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1 Korean J Clin Microbiol Vol. 15, No. 3, September, Detection of Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis, and Candida Species in Affirm VPIII, Papanicolaou Smear Test and Gram Stain Kye Hyun Kim 1, TaeHyoung Kim 2, Jun Hyung Lee 3, Tae Jin Lee 4, MiKyung Lee 3 1 Department of Obstetrics and Gynecology, Kangbuk Samsung Hospital, Sungkyunkwan University School of Medicine, Departments of 2 Urology, 3 Laboratory Medicine, and 4 Pathology, ChungAng University College of Medicine, Seoul, Korea Background: Infectious vaginitis is caused primarily by three different groups of microbial pathogens (Trichomonas vaginalis, Candida spp., and Gardnerella vaginalis). The objective of this study was to compare the Affirm VPIII assay using a DNA hybridization technique with the Papanicolaou (Pap) smear test and the Gram stain in the detection and identification of these three organisms. Methods: A total of 300 vaginal samples were collected from women that were either symptomatic for vaginitis or asymptomatic women that were being seen for routine obstetric or gynecological care. The presence of T. vaginalis, Candida spp., and G. vaginalis was evaluated by using the Affirm VIII assay (Becton Dickinson, USA), Pap smear test, and Gram stain method, respectively. Results: With the Affirm VPIII assay, 1 (0.3%) patient tested positive for T. vaginalis, 99 (33.0%) patients were positive for G vaginalis, and 18 (6.0%) were positive for Candida spp. The detection rates of Trichomonas infection, bacterial vaginosis and candidiasis by the Pap smear test and Gram stain method were 0.7% versus 0%, 16.3% versus 35.7%, and 1.7% versus 9.7%, respectively. The differences between the detection rates of the above three organisms between the Pap smear test and the Gram stain method were statistically significant (P<0.05). Conclusion: The Affirm VPIII assay was more sensitive than the Pap smear test and more specific than the Gram stain method for the detection and identification of these three organisms. In addition, the results of the Affirm VPIII assay are quick to obtain and are simple and easy to interpret. (Korean J Clin Microbiol 2012;15:104109) Key Words: Affirm VPIII, Candida, Gardnerella vaginalis, Gram stain, Papanicolaou stain, Trichomonas vaginalis 서 산부인과외래에서가장흔한부인과질환인질염은질분비물, 냄새, 작열감, 소양감, 성교통, 배뇨통등의증상을특징으로하며감염성질염, 비감염성질염, 만성질염으로분류하고있다. 이중감염성질염이가임기여성에서발생하는질염의 90% 이상을차지하고있으며, 주요원인으로는트리코모나스질염 (trichomonal vaginitis, TV), 칸디다성질염 (vulvovaginal candidiasis, VVC), 세균성질증 (bacterial vaginosis, BV) 등이알려져있다 [1]. 감염성질염에서 TV의원인균은 Trichomonas vaginalis이고, VVC를유발하는원인균은 Candida albicans가약 90% 를차지하고그외 C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei 등이있다. BV는정상적으로존재하는질내미 Received 12 March, 2012, Revised 12 April, 2012 Accepted 13 April, 2012 Correspondence: MiKyung Lee, Department of Laboratory Medicine, ChungAng University Hospital, 2241 Heukseokdong, Dongjakgu, Seoul , Korea. (Tel) , (Fax) , ( ) cpworld@cau.ac.kr 론 생물무리의균형이파괴되면서여러종류의혐기성세균에의한혼합감염의특징이나타나지만 Gardnerella vaginalis가감염의주원인균으로간주되고있으며, 항상염증반응으로나타나는것이아니기때문에질증 (vaginosis) 으로표현하고있다 [1]. 미국에서는감염성질염으로매년약천만명이상의환자가산부인과를방문하고있으며 [2], 특히자가진단한 VVC에대한의사의처방없이구입가능한약제나유사약제로인해많은의료비용이낭비되고있다 [3]. 또한 BV나 TV는수술후감염등의합병증을높이고산과적으로도조기양막파수나조기진통등의합병증이발생할수있기때문에주의가필요하고필요에따라효과적인치료를하여야한다 [4,5]. 그러므로감염성질염에대한이해를높이고효과적인치료를위하여감염성질염의원인이되는미생물검출을통한정확한진단이매우중요하며, 또한불필요한의료비용의낭비를줄일수있을것으로기대되고있다. 감염성질염의진단은환자의증상과진찰에근거한임상적진단과현미경검사, 염색, 배양등의검사실적진단에의한다. 104

2 Kye Hyun Kim, et al. : Diagnostic Testing of Infectious Vaginitis 105 임상적진단은감염성질환을가진여성의상당수가무증상인경우가많고, 유사한증상으로인해감염성질염의원인을확실하게구별하기어려우며, 아급성 (subacute) 감염이나중복감염의경우또한진단이어려울수있어, 임상적진단이유용함에도불구하고정확한진단을위한추가적인검사가필요하다 [1]. 검사실적진단방법에는 wet mount 의현미경검사, 질분비물의 ph 검사, Gram 염색, Papanicolaou (Pap) 도말검사, 배양, 분자유전학적검사등이있으며, 검사에따라예민도와특이도가낮거나, 결과판독이주관적이거나, 시간과노력이많이들거나, 또는특수한배지가필요한등의제한사항이있다 [6]. 최근질분비물로부터 T. vaginalis, G. vaginalis, Candida spp. 를동시에검출하는분자유전학적방법인 Affirm VPIII 검사 (Becton Dickinson, Burlington, NC, USA) 가개발되어감염성질염진단에유용한것으로보고되고있다 [79]. 이에감염성질염의진단을위한 3종류의주요원인균검출과동정을위하여, Affirm VPIII 검사를 Pap 도말검사및 Gram 염색과비교하였다. 대상및방법 1. 대상 2011년 10월부터 2011년 12월까지산부인과를방문하여질검사를받은 300명을대상으로하였으며, 임상시험심사위원회 (IRB) 의승인을받았다. 2. Affirm VPIII 검사키트내에제공된멸균면봉으로질후원개에서질분비물을채취하고 72시간까지실온에서미생물의핵산이보존되도록고안된검체수집튜브에넣고뚜껑을닫아당일검사실로운반하였다. 이후검사는 BD MicroProbe Processor (Becton Dickinson) 를사용하여제조사의지침에따라진행하였다. 즉, 검체수집튜브를열고용해용액 0.4 ml를추가하여잘혼합한후 heating block에서 85 o C로 10분간처리하고완충용액 0.6 ml를추가하여잘혼합시켰다. 기질 0.1 ml를분주한 Affirm VPIII Microbial Identification Test Card (Becton Dickinson) 에검체전량을옮기고 BD MicroProbe Processor에장착하여약 35분간반응을진행하였고, 검사가완료된후가능한빠른시간내에결과를판독하였다 (Fig. 1). Affirm VPIII의측정한계치는 G. vaginalis와 Candida spp. 가질내정상상재균으로존재하는것을고려하여, T. vaginalis는 /ml, G. vaginalis는 colony forming units (CFU)/mL, Candida spp. 는 CFU/mL로제시되어있다. 3. Pap 도말검사환자의질분비물을 endocervical brush/plastic spatula combination를 사용하여채취한후슬라이드에도말하고즉시 95% 알코올에넣어고정시켜 Pap 염색을하는고식적 Pap 도말검사를시행하였으며, 진단검사의학과전공의가판독하였다 (Fig. 2). 4. Gram 염색환자의질분비물을 Stuart Agar Gel Transport Swabs (COPAN Italia, Brescia, Italy) 으로채취하여검사실로수송후 Gram 염색을시행하였으며, 임상미생물부서 5년경력의임상병리사가판독하였다 (Fig. 3). 5. 통계분석통계분석은 Statcalc (Epi Info version 3.5.1, Centers for Disease Control and Prevention, GA, USA) 을사용하여 Chisquare 검증을하였으며, P<0.05를통계적으로유의한것으로판정하였다. 분석값이 5 이하인경우는 Fisher exact test의 P값을사용하였다. 결과총 300명의질분비물을대상으로하였으며, 시험대상자의평균연령은 44.8세였다 (1972세). Affirm VPIII 검사에서는 T. vaginalis가 1명 (0.3%), G. vaginalis는 99명 (33.0%), Candida spp. 는 18명 (6.0%) 에서검출되었다. Pap 도말검사에서는 T. vaginalis가 2명 (0.7%), G. vaginalis는 49명 (16.3%), Candida spp. 는 5명 (1.7%) 에게검출되었으며, Gram 염색에서는 T. vaginalis는검출되지않았고 (0%), G. vaginalis는 107명 (35.7%), Candida spp. 는 29명 (9.7%) 에게서검출되었다 (Table 1). G. vaginalis와 Candida spp. 에대한 3종류의검사간검출률은모두통계적으로유의한차이를보였다 (P<0.05). Affirm VPIII 검사, Pap 도말검사및 Gram 염색등 3종류의검사모두에서동일한결과를보인경우는 T. vaginalis가 297 명 (99.0%, 음성 297명 ), G. vaginalis는 217명 (72.3%, 양성 46 명, 음성 171명 ), Candida spp. 는 273명 (91.0%, 양성 4명, 음성 269명 ) 이었다 (Table 1). 2종류의검사법이상에서동일한결과를보인경우를기준으로판정하였을때, G. vaginalis에대한민감도와특이도는 Affirm VPIII 검사는각각 97.5% 와 90.5%, Pap 도말검사는 60.0% 와 99.5%, Gram 염색은 100% 와 87.7% 였으며, Candida spp. 에대한민감도와특이도는 Affirm VPIII 검사는각각 94.1% 와 99.3%, Pap 도말검사는 29.4% 와 100%, Gram 염색은 100% 와 95.8% 였다 (Table 2). T. vaginalis의경우 Affirm VPIII 검사에서 1검체와 Pap 도말검사에서 2검체만각각양성으로판독되어, 이들검체를 Seeplex STD6 ACE detection kit (Seegene, Biotechnology, Inc., Seoul, Korea) 을사용하여 GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, Inc., Foster, CA, USA) 에서다중중합효소연쇄반응 (PCR) 으로확인

3 106 Korean J Clin Microbiol 2012;15(3): Fig. 1. An Affirm VPIII Microbial Identification Test Card for 4 patient samples showing a positive result for Trichomonas vaginalis (A), Gardnerella vaginalis (B), Candida spp. (C), and mixed infection (D). Each card includes positive (bottom) and negative (top) controls for each patient sample. Fig. 2. Papanicolaou smear test. (A) Individual squamous cells coated with a layer of coccobacilli along the cell membranes (socalled clue cells) (Papanicolaou stain, 400). (B) Yeasts and pseudophyphae (Papanicolaou stain, 400). Fig. 3. Gram stained vaginal smear. (A) Gram negative and variable rods on the squamous cells (clue cells) (Gram stain, 400). (B) Dark blue, dense staining of yeasts (Gram stain, 400).

4 Kye Hyun Kim, et al. : Diagnostic Testing of Infectious Vaginitis 107 하였다. 다중 PCR 검사에서 Affirm VPIII 검사상양성인 1검체만이 T. vaginalis 양성으로확인되었고 Pap 도말검사에서양성인 2검체는모두음성으로확인되었다. Table 1. The results of Affirm VPIII assay, Papanicolaou (Pap) smear test, and Gram stain for Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis, and Candida spp. Pathogen Affirm VPIII Pap test Gram stain No. (%) T. vaginalis G. vaginalis Candida spp. 고 감염성질염은약 50% 이상의환자에서무증상이고 [10], 원인균별주요증상이나진찰소견이 TV의경우많은양의거품과황녹색을띠는역한냄새의분비물, 질발적과자궁경부의심한염증소견 ( 일명딸기모양의발적 ) 이특징이고, VVC의경우질벽에붙어있는백색의치즈같은질분비물과심한외음부소양증, 작열감등이특징이고, BV의경우점도가낮은회백색의생선냄새를내는질분비물이특징이지만명확하게구별하기어려운경우가많고비특이적이어서 [1,10,11], 이러한증상과진찰만으로는감염성질염을정확하게진단하기어려워진단을위한추가검사가필요하게된다. 지금까지감염성질염을효과적으로진단하기위하여임상적기준에서부터분자유전학적방법에이르는다양한진단방법들이개발되어왔다. 예를들면 BV 진단을위하여진찰소견과 wet mount 검사에근거한 Amsel s criteria는유착성회백색 찰 297 (99.0) 1 (0.3) 2 (0.7) 171 (57.0) 21 (7.0) 1 (0.3) 27 (9.0) 32 (10.7) 2 (0.7) 46 (15.3) 269 (89.7) 2 (0.7) 12 (4.0) 12 (4.0) 1 (0.3) 4 (1.3) 의균질한질분비물, amine 검사양성 (whiff 검사양성 ), 질의산성도가 4.5 이상, Clue 세포가정상상피세포의 20% 이상인 4가지기준중 3가지이상이면진단이가능하다 [12]. 이때 amine 검사는 wet mount에 10% KOH를추가하였을때아미노산의대사물인 amine 특유의생선냄새를확인하는것이고, clue 세포는질상피세포의경계가불명확할정도로세균들이표면에부착되어있는세포를말한다. 또한 wet mount의현미경검사는 clue cell 이외에도운동성의원충 (T. vaginalis) 이나효모 ( 발아, 균사 ) 를관찰할수있어감염성질염의진단에사용될수있다. 그러나잘훈련된관찰자에의한판독은특이도가높을수있으나, 일반적으로민감도와특이도가낮고, Trichomonas 관찰시 10분이상검사가지연되면민감도가매우낮아지는등 [13] 다양한요인들에의해검사결과가영향을받을수있는문제점이있다 [1,6,10,11]. BV 진단을위한 Nugent score 에사용되는 Gram 염색은 VVC 진단에도사용할수있으며검사결과를보관할수있고비용이저렴한장점이있지만, 민감도가낮아음성결과만으로질염을배제할수없으며판독이주관적이고검사자간변이가크다는단점이있다 [6]. Pap 도말검사는자궁경부세포의비정형성을검출하기위한방법으로감염성질염의진단에도사용할수있지만, 다양한민감도를보이며특히 Trichomonas 선별시민감도가낮고감염빈도가낮은집단에서는흔히위양성을보이기도한다 [14,15]. 한편, G. vaginalis와 Candida spp. 는질내정상균무리이므로질분비물로부터이들미생물을배양하는것은감염성질염진단에권장되지않으며, 특히 BV 진단을위한 G. vaginalis 배양은절대권장되지않는다 [6]. TV 진단을위한 T. vaginalis 배양은사용할수있으나, 특수배지가필요하고배양기간이긴제한점이있다 [1,6,10]. 최근특정미생물에대한화학물질, 효소, 항원또는핵산의검출에기초한신속검사법들이개발되어사용되고있으며, 이러한검사들은비교적민감도와특이도도높고 1시간이내에결과를확인할수있는장점을가지고있지만, 대부분 BV만을검사하고있어 VVC나 TV에의한감염성질염을확인할수없는단점을가지고있다 [6]. 그러므로감염성질염진단을위한여러가지검사법들의단점을보완하기위한민감하고신속한검사법이요구되고있다. Affirm VPIII 검사는 DNA 교잡 (hybridization) 기술을사용하여질분비물에서임상적으로의 Table 2. Comparison of Affirm VPIII assay, Papanicolaou (Pap) smear test, and Gram stain for the diagnosis of bacterial vaginosis and candidiasis Pathogen Affirm VPIII Pap test Gram stain Sensitivity (%) Specificity (%) Sensitivity (%) Specificity (%) Sensitivity (%) Specificity (%) G. vaginalis Candida spp

5 108 Korean J Clin Microbiol 2012;15(3): 미있는수의 T. vaginalis, G. vaginalis, Candida spp. 를동시에검출할수있는분자유전학적검사로, 정상균무리에의한위양성반응을피하도록민감도를적절하게조정하였고, 72시간까지실온에서미생물의핵산이보존되도록고안된검체수집튜브를제공하며, 검사실에서의검사소요시간도 1시간이내로가능하도록개발되었다 [6]. 본연구에서는 T. vaginalis의검사결과불일치를보인 3검체를다중 PCR로확인한결과 Affirm VPIII 검사에서양성을보인 1검체만다중 PCR검사에서도양성을보여, Pap 도말검사에서는위양성이 2검체, 위음성이 1검체였고, Gram 염색에서는 1검체에서위음성을보인것으로판단되었다. TV가총 300 명중 1명에서만검출되는매우낮은양성빈도를보여검사간비교를하기는어려웠으나, TV 감염빈도가낮은집단에서위양성이흔하다는이전보고 [14,15] 와유사한결과를보였다. 또한이전연구들에서 TV에의한감염성질염진단시 Affirm VPIII 검사가 wet mount 검사나 Pap 도말검사보다더민감한검사로보고된바있어 [7,8,16], Affirm VPIII 검사가 T. vaginalis 검출에유용하게사용될수있을것으로생각된다. 본연구의 G. vaginalis와 Candida spp. 에대한검출률은, Gram 염색이 35.7% 와 9.7% 로가장높았고 Affirm VPIII 검사에서는 33.0% 와 6.0% 였으며, Pap 도말검사가 16.3% 와 1.7% 로가장낮았다. 2종류의검사법이상에서동일한결과를보인경우를기준으로판정한 G. vaginalis와 Candida spp. 에대한민감도는 Gram 염색이가장높았고, 특이도는 Pap 도말검사가가장높았다. 그러나 Gram 염색은높은민감도에비해특이도가상대적으로낮았으며, Pap 도말검사는특이도는매우높았지만민감도가매우낮았다. 반면 Affirm VPIII 검사의 G. vaginalis와 Candida spp. 에대한민감도와특이도는모두 90% 이상이었으며, 특히 Gram 염색에비교하여민감도는낮았지만특이도는높았다. 질염증상을가진산모에서 BV를배제하기위한신속한진단방법으로 Affirm VPIII 검사를 Gram 염색과비교한이전연구에서도, Gram 염색과비교하여 Affirm VPIII 검사는특이도가높고신속하고간편하며신뢰할수있는검사법으로보고되었다 [17]. 본연구에서 Gram 염색이나 Pap 도말검사에서양성인결과가 Affirm VPIII 검사에서음성으로나온경우는, Affirm VPIII 검사에서정상균무리에의한위양성을줄이기위하여 G. vaginalis는 CFU/mL, Candida spp. 는 CFU/mL로검출한계를조정하였기때문으로생각된다. G. vaginalis와 Candida spp. 는여성의 50% 에서정상균무리로존재할수있기때문에, 너무예민한검사는위양성결과를가져올수있고나아가불필요한치료로이어질수있다 [9,15]. 또한본연구에서 G. vaginalis와 Candida spp. 에대한민감도가 Gram 염색에서는매우높은반면 Pap 도말검사에서는매우낮은결과를보인것은판독자에의한변이도일부반영된것으로판단되었다. 즉 Pap 도말검사는진단검사 의학과전공의에의해판독되었고, Gram 염색은 5년이상의판독경력이있는임상병리사에의해판독되어검사자간의변이가더욱크게반영되었을것으로생각되었다. 그러므로추후감염성질염진단을위한진단방법비교에서 Gram 염색이나 Pap 도말검사에서의검사자간변이를줄일수있는방법으로시도해보고, Affirm VPIII 검사에서질내정상균무리에의한위양성을줄이기위하여제시한검출한계를다른분자유전학적방법으로확인해볼필요가있을것으로사료되었다. 결론적으로 T. vaginalis, G. vaginalis, Candida spp. 에의한감염성질염을진단하기위하여 Affirm VPIII 검사, Pap 도말검사및 Gram 염색등 3종류의진단방법을비교한본연구를통하여, DNA 교잡기술을사용한 Affirm VPIII 검사가 Pap 도말검사에비해민감도가높고 Gram 염색보다는특이도가높으며, 검사방법이신속간편하고판독이용이한유용한방법으로판단되었다. 참고문헌 1. Van Der Pol B. Diagnosing Vaginal Infections: It's Time to Join the 21st Century. Curr Infect Dis Rep 2010;12: Kent HL. Epidemiology of vaginitis. Am J Obstet Gynecol 1991; 165: Angotti LB, Lambert LC, Soper DE. Vaginitis: making sense of overthecounter treatment options. Infect Dis Obstet Gynecol 2007;2007: Gravett MG, Hummel D, Eschenbach DA, Holmes KK. Preterm labor associated with subclinical amniotic fluid infection and with bacterial vaginosis. Obstet Gynecol 1986;67: Soper DE, Bump RC, Hurt WG. Bacterial vaginosis and trichomoniasis vaginitis are risk factors for cuff cellulitis after abdominal hysterectomy. Am J Obstet Gynecol 1990;163: Granato PA. Vaginitis: clinical and laboratory aspects for diagnosis. Clin Microbiol Newsletter 2010;32: Brown HL, Fuller DD, Jasper LT, Davis TE, Wright JD. Clinical evaluation of affirm VPIII in the detection and identification of Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis, and Candida species in vaginitis/vaginosis. Infect Dis Obstet Gynecol 2004;12: Gazi H, Degerli K, Kurt O, Teker A, Uyar Y, Caglar H, et al. Use of DNA hybridization test for diagnosing bacterial vaginosis in women with symptoms suggestive of infection. APMIS 2006;114: Levi AW, Harigopal M, Hui P, Schofield K, Chhieng DC. Comparison of Affirm VPIII and Papanicolaou tests in the detection of infectious vaginitis. Am J Clin Pathol 2011;135: Carr PL, Felsenstein D, Friedman RH. Evaluation and management of vaginitis. J Gen Intern Med 1998;13: Schwiertz A, Taras D, Rusch K, Rusch V. Throwing the dice for the diagnosis of vaginal complaints? Ann Clin Microbiol Antimicrob 2006;5: Amsel R, Totten PA, Spiegel CA, Chen KC, Eschenbach D, Holmes KK. Nonspecific vaginitis. Diagnostic criteria and microbial and epidemiologic associations. Am J Med 1983;74: Kingston MA, Bansal D, Carlin EM. 'Shelf life' of Trichomonas vaginalis. Int J STD AIDS 2003;14:289.

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