research to anti-angiogenic or anti-tumor therapies targeting tumor vessels. Development of effective therapeutics in the management of radiation-induced normal tissue damage including skin, bowel, and etc. Improving of the efficiency of radiotherapy with prevention normal tissue damage and cancer recurrence or malignancy. Keywords Endothelial to mesenchymal transition Side effect of radiotherapy Radioresistance Non small cell lung cancer High content screening 4

6 CONTENTS Chapter 1. Outline of this research project 7 Chapter 2. Development status of this field in Korea and Abroad 17 Chapter 3. Methods and Results 33 Chapter 4. Level of the goal attainment and contribution at the field 74 Chapter 5. Possible application of the research 76 Chapter 6. The foreign science-technical informations gathered by performing this research 78 Chapter 7. Reference 87 5

7 1. 연구개발과제의개요 7 2. 국내외기술개발현황 연구수행내용및결과 목표달성도및관련분야에의기여도 연구결과의활용계획등 연구과정에서수집한해외과학기술정보 연구개발성과의보안등급 국가과학기술종합정보시스템에등록한연구시설 장비현황 연구개발과제수행에따른연구실등의안전조치이행실적 연구개발과제의대표적연구실적 기타사항 참고문헌 87 6

8 1. 연구개발과제의개요 1-1. 연구개발목적 코드번호 D-03 폐암 ( 비소세포폐암 ) 의방사선치료의부작용으로나타나는폐섬유화및폐암방사선치료저항성극복을위하여, 방사선에의한정상및종양폐혈관내피세포의간엽세포로의변이 (Endothelial to mesenchymal tarnsition: EndMT) 현상에대한구체적인작용기전및부작용과의상관관계를규명하고, 이를기반으로 EndMT 조절인자를타겟으로하는후보약물을스크리닝함으로써방사선치료효율증진기술개발의기반을구축하고자함. 또한, 다양한방사선폐암치료조건의동물모델및임상샘플을이용한 EndMT 타겟약물의유용성및임상적용가능성을극대화하고자함 연구개발의필요성 방사선치료기술의발전에따른방사선치료효율증진관련연구분야 최근, 고선량소분할방사선치료, 더나아가서체부정위방사선수술치료법등방사선치료기술의발전으로과거에비해상대적으로종양주변정상조직을피하면서종양의국소부위에고선량의방사선조사가가능해졌음. 하지만, 방사선치료시나타나는일부암세포의방사선저항성및방사선치료후나타나는암의재발및전이, 또는정상조직의손상으로인한급 만성부작용등은방사선을이용한항암치료의큰문제점임. 정상조직의손상을최소화하기위한방법으로 stereotactic ablative body radiotherapy (SBRT) 의적용이증가되고있으며좋은국소치료율을보여주고있음. 그러나 SBRT에도방사선부작용과치료실패가발생하고있음. NSCLC( 비소세포페암 ) 를가진 26 명의환자 (29개병변 ) 와결장암, 유방암, 직장암, 상피성암, 간세포암, 흑색종, 식도암으로부터폐로전이된 13명의환자 (16개병변 ) 를대상으로 SBRT를적용하였을때, 3년이내에 NSCLC와전이암등의재발을보임. (Strahlenther Onkol. 2013; 189(1):33-40) 방사선치료를받는전체암환자들에서다시 60-70%, 즉 2/3 정도가경증혹은중증도의다양한부작용을일으킴. 방사선치료를받은암환자의생존률이높아짐에따라방사선치료부작용은환자의삶의질을심각하게저해하게됨. 암치료에있어서방사선치료의중요성이날로더해감에따라지금까지종양제어에치중되었던연구가, 부작용의분자병태생리및회복에관 7

9 한연구로의전환및확대가필요하며, 방사선으로인한만성부작용은평생지속될수도있는 바이에대한효율적관리자체가국가의료비에큰영향을미칠것임. 본연구에서일차적으로극복하고자하는폐암연구의중요성 폐암은전체암중에사망률 1위로폐암의 5년생존률은전체약 10% 에불과하며, 제 1, 2기폐암의조기진단율은 20% 이내에불과함. ( 보건복지부암등록통계, 2010년도 ). 따라서대부분의폐암환자는근치적절제술을적용할수없는경우가많으며, 초기부터중기, 말기까지방사선치료역할이지대함. 그러나, 폐암환자의 40-50% 이상이방사선치료를받지만, 이중제 1, 2기에완치를위한치료를제외하고는 90% 이상은생명연장과완화를목적으로하는치료를받고있으며, 다른암종에비해방사선치료효율이낮음. 특히, 비소세포폐암 (non-small cell lung cancer, NSCLC) 은폐암의 70-85% 를차지하며, 소세포암에비해방사선저항성이강하므로 15-25% 치료가가능하고, 어느정도까지는크기가작아지다가다시재발하는것이일반적임. 따라서, 일차적방사선치료를받은비소세포암의재발및이차적방사선치료시나타나는방사선저항성에대한연구가시급한실정이지만, 체계적인연구가이루어지지않고있음. < limited small cell carcinoma 를치료한 60 세여성환자에서종양재발 > (Radiographics 2004;24(4): ) 최근방사선치료기술의발전으로종양의국소부위에만상대적으로고선량조사 (SBRT 등 ) 가가능해져 local recurrence( 국소부위재발 ) 가작아졌으나, 치료적용환자는초기단계 ( 제 1, 2기 ) 의폐암환자의 25% 이내에불과하며, 이또한폐중앙 (central lung) 및주요혈관 (large vessel, bronchial artery) 부위등에발생한폐암의햅학적위치에따라방사선치료적용은더욱제한적임. 또한, 방사선치료기술의발전에고불구하고, 방사선폐암치료시발생하는정상조직손상에의해, 방사선치료환자의약 70-80% 에서영상의학적폐렴소견을보이며, 20-30% 는증상이발현되는폐렴이발생함. 이러한방사선폐렴은심각할경우사망에이르게할수도있음. 8

10 방사선치료를 3차원입체조형치료법으로 66Gy 까지시행하여, 우측폐상엽에있던종괴는사라졌으나, 연이어종양이있던부위및주변정상조직에심각한기침및호흡곤란증상을동반한방사선폐렴발생을상기그림에서보여주고있음. ( 좌측그림 ) 치료전, ( 가운데그림 ) 방사선치료계획, ( 우측그림 ) 방사선조사부위발생한폐렴및폐섬유화. 방사선에의한정상조직손상에서혈관손상연구의중요성 - 조직섬유화부작용 인체의각조직에는혈관의미세그물망이존재하며, 인체조직을구성하고있는모든세포들의생존은혈관에의한산소와영양분의공급및대사산물의배출이필수적으로요구됨. 따라서, 통상적분할조사조건 (Conventional radiotherapy) 에서뿐만아니라, 최근방사선치료시국소부위의종양을타겟으로하는방사선조사가가능한조건에서도정상조직의혈관손상은간과할수없는문제임. 방사선에의한정상조직의혈관손상은조직섬유화현상과더불어나타나는만성적부작용의주요현상으로알려져있으며, 혈관구성세포중혈관내피세포는방사선에가장민감한세포층으로알려져있음. 방사선에의한초기단계의혈관내피세포손상은 leucocyte의혈관주변조직으로의침투및다양한 cytokine (TGF-β, IL-1, etc) 의분비등염증반응이유도되어, 초기섬유화현상을유도한다고보고되고있으나, 방사선에의한혈관내피세포손상이만성섬유화에미치는직접적인조절기전은정확히규명되어있지않음. 방사선에의한조직섬유화과정에서근섬유아세포 (myofibroblasts) 의활성화는세포외기질 (Extracellular matrix) 을조직에축척시키고, 이러한과정은상피성세포에서중간엽세포로의전이 (epithelial-mesenchymal transition, EMT) 현상이관여되고있는것으로알려져있음. 하지만, 조직섬유화의주된역할을하는근섬유아세포의기원 (origin) 은아직까지논쟁이되 9

11 고있는상황임. 최근혈관내피세포 (Endothelial cell: EC) 는 EndMT 과정을통해간엽세포로변이되는섬유아세포 (fibroblast) 의기원세포중하나로규명되고있음. 병리학적미세환경에따라서혈관내피세포는혈관내피세포특이적인마커 (CD31, VE-Cadherin, VEGFR 등 ) 가손실되고, 섬유아세포마커 (FSP-1, α-sma) 발현이증가하면서콜라젠합성및 TGF-beta 분비가증가하며섬유아세포와같은형태로변이가되는현상임. (British Journal of Cancer 2008; 99: , The role of endothelial-to-mesenchymal transition in cancer progression) 이러한 EndMT 현상은심장형성과관련된발생연구에서처음관찰되었으며, (Dev Biol 1975; 42: , Sturctural analysis of endocardial cytodifferentiation). 최근에는심부전 (heart failure) 과관련된심장의섬유화, renal fibrosis 등의조직섬유화및만성폐고혈압 (chronic pulmonary hypertension), 상처치유 (wound healing), 급성또는만성의신장손상 (acute or chronic kidney injury) 등과같은다양한병리적조건에서 EndoMT가일어난다고보고되고있음 (British Journal of Cancer 2008; 99: , The role of endothelial-to-mesenchymal transition in cancer progression). 본연구진은최근방사선에의한 EndMT 현상이혈관조직의섬유화에관여한다는사실을세계최초로보고하였으며, 방사선에의해유도된동맥경화병변에서 EndMT 현상을관찰하고, 심장대동맥혈관내피세포에서방사선에의해유도되는 EndMT 현상은심장혈관의섬유화를유도하여동맥경화현상을증가시킬수있다는연구결과를보고하였음 (Int J Radiat Biol. 2013; 89(5):356-63, The effect of oxidized low-density lipoprotein (ox-ldl) on radiation-induced endothelial-to-mesenchymal transition). 따라서, 방사선에의한혈관손상및조직섬유화과정에서 EndMT 현상의이해와조절기전의규명은방사선치료효율증진기술개발의중요한기반연구가될것임. 방사선치료효율증진을위한종양혈관타겟연구의중요성 일반적으로일정크기 (1-2 mm) 이상의종양이형성되기위해서는암세포에산소 (Oxygen) 및영양분의공급을위한 angiogenesis ( 신생혈관형성 ) 과정이필요하며, 종양혈관구조는정상조직혈관과달리상당히비정상적인과도한혈관구조를가지고있음. 산소는방사선에의해형성된 radical과반응하여암세포를죽이는데중요한역할을하며, 종양저산소증 (tumor 10

12 hyoxia) 혹은방사선조사후생기는종양저산소증은방사선저항성을가져오는주요요인으로알려져있음 (Clin Cancer Res 2003; 9(6): , Tumor response to ionizing radiation combined with antiangiogenesis or vascular targeting agents: exploring mechanisms of interaction). 방사선종양치료에있어서종양혈관을타겟으로하는신생혈관억제제의병용치료법이임상에서적용중에있으나, 장기간투여시약물에대한내성및종양의종류, 크기에따른많은치료효율의한계점을나타내고있으며, 최근종양혈관에서 EndMT 기전을통한혈관내피세포의변이가주요현상으로관찰되는바, 본연구진은 EndMT 기전을고려한방사선종양치료기술을제안하고자함. 종양조직은암세포뿐만아니라종양주변으로이동되어진섬유세포와염증세포및면역세포그리고종양주변혈관생성을위한혈관내피세포등의다중기질세포유형 (stroma cell) 과세포외기질 (extracellular matrix, ECM) 등이종양미세환경 (tumor microenvironment) 을형성함. 방사선조사후다중기질세포층으로부터분비된다양한 cytokine 및종양미세환경의변화는방사선조사후생존한암세포의성장을촉진시킬수있다는보고가많이되고있음. (J Cancer. 2013; 4(1):66-83, The tumor microenvironment contribution to development, growth, invasion and metastasis of head and neck squamous cell carcinomas) 특히, 암섬유아세포 (Cancer associated fibroblasts, CAFs) 는종양미세환경의중요한구성원으로서, resting fibroblast와는다르며, activated phenotype (Myofibroblast) 으로 vimentine, desmin, a-smooth-muscle actin과 fibroblast activation protein (FAP) 의발현이증가되어있음. 또한 HGF, EGF, b-fgf 등의암세포성장인자및다양한 cytokine (SDF-1 and IL-6등 ) 분비, Extracellular matrix proteins (Collagen, fibronectin, lamin) 을증가시키면서, 다양한기작에의해암세포의성장과전이를촉진하는것으로알려져있음. 따라서암섬유아세포는최근새로운항암치료제개발의주요타겟이되고있음. 11

13 (Semin Cell Dev Biol. 2010; 21(1):19-25, Carcinoma-axxociated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression) 암섬유아세포 (CAF) 의기원은정상섬유세포 (Normal fibroblast) 의유전적변형, 상피세포의간엽세포로의변이현상 (Epithelial to mesenchymal transition, EMT), 골수유래간엽세포 (Bone-marrow derived circulating cells which belong to mesenchymal cells), 그리고최근규명된혈관내피세포의간엽세포로의변이현상 (Endothelial to mesenchymal transition, EndoMT) 등으로부터유래한다고보고되고있지만, 다양한병리학적조건에따라주요기원에대해아직정립된이론이없음. (Front Biosci. 2011; 15: , Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment) 종양에서 EndMT로부터유래된암섬유아세포 (CAF) 의발견과함께새로운항암치료타겟으로의중요성이제안되어지고있으나초기연구단계이기때문에아직정확한생성기전과조절타겟이규명되어있지않음. EndMT를조절하는인자로는 TGF-beta, smad, snail, BMP7 등이제안되고있으며, 최근 hypoxia에의한 EndMT 현상이 pulmunary fibrosis, cancer progression, Cardiac fibrosis 등에서발견되고있음. 많은보고에서방사선치료시암섬유아세포 (CAF) 를비롯한종양미세환경에대한영향을중요하게제안하고있으나, 정확히규명되어있지않음. 최근 pancreas에서섬유아세포가악성화암에대한방사선저항성을나타내고, in vitro 에서고선량방사선조사후 fibroblast 세포가다양한 cytokine 분비를통한 pro-tumorigenic phenotype을나타낸다는보고가있음. 또한 12

14 SART (Stereotactic Ablative Radioation therapy) 조건에서높은방사선량 (single fraction-large dose) 은악성암세포에만살상효과를나타내고상대적으로섬유아세포는방사선저항성을나타낸다고보고된바있음. 방사선치료효율은통상적분할조사조건에서보다고선량소분할방사선조사조건에서종양기질섬유아세포에따라더의존적으로나타날수있다는연구결과도보고되고있으나, 더많은연구결과와임상적자료가뒷받침되어야함 (Cancer Res 2004; 64(9): , Radiation to stromal fibroblasts increases invasiveness of pancreatic cancer cells through tumor-stromal interactions. Int J Oncol 2011; 39(4): , Human lung fibroblasts prematurely senescent after exposure to ionizing radiation enhance the growth of malignant lung epithelial cells in vitro and in vivo). 또한최근많이이용되고있는고선량단일분할 (high-dose single fraction) 방사선조사의경우종양에서암세포를더잘죽이는 higher local control을나타내는이유는직접적인종양세포살상효과뿐아니라, 주변혈관내피층이고선량에의해서빠르게파괴되면서이차적으로종양세포를더죽일수있기때문이라고제안되어지고있음. 또한, 방사선에의한혈관내피세포의사멸은 8-11Gy 이상에서만일어나며, 이보다작은분할조사선량에서는종양혈관파괴에의한이차적종양세포의살상효과를기대하기어렵다고보고되어지고있으나, 이러한가설은더많은연구와임상적데이타가뒷받침되어져야함. 이와더불어, 아직 long-term follow up의임상적데이터가부족한 SBRT 등의고선량소분할조사의정상조직손상에대한임상적데이터와연구가필요한실정임 (Science. 2003; 300(5622):1155-9, Tumor response to radiotherapy regulated by endothelial cell apoptosis). 따라서본연구에서는다양한방사선조사방법에따른종양혈관내피세포의세포사멸정도와 EndMT 유도조건및이를통한 CAF의형성여부와방사선반응성에대한기초연구를수행함으로써, 통상적분할조사및고선량소분할조사시방사선종양치료효율증진기술을위한기반지식을마련할수있을것임. 본연구진은예비실험결과를통해방사선저항성을나타내는종양조직에서방사선에의한 EndMT 현상의현저한증가와종양혈관구조의변화및종양혈관내피세포를중심으로한섬유화현상의증가를관찰하였음. 따라서, 방사선에의한종양조직에서의 EndMT와섬유아현상의규명은방사선종양치료의예후평가및치료효율증진을위한새로운타겟이될것임. 임상적유용성을갖는효율적연구결과도출을위한연구시스템구축필요 기존방사선치료를위한종양실험동물모델의한계점극복을위한 genetically engineered mouse model 이용 그동안일반적으로사용되어왔던방사선치료효율증진연구를위한마우스모델은인위적인세포의주입으로형성되는종양모델을사용해왔으나, 주입된암세포특이적인실험결과와종양성장시필요한혈관형성과정관찰및종양저산소증연구등에한계를나타내고있음. 따라서, 인위적동물모델의한계성을극복하고, 사람의폐암과같은암성장에따른주변미세환경의변화를 mimic 할수있는, 조건부돌연변이마우스 (LSL-K-ras G12D ; p53 R270H/Fl) ) 를이용한자 13

15 발적폐암모델을구축하여본연구를진행하고자함. 특히, 사람의비소세포폐암 (NSCLC) 은 50-70% 이상에서 p53의기능적유전적변이와 10-30% 이상에서 K-RAS의활성화변이가관찰되므로, p53의변이마우스와 K-RAS의활성화변이마우스를교배하여얻은 double transgenic 마우스는비소세포폐암연구의임상적유용성을가지고올수있을것으로예상됨. ( 그림 ) Oncogenic K-ras 의활성화와 p53의조건부돌연변이모델 (LSL-K-rasG12D; p53r270h/fl) 을이용한 human NSCLC를 mimic한마우스모델 (Nat Protoc. 2009; 4(7): ) 본연구진의예비실험결과, 자발적종양모델은세포주입형종양모델과방사선반응성이다르고, 종양혈관구조의변화를관찰하기에적절한모델임을확인할수있었음. 임상적방사선종양치료조사조건을중재할수있는방사선종양치료동물모델구축의중요성 방사선종양치료조사조건은통상적분할조사부터고선량소분할방사선조사조건에이르기까지폐암의진행정도에따라다르게조사되며, 조사방법에따른종양의반응성은매우다르게나타남. 그동안방사선종양치료효율증진에대한대부분의기초연구들은암세포주입형마우스모델및 in vitro 단일세포실험조건에서종양성장정도에따른다양한방사선조사조건의고려없이실행되었고, 그에따른연구결과의임상적적용한계를가져올수밖에없었음. 따라서, 본연구에서는자발적폐암모델에서암의진행정도에따른임상적방사선조사조건 ( 통상적분할조사및국소부위의고선량소분할조사 ) 을정확히중재할수있는방사선종양치료동물모델을구축하고자함. 방사선치료효율증진후보약물발굴을위한최적의약물스크리닝시스템구축필요 방사선치료효율증진약물개발의기존연구들에서는약물후보도출을위해약물의세포내조절인자활성저해정도를분자생물학적방법으로스크리닝하여분석하였으나, 이는단편적인약물의효능을관찰하는정도에지나지않아, 약물의독성및동물모델에서의유효성이나타나지않는등의비효율적연구결과를가져오게되는경우가많음. 14

16 본연구에서는방사선치료증진약물후보를효율적으로스크리닝하기위하여 High content screening(hcs) 의신약개발기술플랫폼을이용하고자함. 신약물스크리닝전문가와공동연구를통해방사선에의한 EndMT 조절기전규명을기반으로분석모델을구축하고, 살아있는세포에서다양한조절인자의생물학적변화를실시간으로관찰및이미지데이터의객관적인분석 tool을이용하여방사선에의한 EndMT 조절후보약물을도출하고자함. 본연구개발대상기술의산업적경제적중요성 본연구진은최근방사선에의한 EndMT 현상발견및방사선에의한조직섬유화에 EndMT가관여한다는사실을세계최초로보고하였으며, 이는세계신약개발의주요 Community를담당하고있는 Global Medical Discovery와 MDLinx에서 hot issue로선정된만큼본연구에서진행하고자하는방사선유도 EndMT 조절기술은세계적수준의선도적연구개발과고부가가치산업으로의발전가능성을보여주고있음. 최근선진국을중심으로다양한질병에서의 EndMT 관련성이보고되고있으며, 아직초기연구단계이므로국내기술선점을통한국가경쟁력을갖추기위해조속한연구가수행되어야함. 본연구에서는임상 ( 시험 ) 단계에진입한기존약물을중심으로 방사선에의한 EndMT 조절약물을발굴하여, 새로운의학용도발명을통한지적재산권확보및단기간내의경제적효과를창출하고자함. 최근방사선및항암치료병용약물로임상단계에진입한신생혈관억제제의 Avastin (Bevacizumab) 은 2011년 56억달러의매출액을기록 ( 하고있지만, 단독약물로서의효과는기대치에미치지못하고있음. 또한장기간처리시발생하는종양성장인자의유도및종양에따른저항성등의부작용을극복하기위한선진제약회사의활발한연구가진행중임. 본연구를기반으로종양혈관의변형에따른 EndMT의조절기전을고려하여새로운 15

17 종양혈관형성을타겟으로하는약물을개발하고, 새로운방사선병용치료요법제시한다면고 부가가치의제약산업의발전을이끌수있을것임. EndMT 조절약물개발을통한방사선에의한정상혈관손상보호기술은방사선치료부작용경감뿐아니라, 방사선사고에대비한생물학적대비책으로직접활용이가능하고, 현재수입으로만의존하고있는방사선손상보호제 Amifostine(Ethyol ) 을대체하여국가적경제력을확보할수있을것임 연구개발범위 방사선폐암치료시방사선저항성결과로나타나는폐암의재발및악성화, 정상조직손상으로나타나는폐섬유화등의부작용을, 방사선에의한종양및정상혈관에서의혈관내피-간엽세포로의변이현상을타겟으로방사선폐암치료효율을증진시킬수있는기술개발을위한기반을구축하고자함. 따라서, 연구결과의임상적유용성을극대화하기위해아래와같은연구개발을추진하고자함. 1) 자발적비소세포폐암소동물모델을구축하여, 2) 방사선에의한폐섬유화및방사선에의한비소세포폐암에서 EndMT 유도현상을규명하고, 3) 정상폐및폐암혈관내피세포에서의 EndMT 기전규명과상호간의상이성혹은유사성을규명하고 4) 방사선에의한폐섬유화및방사선치료후나타나는폐암의악성화및재발을제어하기위한방사선유도 EndMT 조절인자를규명하고자함. 또한, 이를기반으로 5) High content screening (HCS) 기법을도입하여, 임상적활용성이있는방사선유도 EndMT 조절후보약물을도출하고자함. 이와아울러자발적폐암소동물모델을이용한통상적분할조사및고선량소분할조사의다양한임상적상황을중재할수있는방사선폐암치료조사조건을구축하여, 방사선에의한 EndMT 조절인자의임상적적용범위를검증하고자함. 16

18 2. 국내외기술개발현황 코드번호 D-04 (1) 세계적수준 개념정립단계 기업화단계기술안정화단계 (2) 국내수준 최근국내에서도방사선치료효율증진연구를위해방사선에의한정상조직의손상및임상적유사성이있는동물모델구축에관한연구의중요성이부각되고있으나, 국가연구비지원규모및기술력에있어서국외의선도연구그룹들과의격차가크게나타남. 그러나, 방사선에의한조직손상에있어서 EndMT 현상의발견은본연구진이세계최초로보고하였으며, 아직초기단계의연구이기때문에국내타그룹에서는아직체계적으로수행되고있지않음. (3) 국내외연구현황 연구수행기관연구개발의내용연구개발성과의활용현황 일본국립방사선종합연구소 (National Institute of Radiological and Medical Science) 일본 RERF (Radiation Effects Research Foundation) 방사선손상에관여하는인자발굴방사선에의한발암인자발굴및기전연구 방사선에의한인체영향연구 방사선에의한혈액암유발인자규명방사선피폭환자에대한대량유전자 pool 등 방사선에의한발암종류및비발암성질환경향규명 미국 NIAID (National Institute of Allergy and Infectious Diseases) Hravard Mediacl School, University of Washington and NIH 방사선및핵에대한의학적대책프로그램의일환으로방사선에의한생체손상기전연구 종양에서혈관내피 - 간엽세포변이 (EndMT) 현상규명 방사선에의한혈관내피세포손상을포함한병리생리학적증상에대한영향을연구 Pancreatic carcinoma, Kaposi's sarcoma 에서 EndMT 현상과암섬유아세포의관계증명 Duke University Mouse 모델을이용한방사선조사에의한폐손상연구 Mouse 모델에저선량방사선을조사하여폐손상기전연구 (Whole body 조사 ) University of Texas M.D Anderson Cancer Center 1. Mouse 모델을이용한방사선조사에의한폐손상연구 2. 폐암환자를대상으로방사선치료에의한폐렴관련인자발굴 1. Mouse 모델에저선량방사선을조사하여폐손상기전연구 (lung specific 조사 ), 방사선조사량에따른폐손상기전연구 2. 폐암환자 173 명을대상으로방사선치료후폐렴유발과관련된염증유발유전자라이브러리구축및폐렴발생관련성연구 MIT & Harvard Medical school 다양한유전적변이동물모델시스템구축을통하여, 사람의암과가장가까운병리조건을갖춘마우스모델개발 조건부돌연변이동물모델을구축하여, 각장기별자발적발암모델을구축 (Lung adenocarcinoma, osteosarcoma 등 ) Virginia Common Wealth University & Duke University Superxoide dismutase (SOD) mimetic 의방사선폐부작용보호효 아직밝혀지지않은방사선폐손상의기전에있어서 SOD 의방사선보호역할보고를 17

19 University of Chicago, IL Duke University School of Medicine Johns Hopkins University School of Medicine Harvard medical school Memorial Sloan-Kettering 유럽연합 과검증 메타분석을통한비소세포암에서 amifostine 의영향연구 - 총 601 명의환자분석 방사선에의한정상조직손상연구 방사선치료에의한부작용으로서혈관내피세포영향연구 방사선에의한혈관성질환연구 방사선치료에있어서혈관내피세포의중요성연구 7th Framework Program 을통해방사선에의한혈관질환연구 기반으로 SOD 처치에따른단백변화를확인하고, 어떻게 SOD 가방사선조사후 lung function 을향상시키는지규명 부작용을감소하는것을알려진 amifostine 이방사선에의한 tumor response 는떨어뜨리지않음을보고함 Acute syndrome과 late effect에대한혈관내피세포의영향규명방사선에의한혈관내피세포노화에의한동맥경화현상규명방사선치료는혈관내피세포의존성혈관확장을가져옴을규명방사선치료효율증진을위해서는혈관내피세포는일차적타겟임을규명혈관내피세포에대한영향규명을중심으로방사선에의한심혈관질환영향연구 방사선유도폐렴및폐섬유화연구 방사선-폐렴및폐섬유증의발생빈도는방사선조사범위와, 전체조사량및분할조사량등에따라다르게나타난다고보고되고있으며, 방사선폐렴및섬유화특히중증도이상의심한발생위험이높은환자를미리선별할수있다면맞춤형방사선량을조사하여폐조직손상을최소화할수있을것으로기대됨. 방사선에의한폐손상부작용에현재사용되는약물은염증완화를위한 Prednisone, Glucocorticosteroid 및 collagen 합성억제를위한 Colchicine, Penicillamine과 Anitibiotic therapy 등이있지만, 이는독성이너무강하고여러가지부작용이수반됨. 또한정상조직의방사선손상을위해개발된 free radical scavenger인 Amifostine은강한독성과함께고가의약물이라는경제적측면에서도적절하지못한약물임. 현재는스테로이드계항염증제가방사선에의한폐렴증상을완화시키기위해가장많이사용되는치료제로방사선유도폐섬유화증에대한근본적인치료요법으로는한계를나타내고있으며, 방사선유도폐섬유화조절제개발에대한연구가절실히필요함. 방사선에의한폐독성에관여하는것으로가장잘알려진 TGF-beta가폐섬유화과정에도관여하는주요물질임을증명하였음. TGF-beta는콜라겐합성을강하게촉진하는데방사선조사후 TGF-beta 유전자발현이증가하며, 이외에도염증성사이토카인인 TNF-alpha, IL-1, IL-6 등이폐섬유화과정을촉진하는관련인자임을증명한연구들이있으나방사선특이적인폐섬유화관련인자인지에대해서는아직확실하게규명되지않음. 18

20 염증성사이토카인에의한폐섬유화의다양한기전 (Am J Respir Crit Care Med. 1999) 이온화방사선은 mature한 transforming growth factor-β (TGF-β) 에서 latency-associated peptide (LAP) 를분리시킴으로써직접 TGF-β를활성화시킴. 뿐만아니라, 방사선은혈관내피세포에손상을가하여이세포로부터 TGF-β를포함한섬유형성 (pro-fibrotic) 사이토카인을분비하도록만듬. 또다른영향으로방사선은활성산소와활성질소 (ROS and RNS) 의항상성조절을교란하며, 이로인해 TGF-β가활성화되도록하거나또는직접 Smad 신호전달을저해하며, 이러한세포밖사건들은 TGF-β 신호전달을활성화시키고, 세포외기질 (ECM) 과콜라겐축적을증가시키는다양한전사반응을초래함. 방사선에의한혈관손상과제어되지않는조직재생은조직에저산소증을가져오며, 이것은섬유반응을영속하게하는하나의기전으로작용할수있음 (Nat Rev Cancer. 2006; 6(9): , Preventing or reducing late side effects of radiation therapy: radiobiology meets molecular pathology). 19

21 방사선에의한조직섬유화기전 방사선에의한혈관내피세포영향연구 폐혈관내피세포의손상은방사선에의한폐손상의중요한특성으로초기단계에서일어나며, 방사선에의한혈관손상의주요원인으로알려져있음. 방사선조사된혈관내피세포는 growth factors, chemo-attractants, specific injury marker 등의분비와생성의변화를가져옴. 방사선에의한혈관내피세포의세포사멸은 acid sphingomyelinases의활성화와미토콘드리아의세포사멸과정을조절하는 ceramide의합성에의존적으로조절되는것으로밝혀짐. Late vascular effects는방사선조사후한달안에 capillary collapse, thickening of basement membrane, 모세혈관확장 (telangiectasias) 과같은주변조직의손상, clonogenic capacity등이나타남. 그러나, 방사선에의한폐손상부작용에있어서의중요한혈관내피세포손상조절을타겟으로하는제어제개발은거의이루어지고있지않음. 20

22 방사선에의한혈관내피세포의손상은 Thrombine 증가와염증유발에의한다양한사이토카인분비및 TGF-β의증가를통해서초기 Fibrogenesis 및혈관투과성을증가시킴 (Radiotherapy and Oncology. 2010; 97: , review) 최근, 다양한단계별염증질환에서혈관내피세포에의한기능의중요성이대두되면서혈관내피세포를타겟팅하는항염증제에대한연구의중요성이제시되고있음. 항염증효과를나타내는혈관내피세포를타겟으로하는물질 (Nature Reviews Immunology. 2007; 7(10): ) 21

23 방사선조사방법에따른혈관내피세포손상기전의차이점 Models of microvascular endothelial engagement in tumor response to single-dose or fractionated radiotherapy 혈관내피세포 - 간엽세포로의변이 (EndMT) 연구분야 EndMT는염증, 혈류역학적응력, 물리적인손상, 저산소증과같이다양한환경에의해유도된다고보고되어있음. 이러한환경은 metalloproteinase와 serineprotease를활성화시킴으로써혈관내피세포의세포와세포사이, 세포와기질사이의접촉능력을상실하게만듬. 또한 TGF-β, FGF-2, EGF, Notch/delta, WNT 등에의해 Snail1/2, sip-1, twist와같은전사인자를활성화시킴으로써, 혈관내피세포마커의발현을감소시키고간엽세포마커의발현을증가시킴. 이렇게 EndMT가일어난세포는 BMP-7이나 FGF에의해다시원상태로되돌아갈수있다고알려져있으나, 정상혈관내피세포로원상회복되는능력에관해서는좀더연구가필요한상황임. EndMT 저해와 EndMT로부터혈관내피세포의원상회복과관련된요소들에대해세부적으로연구된다면, 이는섬유화로인한장기의손상을막을수있는새로운전략으로이용될수있을것임 (Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2007; 293(1):L1-8, Perspectives on endothelial-to-mesenchymal transition: potential condtribution to vascular remodeling in chronic pulmonary hypertension). 22

24 조직섬유화에관여하는 EndMT 현상의예 EndMT: coversion of endothelial cells to multipotent stem like-cells EndMT가일어난세포는다양한세포로분화가능한줄기세포의특성을갖는다고보고되고있음. 활성화된 ALK2를과발현하여 EndMT가일어난세포는뼈, 연골, 또는지방세포로분화를유도하는배지에서 (osteogenic, chondrogenic, or adipogenic) 배양하였을때각각의특징을갖는세포로분화하였으며, 이러한특성은골수세포에서유래한간엽줄기세포의 (bone marrow derived mesenchymal stem cells) 분화능력과유사함 (Nat Med. 2010; 16(12): , Conversion of vascular endothelial cells into multipotent stem like-cells). 혈관내피세포는 TGF-β2와같은 ALK2 ligands에의해활성화되어 EndMT가일어나게되며, 섬유세포의형태와마커, 그리고중간엽기질세포 (MSC) 라고정의할수있는다분화능력을획득함. EndMT가일어난세포의다분화능력은특정한유도조건하에서골아세포, 지방세포, 연골세포로분화하는능력을통해입증되었음. 중간엽기질세포는혈관내피세포로분화할수있다는가능성이보고되었으므로, EndMT로부터유래한중간엽기질세포또한혈관내피세포로분화할가능성이있음. 23

25 (Cell Stem Cell. 2011; 8(1):10-11) 또한정상혈관의경우, 혈관의지지세포들 (pericytes and smooth muscle cells) 이혈관내피세포의 EndMT로부터유래할수있다는가능성이보고됨. 따라서, EndMT가일어난혈관내피세포는혈관형성과정동안 mural cells의보강 (recruitment) 에중요한역할을하며혈관을안정화시키는데중요한역할을하는것으로제시됨 (Circ Res. 2005; 97: , Endothelial/Pericyte Interactions). 종양에서의 EndMT 연구분야 B16F10 세포를마우스피하에주입하여발생한종양과 Rip-Tag2 마우스에서자발적으로발생된췌장암에서, cancer-associated fibroblasts (CAFs) 의 40% 정도가 EndMT로부터유래하였다고보고함 (Cancer Res. 2007; 67(21): , Discovery of Endothelial to Mesenchymal Transition as a Source for Carcinoma-Associated Fibroblasts), 이것은암을촉진하는 CAFs 가축적되는데있어서 EndMT가중요한공급원임을입증함. 24

26 (Cancer Res. 2007; 67(21): , Discovery of Endothelial to Mesenchymal Transition as a Source for Carcinoma-Associated Fibroblasts) 종양에서혈관내피세포는 cancer-associated fibroblasts (CAFs) 의공급원중하나로서, 비발암성의혈관내피세포는 EndMT에의해친발암성의침습성 CAFs로분화함. 이와마찬가지로종양혈관에통합된혈관유사암세포 (EndCC) 는 EndMT에의해침습성중간엽암줄기세포 (mesenchymal cancer stem cells; MCSC) 가됨. 종양의혈관이파괴되면이러한세포사멸-저항성 EndCC와 MCSC가떨어져나오게되며, 이는신경교종 (Glioma) 에서신생혈관저해제로치료시암세포의파종이증가된현상을설명할수있음. (Int J Cancer. 2010; 128(6): , Existence of tumor-derived endothelial cells suggests an additional role for endothelial-to-mesenchymal transition in tumor progression) EndMT 조절기전연구 혈관내피세포의 TGF-β 수용체가 TGF-β에의해활성화되면 Smad를통해 Snail을활성화시키고 c-abl과 PKCδ를통해 Snail을안정화시킴으로써, 혈관내피세포의마커인 CD31과 VE-Cadherin의발현이감소하고간엽세포의마커인 α-sma와 Vimentin, Collagen I 등의발현이증가하는 EndMT가일어난다고보고되었음. 이러한 TGF-β에의해유도되는 EndMT는 BMP7과 VEGF에의해저해된다고보고되었음. 아직까지 EndMT의정확한조절기전과함께, 정상상태에서일어나는 EndMT와질환상태에서일어나는 EndMT의조절기전이어떻게다른지에대해서는연구가필요한상황임 (Trends Cardiovasc Med. 2008; 18: , Transforming Growth Factor β-induced Endothelial- to-mescenchymal Transition: A Switch to Cardiac Fibrosis?). 25

27 Cancer-Assosciated Fibroblasts 연구의중요성이부각 암-연관섬유아세포 (Cancer-Associated Fibroblasts; CAF) 는암줄기세포 (Cancer Stem Cells; CSCs) 의성장을지지해주며, 암줄기세포가줄기세포성 (stemness) 을유지하는데필수적이라고보고됨. 폐암의초대배양으로부터분리한폐암줄기세포는암-연관섬유아세포의지지가없으면암세포로분화하지만, 분화된암세포에암-연관섬유아세포를첨가하면다시줄기세포성을획득하여암줄기세포가되도록촉진할수있음. 암-연관섬유아세포는 26

28 IGF-II, HGF, SDF1과같은성장인자를분비하고, 암줄기세포가이에대한수용체를발현하도록유도함으로써암줄기세포의성장을조절할수있음. 또한, 암-연관섬유아세포가분비하는 IGF-II는암줄기세포의 IGF1R를자극하여 IGF-II/IGF1R/Nanog 신호전달계를활성화시킴. 이와같이폐암줄기세포와암-연관섬유아세포간의자가분비와주변분비에의한신호전달이함께작용하여폐암세포의줄기세포성을유지시킴. (Nat Commun Mar 25;5:3472, Cancer-associated fibroblasts regulate the plasticity of lung cancer stemness via paracrine signalling) 암-연관섬유아세포 (Cance r-associated Fibroblasts; CAF) 에기반을둔안성맞춤치료요법 : 최근에는몇몇약물이종양자체보다는기질구성요소를표적으로하고있으며, 혈관의성장, 섬유아세포특이단백질, 분비된세포밖기질을표적으로함. 이와관련하여, 종양미세환경 (Tumor microenvironment) 에서거주하는암-연관섬유아세포 (Cancer-Associated Fibroblasts; CAF) 는종양의성장, 혈관신생, 염증, 전이등을조장함으로약물의표적으로이용될수있음. 암-연관섬유아세포는혈관내피세포 (Endothelial cells), 섬유아세포 (Fibroblasts), 종양세포 (Tumor cells), 간엽줄기세포 (Mesenchymal stem cells; MSCs) 로부터유래할수있음. 이세포들은특정마커에의해동정될수있으며 ( 보라색사다리꼴 ) 이를통해항암약물 ( 분홍색사다리꼴 ) 로타겟팅할수있음. 예를들어, 혈관내피세포는암-연관섬유아세포와유사한세포로변형될수있으며이러한세포는 VEGF를발현함. 따라서 VEGF 중화물질로타겟팅할수있음 (Trends Mol Med. 2013; 19(8): , 'Cancer associated fibroblasts'--more than meets the eye.). 27

29 : 종양내의낮은산소수준과 HIF-1α의발현은육종 (sarcoma) 에서전이능 (metastatic potential) 의주요예측인자임. 저산소증상태에서증가한 HIF-1α는 PLOD2의발현을증가시키고무질서하게해체된콜라겐이축적되도록함. 무질서하게축적된콜라겐은일차성암세포의이동뿐만아니라폐의전이를촉진함 (Cancer Discov. 2013; 3(10): , Hypoxia-dependent modification of collagen networks promotes sarcoma metastasis). 최근 ( ~) 주요저널에발표된종양혈관내피세포타겟팅대표연구동향 전세계적으로다양한연구그룹에서각종양의분자특성을타겟으로하는치료에대한연구가활발하게진행되고있는실정임. Focal Adhesion Kinase (FAK) 는암세포의전이에관여하는단백질로써 FAK의억제는종양의전이를억제한다고알려짐. 최근연구동향에따르면혈관내피세포에서 focal adhesion kinase (FAK) 의특이적타겟팅을통해종양의성장과 DNA 손상의조절기전을밝힘 (Nature. 2014; 514: , Endothelial-cell FAK targeting sensitizes tumours to DNA-damaging therapy). 28

30 염증성단핵구는 CCL2와같은사이토카인을분비함으로써, 전이암에침투및이들의성장을촉진하게됨. 이러한결과는 CCL2를중화하거나, CCR2 수용체를차단하는것이치료효과를가질수있다는것을추정할수있게해줌. 하지만, Laura Bonapace 등은유방암에대한생쥐모델에서 CCL2에대한항체요법이치료효과를저하시킬뿐만아니라, 폐전이의가속화를통해서치료군의동물들이 WT에비해서훨씬빠르게사망하도록만든다는사실을확인함. 이러한결과는폐전이환경에골수유래단핵구세포가침투하고, IL-6에의존적인혈관형성이증가하였기때문인것으로보임. 이러한사실은 CCL2 항체치료제를단독으로사용하는데주의가필요하며, IL-6 항체치료법이전이를방지하고, in vivo 모델에서의치료군에대한생존률을높여줄수있음을입증함 (Nature. 2014; 515: , Cessation of CCL2 inhibition accelerates breast cancer metastasis by promoting angiogenesis). 29

31 최근연구동향에따르면암치료를위한자가포식 (autophagy) 억제제로알려진클로로퀸 (chloroquine) 이 Hannelore Maes 등에의해종양혈관을정상화시킬수있음이보고됨. 클로로퀸은종양혈관구조와기능의정상화를통해암세포의침윤및전이를감소시킴. 또한클로로퀸의혈관정상화활성은내피세포에서엔도솜의 Notch1 수송및신호전달변화에주로의존하고있으며, Notch1의결손에의해억제됨을입증함. 따라서본연구는클로로퀸에의한자가포식독립혈관의정상화가종양의침윤및전이를억제하는매커니즘을통해항암치료향상에기여할것으로기대됨 (Cancer Cell. 2014; 26: , Tumor vessel normalization by chloroquine independent of autophagy). 30

32 다른모든세포와마찬가지로암세포또한혈액으로부터성장에필요한영양분을공급받음. 특히급속히성장하는암의특성상, 암세포는보다많은양의혈액을요구하게되고, 또이러한요구를충족시키기위하여암은새로혈관을만들어주위의양분을끊임없이흡수할뿐더러, 이렇게생성된혈관을통하여다른장기로전이되어다른조직까지도파괴함. 이러한암의성장에필요한혈관을타겟으로하는혈관촉진요법을통해약물의약효를향상시키고부작용을최소화할수있는종양의치료가능성을제시함 (Cancer Cell. 2015; 27:7-9, Vascular-promoting therapy reduced tumor growth and progression by improving chemotherapy efficacy). 방사선치료효율증진연구를위한동물모델 국외연구팀에서임상적방사선치료조사조건을반영한폐암치료및폐부작용연구를위해소동물모델을이용하여증명하고자많은노력을하고있으며, Texas southwestern Medical Center 연구팀은 mouse orthotopic lung cancer 모델을구축하여방사선조사에따른정상조직의일차적반응현상을규명했고특히최신방사선치료기법인 SBRT를반영하는소동물모델을세계최초로개발했음. 가장최근에텍사스주립 Southwestern Medical Center에서구축한소동물방사선기모델은최신방사선치료경향인고선량소분할방사선치료, 영상유도방사선조사, 미세방사선조사등이모두효율적으로가능한장비로서세계최초이며, 폐장기를대상으로최근각광을받고있는체부정위방사선수술 (Stereotactic Body Radiotherapy, SBRT) 에임상유사한폐조직반응의예비결과를수립하였음. 31

33 방사선에의한암치료연구를하기위해그동안사용되어왔던동물모델 (immuno-deficient xenograft system, tumor-stroma mismatch) 들은 tumor environment를무시한인위적동물모델로서방사선생물학연구에있어서한계를가짐. Human cancer와가장유사한조건을갖는 genetically engineering mouse models을이용하여유도한자발적폐암의경우방사선치료에대한연구를하기에적절함. 자발적폐암모델에서의폐암형성과정 : Micro-CT imaging 자발적페암마우스모델에서의 Micro-CT imaging을이용한방사선치료효과 A) 방사선치료를받지않은폐암의한달뒤이미지 B) 방사선치료를받아성장이늦어진한달뒤폐암의이미지 Oncogenic K-ras의활성화와 p53의조건부돌연변이모델 (LSL-K-rasG12D; p53r270h/fl) 을이용한 human NSCLC를 mimic한마우스모델에서의방사선치료연구의예 (Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2010; 76(4): ) 32

34 3. 연구수행내용및결과 코드번호 D-05 연구범위 자발적폐암 ( 비소세포폐암 ) 동물모델구축 연구수행방법 ( 이론적 실험적접근방법 ) 조건부 K-Ras 활성화변이유전자조작마우스와조건부 p53 변이유전자조작마우스의교배를통해 Ras 활성화와 p53 변이를갖는조건부돌연변이마우스구축 구체적인내용 Ras 활성화와 p53 변이를갖는조건부돌연변이마우스를이용한자발적폐암 ( 비소세포폐암 ) 의진행과정 (stage) 에따른동물모델구축 종양 nodule 의크기가커짐에따라종양혈관내피세포중심으로콜라겐형성이증가하는것을알수있음 1 차년도 2 차년도 구축된자발적폐암모델에서 EndMT 에의한 CAF (Cancer-associated fibroblast) 의역할규명 Syngeneic murine tumor (CT26 colorectal cancer cell line) 동물모델에서방사선저항성과방사선에의한 EndMT 현상의상관관계규명 자발적폐암동물모델에서방사선조사에따른비소세포암에서의 EndMT 현상규명과선정한 EndMT 저해제를이용한방사선치료효율확인 규명된방사선유도 EndMT 조절기전을기반으로종양폐혈관내피세포에서 EndMT 조절인자유용성및 positive control 약물선정및효능검증 구축된자발적폐암동물모델에서 EndMT 조절인자를이용한 CAF 의역할규명 Syngeneic murine tumor ( 동종생쥐암, CT26 tumor cell line, Balb/C mice) 모델에서방사선저항성과방사선에의한 EndMT 현상의상관관계규명 마우스다리의 CT26 tumor 에방사선조사후관찰 다음의세시기를기준으로 (Pre-radiation/Regression/ Regrowth) Trichrome, 면역형광염색 (α -SMA, CD31) 등을수행 1 차년도에구축한 Ras 활성화와 p53 변이 (K-ras LSL-GLD/+ ; p53 fl/fl ) 를갖는조건부돌연변이마우스를이용하여자발적폐암을생성시킨후 PET- CT 를이용하여일정크기의폐암형성확인후흉부에방사선 (X-ray) 을조사함 EndMT 조절인자의유용성검증을위한임상샘플및 in vivo 실험 자발적폐암형성과정중 sh-lentiviral vector 를이용한 EndMT 조절인자인 HSPB1 를제거하였을경우, EndMT 현상의증가와함께 tumor progression 이현저히증가하는것을확인하였음 방사선조사후종양조직내콜라겐침착증가를관찰, 특히종양혈관중심의증가현상을관찰할수있었음 Pre-radiation/Regression/Regrowth 시기별 EndMT 현상비교 1 차년도에구축한자발적비소세포암모델에서방사선조사전 / 조사후 (regression / regowth) 폐암저항성관찰조건확립및방사선저항성과 EndMT 현상규명 조사조건 : 16Gy dose, 2 fractions FDG-PET-CT 를이용하여폐암의방사선반응성을확인후, 방사선조사 1 달및 2 달후부검및조직분석수행함 (Trichrome, H&E, IHC, IF) 방사선유도 EndMT 조절기전을기반으로선정한 EndMT 조절가능약물 (2-Me) 투여후폐암의방사선반응성관찰 EndMT 조절인자의유용성검증 종양혈관에서의 EndMT 조절인자 ( HSPB1) 의임상적유용성검증 : Human Lung cancer tissue array (90 tissues) 에서 EndMT 현상의유용성검증 Positive control 약물선정및효능검증 33

35 방사선유도 EndMT 조절후보약물스크리닝시스템확립 (II) 과선도약물도출 ( 위탁 ) 방사선유도 EndMT 세포모델을 High content screening 을위한시스템에적용 : 방사선유도 EndMT 세포모델의 384- well 시스템확립 방사선유도 EndMT 억제제개발을위한표지자개발 이미지분석알고리듬개발 임상단계에들어가있는약물중방사선에의한 EndMT 저해제스크리닝및시스템에이용할 positive control 선정과 in vivo 효증검증 ( 자발적폐암모델및 LLC (Lewis lung carcinoma) tumor model 이용 방사선유도 EndMT 억제제개발을위한최적의스크리닝조건확립 IR 에의한세포크기변화를감안하여최적의스크리닝조건확립 : 세포밀도, 약물처리시간, IR 전처리조건 스크리닝을위한 positive control 탐색 방사선에의한 stress fiber 관찰 IR 처리에의한 EndMT 의대표적현상으로 stress fiber 관찰. 세포의형태학적변화및크기변화관찰 방사선유도 EndMT 이미지분석알고리듬개발 약물처리에의한 a. 세포수의변화, b. 세포전체의크기분석, c. 핵크기의변화분석, d. actin 의형태적변환분석자동 3 차년도 방사선유도 EndMT 조절인자의유용성검증 구축된 High content screening 시스템을이용한 EndMT 조절선도약물의유용성확인 Compound 라이브러리스크리닝을통한 EndMT 억제제도출 방사선유도 EndMT 조절인자의유전자조작동물모델구축을통해 in vivo 유용성검증 (Tie2-Cre 마우스를이용한혈관내피세포특이적인유전자 knockdown 혹은 Knockout 모델이용 EC-p53 KD or KO EC-TGFR2 KD EC-p53KD;TGFbR2KD or EC-p53KO;TGFbR2KD 폐암세포주는자발적폐암동물모델로부터 Primary culture 를하여사용하였음 : 이는암세포의다양성과암줄기세포, tumor microenvironment 를보다효과적으로관찰할수있음 방사선조사방법에따른 EndMT 조절인자에의한방사선저항성조절한계규명 Screening 으로부터도출된 6 Hits 의폐암세포및혈관내피세포에의세포독성을확인 도출된 Hit 약물들의세포독성을방사선내성이높은페암세포주와혈관내피세포를이용하 방사선유도 EndMT 억제제도출 Selleck Libraries 를방사선유도 EndMT 세포모델에처리하여활성을보이는화합물선별 방사선유도 EndMT 조절인자타겟유전자조작동물모델을이용한폐암의방사선저항성조절기능검증. 방사선치료시나타나는종양혈관의 EndMT 는 pericyte 를 recruit 함으로써비정상적인종양혈관형성을유도함을증명하였음 (In vitro assay 에서도증명 ) 또한방사선에의한종양혈관의 EndMT 저해는방사선에의한종양혈관의파괴를증진 종양혈관 EndMT 조절을통해나타나는종양미세환경변화 (Tumor Hypoxia, Cancer stem cell 에미치는영향 ) EndMT 조절에의한방사선조사후저항성폐암의재성장과함께나타나는 tumor metastases 의조절 고선량단일방사선조사조건과분할방사선조사조건에따른 EndMT 조절인자의방사선저항성극복여부규명 Hits 의폐암세포및혈관내피세포에대한세포독성을확인 단일농도에서확실히방사선유도 EndMT 억제활성을보이는화합물선별 기능및 target 에따른 Hits 분류 H1299 세포를 384wall plate 에배양하여 34

36 EndMT 현상의임상적유용성분석방사선폐암치료환자의임상샘플에서 EndMT 현상규명 여확인 폐암세포주에서각각의 Hits 에대한 IC 50 값도출 스크리닝에서도출된 Hit 약물의방사선민감제로써의기능확인 여러종류의폐암세포주에 Hit 약물 IC 50 농도를전처리한후, 방사선을조사하여방사선에대한세포민감도변화를 HCS system 으로분석함 자발적폐암모델및 CT26 syngeneic tumor 모델의 in vivo 효능검증 임상샘플을이용한 EndMT 현상의임상적유용성분석 농도별약효평가테스트 (DRC) 실시 (10-points 이상의농도별테스트 ) 이미지분석법을통한세포독성및 IC 50 값도출 (3 번반복실험을통계처리함 ) 스크리닝에서도출된 Hits 약물의방사선민감제로써의기능확인 실험으로도출된 IC 50 농도의 Hit 약물을 H1299 세포에전처리한후, 10Gy 의방사선을처리함 48 시간후, 세포생존률을 HCS 기법으로측정함 선정된 Hit 중 4 개약물에대한 in vivo 효능평가 방사선폐암치료환자의임상샘플에서 EndMT 현상규명 연구결과 가. 자발적폐암 ( 비소세포암 ) 동물모델구축및종양조직내섬유화관찰 1) K-ras LSL-GLD/+ ;p53 fl/fl (KP) 마우스구축 I) 마우스는교배후 3주의임신기간을거쳐 5~8 마리의새끼를출산하며, 새끼마우스는 3~4주의수유기간과 4~5주의성장기간후교배가가능한성숙한마우스가됨. 즉, 한세대의성숙한마우스로부터다음세대의성숙한마우스를얻기까지 3개월의시간이소요됨. 따라서 B6.129S4-K-ras tm4tyj /J 마우스 ( 이하 K-ras 마우스 ) 와 B6.129P2-Trp53 tm1brn /J 마우스 ( 이하 p53 마우스 ) 로부터비소세포암실험에사용할수있는충분한개체수의 K-ras/p53 마우스를얻기까지최소 15개월이소요됨. 35

37 II) K-ras 마우스는한쪽대립유전자에만발암성 K-ras 유전자가삽입되어있으며, p53 마우스는양쪽대립유전자모두 loxp 서열이삽입되어있음. 첫번째교배에서두마우스로부터 50% 의비율로, 발암성 K-ras 유전자와 loxp 서열이한쪽대립유전자에만삽입되어있는 2~4 마리의이형접합체 (Heterozygote) F1 마우스를얻을수있음. III) 두번째교배에서두쌍의이형접합체 F1 마우스로부터 12.5% 의비율로, 발암성 K-ras 유전자가한쪽대립유전자에삽입되어있고 loxp 서열이양쪽대립유전자에삽입되어있는 3~6 마리의 K-ras/p53 마우스 (F2) 를얻을수있음. 36

38 IV) 세번째교배에서두세쌍의 K-ras/p53 마우스 (F2) 로부터 50% 의비율로평균 6~9 마리의 K-ras/p53 마우스 (F3) 를얻을수있음. 이 K-ras/p53 마우스를지속적으로교배하여다섯번째교배에서실험에사용할수있는평균 21~24마리의 K-ras/p53 마우스 (F6) 를얻을수있음. 2) K-ras LSL-GLD/+ ;p53 fl/fl (KP) 마우스의자발적폐암모델형성단계에따른종양조직내섬유화관련 1. Cre adenovirus injection Hematoxylin & Eosin staining : 핵은검푸른색으로세포질은분홍색으로염색됨 No Cre Cre, 6 주 Cre, 9 주 Cre, 13 주 호흡기를통해 K-ras/p53 마우스의폐에 Cre유전자가도입된아데노바이러스 (4x10 7 PFU) 를주입하여, 발암성 K-ras 유전자의발현및 p53 유전자의제거를통해 adenocarcinoma 생성을유도함. 아데노바이러스벡터를이용한 Cre 단백질발현유도후 6, 9, 13주의마우스폐에서 adenocarcinoma가생성및진행됨을확인할수있었음. 2. K-ras LSL-GLD/+ ;p53 fl/fl (KP) 마우스의 lung adenocarcinoma fibrosis 37

39 <Trichrome 염색 : Collagen 이청색으로염색됨 > Adenocarcinoma를유도한후 13주가경과된 K-ras LSL-GLD/+ ;p53 fl/fl (KP) 마우스의폐조직을얻어 trichrome 염색으로종양조직내콜라젠침착정도를관찰함. 종양조직내에 collagen ( 파란색 ) 이염색되는것을통해, 결절의크기가클수록종양내혈관중심의혈관내피세포층을따라콜라겐생성이증가하고있는것을볼수있음 나. 비소세포폐암동물모델에서종양혈관내피세포에서 EndMT 의역할규명유용성규명 1) EndMT 조절인자로발굴한 HSPB1 저해로유도된비소세포폐암의 CAF 및종양섬유화유도 혈관내피세포마커인 CD31과간엽세포마커인 αsma의 co-localization 은방사선에의한혈관내피세포의간엽세포로의전이 (EndMT) 를나타냄. 38

40 자발적비소세포암동물모델에서 HSPb1 에의한 혈관내피세포의간엽세포로의전이 (EndMT) 를확인 그림설명 ) (A) 자발적비소세포암동물모델인 K-ras LSL-GLD/+ ;p53 fl/fl (KP) 마우스의폐에 Ade-Cre를감염시켜 adenocarcinoma를유도. 마우스폐를적출하여 HSPb1을면역화학염색을통해확인한결과 adenocarcinoma가유도된부분에서 HSPb1의발현이증가하는것을확인함. (B) shhspb1(shrna :small hairpin RNA) 과 shcontrol을이용하여 WT과 HSPb1 단백질이결핍된자발적비소세포암모델을제작. HSPb1이결핍된마우스폐에서 WT과비교했을때종양의크기가증가한것을확인. H&E 염색을통해서도종양이더넓게분포된것을확인함. (C) HSPb1이결핍된마우스폐종양과 WT을혈관내피세포마커 CD31과 HSPb1을면역형광염색을통해확인한결과 WT 에비해 CD31의발현이감소한것을확인함.(D) HSPb1이결핍된마우스폐종양과 WT을 HSPb1과 TGFb1,FSP1을면역화학염색을통해확인하고콜라겐침착정도를 Trichrome염색을통해확인한결과 WT에비해 HSPb1의발현은감소하였고콜라겐침착, TGFb1과 FSP1의발현은증가한것을확인함. Adenocarcinoma가형성되는과정에서 HSP25의발현수준을감소시키면, 혈관내피세포의간엽세포로의전이현상과함께섬유화및종양형성이심화되는것을확인함. HSP25발현감소로인해간엽세포로전이된혈관내피세포가 cancer associated fibroblasts (CAFs) 로작용하여종양조직의섬유화를증가시키고종양형성을증가시키는것으로보임. 39

41 2) 사람폐암조직내의종양혈관내피세포에서 HSPB1 의발현 그림설명 ) 사람폐암조직의종양혈관내피세포에서도 HSPB1이발현되는지알아보기위해사람폐암조직 array (40 tissues) 를 HSPB1에대한항체로염색함 ( 짙은갈색 ). 그결과, 소세포암 ( small cell carcinoma), 대세포암 (large cell carcinoma), 편평세포암 (squamous cell carcinoma), 및 adenocarcinoma ( 선암 ) 의종양혈관내피세포에서 HSPB1이발현되는것을관찰함 ( 짙은갈색 ). 사람폐암조직의종양혈관내피세포에서 HSPB1 이발현되는것은일반적인특징으로보여짐. 40

42 3) 사람폐암조직의종양혈관내피세포에서 HSPB1 의존성혈관내피세포의간엽세포로의전이 (EndMT) 그림설명 ) 사람폐암조직의종양혈관내피세포에서발현되는 HSPB1이혈관내피세포의간엽세포로의전이 (EndMT) 현상과관련이있는지알아보기위해, 사람폐암조직 array (50 tiusses) 를 HSPB1 (White), 혈관내피세포마커인 CD31 (Green), 간엽세포마커인 α-sma (Red), 그리고핵염색제인 DAPI (Blue) 로형광염색함. 그결과, α-sma 발현없이 HSPB1을발현하는혈관내피세포 (α-sma-, HSPB1+, CD31+) 는섬유화된부위보다섬유화되지않은부위에서많이분포하였음. 또한, HSPB1 발현이없는혈관내피세포 (HSPB1- CD31+) 는대부분 α-sma를발현하고있었으며 (HSPB1-, α-sma+, CD31+ ;EndMT가일어났음을시사 ), HSPB1과 CD31을발현하지않고 α-sma를발현하는혈관 (α-sma+, HSPB1-, CD31-) 은섬유화된부위에서주로관찰되었음. 사람폐암조직에서섬유화가많이진행된부위에는혈관내피세포의간엽세포로의전이가많이일어나있으며이와함께 HSPB1의발현이감소되어있는것을알수있음. 사람폐암조직의종양혈관내피세포에서 HSPB1 발현이사라지는현상이혈관내피세포의간엽세포로의전이현상및종양조직의섬유화와연관되어있음을시사함. 41

43 * 관련논문 ) 최서현, 남재경, 김부여, 장준호, 진영배, 이해준, 박승우, 지영훈, 조재호, 이윤진 ( 교신저자 ) (Cancer Res. 2016; 76(5): , HSPB1 inhibits the endothelial-to-mesenchymal transition to suppress pulmonary fibrosis and lung tumorigenesis) 다. 방사선에의한종양혈관내피세포에서 EndMT 현상규명및이를타겟으로하는임상단계 진입한약물선정과 in vivo 유효성검증 in vivo에서방사선치료효과는방사선조사시종양크기에따라많은차이를나타냄. LLC (lewis lung carcinoma cell) tumor는 mm 3 일때방사선조사만으로는종양의성장이유의하게저해되지않았으므로, 방사선저항성을타겟으로하는약물의효능을보기에적합한조건이라판단. EndMT와관련한 mechanism을타겟으로 TGF-β 관련 signal을저해하는임상연구단계에들어가있는약물을선정. 혈관내피세포에서방사선에의한변이현상을억제하는약물 (LY , Pirfenidone) 을선정하여, 방사선치료효율증진효과를관찰함. 특히, 방사선병용치료에사용되고있는종양혈관타겟팅 Sunitinib는 Pirfenidone과함께병용처리하였을때유의성있는방사선종양치료효과를보였음 ( 아래 1~3까지구체적실험결과 ) 1) 방사선조사에의한종양혈관내피세포의형태및 VEGF 유도성증식활성변화 42

44 그림설명 ) 방사선조사에의한종양혈관내피세포의형태변화를관찰하기위해 2H11 세포주에 0, 5, 10, 20Gy를조사하고 1, 2, 3일이경과된후 MTT assay를이용하여세포증식을관찰함. 10Gy 방사선조사후 3일이경과되었을때 50% 이상의세포가사멸한것을관찰하였으며 ( 그림왼쪽 ), 5Gy, 10Gy 방사선조사후 2일, 3일이경과되었을때길거나날씬하거나혹은편평한모양의불규칙한형태로변화된것을관찰함 ( 그림오른쪽 ). 그림설명 ) 방사선을조사받은종양혈관내피세포의 VEGF 반응성을알아보기위해방사선조사후 10일이경과된 2H11 세포주에 VEGF를첨가하여 3일간배양한후 MTT assay를이용하여세포증식을관찰함. 방사선을조사받은종양혈관내피세포는 10일이경과된후에도세포증식활성이남아있으나, VEGF에의한세포증식활성은보이지않는것을관찰함. 방사선조사를받은후증식하는종양혈관내피세포는변이과정을거쳐 VEGF에의존적인혈관내피세포의성격을잃는것으로판단됨. 2) 방사선조사에의한종양혈관내피세포의섬유세포로의특징변화 43

45 그림설명 ) 방사선조사에의한종양혈관내피세포의형태변화를관찰하기위해 2H11 세포주에 10Gy를조사하고 1, 2, 3, 4일이경과된후세포의용해물을얻어웨스턴블랏을통해 TGF beta 신호전달및간엽세포와관련된단백질마커의발현변화를관찰하고, RT-PCR을통해 Collagen 의발현변화를관찰함. 방사선을조사받은혈관내피세포는 ALK5의발현과함께하위신호전달분자인 SMAD2/3의인산화가증가하였으며, 간엽세포로의전이와관련된전사인자인 Twist1과 Snail1의발현이증가하였음 ( 그림왼쪽 ). 또한, Type I collagen의발현이증가한것을관찰함 ( 그림오른쪽 ). 이러한결과는방사선을조사받은종양혈관내피세포가섬유세포의특징을갖는세포로변화함을보여줌. 그림설명 ) 섬유세포의특징을획득한종양혈관내피세포가섬유세포와마찬가지로 TGF-β와같은사이토카인을분비하지알아보기위해, 2H11 세포주에 5, 10Gy를조사한후 0, 1, 3, 7, 10일에서세포배양액을얻어 ELISA를통해 TGF-β1의분비량을측정함. 그결과방사선을조사받은종양혈관내피세포는조사후시간이경과함에따라 TGF-β1의분비량이증가하였으며, 방사선조사량이증가함에따라분비량도증가하는것을확인함. 3) Sunitinib malate 와방사선의병합치료에서 Pirfenidone 의병행에의한치료효율증가 방사선을조사받은혈관내피세포는 VEGF에대한활성을보이지않으므로 VEGF를타켓으로하는약물과방사선의병합치료에는한계가있을것으로사료됨. 또한, 방사선을조사받은혈관내피세포는섬유세포로특징이변화되며 TGF-β의신호전달및 type I collagen 발현이증가되어있으므로이를타겟으로하는약물이방사선치료의효율을증가시킬것이라예상됨. 이를알아보고자 VEGF에의한혈관신생을타겟으로하는 Sunitinib malate와, TGF-β 유도성 collagen 발현을타겟으로하는 Pirfenidone, 그리고방사선의병합치료효율을알아보는동물실험을진행함. 그림설명 )C57BL/6 마우스에자가유래인 LLC 폐암세포주를다리에이식하고종양크기가 mm 3 에도달하였을때 6Gy의방사선을조사함. Sunitinib malate는방사선조사 1시간 44

46 전부터처리하여 2일간격으로처리하고, Pirenidone은방사선조사 1일후 3일간매일처리한후 5일부터 2일간격으로처리하였음. 방사선조사후매일종양의크기를측정하고 10일에서종양조직을얻어조직염색으로분석함. 그림설명 ) 종양크기가 mm 3 일때방사선조사만으로는종양의성장이저해되지않았으나, 혈관신생을저해하는 Sunitinib malate나 TGF-β 유도성 Collagen 합성을저해하는 Pirfenidone을함께처리하였을때종양의성장이저해되는것을관찰하였음. 이러한현상은 Sunitinib malate와 Pirfenidone을함께처리하였을때더욱뚜렷하고유의성있게관찰됨. Sunitinib malate와방사선의병합치료에서 Pirfenidone의병행에의한콜라젠침착저해및종양미세혈관분포감소함. 그림설명 ) 방사선과 Pirfenidone의병합치료효과를관찰하기위해방사선조사후 10일이경과된종양조직을얻어 Trichrome 염색을수행하고콜라젠침착정도 ( 파란색염색 ) 를관찰함. 그결과, 방사선과 Sunitinib malate의병합치료조건보다이에 Pirfenidone을추가로처리한조건에서콜라젠침착이뚜렷이감소되는것을확인함. 45

47 그림설명 ) 방사선과 Pirfenidone의병합치료에의한종양내미세혈관분포변화를관찰하기위해, 방사선조사후 10일이경과된종양조직을얻어혈관내피세포마커인 CD31로조직염색을수행함 ( 짙은갈색 ). 종양내미세혈관분포는방사선을조사한종양에서약간증가하였으며, Sunitinib malate 처리시약한감소를보임. 이에비하여 Sunitinib malate와함께 Pirfenidone 을추가로처리하였을때종양내미세혈관분포가현저히감소된것을관찰함. VEGF에의한혈관신생을타겟으로하는 Sunitinib malate와방사선의병합치료에서, TGF-β 유도성 collagen 발현을타겟으로하는 Pirfenidone에의해종양의방사선민감도가증가하는것을확인함. 방사선에의해특성이변형된혈관내피세포를타겟으로하는약물이방사선을이용한종양치료의효율을증대시키는것을알수있음. * 관련논문 ) 최서현, 남재경, 장준호, 이해준, 이윤진 ( 교신저자 ) (Biochem Biophys Res Commun. 2015; 462(2):138-43, Pirfenidone enhances the efficacy of combined radiation and sunitinib therapy) [ 선정약물의최근 Clinical Trial 정보 ] Pirfenidone : TGFβ, TGFβ-induced collagen production inhibitor, TNF, IL-1β 합성저해 46

48 Galunisertib (LY ) : TGFβ receptor I inhibitors 방사선치료효율증진에효과를나타내는 Pirfenidone은방사선폐암치료의부작용으로잘나타나는 radiation-induced pneumonitis 에도꾸준히임상시험이진행되고있으므로, 방사선치료효율증진물질로서다양한조건에서심화연구될필요가있음. 라. 방사선종양저항성에관여하는방사선유도종양혈관내피세포의 EndMT 현상과혈관내피세포특이적유전자조작동물모델을통한방사선유도 EndMT 기능규명 1) 방사선치료후종양재성장에서나타나는 Smooth Muscle Actin (αsma+) Vasculature 47

49 그림설명 ) 방사선치료후재발하는종양의혈관에서 Smooth Muscle Actin (αsma+) 의발현이나타나는것을확인하기위해 Balb/C 마우스에결장암세포 CT26을다리에이식하여종양모델을형성. (A) 방사선조사후종양의성장을분석한결과, 10일까지는종양의크기가감소하였으나이후에는종양의재성장이나타나는것을확인. (B) 방사선조사를하지않은 WT 마우스와방사선조사후 6일, 16일후에종양을적출하여 Trichrome 염색을통해콜라겐침착정도를분석한결과, WT에비해재성장한종양에서증가하는것을확인. 종양의혈관의변화를혈관내피세포의마커인 CD31을면역조직화학염색으로확인한결과, WT에비해재성장이나타난종양에서 CD31- positive 혈관이증가하는것을확인. (C) CD31과간엽세포마커인 αsma의 co-localization ( 노란색 ) 은방사선에의한혈관내피세포의간엽세포로의전이 (EndMT) 를나타냄. EndMT는 WT에비해재성장한종양에서증가하는것을확인. 2) 혈관내피세포특이적유전자조작마우스를이용한연구 (GEMM, Genetically engineered mouse models) 그림설명 ) 자발적비소세포암동물모델인 K-ras LSL-GLD/+ ;p53 fl/fl (KP) 마우스의폐에 Ade-Cre를감염시켜 adenocarcinoma를유도한후분리하여 KP 종양세포를생산. 혈관내피세포의 p53단백질이종양에주는영향을알아보기위하여 Tie2-CRE마우스와 p53 fl/fl 마우스를교배하여이중형질전환마우스를얻음. 이렇게얻은마우스의 p53의유전자중하나는야생형 (Wild type) 대립유전자이고하나는 p53 유전자의 exon 2-10 주변에 loxp 서열이삽입된도입유전자. 혈관내피세포의 Tie2 promoter 활성에의해발현된 CRE 단백질이 loxp서열사이에재조합을일으켜 p53의 exon 2-10이제거되어 p53의발현이저해됨. 이렇게생산된마우스를 EC-p53KD로표시하고 Knock Down 마우스모델이라함. 이마우스와 p53 fl/fl 마우스를교배하여마우스의모든 p53 유전자 exon 2-10주변에 loxp 서열이삽입된마우스모델을얻고이마우스를 EC-p53KO로표시하고 Knock Out 마우스모델이라함. 이렇게얻은혈관내피세포특이적 p53유전자의발현이저해된마우스에 KP 종양세포를다리에이식하여종양모델을형성. KP 종양세포는 Primaty culture 후 4~6 passage 이하로만사용. 종양세포의 cancer stem cells 의 populations, 종양미세환경을구현하기위하여선택하였음. 48

50 3) 혈관내피세포특이적 p53 제거는방사선조사후종양의재성장저해 그림설명 ) 방사선치료후혈관내피세포의 p53 단백질이종양의재성장에주는영향을확인하기위해야생형마우스 (Wild type : WT), EC-p53KD 마우스, 그리고 EC-p53KO 마우스에 KP 종양세포를다리에이식하여종양모델을형성함. (A) WT 마우스, EC-p53KD 마우스, 그리고 EC-p53KO 마우스의종양은방사선치료전까지성장속도는유의성있는차이를나타내지않은것을통해 KP 종양의성장에 p53이영향을주지않는것을확인함. (B and C) WT 마우스, EC-p53KD 마우스그리고 EC-p53KO 마우스의종양에방사선조사 (20Gy) 후종양의성장을비교한결과, WT에비해 EC-p53KD 마우스의종양성장이감소하는것을알수있었고, EC-p53KO 마우스의종양성장이더크게감소하는것을확인함.(D) 방사선조사전혹은, 조사후 WT 마우스, EC-p53KD 마우스, 그리고 EC-p53KO 마우스에서적출한종양조직으로면역화학염색을시행한결과, 혈관내피세포마커인 CD31의차이를확인해본결과, WT에서는방사선조사후 CD31 density 증가를나타내었고, 또한혈관의 diameter도증가한것을확인할수있는반면, EC-p53KO 마우스에서는차이가없는것을확인함.(E) Trichrome 염색을통해종양의콜라겐침착정도를확인한결과, WT에서방사선조사후콜라겐침착정도가증가하는것을확인할수있지만 EC-p53KD 마우스와 EC-p53KO 마우스에서는차이가없는것을확인함. 49

51 4) 혈관내피세포특이적 p53 의제거는방사선조사후종양의 EndMT 현상억제 그림설명 ) 혈관내피세포의 p53 제거가이방사선에의해유도되는종양의혈관내피세포의간엽세포로의전이 (EndMT, colocalization of CD31 and αsma) 에미치는영향을확인함. (A) 방사선조사를하지않은조직과방사선조사후 23일이경과한조직에혈관내피세포마커 CD31과간엽세포마커인 α-sma를면역형광염색을수행하여 WT 마우스와 EC-p53KO 마우스의혈관내피세포의간엽세포로의전이를확인. EC-p53KO 마우스종양의주변주와중심부분에서방사선조사후에혈관내피세로의간엽세포로의전이 (EndMT) 의차이가없는것을확인함. WT 종양의주변부와중심부분에서방사선조사후를확인해본결과, 방사선조사전종양에비해방사선조사후에혈관내피세로의간엽세포로의전이 (EndMT) 가유의성있게증가함을관찰.(B) 마우스종양모델에서방사선조사 23일후의조직뿐만아니라 3일후의조직에서도방사선에의한종양혈관내피세포의간엽세포로의전이 (EndMT) 가나타나며, 혈관내피세포의 p53제거에의해감소하는것을확인. Pericyte는혈관형성에영향을주는것으로알려진혈관내피세포주위를감싸고있는결합조직성세포임. 방사선조사 3일후의조직에서혈관내피세포의마커 CD31과간엽세포마커 α-sma, pericyte의마커인 NG2를면역형광염색을수행한결과, 혈관내피세로의간엽세포로의전이 (EndMT) 가보이는혈관에발현됨을확인함. 방사선조사후종양재성장시 EndMT 현상은종양의재성장과비례하여나타나며, 이는 Pericyte 의 recruit를유도함을알수있음. 또한혈관내피세포특이적 p53은방사선 EndMT를조절하는주요인자이며, EndMT 저해시방사선조사후나타나는비정상적인혈관형성및 pericyte recruitment가저해되며종양재성장도저해됨을알수있었음. 50

52 5) 방사선조사후나타나는종양의 EndMT 관련혈관내피세포의특성 그림설명 ) 방사선조사후재성장하는종양의혈관에서혈관내피세포의간엽세포로의전이 (EndMT) 특성을확인. (A) 방사선조사를하지않은종양조직과방사선조사후 23일이경과한종양조직에혈관내피세포마커 CD31와, 간엽세포마커 α-sma, 세포증식마커 Ki67을면역형광염색수행한결과 EndMT 수행중인혈관내피세포는세포증식마커인 Ki67 발현이증가하는것을관찰할수있었음. (B) FITC-Dextran70을마우스종양적출 30분전에마우스의꼬리정맥에 i.v. 를수행. 방사선조사후혈관손상에의해 FITC-Dextran70의종양조직으로의혈관투과성이증가되며, EC-p53KO 마우스의종양조직에선 WT마우스의종양보다방사선에의한혈관손상을증가시켜 Dextran70의 intratumoral leakage가증가됨을알수있었음. (C) 방사선에의해유도된혈관손상에의해혈관폐쇄현상을확인. Hoechst 33342를마우스종양적출 30분전에마우스의꼬리정맥에 i.v. 를수행. 그결과방사선조사후 EC-p53KO 마우스의종양에비해 WT마우스의종양조직에서혈관내피세포의간엽세로포의전이가나타난부분주변으로 Hoechst 33342가 positive 하게나타남을확인함. 방사선조사에의한 EndMT의특성을규명 : EndMT가진행중인 vessel은 proliferation이활발히일어나며, 방사선에의한종양혈관손상의저항성을나타냄. EC-p53KO 마우스의방사선에의한 EndMT 현상저해는 vessel proliferation 감소및방사선혈관손상저항성감소에따른 vascular distruption의효과를가져올수있었음. 51

53 6) 방사선유도 EndMT 조절에의한종양미세환경의변화 CD44V6 : a Marker of Cancer Stem Cell 그림설명 ) CD44v6는줄기세포마커인 CD44의변이형으로 pre-mrna에서단백질로번역되는과정에서 alternativesplicing ( 선택적이어맞추기 ) 에의해 N-terminaldomain의 exon1-5와 Cytolpasmic domain의 exon 사이에 exon 6가삽입된형태. CD44v6는종양의줄기세포 (Cancer Stem Cells : CSCs) 마커이고, 다른장기로의전이를유도한다고최근보고되고있음. 52

54 그림설명 ) EC-p53KO 마우스에의한방사선조사 (20Gy) 후종양의미세환경변화를확인함. (A) WT 마우스의종양조직과 EC-p53KO 마우스의종양조직에서방사선조사후종양줄기세포마커인 CD44v6를면역화학염색을수행한결과, 방사선조사한 WT에비해 EC-p53KO 마우스종양조직에서 CD44v6의발현이감소하는것을확인. (B) Neoadjuvant radiotherapy를수행한후 surgery 를통해얻은임상폐암조직에서 CD44v6의발현을면역형광염색을통해확인한결과, 방사선치료후의남아있는 tumoral region에서 CD44v6의발현이 radiotherapy를수행하지않은폐암환자의조직과비교시발현률이현저히높은것을확인하였음. (C) 종양의괴사부분과저산소영역에대한관찰한결과 EC-p53KO 마우스의종양에서 WT 마우스대비, 방사선에의한괴사부분 (Necrotic region) 이증가한것을확인하였고, 이는방사선조사에의한혈관내피세포 (CD31) 의손상증가에의한것으로, WT 마우스에비해훨씬 severe한저산소영역 (Pimonidazol positive region) 을가져옴. (D) 방사선을조사한 WT 마우스의종양과 EC-p53KO 마우스종양에서저산소증마커 Pimonidazol과세포증식마커 Ki67, 종양줄기세포마커 CD44v6를면역형광염색으로확인한결과, 방사선조사한 WT 마우스에비해 EC-p53KO 마우스에서저산소증부위가증가하는것을확인함. Severe한저산소증부위에존재하는 CD44v6-positive cells은 Ki67에 non-positive함을관찰. Mild한저산소영역의 CD44v6-positive세포는 Ki67에 positive한경향을나타냄. 방사선조사후 CD44v6에 positive한종양세포의증가를 in vivo 및임상샘플에서확인할수있었으며, 방사선에의한종양혈관의 EndMT 제어에의한종양의 Necrotic region 및저산소증조절은 CD44v6-positive cells의 proliferation에영향을미침을확인하였음. 7) 혈관내피세포특이적 p53 의제거는방사선유도 CD44v6 + 종양세포의전이제어 그림설명 ) EC-p53KO 마우스종양에방사선조사 (20Gy) 후 CD44v6-positive 종양세포의전이제어확인. (A) WT 마우스와 EC-p53KO 마우스의다리종양에방사선조사후 23일후폐에서종양전이결절을확인. 그결과 WT과비교해 EC-p53KO 마우스의폐에서전이암결절의수가감소한것을확인하고 H&E 염색을통해서도 WT과비교해 EC-p53KO 마우스에서전이가저해된것을확인함. (B) WT 종양에방사선조사를하지않은마우스와조사한마우스의폐를면역형광염색을통해종양줄기세포마커인CD44v6와 KP 종양세포마커로 RasN17을같이염색하여확인한결과, 방사선조사를받은 WT 마우스의전이가일어난폐부분에서 CD44v6의 population이현저히높은것을확인함. 53

55 방사선조사후나타나는 CD44v6-positive 종양세포의증가는방사선치료후전이암의주요 population 임을확인하였으며, 방사선에의한 EndMT 조절은 CD44v6-positive 종양세포의전이능 을조절할수있음을보여줌. 8) 방사선유도 EndMT 조절인자및 EndMT 조절에의한 abnormal pericyte recruitment 조절능검증 (in vitro) 그림설명 ) 방사선에의한혈관내피세포의간엽세포로의전이 (EndMT) 현상은비정상적인 Pericyte의 recruitment를유도. (A) HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cell) 에서 sirna (smallinterfering RNA) 를이용하여 p53단백질의발현을감소시킨 si-p53과 si-control에서방사선조사후혈관내피세포의간엽세포로의전이 (EndMT) 확인. 면역형광염색을통해 F-actin에서발현하는팔로이딘 (Phalliodin, 간엽세포전이시나타나는 cytoskeleton filament 형성을확인하기위해사용함. 혈관내피세포마커 CD31과 p53을확인한결과 si-p53에서 sirna 에의해 p53 단백질발현이감소하였고, 방사선조사에의한팔로이딘발현도감소한것에반해 CD31의발현은증가한것을확인. Western blot을통해확인한결과 p53단백질발현감소에의해방사선에의한간엽세포마커인 α-sma와 Vimentin의발현감소, 혈관내피세포마커인 CD31 의발현은증가됨을확인함. (B) HUVEC에서 sirna를이용하여 TGFbR2단백질의발현을감소시킨 si-tgfbr2와 si-control에서방사선조사 (10Gy) 후혈관내피세포의간엽세포로의전이 (EndMT) 확인. 면역형광염색을통해팔로이딘 (Phalliodin), CD31과 p53을확인한결과 si-tgfbr2에서 sirna에의해 TGFbR2단백질발현이감소하였고방사선조사에의한팔로이딘발현은증가한것을확인함. Western blot을통해확인한결과 TGFbR2 단백질발현감소에의해간엽세포마커인 α-sma와 Vimentin의발현이증가한것에반해혈관내피세포 CD31의발현은감소됨을확인함. (C) HUVEC에서 sirna를이용하여 TGFbR2단백질과 p53단백질의발현을감소시킨 si-tgfbr2와 si-p53, si-control에서방사선조사후 pericyte의 recruitment를 tube formation assay를통해확인함. si-tgfbr2와 si-p53, si-control에방사선을조사한세포와조사하지않은세포를 54

56 Matrigel에분주한후 tube가형성되는것을확인후 pericyte를분주하여변화를관찰한결과 3가지의세포모두에서방사선조사하지않은데비해방사선조사된세포의 tube 형성이비정상적인것을확인함. 반면에 pericyte의분주는방사선조사후방사선에의해저해되는혈관내피세포의 tube 형성을회복시키는것을확인하였고, si-tgfbr2에서는 pericyte의과다한 recruitment를관찰할수있었으며, 그에따른 tube formation도증가되는것을알수있었음. 방사선에의한혈관내피세포의 EndMT 현상은비정상적인 pericyte의 recruitment를유도하며, 이는방사선조사후종양의재성장시나타나는과도한혈관형성에기여함을제안할수있음. 9) 혈관내피세포특이적 Tgfbr2제거는방사선조사후종양의재성장, EndMT 현상및폐암전이를증가시킴 그림설명 ) 혈관특이적 TGFbR2 제거가방사선조사후종양의혈관내피세로의간엽세포로의전이 (EndMT) 와성장, 전이에미치는영향을확인함. (A) 혈관내피세포의 TGFbR2가종양에주는영향을알아보기위하여 Tie2-CRE마우스의 TGFbR2 fl/fl 마우스를교배하여혈관특이적 conditional Knockdown 마우스를얻음. 이렇게얻은마우스의 TGFbR2의유전자중하나는야생형 (Wild type) 대립유전자이고하나는 TGFbR2유전자의 exon 4 주변에 loxp 서열이삽입된도입유전자. 혈관내피세포의 Tie2 promoter 활성에의해발현된 CRE 단백질이 loxp 서열사이에재조합을일으켜 TGFbR2의 exon 4가제거되어 TGFbR2의발현이저해됨. 이렇게생산된마우스를 EC-TGFbR2KD 마우스로표시하고 Knock Down 마우스모델이라함. 이렇게얻은 TGFbR2 유전자의발현이저해된마우스에 KP 종양세포를다리에이식하여종양모델을형성.(B) WT 마우스와 EC-TGFbR2KD 마우스종양의방사선치료전까지성장속도를비교한결과유의성이없는것을통해종양의성장에 TGFbR2 제거가영향을주지않는것을확인함. (C and D) WT 마우스와 EC-TGFbR2KD 마우스의종양에방사선조사후종양의성장을비교한결과, WT 마우스에비해 EC-TGFbR2KD 마우스의종양이성장함을확인함. (E) WT 마우스, EC-TGFbR2KD 마우스에서적출한종양조직을면역화학염색을통해 TGFb1의차이를확인해본결과, WT에서는방사선조사후 TGFb1이증가하였지만 EC-TGFbR2KD 마우스에서는차이가없음을확인. (E) Trichrome 염색을통해종양의콜레겐침착 55

57 정도를확인한결과, WT에서방사선조사후콜라겐침착정도가증가하는것보다 EC-TGFbR2KD 마우스종양에서방사선조사후콜라겐침착이더증가한것을확인함. 그림설명 ) TGFbR2 단백질이방사선조사 (20Gy) 후종양의혈관내피세로의간엽세포로의전이 (EndMT) 와성장을확인함. (A) 방사선조사를하지않은조직과방사선조사 24일후얻은조직에서혈관내피세포마커 CD31과간엽세포마커인 α-sma를면역형광염색을수행함. WT 마우스와 EC-TGFbR2KD 마우스의종양에방사선조사후확인한결과, 방사선조사를수행하지않은종양에비해방사선조사를수행한조직에서혈관내피세로의간엽세포로의전이 (EndMT) 가크게증가함을관찰하였고, WT 마우스에비해 EC-TGFbR2KD 마우스종양에서 EndMT 현상이더증가되는것을확인함. 방사선조사후의조직에서혈관내피세포의마커 CD31과간엽세포마커 α-sma, pericyte의마커인 NG2의면역형광염색을수행한결과, WT 마우스와 EC-TGFbR2KD 마우스의혈관내피세포로의간엽세포로의전이 (EndMT) 부분에 pericyte의 recruitment를확인함. (B) 방사선에의한혈관손상정도를비교하기위해 Dextran70을이용. FITC-Dextran70을마우스종양적출 30분전, 마우스의꼬리정맥에 i.v. 를수행. 그결과 WT 마우스와비교해 EC-TGFbR2KD 마우스종양에서방사선조사후 FITC-Dextran70의종양내 leakage 정도가감소함을확인함. (C) WT 마우스와 EC-TGFbR2KD 마우스의다리종양에방사선조사 24일후폐에서전이암결절을확인. 그결과 WT과비교해 EC-TGFbR2KD 마우스폐에서전이암결절의수가증가한것을확인함. (D) WT 종양에방사선조사를하지않은마우스와조사한마우스의폐를 H&E염색과면역형광염색을통해종양줄기세포마커인 CD44v6와 KP 종양세포마커 RasN17을확인해본결과방사선조사를받은 WT 마우스에비해 EC-TGFbR2KD 마우스의폐전이암에서 CD44v6의 population이현저히높은것을확인함 방사선에의한 EndMT 현상을저해하던 EC-p53KD 마우스또는 EC-p53KO 마우스의종양과는반대 56

58 로, EC-TGFbR2KD 마우스에서는방사선에의한종양혈관의 EndMT 현상이증가되며, 이에따라과도한종양혈관형성과함께방사선종양저항성이더강하게나타남. 이러한방사선에의한 EndMT 현상은방사선에의한 TGF 증가현상과일치하지않으며, 종양의콜라겐침착정도와는일치함. 또한종양혈관의 EndMT 현상증가와더불어방사선조사후폐전이암의정도가증가되며, 폐전이암에서 CD44v6 popluation은 60% 이상을차지함을알수있었음. 10) 혈관내피세포특이적인 p53 과 Tgfbr2 를 double deletion 시킨마우스모델에서혈관특이적 p53 제 거에의한방사선종양저항성극복확인 그림설명 ) (A) 혈관내피세포의 p53과 TGFbR2 유전자의발현을동시에저해시킨마우스를제작. Tie2-CRE마우스의 p53 fl/fl ;TGFbR2 fl/fl 마우스를교배하여이중형질전환마우스를얻음. 이렇게얻은마우스의 p53과 TGFbR2의각유전자중하나는야생형 (Wild type) 대립유전자이고하나는 p53과 TGFbR2 유전자에 loxp 서열이삽입된도입유전자. 혈관내피세포의 Tie2 promoter 활성에의해발현된 CRE 단백질이 loxp 서열사이에재조합을일으켜 p53과 TGFbR2의발현이저해됨. 이렇게생산된마우스를 EC-p53KD;TGFbR2KD로표시하고 Knock Down 마우스모델이라함. 이마우스와 p53 fl/fl 마우스를교배하여마우스의모든 p53 유전자 exon 2-10주변에 loxp 서열이삽입된마우스모델을얻고이마우스를 EC-p53KO;TGFbR2KD로표시하고 Knock Out 마우스모델이라 57

59 함. 이렇게얻은마우스에 KP 종양세포를다리에이식하여종양모델을형성. (B) WT 마우스와 EC-p53KD;TGFbR2KD 마우스, EC-p53KO;TGFbR2KD 마우스종양의방사선치료전까지성장속도를비교한결과유의성이없는것을확인.(C and D) WT 마우스와 EC-p53KD;TGFbR2KD 마우스, EC-p53KO;TGFbR2KD 마우스의종양에방사선조사 (20 Gy) 후종양의성장을비교한결과, WT 마우스에비해 EC-p53KD;TGFbR2KD 마우스와 EC-p53KO;TGFbR2KD 마우스의종양성장이저해되는것을확인. (E) WT 마우스, EC-p53KO;TGFbR2KD 마우스에서적출한종양조직을혈관내피세포마커 CD31과간엽세포마커 α-sma, pericyte 마커 NG2를면역형광염색을통해혈관내피세포의간엽세포로의전이 (EndMT) 와 pericyte를확인한결과 WT 마우스에비해 EC-p53KO;TGFbR2KD 마우스에서감소한것을확인함. (F) 혈관의손상을확인하기위해 Dextran70을이용. FITC-Dextran70을마우스종양적출 30분전에마우스의꼬리정맥에 i.v. 함. 그결과 WT과비교해 EC-p53KO;TGFbR2KD 마우스종양에서방사선조사후FITC-Dextran70의투과가높은것을확인. WT 마우스와 EC-p53KD;TGFbR2KD 마우스, EC-p53KO;TGFbR2KD 마우스의종양에방사선조사후폐전이암에서종양결절을확인. 그결과 WT 마우스와비교해 EC-p53KD;TGFbR2KD 마우스, EC-p53KO;TGFbR2KD 마우스폐에서결절의수가감소한것을확인. 방사선에의한혈관내피세포전이조절로방사선에의한종양저항성극복가능여부를 Double Knockout 마우스모델을통해확인함. 11) 방사선조사조건에따른혈관특이적 p53 발현저해에의한방사선저항성극복정도확인 58

60 그림설명 ) 분할방사선조사조건 (5Gy x 6times) 에서혈관내피세포특이적 p53제거에의한마우스의종양의방사선저항성 ( 종양의재성장과전이 ) 극복여부. (A) WT 마우스와 EC-p53KD 마우스의종양부분에 6일간 5Gy씩방사선조사를수행. 마지막조사 2일후와 21일후에마우스에서종양적출. (B and C) WT 마우스와 EC-p53KD 마우스의종양에분할방사선조사후종양의성장을비교한결과유의성이없는것을확인. (D) WT 마우스와 EC-p53KD 마우스의종양에방사선조사후폐에서종양결절을확인. 그결과 WT 마우스와비교해 EC-p53KD 마우스의폐에서결절의수를확인한결과유의성이없는것을확인. (E) 혈관의손상을확인하기위해 FITC-Dextran70을마우스종양적출 30분전에마우스의꼬리정맥에 i.v. 함. 그결과 WT과비교해 EC-p53KO 마우스종양에서방사선조사후 FITC-Dextran70의투과가높은것을확인. (F) WT 마우스와 EC-p53KD 마우스에서적출한종양조직을혈관내피세포마커 CD31과간엽세포마커 α-sma, pericyte 마커 NG2를면역형광염색을통해혈관내피세포의간엽세포로의전이 (EndMT) 와 pericyte recruitment를확인한결과 WT에비해 EC-p53KD 마우스에서감소한것을확인.(G) 분할방사선조사한마우스종양조직에 CD44v6와 Ki67을면역형광염색수행한결과 WT 마우스와 EC-p53KD 마우스에서 CD44v6 proliferation에는차이가없는것을확인. 또한저산소증을확인하는 Pimonidazol의 intensity도차이가없는것을확인함. 5Gy X 6 times 분할방사선조사조건에서는종양혈관내피세포의 EndMT 저해에의한방사선종양저항성극복효과가나타나지않았음. 이는 5Gy 분할방사선조사조건에서 20Gy와비교시, EndMT 조절에의한방사선에의한혈관파괴효과에비해, CD44v6 종양세포의증식률에는영향을미치지못함. 본연구를통해제안하는방사선치료후종양재성장에따른종양혈관내피세포의 EndMT 과정과종양혈관생성과정 방사선에의한종양혈관의 EndMT 진행은비정상적인 pericyte의 recruitment를가져옴. 이러한 EndMT 관련 vasculature는방사선치료후종양재성장및전이를증가시키며, 방사선에의해증가되는 CD44v6-positive 종양세포는방사선조사후재성장과더불어나타나는암전이세포의주요 population임을알수있었음. 따라서, 방사선에의한종양혈관의 EndMT 는방사선저항성극복을위한중요타겟임을제시함. 59

61 마. High content screening(hcs) 을위한시스템을이용하여방사선유도 EndMT 저해제도 출 1) 방사선유도 EndMT 억제제개발을위한최적의스크리닝조건확립및이미지분석시스템구축 방사선유도 EndMT 억제제개발을위한최적의스크리닝조건확립. 방사선처리는현저한세포크기증가를유발하기때문에, 384 well plate에적절한세포밀도를조사함. 500~2000 HUVEC cell/well 범위의세포밀도에서 700 HUVEC cell/well의 HTS/HCS를위한최적밀도로선정함. 방사선유도 EndMT 이미지분석시스템구축및검증 방사선유도 EndMT 억제를관찰하기위한 phenotypical 마커로서세포의형태학적인변화, stress fiber형성등을선정하고, 이를정량화할수있는이미지분석시스템을성공적으로구축함 [A]. 본분석시스템으로분석한경우, 방사선을처리한세포의크기가비처리군에비해상당히증가함을관찰할수있었으며, fiber의방향성의변화또한명확히계측됨 [B]. 방사선에의한 EndMT 현상분석시스템구축 60

62 A. 방사선유도 EndMT 이미지분석시스템 B. Opera High Content Imaging System 으로획득된이미지로부터 parameter 별패턴분석 방사선에의한 EndMT현상의세포이미지를분석한결과, 방사선비처리세포대비, 방사선에의한핵크기증가, 세포질크기증가, stress fiber의급격한변화를정량적으로비교가능함을확인하였음. 약물스크리닝에의한 EndMT 저해제도출시, 다음과같은기준으로약물을선정함 1. 방사선에의한핵크기증가저해약물 2. 방사선에의한세포크기증가저해약물 3. Stress fiber 증가저해약물 4. 세포수감소약물제외 ( 약물독성배제 ) 5. 폐암세포주의방사선치료효율증진효과를보이는약물 ( 방사선치료효율저감약물배제 ) 2) 방사선유도 EndMT 억제제개발을위한스크리닝시스템검증 HUVEC세포가 seeding 된 384 well plates에 0, 10Gy의방사선을처리한후, Opera High Content Imaging System으로획득된이미지로부터 epifluorescence 의양적인변화및패턴의변화를자동화시스템으로분석하였음. 각각의 well상의세포가균질하게방사선에노출되었는지를 HTS/HCS로확인함으로써 HCS 적용가능함을확인함. 세포의크기및핵의크기변화, stress fiber 형성을분석하여본스크리닝시스템의효율성을검증함. 10Gy의방사선이처리된 384 well plates에서균질하게세포전체의크기및핵의크기, stress fiber의증가를확인할수있었음 ( 그림 A-C). 61

63 방사선유도 EndMT 억제제개발을위한스크리닝시스템검증 HUVEC 세포가 seeding 된 384 well plates 에 0, 10Gy 의방사선을처리한후 A, Nuclei area B, cell area C, stress fiber 를 EndMT 이미지분석시스템으로분석함 62

64 3) Compound 라이브러리스크리닝을통한 EndMT 억제제도출 스크리닝을위한계획및 Compound 라이브러리선정 IR 처리조건 : 10Gy, 12시간전처리 Selleck Libraries를단일농도 (10uM) 로처리하여 72시간처리후, 활성을보이는화합물선별. Selleck Libraries는다양한 kinase inhibitors과 anticancer drugs로구성된 Libraries이기때문에본연구에적합할것으로사료되었으므로, 본스크리닝을위하여선정되었음. Compounds가처리된 plates를 4% formaldehyde로 30분간고정후, Alexa Fluor 488 Phalloidin과 hoechst 33342를함께염색함. Opera High Content Imaging System으로이미지획득후, IM software를이용하여분석함. 방사선유도 EndMT 억제제개발을위한스크리닝절차 4) Compound 라이브러리스크리닝을통한 EndMT 억제제도출 개발된약효검색실험법을실제로대용량초고속약효검색에적용하기위하여자동화장비에적용하여검증한후 2,000여개의화합물라이브러리에대한약효검색실험을수행함. 분석법및실험과정을검증하기위하여, non-ir 그룹과화합물용해제인 DMSO를 Control로하여약효검색을진행하였으며, 80% 이상의 EndMT 억제효과를보이면서 50% 이하의세포독성을보이는유효화합물을선별함. 약효검색실험의평가를위하여약효검색의정확도를 Z' 값으로확인한결과, 모든약효검색과정은 Z' 값이충분히신뢰할수있는범위를보임. 8개의후보 Hit compounds를선정하였으며, 그중최상의 2개 Hit compounds를도출하였음. 63

65 그림설명 ) 방사선유도 EndMT 억제제개발을위한 Compound 라이브러리스크리닝결과. HUVEC 세포가 seeding 된 384 well plates에 0, 10Gy의방사선을처리한후, Selleck Libraries를단일농도 (10uM) 로처리하여스크리닝을수행함. A, Nuclei count B. Nuclei area C, cell area D, stress fiber를 EndMT 이미지분석시스템으로분석함. 8개의일차 Hit compounds를선정하였으며, 그중최상의 2개 Hit compounds를도출하였음. 바. Screening 으로부터도출된 Hit compounds 의폐암세포에대한세포독성확인 1) 도출된 Hits 약물의방사선유도 EndMT 활성억제제로써의기능검증 Hits 약물에의한방사선유도 EndMT 억제를관찰하기위하여세포의형태학적인변화, stress fiber 형성및세포독성을단일농도처리에서관찰함. 선정된 6개의 small compounds는방사선에의한 HUVEC세포의형질전환을억제하였으며, 단일농도에서방사선민감도를증가시킴을확인함. 도출된 Hit 약물의방사선유도 EndMT 활성억제제로서의기능검증 기능및 target에따른 Hits 분류 Hits 약물에의한방사선유도 EndMT 억제기전연구를위하여, 각 Hit의기능을문헌조사함. Kinase 활성억제제로구성된 chemical library로스크리닝을진행하였기때문에, 도출된 Hit 의대부분은 tumorigenesis 과정에중요한역할을하는단백질이인산화및활성을억제하는약물이었음. 64

66 기능및 target 에따른 Hits 분류 2) H1299 세포와 HUVEC 세포에서의농도별약효평가테스트 (DRC) 실시 도출된 Hit 약물의농도별약효평가테스트 (DRC) 실시 H1299 ( 폐암세포주 ) 와 HUVEC ( 혈관내피세포주 ) 에서 10-points 이상의농도별테스트를시행함. 6개의 hits는모두단독처리에서항암효과가있었으며, 특히 CHIR-99021, Enzastaurin과 Methoxyestradiol은혈관내피세포보다폐암세포주의사멸을효과적으로유도함. 방사선과병용처리효과를관찰한결과, Enzastaurin, oxaliplatin, CHIR-99021과 Methoxyestradiol는페암세포주에서방사선민감도를향상시켰으나, 혈관내피세포주에서는방사선민감도를향상시키지못함을확인함. 이는 Hit약물이폐암세포에특이적으로방사선민감제로써작용하며, 한편으로는혈관내피세포의형질전환을억제함을시사함. 3) 폐암세포주와혈관내피세포주에서각각의 Hit 에대한 IC 50 값도출및방사선병용효과확인 H1299 ( 폐암세포주 ) 와 HUVEC ( 혈관내피세포주 ) 에서 Hit 약물단독의 IC 50 값과방사선을병용처 65

67 리했을경우, 시너지효과를 HCS 기법으로확인함. 폐암세포주및혈관내피세포주에서의 Hit 에대한 IC 50 값도출및방사선병용처리효과검증 각각의약물은 H1299 ( 폐암세포주 ) 와 HUVEC ( 혈관내피세포주 ) 에서서로다른반응성을나타내었음. 이중 CHIR-99021, Enzastaurin과 Methoxyestradiol은폐암세포에특이적으로민감한반응을일으킴을확인함. 본실험에서도출된 IC 50 값을활용하여 in vivo 에서의약물효능검증에적용함. 4) 스크리닝에서도출된 Hit 약물의방사선민감제로써의기능확인 이미지분석을통해 IC 50 농도 Hit 의방사선민감제및방사선유도 EndMT 억제제의기능확인. 이미지분석을통한방사선민감제및방사선유도 EndMT 억제제로서의기능확인 66

68 H1299세포와 HUVEC세포에 IC 50 농도의 HIT약물을방사선과병용처리한후, stress fiber의생성정도와세포사멸을분석하였음. CHIR-99021, Enzastaurin과 Methoxyestradiol은방사선에의한 H1299의사멸을극대화시켰으며, 방사선에의한 HUVEC세포의 stress fiber 형성및세포크기변화를최소화하였음. 방사선유도내피간엽이행은방사선내성에있어주요원인이기때문에, 본연구진은방사선유도내피간엽이행을억제하는약물개발을통하여방사선치료효율증진을목표로연구를진행하였음. 내피간엽이행을억제하는약물스크리닝을위해사람혈관내피세포 (HUVEC) 를이용한페노믹스크리닝모델을성공적으로구축하였고, 이모델을이용하여방사선유도내피간엽이행을감소시키는 3개의약물 (CHIR-99021, Enzastaurin과 Methoxyestradiol) 을최종적으로선별함. 5) 도출된 Hit 약물의방사선치료효율증진효과 in vivo 효능검증 KP 비소세포암세포종양이식동물모델에서방사선과선정된후보약물의방사선치료효율증진효과 2-Methoxyestradiol 처리에의한비소세포암의방사선치료효율증진효과검증 2-Methoxyestradiol(2-MeOE2) 은 tubulin polymerization 저해제로알려져있으나최근에는 HIF-1α 저해제로연구가되고있으며, in vitro 수준에서방사선에의한혈관내피세포변이저해물질로선정하였음. 2-MeOE2 투여및흉부방사선조사모식도 67

69 그림설명 ) 자발적비소세포암동물모델인 K-ras LSL-GLD/+ ;p53 fl/fl (KP) 마우스의폐에 Ade-Cre 를 감염시켜 adenocarcinoma 를유도하고, 6 주후마우스의복강에 2-Methoxyestradiol 투여및흉 부부위방사선을조사함. 방사선조사후 0, 5, 10, 20 일에서 FDG-PET 을이용하여종양의대사활성도를측정하고비소세 포암의반응성을확인하면서, 방사선조사후 1, 2개월이경과한마우스의폐암조직을얻어 H&E 염색으로분석함. FDG-PET 을이용한종양의대사활성도측정 그림설명 ) FDG-PET을이용하여종양의대사활성도를측정한결과 (SUVmax), 방사선조사단독처리조건에비해방사선과 2-MeOE2를함께처리하였을때 adenocarcinoma의대사활성도가뚜렷이저해되는것을관찰함. 2-MeOE2 투여에의한폐종양결절크기억제 그림설명 ) 방사선조사후 1, 2 개월이경과한마우스의폐암조직을얻어 H&E 염색으로분석한 68

70 결과, 방사선조사단독처리조건에비해방사선과 2-MeOE2를함께처리하였을때 adenocarcinoma의결절크기가뚜렷이감소하는것을관찰함. 2-MeOE2가비소세포암의방사선민감도를증가시킴. 2-MeOE2 투여에의한림프절종양전이억제 그림설명 ) Adenocarcinoma를유도한마우스의림프절에서종양전이를확인한결과, 방사선조사단독처리조건에비해방사선과 2-MeOE2를함께처리하였을때림프절로의전이가유의성있게억제됨을확인함. 2-MeOE2 투여에의한종양의성장억제 그림설명 ) 2-MeOE2의항암효과를확인하기위해 Balb/C 마우스에결장암세포 CT26을다리에이식하여종양모델을형성. 방사선조사후 2-MeOE2를주 3회복강내투여하고종양의성장을분석한결과, 방사선조사후종양의성장이방사선조사단독처리조건에비해방사선과 2-MeOE2를함께처리하였을때저해되는것을관찰함. 69

71 추진일정 연도 1 차년도 2 차년도 3 차년도 연구개발의내용 자발적비소세포폐암동물모델을이용한방사선저항성폐암및폐섬유화동물모델구축방사선조사에의한 EndMT 현상과방사선폐암저항성조건확립 in vitro 및 in vivo 동물모델에서방사선유도 EndMT 조절기전규명방사선유도 EndMT 조절인자발굴및 EndMT 조절인자의유용성확인방사선유도 EndMT 조절후보약물스크리닝시스템구축구축된 High c o n t e n t screening시스템을이용한 EndMT 조절후약물선정방사선유도 EndMT 조절인자의유용성검증 : 유전자조작동물모델을이용한검증구축된 High c o n t e n t screening시스템을이용한 EndMT 조절후약물선정과유용성확인 EndMT현상의임상적유용성및적용범위분석 추진일정 비고 70

72 연구개발추진전략 (1) 임상적유용성을갖는연구결과도출을위하여, 사람의폐암과가장유사한자발적동물모델시 스템을이용하고, 방사선조사및고선량소분할조사조건을다르게구축하여관찰, 방사선에의한 EndMT 조절의임상적유용성을규명. (2) 방사선유도 EndMT 타겟조절인자를발굴하여, EndMT 조절가능한혈관내피세포특이적유전자변형마우스를구축하여, EndMT 기전및기능을규명. (3) EndMT를조절할수있는후보약물리스트를구축하기위하여, High content screening 시스템 (Phenomic screening system) 을도입하고, multi-probe를이용하여살아있는세포로부터실시간약물에대한세포반응을관찰하여후보약물을선정함. 방사선치료효율증진약물개발의기존연구들에서는약물후보도출을위해서, 약물의세포내조절인자활성저해정도를분자생물학적방법으로스크리닝하여분석하였으나, 이는단편적인약물의효능을관찰하는정도에지나지않아, 약물의독성및동물모델에서의유효성이나타나지않는등의비효율적연구결과를가져오게되는경우가많음. 따라서, 본연구에서는방사선치료증진약물후보를효율적으로스크리닝하기위하여 High content screening(hcs) 의신약개발기술플랫폼을이용하고자함. 방사선에의한 EndMT 조절기전규명을기반으로, 분석모델을구축하고, 살아있는세포에서다양한조절인자의생물학적변화를실시간으로관찰, 이미지데이터의객관적인분석 tool을이용하여방사선에의한 EndMT 조절후보약물을도출하고자함. 71

73 신약물의개발에서 High content screening (HCS) 기법 in vivo와가장유사한세포환경을유지할수있는혈관내피세포의삼차원입체배양기술 (3D culture) 을 384 well plates에적용하여 3D culture와 αsma promoter-gfp 벡터시스템을도입하고, High content screening 기술을결합한모델을구축하고, High content screening 기법으로얻은 image를객관화하기위한 plug in을제작을함께진행하여, 이미지데이터를관찰자의주관적인견해가포함이되지않고객관적으로분석할수있도록각기다른조건의실험에적절한 plug in을제작함으로써신뢰도높은데이터를얻을수있도록함. 구축된 High content screening 시스템을이용한 EndMT 조절선도약물의유용성확인 72

74 연구개발의추진체계 73

75 4. 목표달성도및관련분야기여도 4-1. 목표달성도 코드번호 D-06 구분년도세부연구목표가중치평가의착안점및척도 1 차년도 차년도 2014 자발적폐암 ( 비소세포폐암 ) 동물모델구축 방사선저항성동물모델구축 방사선조사에의한 EndMT 현상과방사선저항성상관관계분석 in vitro 방사선유도 EndMT 조절기전규명 자발적폐암동물모델에서방사선조사에따른 EndMT 현상규명 규명된방사선유도 EndMT 조절기전을기반으로종양폐혈관내피세포에서 EndMT 조절인자발굴 EndMT 발현억제제개발을위한약효평가시스템확립및유효약물도출 40 % 자발적폐암동물모델및방사선조사조건에따른부작용동물모델구축 방사선에의한 EndMT 현상과방사선저항성및폐부작용간의상관관계분석 30 % 방사선에의한종양및정상폐혈관내피세포에서 EndMT 조절인자발굴을위한기전연구 30 % 40 % 30 % 30 % 자발적폐암동물모델에서 방사선조사에 따른 EndMT 현상규명 이에따른임상단계에들어가있는약 물중 스크리닝시스템에이용할 positive control 선정과 in vivo 효 증검증 ( 자발적폐암모델및 LLC (Lewis lung carcinoma) tumor model 이용. EndMT 조절인자의임상적유용성검증 : Human Lung cancer tissue array (90 tissues) 에서 EndMT 현상의유용성 검증 방사선유도 EndMT 조절후보약물스크 리닝시스템 (HCS) 구축과선도약물후 보발굴 최종평가 ( 단계평가 ) 2015 방사선유도 EndMT 조절인자의유용성검증 ( 유전자조작동물모델을이용한검증 ) 구축된 HCS 시스템을 이용한 EndMT 조절선 도약물의방사선치료효 율증진유용성확인 임상샘플을이용한 EndMT 현상분석및방사선조사조건에따른 EndMT 조절인자의유용성분석 40 % 50 % 10 % in vivo 에서방사선유도 EndMT 조절인자의유용성검증여부 1. 혈관세포특이적인유전자조작동물모델을통한방사선유도 EndMT조절효과규명 2. 방사선치료시 EndMT조절에의한종양미세환경의변화및방사선저항성조절효과규명 방사선폐암치료조건에 EndMT조절후보약물선정여부와 in vivo 유용성검증 1. HIT의폐암세포에대한세포독성확인 2. 6가지의 Hits약물효능을 2, 3차어세이를통하여방사선민감제및방사선유도 EndMT 억제제로써의기능을검증하고이에따라 Hit-Lead 단계에들어갈수있는최종 Hit을도출하였음 3. HIT의방사선민감제로써기능확인 4. 폐암세포주와혈관내피세포주에서각각의 Hit에대한 IC 50 값도출하여 in vivo 효능검증을위한적정농도를제시 74

76 임상샘플을이용한 EndMT 현상의임상적유용성분석및소선량방사선과저선량분할방사선조사조건에서의 EndMT타겟팅효과규명 4-2. 관련분야기여도 본과제수행중보고한방사선유도 EndMT관련연구결과의발표는 Clinical cancer research 의 cover article로도선정, 관련분야에대한연구의우월성을보여줌. 방사선내성극복기전을이해하는데중요한자료를제공할것으로사료됨. EndMT의활성조절기술을통해항암치료증진과부작용경감을위한새로운분자적타겟을제공함. 본연구를통해방사선치료효율증진을위한새로운 in vitro와 in vivo assay system 기술등이확보되어기초및응용연구자에공여되어국내방사선치료연구및항암제개발에기여함. 75

77 5. 연구결과의활용계획 연구개발결과의활용방안 코드번호 D-07 방사선에의한종양폐혈관의 EndMT 조절기전및약물의개발은방사선종양치료에국한되는것이아니라, 종양의진행및암전이등을조절할수있는항암치료제로활용할수있을것임. 방사선에의한정상폐혈관의 EndMT 조절기전은방사선유도폐섬유화치료에대한기반기술뿐아니라, 방사선에의한다른장기의손상치료로방사선부작용전반에걸쳐활용가능할것으로사료됨. 따라서, 방사선치료부작용제어제뿐아니라방사선피폭과같은국가비상사태에대한대책의일환으로방사선피폭보호제개발의기반기술로활용되어질수있음. 또한최근, EndMT의관여가보고되고있는다양한병변, 동맥경화, renal fibrosis, 심부전과관련된심장의섬유화, renal fibrosis 등의조직섬유화및만성폐고혈압, 급성또는만성의신장손상등의치료기술기반으로활용될것임. 기대성과 (1) 기술적측면 본연구진은최근방사선에의한 EndMT 현상발견및방사선에의한조직섬유화에 EndMT가관여한다는사실을세계최초로보고하였으며, 본연구에서진행하고자하는방사선유도 EndMT 조절기술은세계적수준의선도적연구개발과고부가가치산업으로의발전가능성을보여주고있음. 최근선진국을중심으로다양한질병에서의 EndMT 관련성이보고되고있으며, 아직초기연구단계이므로학문적성과뿐아니라, 기술적인면에서도국가경쟁력을갖출수있을것임. 방사선치료증진제개발을위한혈관내피세포타겟 Phenomic screening 시스템을이용한 High content screening 또한세계최초의시도이며, 이를통한약물개발의기반이갖춰진다면, 국내에미흡해있던신약물개발시장의활성화를가져올수있을것임. (2) 경제적 산업적측면 본연구에서는임상 ( 시험 ) 단계에진입한기존약물을중심으로 방사선에의한 EndMT 조절약물을발굴하여, 새로운의학용도발명을통한지적재산권확보및단기간내의경제적효과를창출하고자함. 최근방사선및항암치료병용약물로임상단계에진입한신생혈관억제제의 Avastin (Bevacizumab) 은 2011년 56억달러의매출액을기록 ( 하고있지만, 단독약물로서의효과는기대치에미치지못하고있고, 장기가감처리시종양성장인자를유도하거나, 종양에따른저항성등의부작용등을극복하기위한선진제약회사의활발한연구가진행중임. 본연구를기반으로종양혈관의변형에따른 EndMT의조절기전을고려한, 새로운종양혈관형성을타겟으로하는약물을개발하고, 새로운방사선병용치료요법제시한다면고부가가치의제약산업의발전을이끌수있을것임. 76

78 EndMT(Ethyol ) 조절약물을방사선에의한정상혈관손상보호기술은방사선치료부작용경감뿐아니라, 방사선사고에대비한생물학적대비책으로직접활용가능, 현재수입으로만의존하고있는방사선손상보호제인 Amifostine을대체하여국가적경제력을확보할수있을것임. 추가연구의필요성 본연구과제의주요성과인방사선저항성종양에서의혈관성장의새로운타겟기전및작용점규명을통해방사선에의한치료효율증진을위한새로운연구방향을도출하였음. 이러한새로운작용점을기반으로방사선치료효율증진후보약물을스크리닝한결과선정한 Hit 약물외에도의미있는결과의후보약물들이도출되었음. 도출된후보약물의임상적용및약물개발로의후속실용화연구과제가절실히필요한시점임. 또한유전자변형동물모델을이용한방사선저항성종양에서규명한새로운현상들에대한집중심화연구를통해, 그동안타연구에서접근하지못했던방사선치료효율증진을위한다방면의치료효율증진방안을제시할수있을것으로사료됨. 77

79 6. 연구과정에서수집한해외과학기술정보 1) Image-guided radiotherapy platform 구축 코드번호 D-08 본과제에서도구축하여사용중인 K-ras에의해유도되는자발적폐암모델은인간의페암에대한 Chemotherapy효과를제일잘묘사하고있는동물모델임. 그러나 Focal radiotherapy에대한연구를하기에, Lung tumor를유도하는 Cre adenovirus의 Intranasal주입은 Single nodule의생성이어려웠으나, intratracheal 주입방식으로 single tumor를형성시키고 (A), precise targeted irradiation이가능하게 Image-guided radiotherapy platform (B) 를구축함 (Nat Commun. 2014; 5:5870, Image-guided radiotherapy platform using single nodule conditional lung cancer mouse models). 78

80 2) 방사선치료시정상조직손상을고려한방사선민감제개발연구동향 방사선치료계획과조사방법의개선에도불구하고, 고선량방사선조사는특히정상조직의손상에대한두려움으로국부종양을제거하기위해제한으로적용한다. 그러나, 암세포만특이적으로방사선에대한민감도를증가시킬수있는약물을이용하면더적은방사선조사량으로암세포를제거하고정상조직의손상을줄일수있을것임 (Nat Rev Cancer. 2011; 11(4): , Strategies to improve radiotherapy with targeted drugs. Nat Rev Drug Discov. 2013; 12(7): , Strategies for optimizing the response of cancer and nor- mal tissues to radiation). 최근가능성있는방사선반응성조절타겟후보물질로 ATM이연구되고있음. ATM (Ataxia telangiectasia mutated) 은 DNA손상시 p53, CHK2, 그리고 KAP-1과같은단백질을인산화시킴으로써세포주기를조절하여 DNA 복구가일어날수있도록함. 모세혈관확장운동실조증 (Ataxia telangiectasia, A-T) 환자는유전적으로이 ATM 유전자가돌연변이되어있으며, 이환자로부터분리한세포는방사선에대해민감하다는것이관찰되었음 (Annu Rev Genet. 1979; 13: , Ataxia telangiectasia: an inherited human disorder involving hyper- sensitivity to ionizing radiation and related DNA-damaging chemicals). 이러한사실로부터방사선에대한민감도를증가시키기위해 ATM에대한저해제가개발되고있음 (Cancer Res. 2008; 68(18): , Transient inhibition of ATM kinase is sufficient to enhance cellular sensitivity to ionizing radiation. Cancer Res. 2004; 64(24): , Identification and characterization of a novel and specific inhibitor of the ataxia-telangiectasia mutated kinase ATM). 최근, 마우스의교아세포종 (glioblastoma) 모델에서 ATM 저해제와함께방사선치료를하였을때 p53( 종양억제유전자 ) 이없는교아세포종은방사선에의한민감도가더욱증가하며마우스의생존률이증가된다고보고되었음 (Clin Cancer Res. 2013; 19(12): , ATM kinase inhibition preferentially sensitizes p53-mutant glioma to ionizing radiation). 또한, 2014년최근에는정상조직의혈관내피세포는 ATM이제거되어도방사선에대한민감도에변화가없으나, 종양미세환경의종양혈관내피세포는 ATM을제거하였을때방사선에대한민감도가증가하여종양의세포사멸을증가시킨다고보고되었음 (J Clin Invest. 2014; 124(8): , Atm deletion with dual recombinase technology preferentially radiosensitizes tumor endothelium). 79

81 이와같이정상세포에대한영향은적고, 종양세포나종양미세환경의기질세포 (Stromal cells) 에대한방사선의민감도를증가시키는약물을사용하면방사선에의한부작용을줄이면서효율적으로종양을제거할수있으므로이에대한연구가많이진행되어야함. 80