< C6AFC1FD28B9DABFEBB1D9292E687770>

Size: px

Start display at page:

Download "< C6AFC1FD28B9DABFEBB1D9292E687770>"

인석 온
6 years ago
Views:

/ 바이오이미징 홀로그래픽광학영상및제어기법 DOI: 10.3938/PhiT.26.

2016년부터 UNIST 생명공학과조교수로재직중이다. (jh.park@unist.ac.kr) 김규현박사는 2017년 KAIST 물리학과에서박사학위를취득하였으며, 현재동대학에서박사후연구원으로재직중이다. (kkh2580@kaist.ac.kr) 박용근교수는 2010년 Harvard-MIT 의과학과에서박사학위를취득하였으며, 2010년부터 KAIST 물리학과에서근무하고있다.

1 / 바이오이미징 홀로그래픽광학영상및제어기법 DOI: /PhiT 박정훈 김규현 박용근 Holographic Optical Imaging and Manipulation Techniques Jung-Hoon PARK, Kyoohyun KIM and YongKeun PARK 저자약력 박정훈교수는 2014년 KAIST 물리학과에서박사학위를취득하였으며, Janelia 연구소와 Purdue 대학에서연구원을거쳐, 2016년부터 UNIST 생명공학과조교수로재직중이다. 김규현박사는 2017년 KAIST 물리학과에서박사학위를취득하였으며, 현재동대학에서박사후연구원으로재직중이다. 박용근교수는 2010년 Harvard-MIT 의과학과에서박사학위를취득하였으며, 2010년부터 KAIST 물리학과에서근무하고있다. 홀로그래픽기술개발과의생명분야응용연구를하고있다. 100편이상의연구논문을발표했으며, 박용근교수연구내용을바탕으로 2개의회사 (Tomocube Inc., The.Wave.Talk) 가설립되었다. Optical imaging of live cells is essential for the study of cell biology and is important for the diagnosis of several diseases. In addition, optical manipulation of individual cells may open new avenues for the investigation of various cell mechanisms and physiology. One of the challenges in bioimaging is that individual biological cells are transparent due to weak scattering whereas biological tissues, which consist of multiple layers of transparent cells, are opaque due to strong scattering. To address this challenge, several holography-based techniques have been introduced over the past decade. Three-dimensional holographic microscopy enables 3D label-free imaging of live cells and tissues. Holographic control, in combination with holographic measurements, provides a method to systematically manipulate live cells. Furthermore, holographic wavefront shaping offers a non-invasive method to image individual cells through intact biological tissues. To provide insight into how holography techniques can be exploited for various applications in bioimaging, we summarize recent progress on holographic methods and their applications in bioimaging. 다양한질병을이해하고, 진단하고, 또치료하기위해서는세포수준에서일어나는변화를효과적으로관찰하는것이매우중요하다. 이때현미경은세포를관찰하는연구와진단에빼놓을수없는중요한기술이다. 예를들면병원의병리학과에서는환자의위장이나대장에서채취한조직시편을얇게썰고핵과같은세포내특정부위를염색후, 광학현미경으로핵과세포의형상을관찰하여암조직의유무를판별한다. 또한, 말라리아와같은다양한기생충질환의연구와진단은적혈구와같은모세포에기생충또는관련물질이존재하는지를현미경으로관찰하는것이매우중요하다. 또한최신신약개발과정에서는후보항암물질이실제세포에어떤영향을미치는지관찰하기위해현미경을이용하여, 항암물질에대한세포의반응을관찰하여분석한다. 최근에는세포를생체조직에서현미경으로옮기는과정없이, 살아있는조직내에서바로세포를관찰하려는 in vivo 생체영상분야도급속히성장하고있다. 바이오이미징분야에서최근중요하게부상하고있는기술은홀로그래픽광학영상및제어기법이다. 3차원홀로그래픽현미경기술은레이저간섭과단층촬영 (computed tomography) 기술을이용하여, 세포의 3차원굴절률정보를측정할수있다. 이를이용하면, 추가적인염색이나준비과정필요없이, 세포가살아있는상태그대로영상을얻을수있다. 이때문에, 오랜시간동안세포를관찰할수있으며, 또한, 줄기세포나면역세포와같이염색과정을쓸수없는연구분야에활용될수있다. 또한, 홀로그래픽제어기법을활용하면피부와같이광산란이심한생체조직에서도살아있는세포를효과적으로관찰할수있게된다. 광산란을효과적으로줄여, 세포를채취해서외부에서관찰하지않고도, 생체조직내의세포를관찰할수있는기술들이속속개발되고있다. 본글에서는홀로그래픽측정과제어기술이어떻게생체영상분야에이용될수있는지를소개하고자한다. 물리학과첨단기술 MARCH

바이오이미징 시작하는글 A B 의사가외래환자를대할때가장먼저해야하는것은관찰이다. 환자의걸음걸이, 안색, 말투등을포함한모든사소한것들로부터정보를얻기위해세심한관찰을한다. 마찬가지로연구자들이세포를포함한측정대상의정보를파악하기위해서가장많이사용하는방법이형상관찰이다. 시편의형상을관찰하기위해서는가장많이사용하는방식이광학영상 (imaging) 이다.

세포가빛을거의산란시키지않기때문에, 세포가투명하게보여서광학영상을얻기가어렵다는점이다 ( 그림 1A). 세포를구성하는주요성분, 즉, 물, 단백질, 탄수화물, 지질, 핵상등이모두가시광선대역에서빛을거의산란시키지않는다. 다른한편으로는생체조직은매우불투명하다 ( 그림 1B). 이때문에피부속깊숙이있는세포를직접자세히관찰하기가매우어렵다.

각각의세포들은투명하지만, 수많은세포가쌓여있게되면, 각세포에의해미세하게일어난빛의굴절과반사가중첩되어매우복잡한형태로산란이되는것이다. 마치매우작은물방울하나는투명해서잘안보이지만 ( 그림 1C), 물방울들이매우많이모여있는구름은빛을심하게산란시켜하얗게보이고, 구름뒤의하늘을볼수없게만드는것과같은현상이다 ( 그림 1D).

2 바이오이미징 시작하는글 A B 의사가외래환자를대할때가장먼저해야하는것은관찰이다. 환자의걸음걸이, 안색, 말투등을포함한모든사소한것들로부터정보를얻기위해세심한관찰을한다. 마찬가지로연구자들이세포를포함한측정대상의정보를파악하기위해서가장많이사용하는방법이형상관찰이다. 시편의형상을관찰하기위해서는가장많이사용하는방식이광학영상 (imaging) 이다. 물리적으로는빛을시편에입사시켜, 시편의각지점에서산란된입사광을렌즈와같은광학기기를이용하여다시다른공간상의한점으로모아주어시편의형상을재구성한다. 빛은특히생체세포나조직에거의영향을주지않기때문에, 세포와조직의원상태그대로두면서관찰할수있게만들어준다. 하지만, 광학영상으로생체세포를관찰하는데에는근본적인어려움이있다. 세포가빛을거의산란시키지않기때문에, 세포가투명하게보여서광학영상을얻기가어렵다는점이다 ( 그림 1A). 세포를구성하는주요성분, 즉, 물, 단백질, 탄수화물, 지질, 핵상등이모두가시광선대역에서빛을거의산란시키지않는다. 다른한편으로는생체조직은매우불투명하다 ( 그림 1B). 이때문에피부속깊숙이있는세포를직접자세히관찰하기가매우어렵다. 외과적인절제술을통해조직일부를떼어내서외부에있는현미경으로관찰해야한다. 피부가여러층의투명한세포들로구성되어있음에도불구하고, 피부자체가불투명한것은빛이피부에서흡수되었기때문이아니다. 실제로레이저포인터로손가락끝에대어보면상당히많은빛이손가락을투과해서나오는것을관찰할수있다. 피부가불투명한것은산란이너무많이일어나기때문이다. 각각의세포들은투명하지만, 수많은세포가쌓여있게되면, 각세포에의해미세하게일어난빛의굴절과반사가중첩되어매우복잡한형태로산란이되는것이다. 마치매우작은물방울하나는투명해서잘안보이지만 ( 그림 1C), 물방울들이매우많이모여있는구름은빛을심하게산란시켜하얗게보이고, 구름뒤의하늘을볼수없게만드는것과같은현상이다 ( 그림 1D). 바이오이미징분야에서의이 paradox 를해결하기위해다양한홀로그래픽기술이개발되고상용되고있다. 단순히빛의세기 (intensity) 만을가지고빛에담긴정보를측정하거나역으로제어하려고하는것이아닌, 빛의세기와방향정보, 즉빛의홀로그래피정보를활용하였을때바이오이미징분야의난제를해결할수있을것이라는다양한결과들이발표되고있다. 물리적인관점에서보면, 이문제는파동광학으로잘설명 C Fig. 1. (A) Acanthamoeba trophozoites with the characteristic acanthopodia in bright field microscopy. Scale bar: 10 μm. (B) Light transmits through human hands. Biological tissues are opaque because of multiple light scattering. (C) Individual water droplets are transparent. (D) Cloud is highly scattering. Reproduced from Refs. [1-4]. (CC By 2.0). 할수있다. 개별세포에서는빛의흡수는거의무시할수준으로일어나고, 빛의파면이왜곡된다. 따라서위상샘플 (phase object) 이라고광학적으로구분할수있다. 일반적인광학현미경 (bright-field microscopy) 은빛의세기를이용해서영상화를하므로빛의세기가거의바뀌지않는위상샘플의영상을얻기는매우어렵다. 이러한문제때문에 17세기현미경이개발된이후수세기동안생체세포를직접관찰하기는쉽지않았다. 이러한어려움을해결한기술은위상차현미경 (phase contrast microscopy) 이다. 네덜란드물리학자 Frits Zernike 는빛의간섭을이용해서위상샘플을쉽게영상화할수있는기술을간섭을이용해서구현함으로써, 노벨물리학상을받는다. [5] 위상차현미경은생체세포와같은위상시편을영상화하 [1] J. Lorenzo-Morales, N. A. Khan and J. Walochnik, Parasite 22, 10 (2015). [2] Jason Hickey. Light bulb. Online image. Flickr. 24 July < [3] Law Granit. drops on glass. Online image. Flickr. 26 Jan < [4] Edward Stojakovic. Clouds. Online image. Flickr. 20 Aug < [5] F. Zernike, Science 121, 345 (1955). D 8 물리학과첨단기술 MARCH 2017

3 는데에는매우효과적이기때문에지금도수많은생물학연구실이나병원에서널리사용되고있지만, 중요한기술적인한계가있다. 3차원영상을얻을수없다는문제와위상정보를정량적으로얻을수없다는한계가있었다. 2000년대들어 MIT를포함한여러연구그룹에서이문제를본격적으로다루기시작하였고, 최근 10년사이정량위상영상 (quantitative phase imaging) 이라는분야로급격히성장하였다. [6,7] 홀로그래피또는간섭계를이용하여투명한세포와같은위상시편의위상정보를정량적으로측정하는이분야는혈액학, [8] 세포생물학, [9] 신경생물학, [10] 면역학 [11] 을포함한생물학 / 의학분야뿐만아니라, 나노과학, [12] 정밀계측 [13,14] 분야에서도큰응용가능성을보인다. 또한, 최근 10년사이홀로그래픽기법이파면의제어에사용되는경우피부와같이산란이심한매질에서의다중산란을효과적으로제어할수있다는다양한연구결과가소개되고있다. 파면제어 (wavefront shaping) 라고도불리는이분야는, 매우복잡한형태로일어나는다중산란이 stochastic한현상으로보이나, 물리적으로는 deterministic한현상이라는점에착안해서, 산란매질내에서빛의투과를홀로그래픽기술을이용해서측정하고제어한다. [15,16] 이러한홀로그래픽파면제어를이용하면, 산란이매우심한피부와같은시편을지난빛으로광초점을만들수있다. [17] 또한, 다중산란의높은자유도로인해이렇게제어된빛을특정파장이나편광성분으로도선택적으로조절할수있으며, [18,19] 심지어는기존광학계로는제어가매우어려운근접장, 또는시공간 (spatiotemporal) 제어또한가능하게해준다. [20-22] 본글에서는이처럼홀로그래픽측정과제어기술을이용한바이오이미징분야의기본원리와첨단연구동향을살펴보고자한다. 고속광회절단층촬영법홀로그래픽측정을이용한정량위상영상을통해투명한세포와같은위상시편의위상정보뿐만아니라시편의 3차원굴절률분포또한정량적으로측정할수있다. 굴절률은생물학시편의화학적조성과구조에민감한물질의고유광학특성이다. 생물학시편의굴절률값은시편내단백질농도에정비례하므로, 생물학시편의굴절률값으로부터시편내의단백질농도, 건조질량 (dry mass), 부피등을정량적으로구할수있다. [6,23] 미세입자의 3차원굴절률분포는다양한정량위상현미경기법을사용하여측정할수있다. 이중광회절단층촬영법은시편에여러다른각도로빛을입사하고이때시편에의해 산란된광학장 (optical field) 을간섭계를이용하여측정한뒤푸리에회절이론 (Fourier diffraction theorem) 을이용하여시편의 3차원굴절률분포를측정하는방법이다. [24] 푸리에회절이론에따르면특정각도로입사한빛에의해산란된시편의광학장의 2차원푸리에스펙트럼 (Fourier spectrum) 은 3차원푸리에공간상에서 Ewald 구면으로사영 (mapping) 된다. 다양한각도로빛을입사하며측정한광학장의 2차원푸리에스펙트럼을 3차원공간에사영한뒤 3차원역푸리에변환하면시편의 3차원굴절률분포를측정할수있다. 광회절단층촬영법은시편에의한빛의회절과굴절을고려하기때문에시편의 3차원굴절률분포를모양의왜곡없이고해상도로측정할수있다는장점이있다. 최근광회절단층촬영법을이용, 적혈구뿐만아니라백혈구, HeLa 세포등내부구조가더복잡한생물세포의 3차원굴절률분포를측정하여다양한생리병리학적환경에서의생화학적, 구조적변화 [6] K. Lee et al., Sensors 13, 4170 (2013). [7] G. Popescu and Y. Park, Proc. of SPIE 9336 (2015). [8] Y. Park, C. A. Best, K. Badizadegan, R. R. Dasari, M. S. Feld, T. Kuriabova, M. L. Henle, A. J. Levine and G. Popescu, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6731 (2010). [9] K. Kim, S. Lee, J. Yoon, J. Heo, C. Choi and Y. Park, Scientific Reports 6, (2016). [10] P. Jourdain, N. Pavillon, C. Moratal, D. Boss, B. Rappaz, C. Depeursinge, P. Marquet and P. J. Magistretti, The Journal of Neuroscience 31, (2011). [11] J. Yoon, K. Kim, H. Park, C. Choi, S. Jang and Y. Park, Biomed Opt. Express 6, 3865 (2015). [12] G. Baffou, P. Bon, J. Savatier, J. Polleux, M. Zhu, M. Merlin, H. Rigneault and S. Monneret, ACS Nano 6, 2452 (2012). [13] K. Kim, J. Yoon and Y. Park, Optics Letters 41, 934 (2016). [14] J. Park, H. Yu, J.-H. Park and Y. Park, Optics Express 22, (2014). [15] H. Yu, J. Park, K. Lee, J. Yoon, K. Kim, S. Lee and Y. Park, Current Applied Physics 15, 632 (2015). [16] A. P. Mosk, A. Lagendijk, G. Lerosey and M. Fink, Nature Photonics 6, 283 (2012). [17] I. M. Vellekoop and A. P. Mosk, Optics Letters 32, 2309 (2007). [18] J. H. Park, C. H. Park, H. Yu, Y. H. Cho and Y. K. Park, Opt. Lett. 37, 3261 (2012). [19] J.-H. Park, C. Park, H. Yu, Y.-H. Cho and Y. Park, Opt. Express 20, (2012). [20] J. Park, J.-Y. Cho, C. Park, K. Lee, H. Lee, Y.-H. Cho and Y. Park, ACS Nano 10, 6871 (2016). [21] J.-H. Park et al., Nature Photonics 7, 454 (2013). [22] J. Aulbach, B. Gjonaj, P. M. Johnson, A. P. Mosk and A. Lagendijk, Phys. Rev. Lett. 106, (2011). [23] G. Popescu, Y. Park, N. Lue, C. Best-Popescu, L. Deflores, R. R. Dasari, M. S. Feld and K. Badizadegan, Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, C538 (2008). [24] E. Wolf, Optics Communications 1, 153 (1969). 물리학과첨단기술 MARCH

바이오이미징 (A) High-speed 3D imaging of cell reaction Silica bead z x 10 μm 0.282 sec 0.329 sec 0.376 sec 0.423 sec 0.

4 바이오이미징 (A) High-speed 3D imaging of cell reaction Silica bead z x 10 μm sec sec sec sec sec Macrophage (B) High-speed 3D imaging of in vivo red blood cells x-y cross sect ional slice 3D rendering 5 μm t = 0.05 s t = 0.56 s t = 0.95 s n Volume : fl Hb concentration : g/dl Hb contents : pg Volume : fl Hb concentration : g/dl Hb contents : pg Volume : fl Hb concentration : g/dl Hb contents : pg Fig. 2. (A) Cross-sectional slices of 3D RI tomograms of a macrophage and an optically trapped silica bead in the x-z plane. Modified from Ref. [28] (B) Cross-sectional slices of 3D RI tomograms of live mouse red blood cells flowing inside microcapillary of live mouse mesentery. Modified from Ref. [29] (CC By 4.0). 를측정하는연구가수행되고있다. [25] 그러나기존의광회절단층촬영법은수백개의다양한각도로빛을입사하며수백장의영상을촬영하므로영상촬영시간에제한이있으며, 복잡한연산을수반하는푸리에변환을반복적으로수행하므로 3차원영상을재구성하는데에많은계산시간이필요했다. 이로인해기존의광회절단층촬영법은고속촬영및실시간촬영에제한이있었다. 이러한한계를극복하기위해최근시편의 3차원굴절률분포를고속촬영할수있는고속광회절단층촬영법개발에대한연구가활발히진행되고있다. [26,27] 고속광회절단층촬영법개발은 1) 입사각도를줄이며다양한각도로빛을빠르게입사하는기술개발, 2) 그래픽처리장치 (GPU: Graphic Processing Unit) 를사용하여복잡한계산이필요한푸리에변환등의계산속도를향상하는기술개발의두단계로나뉜다. 이를통해 20 mm 20 mm 20 mm 부피의 3차원굴절률분포를 0.2초에복원하는실시간광회절단층촬영법이개발되었으며, PMMA 이합체 (dimer) 의 3차원브라운운동, 유속의흐름변화에따른적혈구모양의변화를실시간으로 3차원영상화할수있었다. [26] 또한, 이러한광회절단층촬영법은 1초당 60개의 3차원굴절률분포를측정할수있어, 광집게 (optical tweezers) 로포획한실리카입자로백혈구세포막에힘을가하는모습 ( 그림 2A), [28] 간세포 (hepatocyte) 내부지방방울 (lipid droplet) 의 3차원브라운운동, [9] 살아있는쥐장간막혈관내부를흐르는살아있는적혈구의 3차원운동 ( 그림 2B) [29] 등생명세포및조직의 3차원운동을고속으로측정하는데에이용되었다. 한편, 최근디지털소형거울장치 (DMD: Digital Micromirror Device) 를이용, 입사하는빛의각도를빠르게바꿔시편의 3 차원굴절률분포를측정하는속도를향상하는연구가발표되었다. [30,31] DMD는상용프로젝터의영상재생기능에핵심적인부품으로써수십만개의마이크로미터크기의소형거울로구성되며, 각각의소형거울의켜짐 / 꺼짐상태를개별적으로조절하여 DMD에반사된빛의파면을제어할수있다. DMD 는개별거울의크기가매우작아광회절단층촬영장비에서입사광의각도를수 khz의빠른속도로안정적으로바꿀수있었으며, 이를통해폴리스티렌구슬의 3차원브라운운동을 100 Hz의속도로측정할수있었다. DMD 를이용한광회절단층촬영현미경은최근상업화되어, 여러생명과학연구실과병원에서활용되고있다. [32] DMD를이용하면임의의입사파면을안정적으로제어할수있으므로, 향후같은광경로상에서광회절단층촬영과구조화조명현미경 (Structured illumination microscopy) 등의다양한현미경기술을동시에구현하여세포의 3차원굴절률분포뿐만아니라형광정보를이용하여높은분자특이성 (molecular specificity) 을갖는영상을얻을수있을것으로기대된다. 능동홀로그래픽광제어 고속광회절단층촬영법을이용하여시편의 3차원굴절률분포를실시간으로구하는기술은복잡한물체를안정적으로광제어하는데에도효과적으로응용될수있다. 기존의광제어기술은광집게 (optical tweezers) 라불리는데, 레이저빛의초점을강하게모아주면초점근처에서인력이작용하게되어시편을포획하고, 초점의위치를바꿔주어시편을 3차원상에서움직일수있다. [33] 기존의광집게기술의경우주로구형입자를포획하고 3 [25] K. Kim, J. Yoon, S. Shin, S. Lee, S.-A. Yang and Y. Park, Journal of Biomedical Photonics & Engineering 2, (2016). [26] K. Kim, K. S. Kim, H. Park, J. C. Ye and Y. Park, Optics Express 21, (2013). [27] G. Dardikman, M. Habaza, L. Waller and N. T. Shaked, Opt. Express 24, 1839 (2016). [28] K. Kim, J. Yoon and Y. Park, Optica 2, 343 (2015). [29] K. Kim, K. Choe, I. Park, P. Kim and Y. Park, Sci. Rep. 6, (2016). [30] S. Shin, K. Kim, J. Yoon and Y. Park, Opt. Lett. 40, 5407 (2015). [31] S. Shin, K. Kim, T. Kim, J. Yoon, K. Hong, J. Park and Y. Park, Proc. of SPIE 9718, (2016). [32] For further information, please refer to Tomocube Inc. ( [33] D. G. Grier, Nature 424, 810 (2003). 10 물리학과첨단기술 MARCH 2017

영국 Padgett 교수 연구팀은 최근 활발히 연구되고 있는 이 (A) 광자 중합(two-photon polymerization) 기술을 이용하여 복잡 ODT Laser (λ = 532 nm) 한 형상의 물체에 구형 핸들을 만들고 이를 광 집게로 포획하 Camera Galvanomirror Initial State [35] 여 안정적으로 위치 및 방향을

또한 호주 Rubinsztein-Dunlop 교수, Bowen 교수 공동 Final State (Assembled) 연구팀은 T-matrix 방법을 반복적으로 사용하여 포획광의 최 High-power Laser (λ = 1,064 nm) 3D Light Mould Trapping beam [36] 적화된 파면을 계산하는 기술을 개발했다.

위의 연구들은 기존의 광 집게 기술로 안정적으로 제어 할 수 없는 물체의 광 제어를 가능하게 했으나, 시편의 모양 Spatial Light Modulator (Wavefront Shaping) 및 광학적 특징에 대한 사전 정보가 필요하며, 이광자 중합 기 술을 이용한 시편 제작과 T-matrix 계산 모두 많은 시간이 걸 (B) Red blood cell

x -axis rotation y-axis translation 3 μm y-axis translation 4 μm 5 μm y 최근 본 연구진은 시편의 3차원 형상을 실시간으로 측정하 z-axis rotation y-axis rotation 고 이를 바탕으로 포획광의 파면을 제어하면 복잡한 형상의 시편의 방향 및 모양의 안정적 조절이 가능하다는 연구를

전자기 변분 원리(electromagnetic variational prin- [38] 포획광과 유전(dielectric) 물체가 중첩되는 ciple)에 따르면, 부분의 부피가 최대가 될 때 포획광에 대한 유전 물체의 전자 z-axis rotation 기 에너지가 최소화된다.

(B) Time-lapse cross-sectional slice images of the measured tomograms for red blood cells which are trapped, rotated, translated and assembled by TOMOTRAP.

5 영국 Padgett 교수 연구팀은 최근 활발히 연구되고 있는 이 (A) 광자 중합(two-photon polymerization) 기술을 이용하여 복잡 ODT Laser (λ = 532 nm) 한 형상의 물체에 구형 핸들을 만들고 이를 광 집게로 포획하 Camera Galvanomirror Initial State [35] 여 안정적으로 위치 및 방향을 제어하는 기술을 발표했다. 이를 이용하여 구형 핸들이 붙은 표면 측정 탐침을 광 제어하 Objective Lens 여 물체 표면의 지형을 방향과 관계없이 탐지할 수 있음을 보 였다. 또한 호주 Rubinsztein-Dunlop 교수, Bowen 교수 공동 Final State (Assembled) 연구팀은 T-matrix 방법을 반복적으로 사용하여 포획광의 최 High-power Laser (λ = 1,064 nm) 3D Light Mould Trapping beam [36] 적화된 파면을 계산하는 기술을 개발했다. 이를 이용하여 크 기가 큰 구형 입자의 포획 효율을 최대 20배가량 높일 수 있 었다. 위의 연구들은 기존의 광 집게 기술로 안정적으로 제어 할 수 없는 물체의 광 제어를 가능하게 했으나, 시편의 모양 Spatial Light Modulator (Wavefront Shaping) 및 광학적 특징에 대한 사전 정보가 필요하며, 이광자 중합 기 술을 이용한 시편 제작과 T-matrix 계산 모두 많은 시간이 걸 (B) Red blood cell rotation, translation, assembly 려 임의의 물체의 실시간 안정적 광 제어에는 한계가 있었다. x -axis rotation y-axis translation 3 μm y-axis translation 4 μm 5 μm y 최근 본 연구진은 시편의 3차원 형상을 실시간으로 측정하 z-axis rotation y-axis rotation 고 이를 바탕으로 포획광의 파면을 제어하면 복잡한 형상의 시편의 방향 및 모양의 안정적 조절이 가능하다는 연구를 발 x (C) Red blood cell folding (L-shaped) (D) HT-29 cell rotation [37] 표했다. 전자기 변분 원리(electromagnetic variational prin- [38] 포획광과 유전(dielectric) 물체가 중첩되는 ciple)에 따르면, 부분의 부피가 최대가 될 때 포획광에 대한 유전 물체의 전자 z-axis rotation 기 에너지가 최소화된다. 따라서 임의의 모양을 가진 유전 물 체를 기존 광 집게의 가우시안 빔으로 포획하면 포획광과 중 y x 5 μm 5 μm Fig. 3. (A) Schematic figure and optical setup for tomographic mold for optical trapping (TOMOTRAP). (B) Time-lapse cross-sectional slice images of the measured tomograms for red blood cells which are trapped, rotated, translated and assembled by TOMOTRAP. (C) Timelapse cross-sectional slice images of the measured tomograms for a red blood cell folded to be an L-shaped cell. (D) Time-lapse 3D isosurface of a HT-29 cell rotated by TOMOTRAP. Modified from Ref. [37](CC By 4.0). 차원 위치를 제어하는 데 이용되었다. 이는 빛이 구형 입자에 작용하는 힘과 이에 따른 입자의 반응은 Mie 이론을 이용하여 첩되는 부분의 부피가 최대화되도록 방향(orientation)을 바꾸 어 광축 방향으로 정렬하려고 할 것이며, 이는 앞서 언급한 현 상을 잘 설명한다. 반대로, 이러한 원리를 역으로 생각하여 포 획광의 모양을 물체의 모양과 같도록 파면을 제어하여 입사하 면 어떻게 될까? 포획광과 유전 물체가 겹치는 부분의 부피는 자연스럽게 최대가 되어 포획광에 대한 유전 물체의 전자기 에너지가 최소화되므로 유전 물체는 방향을 바꾸지 않고 안정 적으로 포획될 수 있을 것이다. 또한, 포획광의 모양을 유전 물체의 움직이고자 하는 방향, 위치 또는 모양으로 입사해주 면, 유전 물체는 다시 전자기 에너지를 최소화하기 위해 갱신 분석적으로 계산될 수 있기 때문이다. 그러나 입자의 모양과 내부 구조가 복잡해지는 경우 빛의 초점을 모아 광 집게를 만 드는 경우 입자에 선형 힘뿐만 아니라 돌림 힘(torque)이 작용 하여 입자가 광축 방향으로 정렬하려는 움직임이 있어 물체가 불안정한 운동을 하며, 광축 방향으로 정렬하여 물체의 방향을 제어하는 데 어려움이 있었다. 빛이 임의의 입자에 작용하는 힘을 예측하기 위해서는 T-matrix 방법, 이산 쌍극자 근사법 (Discrete Dipole Approximation) 등의 복잡한 수치 계산이 필 요하여 비 구형 입자를 안정적으로 광 제어하는 것은 제한적 [34] S. H. Simpson, J Quant Spectrosc Ra 146, 81 (2014). [35] D. B. Phillips, M. J. Padgett, S. Hanna, Y. L. D. Ho, D. M. Carberry, M. J. Miles and S. H. Simpson, Nature Photonics 8, 400 (2014). [36] M. A. Taylor, M. Waleed, A. B. Stilgoe, H. Rubinsztein-Dunlop and W. P. Bowen, Nature Photonics 9, 669 (2015). [37] K. Kim and Y. Park, Nature Communications, in press (2017, arxiv preprint arxiv: ). [38] J. D. Joannopoulos, S. G. Johnson, J. N. Winn and R. D. Meade, Photonic crystals: molding the flow of light (Princeton university press, 2011). 이었다.[34] 물리학과 첨단기술 MARCH

바이오이미징 된포획광의모양으로정렬하게되므로, 복잡한형상의물체의방향, 위치또는모양을안정적으로제어할수있을것이다. 본연구진은이를구현하기위해고속광회절단층촬영법을이용하여시편의 3차원굴절률분포를실시간으로측정하고, 포획광의 3차원광도분포 (light intensity distribution) 가시편의 3차원굴절률분포를갖도록포획광의파면을제어했다 ( 그림 3A).

이를통해구형입자로부터대칭이깨져있는 PMMA 이합체의 3차원방향과위치를자유자재로제어하고조립하는데성공했으며, 적혈구 ( 그림 3B-C), 대장암세포 (HT-29)( 그림 3D) 등복잡한형상과내부구조를갖는다양한생명시편의방향, 위치및모양을안정적으로제어할수있었다.

6 바이오이미징 된포획광의모양으로정렬하게되므로, 복잡한형상의물체의방향, 위치또는모양을안정적으로제어할수있을것이다. 본연구진은이를구현하기위해고속광회절단층촬영법을이용하여시편의 3차원굴절률분포를실시간으로측정하고, 포획광의 3차원광도분포 (light intensity distribution) 가시편의 3차원굴절률분포를갖도록포획광의파면을제어했다 ( 그림 3A). 포획광의 3차원광도분포를원하는모양으로만들 2차원파면은 3차원 Gerchberg-Saxton 알고리즘 [39] 을이용하여 GPU로실시간계산하였으며, 이파면을공간광변조기 (SLM: Spatial light modulator) 에투영하여포획광의 3차원광도분포를제어했다. 이를통해구형입자로부터대칭이깨져있는 PMMA 이합체의 3차원방향과위치를자유자재로제어하고조립하는데성공했으며, 적혈구 ( 그림 3B-C), 대장암세포 (HT-29)( 그림 3D) 등복잡한형상과내부구조를갖는다양한생명시편의방향, 위치및모양을안정적으로제어할수있었다. 본방법은시편의모양과광학적특성에대한사전정보를알지않아도임의의비구형입자를안정적으로제어하고조립할수있다는장점이있다. 구현된방법은세포를원하는모양으로안정적으로변형시킬수있어세포의역학적반응을정량분석할수있다. 또한복잡한형상을갖는세포들을포획하고조립하는, 세포단계의수술작업을광제어하고실시간촬영하여세포의반응, 수술예후등을모니터링할수있을것으로기대된다. 빛의위상과심부조직이미징바이오이미징에대한바탕지식이있는독자의경우심부조직 (deep tissue) 이미징에서위상의중요성에대해의문을품을수있을것이다. 실제현재심부조직이미징분야를이끌고있는 multiphoton 현미경, photoacoustic 현미경, diffuse optical tomography 등의이미징기술들은각각형광의세기, 음파의세기, 그리고산란된빛의세기분포를측정하여이미지를구현한다. 이는앞서살펴본홀로그래피기반현미경기술들이위상측정에주안점을두는것과상반된모습이다. 허나 Abbe가처음주장하였듯이, 모든이미지형성은빛의회절과간섭의결과물이다. 다시말하자면, 빛의세기만을최종적으로측정하더라도그이미지를형성하기까지의빛의경로는빛의파면에의해결정되고변화한다는것이다. 이와같은이유로심부조직고해상도이미징을구현하기위해서는최대한작은크기의광초점을생체조직깊숙이전달할수있는파면을설계할수있는위상제어가필수적이다. 일반적인광학렌즈는평면파를수렴하는구면파로변형시켜목표지점에광초점을형성하도록설계되어있다 [40] ( 그림 4). Fig. 4. (Top Left) A lens is designed to transform a plane wave into a spherical wave that converges at the focal plane. (Top right) Light passing through inhomogeneous media results in a severely aberrated focus. (Bottom) Light passing through homogeneous media with different refractive index. Aberrations deteriorate the focus much more severely for high NA lenses. Modified from Ref. [40]. 허나렌즈와목표초점면사이에임의의굴절률을갖는물질이분포하게되면기존렌즈의디자인대로회절한계에해당하는광초점이형성되지못한다. 굴절률이높은균일한물질이렌즈와초점면사이를채울경우, 높은각도로입사하는빛의성분들이직각으로입사하는빛의성분보다상대적으로큰광경로를겪게되어곡면수차 (spherical aberration) 가발생하게되며이와같은수차는고해상도이미징을위한높은개구수의대물렌즈를사용할수록심하게나타난다. 심부조직이미징의경우이보다더어려운문제를극복해야한다. 조직을이루는각각의세포내부는대부분물로이루어져있지만세포벽과세포내소기관들은복잡하고불균일한모양을띠고있다. 또한이들기관의외벽은대부분지질로이루어져있으므로각각의경계면에서굴절이무수히일어나게되어광경로가완전히일그러지게된다. 이경우에는렌즈를이용하더라도회절한계에해당하는광초점이아닌무작위적인 speckle 패턴이나타나게되어고해상도이미징은불가능해진다. 수차를일으키는불균일한굴절률분포는같은조직내에서도관찰하고자하는위치에따라급격히변하게된다. 이에따라생체조직에의한수차를예측하여렌즈의디자인에포함하는것은불가능하며관찰하고자하는생체조직에따라역동적으로변할수있는수차보정이요구된다. 이를구현하기 [39] G. Whyte and J. Courtial, New J Phys 7, 117 (2005). [40] N. Ji, Nature Methods 14, 374 (2017). 12 물리학과첨단기술 MARCH 2017

이에따라 widefield 카메라를이용하여 single shot으로파면을측정할수있는 Shack-Hartmann 파면측정기의개발이주를이루었다. Shack-Hartmann 파면측정기는카메라와마이크로렌즈배열을결합하여파면의 tip/tilt를초점의공간상이동으로변환하여파면을측정가능케한다.

7 위해서는첫째, 생체조직에의해교란된빛의파면측정과둘째, 교란된빛의파면을다시고해상도광초점형성을위해필요한구면파로되돌릴수있는파면제어를동시에구현해야한다. 수차측정및보정을위한노력은바이오이미징이아닌천문학분야에서먼저발전하였다. [41] 허블망원경과같이우주에배치된소수의망원경을제외한지구상의모든망원경은대기를통과한후의별빛을측정해야하기때문에대기의요동으로인한수차보정을해야고해상도이미지를얻을수있다 ( 아이러니하게도허블망원경또한대기에의한수차가아닌잘못설계된렌즈로인한수차보정이추후에필요했다 ). 천문학에서는빠르게변하는대기의요동속도를따라가기위해수밀리초단위의시간분해능으로수차를측정및보정해야한다. 이에따라 widefield 카메라를이용하여 single shot으로파면을측정할수있는 Shack-Hartmann 파면측정기의개발이주를이루었다. Shack-Hartmann 파면측정기는카메라와마이크로렌즈배열을결합하여파면의 tip/tilt를초점의공간상이동으로변환하여파면을측정가능케한다. 초창기수차보정 (Adaptive Optics) 현미경에도 Shack-Hartmann 파면측정기를사용한응용사례들이주를이루었었다. 허나 Shack-Hartmann 파면측정기는마이크로렌즈배열을구성하는렌즈의크기및개수에따라해상도가제한되며, tip/tilt 가너무클경우, 혹은렌즈의크기에비해파면이빠르게변할경우정확한파면측정이불가능하다. 천문학의경우대기에의한수차의복잡도가낮아낮은파면해상도만으로도어느정도정확한보정이가능하지만생체조직에의한수차는복잡도가훨씬높기때문에더높은해상도의정밀측정및제어가필수적이다 ( 그림 5). 이에따라생체조직에의한수차, 특히뇌와같이산란이심한장기를관찰하고자할때는보다높은해상도의파면측정및제어가필요하다. 이를해결하기위해바이오이미징분야에서는 Shack-Hartmann 센서등의장비를이용한직접적인 (direct) 파면측정방법외에파면측정장치를사용하지않고이미지신호등을이용한간접적인 (indirect) 파면측정방법들이최근발전되고있다. 예를들어, 이광자현미경의경우이미지신호의세기가광초점의세기의제곱에비례하여증가하므로이미지의총세기를최대화할수있는방향으로파면을조절하여최적의광초점을복원할수있다. ~100 개정도의픽셀로제한되는 Shack-Hartmann 파면측정기에비해파면제어장비는수백만개의픽셀을독립적으로제어할수있는액정기반공간광변조기등을사용할수있으므로생체조직뿐만아니라복수산란이더욱심하게일어나는두꺼운페인트층도통과하여광초점을재건할수있다. 간접적인파면측 Fig. 5. Typical measurement of the aberrated wavefront per depth in tissue using a Shack-Hartmann wavefront sensor. For low order aberrations (shallow depths), the aberrated wavefront is measured correctly. As we go deeper into tissue, higher aberrations occur and the pixelation due to the finite size of each lens results in incorrect measurements. Modified from Ref. [42]. 정방법은또한독립적인파면측정기가필요없으므로가격및시스템복잡도측면에서더욱유리하다. 수차에의해왜곡된파면을측정 / 보정할수있는다양한기술들이최근개발되었지만, 실제바이오이미징에사용할수있는기술들은극히제한되어있다. 예를들면, 광간섭단층촬영기법 (optical coherence tomography) 을피부와같이산란이심한조직에적용할경우, 다중산란으로인해투과깊이의제약이있는문제가있었다. 이를극복하기위해, 파면제어기법을이용하여각측정지점마다광초첨형성을최적화하여투과깊이를두배이상증가시킨연구도보고된바있었다. [44-46] 하지만, 모든 3차원공간마다파면을제어하기위해서는상당히오랜제어시간과복잡한측정과정을거쳐야한다 [41] J. W. Hardy, Adaptive optics for astronomical telescopes (Oxford University Press, New York, 1998). [42] K. Wang, W. Z. Sun, C. T. Richie, B. K. Harvey, E. Betzig and N. Ji, Nature Communications 6, 7276 (2015). [43] J. H. Park, W. Sun and M. Cui, P Natl Acad Sci USA 112, 9236 (2015). [44] J. Jang et al., Optics Express 21, 2890 (2013). [45] H. Yu, J. Jang, J. Lim, J. H. Park, W. Jang, J. Y. Kim and Y. Park, Optics Express 22, 7514 (2014). [46] H. Yu, J. P. Lee, K. Lee, J. Jang, J. Lim, W. Jang, Y. Jeong and Y. Park, Journal of Biomedical Optics 21, (2016). 물리학과첨단기술 MARCH

8 바이오 이미징 서로 다른 각도에서 수차를 측정, 이들 정보를 취합하여 수차 tomogram을 얻게 된다. 허나 이러한 접근 방법을 산란이 심 한 생체 조직에 그대로 적용하기에는 어려움이 있다. 이에 따 라 본 연구진은 하나의 파면기만을 이용하여 수차 보정 이미 징 측정 영역을 극대화하기 위해 파면 제어기를 일반적인 현 미경의 pupil plane이 아닌 산란층이 위치한 conjugate image Fig. 6. Imaging through the skull of live mice. (Left) Conventional two photon microscope image. (Center) Aberration corrected image of dendritic spines through the skull, scale bar: 5 μm. (Right) Correction wavefront. Modified from Ref. [43]. plane에 설치하여 파면 제어의 효과적인 영역을 확대할 수 있 음을 선보였으며, 이를 이용하여 생체조직 중 산란이 가장 심 한 두개골을 통과하여 살아있는 쥐의 뇌세포 구조 및 뇌 내부 [43] 면역 세포의 실시간 움직임을 관찰한 바 있다 (그림 6). 는 단점이 있었다. 이는 바로 생체 조직에 의한 수차가 위치에 따라 변한다는 맺음말 점 때문이다. 이미지 구현을 위해서는 광 초점을 한 군데에서 가 아닌 이미지를 얻고자 하는 넓은 영역 내 모든 지점에서 바이오 이미징의 관찰 대상이 되는 세포는 대부분 물로 이 복원해야 한다. 허나 앞서 살펴본 바와 같이 생체 조직의 불균 루어져 있어 가시광선 대역에서의 흡수가 미미하다. 이러한 상 일성으로 인해 하나의 보정 파면이 효과적으로 작동할 수 있 황에서 세포와 빛의 상호작용은 세포의 굴절률 분포와 입사되 는 영역은 극히 제한된다. 는 빛의 파면에 의해 결정되게 된다. 최근 홀로그래픽 기법을 본 연구진은 이러한 문제를 해결하기 위한 첫 걸음으로 생 통해 빛의 파면을 측정하고 제어함으로써 단일 세포의 3차원 체 조직에 의한 수차를 하나의 파면만으로도 보다 넓은 영역 굴절률 분포를 측정하거나 복잡한 모양의 세포 내 소기관 등 에 대해 보정할 수 있는 기술을 최근 선보였다. 이는 천문학에 을 독립적으로 제어할 수 있는 새로운 연구 결과들이 보고되 서 개발된 Multiconjugate Adaptive Optics에서 착안한 아이 고 있다. 더 나아가 생체 조직 내부에서 세포의 자연상태 그대 디어로 특정 두께를 갖는 산란층의 수차를 누적하여 하나의 로의 모습을 비침습적으로 관찰할 수 있는 위상 제어 기술들 파면 제어기로 보정하는 것이 아니라 대기의 여러 층에서 발 이 개발되고 있다. 앞으로 해당 기술들의 속도, 효율 등 실용 생하는 수차를 층별로 구분하여 다수의 MEMS 거울을 사용하 적인 부분에서 획기적인 발전이 이루어질 경우 현재 대부분 여 각각의 층에 의한 수차를 보정하는 개념이다. 이때 층별 수 연구실에 국한되고 있는 현미경 기술이 임상 그리고 더 나아 차를 구분하기 위해서는 앞서 살펴본 홀로그래피 기반 3차원 가 우리의 실생활에 깊숙이 파고들 수 있게 되리라 기대한다. 굴절률 측정과 유사하게 여러 대의 파면 측정기를 이용하여 14 물리학과 첨단기술 MARCH

<30315FC6AFC1FDBFA15FBACEC3C45F F E687770>

<30315FC6AFC1FDBFA15FBACEC3C45F F E687770> 고분자특성분석지상강좌 3 차원홀로그래픽현미경의원리와응용 Principles and Applications of Three-Dimensional Holographic Microscopy 김규현 1 ㆍ신승우 1 ㆍ박용근 1,2 Kyoohyun Kim 1 ㆍSeungwoo Shin 1 ㆍYongKeun Park 1,2 1 Department of Physics,