치의학석사학위논문 흰쥐구치치수괴사치근단치주염 모델에서나노섬유메시에탑재한 항생제적용효과 2014 년 2 월 서울대학교대학원 치의학과 오영민

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2 치의학석사학위논문 흰쥐구치치수괴사치근단치주염 모델에서나노섬유메시에탑재한 항생제적용효과 2014 년 2 월 서울대학교대학원 치의학과 오영민

3 흰쥐구치치수괴사치근단치주염 모델에서나노섬유메시에탑재한 항생제적용효과 지도교수우경미 이논문을치의학석사학위논문으로제출함 2013 년 10 월 서울대학교대학원 치의학과 오영민 오영민의치의학석사학위논문을인준함 2013 년 11 월 위원장류현모 ( 인 ) 부위원장우경미 ( 인 ) 위원백정화 ( 인 )

4 초 록 흰쥐구치치수괴사치근단치주염모델을설정하고이를이용하여나노섬유에도포 탑재시킨항생제의적용효과를평가하였다. 합성고분자나노섬유를전기방사법을이용하여제작하였다. 제작된나노섬유표면에 3- Mix 항생제를도포하고, 고체배지에형성된 Streptococcus mutans (ATCC 25175) 의콜로니를계수하여나노섬유에서항생제가유리되는양상을관찰하였다. 나노섬유에도포된항생제는세균증식을억제하는유효농도로방출되었다. 특히초기에많은양의항생제가방출되었다. 쥐의치아에인공적으로와동을형성하여치근단병소를일으키고자하였으며, 치수노출 4주후 microct로치근단병소의생성을확인하였다. 치수노출 4주후전체치아를임의로 5개의군으로나누어각기다른처치를하고, 처치 6주후각각의치아를 microct 촬영하였다. 처치후, 치근단병소의크기를측정한결과항생제를도포한나노메시군이가장치료효과가큰것을확인하였다. 이와같은결과는항생제를도포시킨나노섬유메시가치수괴사치근단치주염치료에효과적으로사용될수있음을시사한다. 주요어 : 치수질환, 나노섬유, 항생제 학번 :

5 목 차 제 1 장서론... 1 제 1 절연구의배경... 1 제 2 절연구의내용... 2 제 2 장실험방법... 3 제 3 장실험결과... 7 제 4 장고찰 제 5 장결론 참고문헌 Abstract... 18

6 표목차 [ 표 1] [ 표 2] [ 표 3] 그림목차 [ 그림 1]... 6 [ 그림 2]... 7 [ 그림 3]... 7 [ 그림 4]... 8 [ 그림 5]... 9 [ 그림 6]... 9

7 제 1 장서 론 제 1 절연구의배경 최근연구에서 PCL fiber에의해 odontogenesis가촉진된다는것이확실해지고있다. 한연구에서 MTA만을이용하여치수복조술을시행한경우에비해 nano fiber를함께사용하였을경우 4배나더두꺼운 dentinal bridge 가생성되었음이관찰되었다. 1 또다른연구에서는 PCL fiber 가 HDPC(Human Dental Pulp Cell) 의부착과증식을촉진하며, 상아모세포의 분화를활성화시키는것이확인되었다. 2 또한, Ciprofloxacin, Metronidazole, 그리고 Minocycline 등 3 종의약제를혼합하여사용하면광범위한근관내 세균에효과가있다는연구가있었다. 3 최근에는 3-mix paste 라고불리는 위의 3 종의항생제를연고형태로제작하여미성숙영구치치료에활용하는 연구가많이이루어졌다. 4 그러나이러한항생제를 PCL fiber 에 wetting 하여근관내에국소적으로전달할경우 fiber 단독으로사용한경우에비하여 어떠한효과가추가적으로유발되는지에대한연구는아직까지이루어지지 1 Lee, W., Oh, J. H., Park, J. C., Shin, H. I., Baek, J. H., Ryoo, H. M. and Woo, K. M. (2012) Performance of electrospun poly caprolactone fiber meshes used with mineral trioxide aggregates in a pulp capping procedure. Acta biomaterialia. 8, Kim, J. J., Bae, W. J., Kim, J. M., Kim, J. J., Lee, E. J., Kim, H. W. and Kim, E. C. (2013) Mineralized polycaprolactone nanofibrous matrix for odontogenesis of human dental pulp cells. Journal of biomaterials applications. 3 Hoshino, E., et al. (1996). "In-vitro antibacterial susceptibility of bacteria taken from infected root dentine to a mixture of ciprofloxacin, metronidazole and minocycline." Int Endod J 29(2): Vijayaraghavan, R., et al. (2012). "Triple antibiotic paste in root canal therapy." J Pharm Bioallied Sci 4(Suppl 2): S

8 않았다. 근관치료이외의분야에서 PCL fiber 를이용하여항생제를 국소적으로송달하는연구는많이이루어졌다. 특히 PCL fiber 는그모양에 있어유동성이있어, 원하는부위에다량의약제를의도된방식으로송달하는 것이가능하다. 5 6 이에반해기존의항생제송달방식은 irrigation, intracanal paste, film 등이있는데 7, 전자의경우는장기간의지속적인항생제 release 가불가능하며, 후자의경우는적용부위에환자의불편감이크다는 한계가있다. 제 2 절연구의내용 최근 PCL fiber를이용한약물전달과그임상적적용에관해활발히연구되고있다. 하지만항생제를도포한 PCL fiber가치수염치료에어떠한작용을하는지는아직밝혀지지않았다. 본연구에서는흰쥐구치치수괴사치근단치주염모델을설정하고, 항생제처치, 나노섬유처치, 항생제를도포한섬유처치등에대해각각의치료효과를비교분석하고자한다. 5 Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P. and Meinel, L. (2012) Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.v. 81, Teo, E. Y., et al. (2011). "Polycaprolactone-based fused deposition modeled mesh for delivery of antibacterial agents to infected wounds." Biomaterials 32(1): Mohammadi, Z. and Abbott, P. V. (2009) On the local applications of antibiotics and antibiotic-based agents in endodontics and dental traumatology. International endodontic journal. 42,

9 제 2 장실험방법 1 전기방사법을이용한나노섬유제작 먼저 15%(W/V) PCL(polycaprolactone, , ALDRICH chemistry) 와 1.5%(W/V) D.D.W. 를 MC(dichloromethane,676853, SIGMA-ALDRICH chemistry) 에넣은후 5시간에걸쳐 stirring 해주고이를다시 DMF(dimethylformamide, , SIGMA-ALDRICH chemistry) 에녹여 solution을제작하였다. solution은 12kV 전압, 27G 바늘, 바늘과 10cm 거리, 1.0ml/hr의조건에서 electrospinning 되었다. 2 주사전자현미경관찰 항생제 loding 전후 scaffold의구조적특성은가속전압 15.0kV, 18.0uA하에서주사전자현미경 (HITACHI S-4700) 으로 500배율과 2000배율에서관찰하였다. fiber의직경과 orientation은 ImageJ라는프로그램을이용하여측정하였다. 3 Contact angle 측정 항생제 loading 전후 fiber의 hydrophilicity 변화를알기위해 contact angle 을측정하였다. 이를위해소위 sessile drop method 을이용하였다. ImageXP 라는프로그램을이용하여 capture한후자동으로 contact angle을측정하였다. 4 항생제도포 먼저 Ciprofloxacin(SIGMA chem.), Minocycline(SIGMA chem.), 3

10 Metronidazole(SIGMA chem.) 을 D.D.W. 에각각의포화농도로용해시켰다. (Ciprofloxacin 35mg/ml, Minocycline 50mg/ml, Metronidazole 10mg/ml) 그후각각의항생제가 1:1:1 질량비로혼합된용액을제조하기위해포화용액을 10:7:35의부피비로혼합하였다. 이를 wetting 처리 8 한 PCL fiber 표면에도포한다음에동결건조하였다. 이렇게제작된 fiber의 release 특성을확인하기위해 1ml의 D.D.W. 에 1cm X 1cm size로자른 PCL fiber를넣은후 37.5 도의온도를유지한채로 stirring하며, 초기 2일은 4시간간격으로 3일째이후로는하루간격으로항생제 release sample을채취하였다. 항생제 release 특성의정량적분석을위해 BHI 배지 (LB Broth media, GENERAL BIOTECH GL 7002-LB) 에서배양한 Streptococcus mutans(atcc 25175, 한국구강미생물자원센터 (KCOM) 으로부터분양받음.) 에채취한 sample을가하여전후의세균수감소를측정하였다. 이를 Standard Curve와비교하여시간에따른 PCL fiber의약제 release 양을확인하였다. 5 흰쥐구치치수괴사치근단치주염모델설정및처치 쥐의상악양쪽제1,2 어금니에인공적으로 #2 low speed round bur을이용하여와동을형성하였다. 쥐의치은에서채취한 plaque를와동에넣은후 GI cement(fuji X,GC corp.) 으로가봉하였다. 약 4주경과후, Micro CT 상에서치근단병소의발생을확인한다음전체치아를임의로 5개의군으로나누어각기다른처치를하였다. 5개의군은아래와같으며, 3종의항생제는 8 Mikos, Antonios G., et al. "Wetting of poly (L-lactic acid) and poly (DL-lactic-co-glycolic acid) foams for tissue culture." Biomaterials 15.1 (1994):

11 Ciprofloxacin, Minocycline, Metronidazole이다. 3종의항생제만을근관내에적용할때에는 polyethylene Glycol 4000과 400을 1:1로혼합한후동량의 propylene Glycol과섞은것을 base로이용하였다. 대조군 : 아무처치도하지않고, flowable resin 으로가봉하였다. 실험군 1. Ca(OH)2 페이스트 2. 3종의항생제페이스트 3. 나노섬유 4. 3종의항생제를도포한나노섬유 6 microct 촬영및이미지재건 총 9마리의쥐를두번에걸쳐희생하였다. 첫번째시기는인공적으로와동형성후 4주가지난시점에치근단병소유무를확인하기위해 1마리를희생하였다. 두번째시기는처치후 6주가지난시점이며, 역시치유양상을확인하였다. 모든 microct 촬영후에는치근장축방향으로이미지를재건하여각시점을비교하였다. 각각의이미지에서병소의범위를정하였으며, 1mm2 = 27,411 pixel로계산하였다. 9 9 Lin SK, Hong CY, Chang HH, et al. Immunolocalization of macrophages and transforming growth factor-1 in induced rat periapical lesions. J Endod 2000: 26:

12 Fig. 1. Animal Experiment 6

13 제 3 장실험결과 1. 전기방사법을이용하여제작된나노섬유의형태학적관찰전기방사법을이용하여제작된 PCL fiber는규칙적인형태를보였으며, fiber 의직경은 800nm에서 1um 정도로항생제도포전후로형태나 size에서별다른변화를보이지않았다. (Fig. 2) Fig. 2. 주사전자현미경사진. 좌 ; 항생제도포전, 우 ; 항생제도포후 2. 나노섬유의 Contact Angle 측정 PCL fiber의 contact angle은항생제도포전 86.1, 도포후 48.3 이었다. 항생제도포로 contact angle이큰폭으로감소하였고, 나노섬유의친수성이크게증가하였음을알수있었다. (Fig. 3) Fig. 3. 항생제도포전후의 contact angle. 7

14 3. 항생제의 Release 특성 초기 4h 에총항생제의 80% 이상이 release 되었으며, 16h 이내에거의 대부분의항생제가유리되는것으로관찰되었다. (Fig. 4) Fig. 4. 배양시간에따른 colony 의수. 8

15 4. 흰쥐구치치수괴사치근단치주염모델의 CT image 와동형성후 4 주차에쥐상악어금니 micro CT 촬영결과치근단부위에 방사선투과상이증가하였고, 주위치조골의골소주의불규칙적인소실이 관찰되었다. (Fig. 5) Fig. 5. 건전한치아 ( 上 ) 와와동형성 4 주차치아 ( 下 ) 처치한총 28개의치아중치수강저가천공된 6개의치아는치근단병소크기측정에서제외하였다. 처치 6주후에관찰한 micro CT image 상에서치근단병소의크기는실험군에따라상이하였다. (Fig. 6. Table 3) 아무처리도하지않은대조군에비해모든실험군에서병소의크기가작았으며, 항생제를도포한나노섬유의경우에가장작았다. No tx. Ca(OH)2 Nano fiber 3-Mix anti Nano f.+anti Fig. 6. 처치 6주차 image 9

16 Table 1. 치근단병소를아래의기준에따라분류하여나타내었다. GROUP Periapical lesion 분류 No tx Ca(OH) PCL fiber Mix Antibiotics Anti-loaded PCL fiber : 병소없음 +: 치근단에국한된병소이며, 중격은온전한상태. ++: 치근단주변골의소실과중격은 1/2정도소실. +++: 치근단과중격을포함하여광범위한골의소실이관찰됨. GRADE Table 2. No tx group 과 Anti-loaded PCL fiber group 간의 Periapical lesion 의 통계적차이 t 자유도 평균의동일성에대한 t- 검정 유의확률 ( 양쪽 ) 평균차 차이의표준오차 차이의 95% 신뢰구간하한상한 **

17 Table 3. microct 영상에서치근단병소의영역을정하여면적을계산하였다. Periapical Lesion GROUP CT image Analysis Means±SD ( mm2 ) No tx ±0.430 Ca(OH) ±0.601 PCL fiber 1.422± Mix Antibiotics 1.452±0.586 Anti-loaded PCL fiber 1.064±

18 제 4 장고 찰 나노섬유에항생제를 loading 하는방법은크게두가지로나뉜다. 첫째는항생제를 fiber solution에혼합후전기방사하는방법이며, 다른하나는전기방사후에항생제를섬유표면에적시는방법이다. 전자의특징은항생제로인해섬유의구조가영향을받을수있다는점과섬유가분해되어야 항생제가방출된다는점이다. 10 이에반해후자의특징은전기방사과정에 항생제의영향을배제할수있으며, 섬유가분해되지않더라도항생제가초기에많이방출될수있다는점이다. 실제항생제도포전후의나노섬유구조를 SEM 사진으로확인해본결과나노섬유의직경과배열에있어서변화가거의없었다. 나노섬유에서섬유의직경, 배열은섬유의물리적특성을좌우한다. 특히나노섬유의직경은섬유의표면적의크기, 결국세포 부착특성과도연관된다. 11 결국항생제도포에따른나노섬유의특성은 영향을받지않는다. 나노섬유에항생제도포후에는접촉각이크게감소하였다. 이는나노섬유의친수성이증가하였음을의미한다. 나노섬유는약물전달시스템으로기능하며동시에세포와상호작용을하며세포가부착할수있는비계 (scaffold) 의역할을한다. Wald, HD. Et al. 등의연구에따르면, 소수성 10 Bottino, M. C., et al. "bioactive nanofibrous scaffolds for regenerative Endodontics." Journal of dental research (2013): Chen, Ming, et al. "Role of electrospun fibre diameter and corresponding specific surface area (SSA) on cell attachment." Journal of tissue engineering and regenerative medicine 3.4 (2009):

19 비계의겉과안쪽부위에 cell suspension 을주입하더라도비계내대부분의 공극은세포가없이비어있는상태로관찰되었다. 12 나노섬유가친수성을 띄는경우소수성일때에비해세포들이비계내의공극으로쉽게들어옴에따라더큰효과를보일것이다. 치수염치료에있어요구되는것은감염된근관내의세균의수를줄이며, 세균의성장을억제하는것이다. 세종의항생제를국소도포제로적용하였을 때근관내세균수를줄이는것에효과가있다는것이알려져있다. 13 또한 서론에서언급한바와같이 3종의항생제를혼합하여사용하면광범위한근관내세균에효과가있다는연구가있었다. 이 3종의항생제가섬유에서방출되는결과를살펴보면, 초기 4h까지 80% 이상이방출되는것으로관찰되었다. 이는기존의항생제를 fiber solution에혼합후방사한 실험에서의결과와는확연한차이를확인할수있다. 14 실험시작전에 의도한대로초기에고농도로항생제가유리되면서작용하여강력하게치수내의세균수를줄이게될것으로예상된다. 와동형성 4주차의 CT 이미지를관찰해보면, 사람의성숙영구치와는치근단공의크기에서큰차이를보인다. 쥐의근단공은상대적으로많이열려있는편이며, 형태적으로사람의미성숙영구치와유사한모습을보인다. 12 Wald HL, Sarakinos G, Lyman MD, Mikos AG, Vacanti JP, Langer R. Cell seeding in porous transplantation devices. Biomaterials 1993; 14: Sato, I., et al. "Sterilization of infected root canal dentine by topical application of a mixture of ciprofloxacin, metronidazole and minocycline in situ."international endodontic journal 29.2 (1996): Dave, Rachna, et al. "Endogenously triggered electrospun fibres for tailored and controlled antibiotic release." Journal of Biomaterials Science, Polymer Editionahead-ofprint (2013):

20 넓은근단공을통하여원활한혈액공급이가능하고, 치료에대한효과도더신속하게나타날것으로생각된다. 치수염이발생한경우치근단주위골소주의불규칙적인소실과치근단주위방사선투과상의크기증가등이보이는데이는사람의치아와유사한방사선학적특징이다. 처치 6주차의 CT 이미지에서치근단병소의크기를측정하였을때, 항생제를도포한나노메시에서병소의크기가가장적었으며, 그다음으로는순서대로나노메시만적용한경우, 3-Mix 항생제를적용한경우, 수산화칼슘을적용한경우였으며, 아무런처치를하지않은경우에병소의크기가가장컸다. (Table 3.) 하지만아무처치도하지않은대조군과항생제도포나노메시를적용한실험군사이에서만통계적으로유의미한차이가있었고 (P < 0.01, Table 2.), 나머지군사이에서는유의수준 0.05에서통계적으로유의성이없었다. 이러한결과의가능성있는여러가지요인을생각해볼수있다. 이번실험모델에서가장개선이필요한점은처치후수복물을안정적으로유지할수있는방안에관한것이다. 쥐의먹이는굉장히단단한코르크재질로써와동형성과처치, 임시가봉등의여러조작으로약해진치질이저작시에잘부서지는요인이되었다. 치질이부서지게되면구강내로치수가다시노출되어구강내의세균에의해다시감염되게된다. 치료시사용한약제등이효과적으로작용하기위해서는치수와넓게접촉하는것이필요하지만, 넓게접촉하기위해치질을많이삭제할경우치아의구조적견고성을심각하게위협하게된다. 이둘사이에서적절히조화를이룰수있는모델을생각해야한다. 또다른문제는 3 Mix antibiotics paste의적용에서발생하였다. 14

21 Propylene glycol을혼합하여적용하였는데, 제조한 Propylene glycol base 는예상보다더흐름성이좋아근관적용이용이하지않았으며, 소수성으로인해레진임시가봉물이자주탈락하였다. 이는특히사람의치아에비해상대적으로굉장히작은쥐의대구치에서더욱문제가되는것으로보인다. 제 5 장결 론 흰쥐구치치수염모델은전술한바와같이여러가지어려움에도불구하고, 치료후결과가더신속하게나타나며, 더경제적이며여러가지처치를자유롭게해볼수있는효과적인모델이다. 앞으로이어지는연구에서흰쥐구치치수염모델을통하여근관치료에대해의미있는발전이이루어지길기대해본다. 15

22 참고문헌 1. Lee, W., Oh, J. H., Park, J. C., Shin, H. I., Baek, J. H., Ryoo, H. M. and Woo, K. M. (2012) Performance of electrospun polycaprolactone fiber meshes used with mineral trioxide aggregates in a pulp capping procedure.acta biomaterialia. 8, Kim, J. J., Bae, W. J., Kim, J. M., Kim, J. J., Lee, E. J., Kim, H. W. and Kim, E. C. (2013) Mineralized poly-caprolactone nanofibrous matrix for odontogenesis of human dental pulp cells. Journal of biomaterials applications. 3. Hoshino, E., et al. (1996). "In-vitro antibacterial susceptibility of bacteria taken from infected root dentine to a mixture of ciprofloxacin, metronidazole and minocycline." Int Endod J 29(2): Vijayaraghavan, R., et al. (2012). "Triple antibiotic paste in root canal therapy." J Pharm Bioallied Sci 4(Suppl 2): S Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P. andmeinel, L. (2012) Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.v. 81, Teo, E. Y., et al. (2011). "Polycaprolactone-based fused deposition modeled mesh for delivery of antibacterial agents to infected wounds." Biomaterials 32(1): Mohammadi, Z. and Abbott, P. V. (2009) On the local applications of antibiotics and antibiotic-based agents in endodontics and dental traumatology. International endodontic journal. 42, Lin SK, Hong CY, Chang HH, et al. Immunolocalization of macrophages and transforming growth factor-1 in induced rat periapical lesions. J Endod 2000: 26: Bottino, M. C., et al. "bioactive nanofibrous scaffolds for regenerative Endodontics." Journal of dental research 2013):

23 10. Mikos, Antonios G., et al. "Wetting of poly(l-lactic acid) and poly (DLlactic-co-glycolic acid) foams for tissue culture." Biomaterials 15.1 (1994): Chen, Ming, et al. "Role of electrospun fibre diameter and corresponding specific surface area (SSA) on cell attachment." Journal of tissue engineering and regenerative medicine 3.4 (2009): Wald HL, Sarakinos G, Lyman MD, Mikos AG, Vacanti JP, Langer R. Cell seeding in porous transplantationde-vices. Biomaterials 1993; 14: Sato, I., et al. "Sterilization of infected root canal dentine by topical application of a mixture of ciprofloxacin, metronidazole and minocycline in situ."international endodontic journal 29.2 (1996): Dave, Rachna, et al. "Endogenously triggered electros-pun fibres for tailored and controlled antibiotic release." Journal of Biomaterials Science, Polymer Editionahead-of-print (2013):

24 Abstract Performance of the antibiotics- loaded electrospun PCL fiber meshes in a rat model of pulp necrosis with periapical periodontis in permanent molars Oh, Youngmin Department of Dentistry School of Dentistry Seoul National University To determine whether the antibiotics-loaded electrospun PCL fiber meshes can be used effectively for the treatment of pulp necrosis with periapical periodontis in permanent molars, poly(ε-caprolactone) (PCL) nanofibers were made. To examine the characteristics of PCL fiber, scanning electron microscope images and contact angle images were taken. Then, the PCL fibers were coated by dipping them in antibiotics solution. The drug release from the PCL fibers was determined by counting the colony numbers of Streptococcus mutans. The cavities were made to exposure the pulp. The plaques around teeth were collected and inserted into the cavities in rat upper molars. After 4 weeks of pulp exposure, the molars were 18

25 divided into five groups and treated with following medication; control, Ca(OH) 2 paste, antibiotics paste, plain PCL fibers, and antibiotics-loaded PCL fibers. After 6 weeks of the treatment, the rats were sacrificed, and microct images were taken. The morphology of nano fiber was regular and uniform. The diameter was about 800nm. Antibiotics loaded on PCL fiber were released at effective concentrations to inhibit the formation of colonies of S. mutans. After 6 weeks, all the treatments reduced the sizes of periapical lesions. Especially, antibioticsloaded PCL fibers improved the healing of periapical lesion. Taken together, the antibiotics-loaded nanofiber meshes can be used effectively in the therapeutic procedures for pulp necrosis with periapical lesions in permanent molars. Keywords : pulp lesion, nano fiber, antibiotics Student Number :

26 저작자표시 - 비영리 - 동일조건변경허락 2.0 대한민국 이용자는아래의조건을따르는경우에한하여자유롭게 이저작물을복제, 배포, 전송, 전시, 공연및방송할수있습니다. 이차적저작물을작성할수있습니다. 다음과같은조건을따라야합니다 : 저작자표시. 귀하는원저작자를표시하여야합니다. 비영리. 귀하는이저작물을영리목적으로이용할수없습니다. 동일조건변경허락. 귀하가이저작물을개작, 변형또는가공했을경우에는, 이저작물과동일한이용허락조건하에서만배포할수있습니다. 귀하는, 이저작물의재이용이나배포의경우, 이저작물에적용된이용허락조건을명확하게나타내어야합니다. 저작권자로부터별도의허가를받으면이러한조건들은적용되지않습니다. 저작권법에따른이용자의권리는위의내용에의하여영향을받지않습니다. 이것은이용허락규약 (Legal Code) 을이해하기쉽게요약한것입니다. Disclaimer

27 치의학석사학위논문 흰쥐구치치수괴사치근단치주염 모델에서나노섬유메시에탑재한 항생제적용효과 2014 년 2 월 서울대학교대학원 치의학과 오영민

28 흰쥐구치치수괴사치근단치주염 모델에서나노섬유메시에탑재한 항생제적용효과 지도교수우경미 이논문을치의학석사학위논문으로제출함 2013 년 10 월 서울대학교대학원 치의학과 오영민 오영민의치의학석사학위논문을인준함 2013 년 11 월 위원장류현모 ( 인 ) 부위원장우경미 ( 인 ) 위원백정화 ( 인 )

29 초 록 흰쥐구치치수괴사치근단치주염모델을설정하고이를이용하여나노섬유에도포 탑재시킨항생제의적용효과를평가하였다. 합성고분자나노섬유를전기방사법을이용하여제작하였다. 제작된나노섬유표면에 3- Mix 항생제를도포하고, 고체배지에형성된 Streptococcus mutans (ATCC 25175) 의콜로니를계수하여나노섬유에서항생제가유리되는양상을관찰하였다. 나노섬유에도포된항생제는세균증식을억제하는유효농도로방출되었다. 특히초기에많은양의항생제가방출되었다. 쥐의치아에인공적으로와동을형성하여치근단병소를일으키고자하였으며, 치수노출 4주후 microct로치근단병소의생성을확인하였다. 치수노출 4주후전체치아를임의로 5개의군으로나누어각기다른처치를하고, 처치 6주후각각의치아를 microct 촬영하였다. 처치후, 치근단병소의크기를측정한결과항생제를도포한나노메시군이가장치료효과가큰것을확인하였다. 이와같은결과는항생제를도포시킨나노섬유메시가치수괴사치근단치주염치료에효과적으로사용될수있음을시사한다. 주요어 : 치수질환, 나노섬유, 항생제 학번 :

30 목 차 제 1 장서론... 1 제 1 절연구의배경... 1 제 2 절연구의내용... 2 제 2 장실험방법... 3 제 3 장실험결과... 7 제 4 장고찰 제 5 장결론 참고문헌 Abstract... 18

31 표목차 [ 표 1] [ 표 2] [ 표 3] 그림목차 [ 그림 1]... 6 [ 그림 2]... 7 [ 그림 3]... 7 [ 그림 4]... 8 [ 그림 5]... 9 [ 그림 6]... 9

32 제 1 장서 론 제 1 절연구의배경 최근연구에서 PCL fiber에의해 odontogenesis가촉진된다는것이확실해지고있다. 한연구에서 MTA만을이용하여치수복조술을시행한경우에비해 nano fiber를함께사용하였을경우 4배나더두꺼운 dentinal bridge 가생성되었음이관찰되었다. 1 또다른연구에서는 PCL fiber 가 HDPC(Human Dental Pulp Cell) 의부착과증식을촉진하며, 상아모세포의 분화를활성화시키는것이확인되었다. 2 또한, Ciprofloxacin, Metronidazole, 그리고 Minocycline 등 3 종의약제를혼합하여사용하면광범위한근관내 세균에효과가있다는연구가있었다. 3 최근에는 3-mix paste 라고불리는 위의 3 종의항생제를연고형태로제작하여미성숙영구치치료에활용하는 연구가많이이루어졌다. 4 그러나이러한항생제를 PCL fiber 에 wetting 하여근관내에국소적으로전달할경우 fiber 단독으로사용한경우에비하여 어떠한효과가추가적으로유발되는지에대한연구는아직까지이루어지지 1 Lee, W., Oh, J. H., Park, J. C., Shin, H. I., Baek, J. H., Ryoo, H. M. and Woo, K. M. (2012) Performance of electrospun poly caprolactone fiber meshes used with mineral trioxide aggregates in a pulp capping procedure. Acta biomaterialia. 8, Kim, J. J., Bae, W. J., Kim, J. M., Kim, J. J., Lee, E. J., Kim, H. W. and Kim, E. C. (2013) Mineralized polycaprolactone nanofibrous matrix for odontogenesis of human dental pulp cells. Journal of biomaterials applications. 3 Hoshino, E., et al. (1996). "In-vitro antibacterial susceptibility of bacteria taken from infected root dentine to a mixture of ciprofloxacin, metronidazole and minocycline." Int Endod J 29(2): Vijayaraghavan, R., et al. (2012). "Triple antibiotic paste in root canal therapy." J Pharm Bioallied Sci 4(Suppl 2): S

33 않았다. 근관치료이외의분야에서 PCL fiber 를이용하여항생제를 국소적으로송달하는연구는많이이루어졌다. 특히 PCL fiber 는그모양에 있어유동성이있어, 원하는부위에다량의약제를의도된방식으로송달하는 것이가능하다. 5 6 이에반해기존의항생제송달방식은 irrigation, intracanal paste, film 등이있는데 7, 전자의경우는장기간의지속적인항생제 release 가불가능하며, 후자의경우는적용부위에환자의불편감이크다는 한계가있다. 제 2 절연구의내용 최근 PCL fiber를이용한약물전달과그임상적적용에관해활발히연구되고있다. 하지만항생제를도포한 PCL fiber가치수염치료에어떠한작용을하는지는아직밝혀지지않았다. 본연구에서는흰쥐구치치수괴사치근단치주염모델을설정하고, 항생제처치, 나노섬유처치, 항생제를도포한섬유처치등에대해각각의치료효과를비교분석하고자한다. 5 Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P. and Meinel, L. (2012) Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.v. 81, Teo, E. Y., et al. (2011). "Polycaprolactone-based fused deposition modeled mesh for delivery of antibacterial agents to infected wounds." Biomaterials 32(1): Mohammadi, Z. and Abbott, P. V. (2009) On the local applications of antibiotics and antibiotic-based agents in endodontics and dental traumatology. International endodontic journal. 42,

34 제 2 장실험방법 1 전기방사법을이용한나노섬유제작 먼저 15%(W/V) PCL(polycaprolactone, , ALDRICH chemistry) 와 1.5%(W/V) D.D.W. 를 MC(dichloromethane,676853, SIGMA-ALDRICH chemistry) 에넣은후 5시간에걸쳐 stirring 해주고이를다시 DMF(dimethylformamide, , SIGMA-ALDRICH chemistry) 에녹여 solution을제작하였다. solution은 12kV 전압, 27G 바늘, 바늘과 10cm 거리, 1.0ml/hr의조건에서 electrospinning 되었다. 2 주사전자현미경관찰 항생제 loding 전후 scaffold의구조적특성은가속전압 15.0kV, 18.0uA하에서주사전자현미경 (HITACHI S-4700) 으로 500배율과 2000배율에서관찰하였다. fiber의직경과 orientation은 ImageJ라는프로그램을이용하여측정하였다. 3 Contact angle 측정 항생제 loading 전후 fiber의 hydrophilicity 변화를알기위해 contact angle 을측정하였다. 이를위해소위 sessile drop method 을이용하였다. ImageXP 라는프로그램을이용하여 capture한후자동으로 contact angle을측정하였다. 4 항생제도포 먼저 Ciprofloxacin(SIGMA chem.), Minocycline(SIGMA chem.), 3

35 Metronidazole(SIGMA chem.) 을 D.D.W. 에각각의포화농도로용해시켰다. (Ciprofloxacin 35mg/ml, Minocycline 50mg/ml, Metronidazole 10mg/ml) 그후각각의항생제가 1:1:1 질량비로혼합된용액을제조하기위해포화용액을 10:7:35의부피비로혼합하였다. 이를 wetting 처리 8 한 PCL fiber 표면에도포한다음에동결건조하였다. 이렇게제작된 fiber의 release 특성을확인하기위해 1ml의 D.D.W. 에 1cm X 1cm size로자른 PCL fiber를넣은후 37.5 도의온도를유지한채로 stirring하며, 초기 2일은 4시간간격으로 3일째이후로는하루간격으로항생제 release sample을채취하였다. 항생제 release 특성의정량적분석을위해 BHI 배지 (LB Broth media, GENERAL BIOTECH GL 7002-LB) 에서배양한 Streptococcus mutans(atcc 25175, 한국구강미생물자원센터 (KCOM) 으로부터분양받음.) 에채취한 sample을가하여전후의세균수감소를측정하였다. 이를 Standard Curve와비교하여시간에따른 PCL fiber의약제 release 양을확인하였다. 5 흰쥐구치치수괴사치근단치주염모델설정및처치 쥐의상악양쪽제1,2 어금니에인공적으로 #2 low speed round bur을이용하여와동을형성하였다. 쥐의치은에서채취한 plaque를와동에넣은후 GI cement(fuji X,GC corp.) 으로가봉하였다. 약 4주경과후, Micro CT 상에서치근단병소의발생을확인한다음전체치아를임의로 5개의군으로나누어각기다른처치를하였다. 5개의군은아래와같으며, 3종의항생제는 8 Mikos, Antonios G., et al. "Wetting of poly (L-lactic acid) and poly (DL-lactic-co-glycolic acid) foams for tissue culture." Biomaterials 15.1 (1994):

36 Ciprofloxacin, Minocycline, Metronidazole이다. 3종의항생제만을근관내에적용할때에는 polyethylene Glycol 4000과 400을 1:1로혼합한후동량의 propylene Glycol과섞은것을 base로이용하였다. 대조군 : 아무처치도하지않고, flowable resin 으로가봉하였다. 실험군 1. Ca(OH)2 페이스트 2. 3종의항생제페이스트 3. 나노섬유 4. 3종의항생제를도포한나노섬유 6 microct 촬영및이미지재건 총 9마리의쥐를두번에걸쳐희생하였다. 첫번째시기는인공적으로와동형성후 4주가지난시점에치근단병소유무를확인하기위해 1마리를희생하였다. 두번째시기는처치후 6주가지난시점이며, 역시치유양상을확인하였다. 모든 microct 촬영후에는치근장축방향으로이미지를재건하여각시점을비교하였다. 각각의이미지에서병소의범위를정하였으며, 1mm2 = 27,411 pixel로계산하였다. 9 9 Lin SK, Hong CY, Chang HH, et al. Immunolocalization of macrophages and transforming growth factor-1 in induced rat periapical lesions. J Endod 2000: 26:

37 Fig. 1. Animal Experiment 6

38 제 3 장실험결과 1. 전기방사법을이용하여제작된나노섬유의형태학적관찰전기방사법을이용하여제작된 PCL fiber는규칙적인형태를보였으며, fiber 의직경은 800nm에서 1um 정도로항생제도포전후로형태나 size에서별다른변화를보이지않았다. (Fig. 2) Fig. 2. 주사전자현미경사진. 좌 ; 항생제도포전, 우 ; 항생제도포후 2. 나노섬유의 Contact Angle 측정 PCL fiber의 contact angle은항생제도포전 86.1, 도포후 48.3 이었다. 항생제도포로 contact angle이큰폭으로감소하였고, 나노섬유의친수성이크게증가하였음을알수있었다. (Fig. 3) Fig. 3. 항생제도포전후의 contact angle. 7

39 3. 항생제의 Release 특성 초기 4h 에총항생제의 80% 이상이 release 되었으며, 16h 이내에거의 대부분의항생제가유리되는것으로관찰되었다. (Fig. 4) Fig. 4. 배양시간에따른 colony 의수. 8

40 4. 흰쥐구치치수괴사치근단치주염모델의 CT image 와동형성후 4 주차에쥐상악어금니 micro CT 촬영결과치근단부위에 방사선투과상이증가하였고, 주위치조골의골소주의불규칙적인소실이 관찰되었다. (Fig. 5) Fig. 5. 건전한치아 ( 上 ) 와와동형성 4 주차치아 ( 下 ) 처치한총 28개의치아중치수강저가천공된 6개의치아는치근단병소크기측정에서제외하였다. 처치 6주후에관찰한 micro CT image 상에서치근단병소의크기는실험군에따라상이하였다. (Fig. 6. Table 3) 아무처리도하지않은대조군에비해모든실험군에서병소의크기가작았으며, 항생제를도포한나노섬유의경우에가장작았다. No tx. Ca(OH)2 Nano fiber 3-Mix anti Nano f.+anti Fig. 6. 처치 6주차 image 9

41 Table 1. 치근단병소를아래의기준에따라분류하여나타내었다. GROUP Periapical lesion 분류 No tx Ca(OH) PCL fiber Mix Antibiotics Anti-loaded PCL fiber : 병소없음 +: 치근단에국한된병소이며, 중격은온전한상태. ++: 치근단주변골의소실과중격은 1/2정도소실. +++: 치근단과중격을포함하여광범위한골의소실이관찰됨. GRADE Table 2. No tx group 과 Anti-loaded PCL fiber group 간의 Periapical lesion 의 통계적차이 t 자유도 평균의동일성에대한 t- 검정 유의확률 ( 양쪽 ) 평균차 차이의표준오차 차이의 95% 신뢰구간하한상한 **

42 Table 3. microct 영상에서치근단병소의영역을정하여면적을계산하였다. Periapical Lesion GROUP CT image Analysis Means±SD ( mm2 ) No tx ±0.430 Ca(OH) ±0.601 PCL fiber 1.422± Mix Antibiotics 1.452±0.586 Anti-loaded PCL fiber 1.064±

43 제 4 장고 찰 나노섬유에항생제를 loading 하는방법은크게두가지로나뉜다. 첫째는항생제를 fiber solution에혼합후전기방사하는방법이며, 다른하나는전기방사후에항생제를섬유표면에적시는방법이다. 전자의특징은항생제로인해섬유의구조가영향을받을수있다는점과섬유가분해되어야 항생제가방출된다는점이다. 10 이에반해후자의특징은전기방사과정에 항생제의영향을배제할수있으며, 섬유가분해되지않더라도항생제가초기에많이방출될수있다는점이다. 실제항생제도포전후의나노섬유구조를 SEM 사진으로확인해본결과나노섬유의직경과배열에있어서변화가거의없었다. 나노섬유에서섬유의직경, 배열은섬유의물리적특성을좌우한다. 특히나노섬유의직경은섬유의표면적의크기, 결국세포 부착특성과도연관된다. 11 결국항생제도포에따른나노섬유의특성은 영향을받지않는다. 나노섬유에항생제도포후에는접촉각이크게감소하였다. 이는나노섬유의친수성이증가하였음을의미한다. 나노섬유는약물전달시스템으로기능하며동시에세포와상호작용을하며세포가부착할수있는비계 (scaffold) 의역할을한다. Wald, HD. Et al. 등의연구에따르면, 소수성 10 Bottino, M. C., et al. "bioactive nanofibrous scaffolds for regenerative Endodontics." Journal of dental research (2013): Chen, Ming, et al. "Role of electrospun fibre diameter and corresponding specific surface area (SSA) on cell attachment." Journal of tissue engineering and regenerative medicine 3.4 (2009):

44 비계의겉과안쪽부위에 cell suspension 을주입하더라도비계내대부분의 공극은세포가없이비어있는상태로관찰되었다. 12 나노섬유가친수성을 띄는경우소수성일때에비해세포들이비계내의공극으로쉽게들어옴에따라더큰효과를보일것이다. 치수염치료에있어요구되는것은감염된근관내의세균의수를줄이며, 세균의성장을억제하는것이다. 세종의항생제를국소도포제로적용하였을 때근관내세균수를줄이는것에효과가있다는것이알려져있다. 13 또한 서론에서언급한바와같이 3종의항생제를혼합하여사용하면광범위한근관내세균에효과가있다는연구가있었다. 이 3종의항생제가섬유에서방출되는결과를살펴보면, 초기 4h까지 80% 이상이방출되는것으로관찰되었다. 이는기존의항생제를 fiber solution에혼합후방사한 실험에서의결과와는확연한차이를확인할수있다. 14 실험시작전에 의도한대로초기에고농도로항생제가유리되면서작용하여강력하게치수내의세균수를줄이게될것으로예상된다. 와동형성 4주차의 CT 이미지를관찰해보면, 사람의성숙영구치와는치근단공의크기에서큰차이를보인다. 쥐의근단공은상대적으로많이열려있는편이며, 형태적으로사람의미성숙영구치와유사한모습을보인다. 12 Wald HL, Sarakinos G, Lyman MD, Mikos AG, Vacanti JP, Langer R. Cell seeding in porous transplantation devices. Biomaterials 1993; 14: Sato, I., et al. "Sterilization of infected root canal dentine by topical application of a mixture of ciprofloxacin, metronidazole and minocycline in situ."international endodontic journal 29.2 (1996): Dave, Rachna, et al. "Endogenously triggered electrospun fibres for tailored and controlled antibiotic release." Journal of Biomaterials Science, Polymer Editionahead-ofprint (2013):

45 넓은근단공을통하여원활한혈액공급이가능하고, 치료에대한효과도더신속하게나타날것으로생각된다. 치수염이발생한경우치근단주위골소주의불규칙적인소실과치근단주위방사선투과상의크기증가등이보이는데이는사람의치아와유사한방사선학적특징이다. 처치 6주차의 CT 이미지에서치근단병소의크기를측정하였을때, 항생제를도포한나노메시에서병소의크기가가장적었으며, 그다음으로는순서대로나노메시만적용한경우, 3-Mix 항생제를적용한경우, 수산화칼슘을적용한경우였으며, 아무런처치를하지않은경우에병소의크기가가장컸다. (Table 3.) 하지만아무처치도하지않은대조군과항생제도포나노메시를적용한실험군사이에서만통계적으로유의미한차이가있었고 (P < 0.01, Table 2.), 나머지군사이에서는유의수준 0.05에서통계적으로유의성이없었다. 이러한결과의가능성있는여러가지요인을생각해볼수있다. 이번실험모델에서가장개선이필요한점은처치후수복물을안정적으로유지할수있는방안에관한것이다. 쥐의먹이는굉장히단단한코르크재질로써와동형성과처치, 임시가봉등의여러조작으로약해진치질이저작시에잘부서지는요인이되었다. 치질이부서지게되면구강내로치수가다시노출되어구강내의세균에의해다시감염되게된다. 치료시사용한약제등이효과적으로작용하기위해서는치수와넓게접촉하는것이필요하지만, 넓게접촉하기위해치질을많이삭제할경우치아의구조적견고성을심각하게위협하게된다. 이둘사이에서적절히조화를이룰수있는모델을생각해야한다. 또다른문제는 3 Mix antibiotics paste의적용에서발생하였다. 14

46 Propylene glycol을혼합하여적용하였는데, 제조한 Propylene glycol base 는예상보다더흐름성이좋아근관적용이용이하지않았으며, 소수성으로인해레진임시가봉물이자주탈락하였다. 이는특히사람의치아에비해상대적으로굉장히작은쥐의대구치에서더욱문제가되는것으로보인다. 제 5 장결 론 흰쥐구치치수염모델은전술한바와같이여러가지어려움에도불구하고, 치료후결과가더신속하게나타나며, 더경제적이며여러가지처치를자유롭게해볼수있는효과적인모델이다. 앞으로이어지는연구에서흰쥐구치치수염모델을통하여근관치료에대해의미있는발전이이루어지길기대해본다. 15

47 참고문헌 1. Lee, W., Oh, J. H., Park, J. C., Shin, H. I., Baek, J. H., Ryoo, H. M. and Woo, K. M. (2012) Performance of electrospun polycaprolactone fiber meshes used with mineral trioxide aggregates in a pulp capping procedure.acta biomaterialia. 8, Kim, J. J., Bae, W. J., Kim, J. M., Kim, J. J., Lee, E. J., Kim, H. W. and Kim, E. C. (2013) Mineralized poly-caprolactone nanofibrous matrix for odontogenesis of human dental pulp cells. Journal of biomaterials applications. 3. Hoshino, E., et al. (1996). "In-vitro antibacterial susceptibility of bacteria taken from infected root dentine to a mixture of ciprofloxacin, metronidazole and minocycline." Int Endod J 29(2): Vijayaraghavan, R., et al. (2012). "Triple antibiotic paste in root canal therapy." J Pharm Bioallied Sci 4(Suppl 2): S Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P. andmeinel, L. (2012) Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.v. 81, Teo, E. Y., et al. (2011). "Polycaprolactone-based fused deposition modeled mesh for delivery of antibacterial agents to infected wounds." Biomaterials 32(1): Mohammadi, Z. and Abbott, P. V. (2009) On the local applications of antibiotics and antibiotic-based agents in endodontics and dental traumatology. International endodontic journal. 42, Lin SK, Hong CY, Chang HH, et al. Immunolocalization of macrophages and transforming growth factor-1 in induced rat periapical lesions. J Endod 2000: 26: Bottino, M. C., et al. "bioactive nanofibrous scaffolds for regenerative Endodontics." Journal of dental research 2013):

48 10. Mikos, Antonios G., et al. "Wetting of poly(l-lactic acid) and poly (DLlactic-co-glycolic acid) foams for tissue culture." Biomaterials 15.1 (1994): Chen, Ming, et al. "Role of electrospun fibre diameter and corresponding specific surface area (SSA) on cell attachment." Journal of tissue engineering and regenerative medicine 3.4 (2009): Wald HL, Sarakinos G, Lyman MD, Mikos AG, Vacanti JP, Langer R. Cell seeding in porous transplantationde-vices. Biomaterials 1993; 14: Sato, I., et al. "Sterilization of infected root canal dentine by topical application of a mixture of ciprofloxacin, metronidazole and minocycline in situ."international endodontic journal 29.2 (1996): Dave, Rachna, et al. "Endogenously triggered electros-pun fibres for tailored and controlled antibiotic release." Journal of Biomaterials Science, Polymer Editionahead-of-print (2013):

49 Abstract Performance of the antibiotics- loaded electrospun PCL fiber meshes in a rat model of pulp necrosis with periapical periodontis in permanent molars Oh, Youngmin Department of Dentistry School of Dentistry Seoul National University To determine whether the antibiotics-loaded electrospun PCL fiber meshes can be used effectively for the treatment of pulp necrosis with periapical periodontis in permanent molars, poly(ε-caprolactone) (PCL) nanofibers were made. To examine the characteristics of PCL fiber, scanning electron microscope images and contact angle images were taken. Then, the PCL fibers were coated by dipping them in antibiotics solution. The drug release from the PCL fibers was determined by counting the colony numbers of Streptococcus mutans. The cavities were made to exposure the pulp. The plaques around teeth were collected and inserted into the cavities in rat upper molars. After 4 weeks of pulp exposure, the molars were 18

50 divided into five groups and treated with following medication; control, Ca(OH) 2 paste, antibiotics paste, plain PCL fibers, and antibiotics-loaded PCL fibers. After 6 weeks of the treatment, the rats were sacrificed, and microct images were taken. The morphology of nano fiber was regular and uniform. The diameter was about 800nm. Antibiotics loaded on PCL fiber were released at effective concentrations to inhibit the formation of colonies of S. mutans. After 6 weeks, all the treatments reduced the sizes of periapical lesions. Especially, antibioticsloaded PCL fibers improved the healing of periapical lesion. Taken together, the antibiotics-loaded nanofiber meshes can be used effectively in the therapeutic procedures for pulp necrosis with periapical lesions in permanent molars. Keywords : pulp lesion, nano fiber, antibiotics Student Number :