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효진 내
5 years ago
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1 한국식품영양과학회지 최정호 신광순 경기대학교식품생물공학과 α β β 서론탄수화물은이제까지생체구조물질이나에너지원으로써의역할만이강조되어왔으나 최근세포표면의당단백질이나당지질에결합해있는당쇄 가세포간의인식과접착을통하여세포의분화 정보전달 감염및암화 암전이등을포함한생명현상에깊이관여한다는사실 이밝혀지고있어이에대한관심이집중되고있다 또한과거식이섬유로써밖에그기능을평가받지못했던담자균류 생약재 식용식물및해조류유래의다당류에서항보체활성 항종양활성 식작용증강활성 등의면역조절기능과혈당강하활성 등여러약리작용이발견되고있어주목되고있는데이들은주로신체의항상성 유지와기능의조절역할을담당하는 로써작용하여치료효과를낸다고알려져있다 이들당쇄및다당류가갖는생리활성의규명과그작용기구의해석에는당쇄구조에대한연구가필수적으로요구되고있지만이에대한연구는타생체고분 자화합물인단백질및핵산에비해매우복잡하여신속한연구의진행이어려운부분으로평가되고있다 당쇄의구조결정은구성당의다양성 배열순서 아노머형태 당류간의연결위치 뿐만아니라 분지쇄 구조와특정잔기의수식등에기인하여상당히복잡한양상을갖게되어 분석과응용에큰어려움을안고있다 천년초 는충남지역에서중소단위로생산되고있는선인장류로서 길고굵은가시가많고높이약 까지자라는제주도의백년초 와달리 솜털가시를가지며토양에서약 정도로자라는특성이있다 천년초는여름에는수분이풍부한지역에서성장번식하고 휴면기인겨울에는비닐하우스가없는노지에서도생존하며 병충해에도강한특징을갖는다고알려져있다 천년초의가장큰특징은점질다당을다량으로함유하고있다는점으로이를이용한가공식품및기능성소재개발등이추진되고있다 천년초추출물의생리활성에대한연구로는항산화활성 간손

2 상예방효과 병원성식중독미생물에대한항균효과 항동맥경화효과 등이보고되어있으며 식품에의응용연구로는천년초분말의첨가에의한식빵의노화억제효과가보고되기도하였다 그러나천년초추출물이타식물체에서볼수없는고점도의물성으로인해개발및응용에큰어려움이되고있다 최근저자등은천년초의점질조다당이마우스의폐암전이모델에서강력한항전이활성을나타냄을확인하였으며따라서본연구에서는이들결과와함께활성물질로추정되는천년초다당을분리정제하고 그들의구조분석을행함으로써천년초를새로운기능성소재로개발하기위한기초자료를제공하고자하였다 재료및방법재료본실험에사용된천년초 는 년초충남연기군에서생산된것을 주월드웨이 로부터공급받아 토사일부와잔가시를제거하고물로세척하여실험재료로사용하였다 일반분석방법중성당함량은 를표준물질로하여 법으로 산성당함량은 를표준물질로하여 법으로 단백질함량은표준물질로 을사용하여 법 으로 의신속한정량을위해서는 비색정량법을실험실여건에맞게변형하여사용하였다 한편분자량및정제도측정에사용한 는 각 을장착한 를사용하여 를용매로 로용출하였으며정제다당의분자량은 및 를표준물질로하여얻어진표준곡선과비교하여측정하였다 구성당분석은다당시료를 로 에서 시간가수분해하여각각 유도체 로전환시킨후 로분석하였다 의분석은 μ 이장착된 을이용하였으며표준온도조건 에서분석을실시하였다 구성당의 는 의면적비 에대한반응계수및각구성당의 유도체의분자량으로부터계산하였다 β 의존재를확인하기위한 β β 와의반응성검토는 와 의방법에 겔확산법으로측정하였다 천년초항전이다당의분리및정제 주월드웨이로부터제공받은천년초생채 에 를가하여마쇄하고 시간동안방치하여재료중의 색소를용출시킨후 에서 분간원심분리 하여상등액을제거하였다 천년초잔사는재차 및 로각각 회세척하고그잔사를 과 의혼합용액 과 으로각각 회세척하여건조하였으며탈색된천년초건조분말 을얻었다 은 배부피의증류수를가하고상온에서 시간용해성다당류를추출하였으며 원심분리하여상등액만을회수하였다 여기에최종농도가 가되도록에탄올을첨가하여하룻밤방치한후 발생한침전물을회수하고 에탄올을이용 회세척하였다 침전물은소량의증류수에용해하여 투석막 을이용하여 일간투석을행하고동결건조를거쳐조다당시료인 수율 를얻었다 는증류수로평형화된 에흡착시킨후증류수 의 용액으로단계적으로용출시켰으며 각용출획분은투석과동결건조를거쳐 개획분으로분획하였다 이들중수율이가장양호했던 획분은 로평형화된 에 하고동일 를이용하여용출시켜분자량이상이한 개획분 및 로분획하였다 이중고수율고분자다당인 획분을대상으로농축 투석및동결건조를행하여분석용정제시료로사용하였다 참조 Methylation analysis 에의한구조및결합위치결정다당시료의결합위치결정을위한 는 방법 을실험실여건에맞게일부변형하여실시하였다 건조된다당시료 에 의무수 를가하고교반하여용해시킨후 실험실에서 와 로부터합성한 μ의 를가하여 시간동안반응시켰다 다당이완전히 로전환되도록 필요한경우 를수차례첨가하였고잔존량은 으로확인하였다 화다당은 를이용 회수하고

3 최정호 신광순 로 에서 시간가수분해후 환원및 화과정을거쳐 로전환하고 로분석하였다 분석은 을장착한 과 를이용하여최적온도조건 에서분석하였다 압력 메틸화된시료의유도체는 에의한 분석과 의상대보유시간을조합하여동정하였으며 각화합물의 는 면적과분자응답계수로부터산출하였다 CNC-Ia 의구조해석을위한효소처리 의상세구조를추정하기위해서는구조분석이용이한단편으로분해하여해석해야하므로이를위해일련의효소처리에의한가수분해를행하였다 이때사용한효소는천년초유래다당 의구성당분석결과를참조하여분해에적절하다고추정되는 개효소α 기원 및 β 기원 를선정하였으며제조사가제공한처리조건을실험실조건에맞게응용하여사용하였다 참조 처리 시료 에 에용해시키고 의 를가하여 항온수조에서 시간가수분해를행하고 로 분간중탕하여잔존효소활성을정지시켰다 이반응물을원심분리하여얻은상등액은 로평형화된 을이용하여 상에서분획하여분자량및구성성분이상이한 개획분 과 를획득하였다 처리 처리에서얻어진 시료는 에용해시킨후 을가하여 에서 시간처리하고동일 을이용 상에서분획하여 개획분 과 를얻었으며이를 전체구조해석에사용하였다 실험동물및세포배양생후 주령의자성 를 주중앙실험동물 에서구입하여분양받아일주일간적응을거친후실험에사용하였다 마우스는사육조에 마리씩넣어온도 ± 습도 에서사육하였으며물과사료는자유급식형태로유지하였다 종양세포주인 는한국세포주은행 으로부터분양받아사용하였으며배양은 이함유된 배 지 를이용 하여 습도및 의배양기에서배양하였다 항전이활성 시료의항전이활성은폐 에대한고전이성종양세 포주인 를이용하는실험동물종양전이 모델을이용하였다 실험동물로각각 마우스를 사용하였으며 종양의접종을위해 세포를정맥주사 하였고시료는종양접종 일전에각농도별로 회미정맥을통하여주사하였다 종양 접종 일후에마우스를희생시키고종양의표적기관인폐 를적출하여 용액 에서전이된종양을고정시킨후 종양의군집수를 측정하였다 한편 시료에의한항종양전이효과는종양만 접종한대조군과비교하여산출하였다 μ μ μ μ 결과및고찰 천년초조다당의항전이활성 천년초를탈색처리하여얻어진건조분말 을냉수 추출하고 에탄올침전 투석및동결건조를행하여얻어진 조다당 를대상으로 를이용하여 폐로의암전이에대한억제활성을관찰하였다 에서 보는바와같이시료를투여하지않은대조군에서는평균 개의전이암 가관찰된반해 및 μ 농도로 를 회투여한군에서는각각 개의 가관찰되었다 이러한사실은종양접종 일전 및 μ 의정맥투여로각각 및 의유의한예방적전이억제활성을보인결 과이었다 식물유래생체조절물질 은종양의증식혹 은전이를억제하기위한주요한도구로많이사용되어왔다 실질적으로 들은외래물질에대한숙주의방어 력을증진시킴으로써종양에대한면역요법제재로이용하 고있는데 마우스를이용한종양의실험전이모델에 서식물추출물을포함하는 에의한종양의억제결과는 ± ± ± ± ±

4 α β 주로 혹은 세포등비특이적면역작동세포의활성화에기인하는것으로보고되어있다 의결과에서 의예방적암전이억제활성이 및 μ의저농도혈관투여에의하여 이상의높은전이억제효과를보인결과는타식물추출물에비하여매우우수한결과로판단된다 천년초유래항전이다당의정제및화학적특성천년초유래조다당이갖는항전이활성의본체를규명하기위해 를대상으로각종 를이용하여정제를행하고정제다당의구조적특성을규명하고자하였다 천년초유래조다당 는 를이용하여음이온교환 를행하여비흡착 개획분 과 의 용액으로용출되는 개의흡착획분 으로분획할수있었다 본정제과정에서높은수율을보였던 은 을이용하여겔여과를행하여분자량이상이한 및 로정제할수있었다 천년초에서정제한다당 는 에비해월등한수율 로얻어졌으며이획분의순도및분자량을확인하기위하여 를행한결과 단일 를나타내어비교적 순수하게정제된분자량 의고분자다당체임을확인

5 최정호 신광순 할수있었다 천년초유래정제다당 의화학조성을 살펴본결과는 에나타난바와같이중성당 산성당 로구성되어있었으며일반적으로식물추출 물에서검출되는단백질및 는함유하고있지않았다 한편 를가수분해하여 유도체로전환 하고구성당을분석한결과 는 및 를각각 의높은비율로함유 하고있었으며 그외 와 가미량검출되었 다 의구성당분석결과로미루어 이들은고도로 분지된 으로존재할가능성을강력히시사 한다 일반적으로 은고등식물에서주로발 견되는다당류의일종 으로 구조적특성에따라 형 형 및기타형으로구분된다 형 은측쇄 에 잔기를갖는 β 주쇄로구성된다당을 형은 β 주쇄에 의 위치에서 β 측쇄및비환원말단 잔기를갖 는 β 을 그리고기타형은 측쇄를갖는 를지칭한다 가 와 를높은비율로함유하고 있는사실로부터 는 으로존재할 가능성이시사되었으므로이들이어떤구조로존재하는지 를추정하기위해 형의 β 과특이적 으로반응하여적색침전을형성하는것 으로알려져있 는 β 와의반응성을검토하였다 표 준 β 인 의경우침전환을 형성하였지만 는어떤침전환도관찰되지않았다 는제시하지않았음 따라서 은적어도 형 구조는아님을추측할수있었다 CNC-Ia 의 methylation analysis 에의한당쇄결합양 식해석 다당의구조분석에있어서당쇄의결합양식은다당체의 기본구조를해명한다는점에서가장중요한분석으로알려 져있다 를구성하는당쇄의결합양식을분석하 기위해 를행하고 로분석한 결과는 과 및 에제시한바와같다 는총 종의당쇄결합이검출되었으며 결 합및 결합이높은비율로확인되었다 특히 잔기의경우비환원말단에존재함을의미하는 가높은비율로검출되 었는데이러한사실은측쇄 가 또는 이들의 당이고도로분지된 형태로존재함을 추정할수있었다 또한 가높은비율로존재

하는사실로부터측쇄에붙어있는 잔기는 결합으로연결되어존재함을알수있었다 특이한사항은 가상대적으로높게검출된사실 로써 이는 결합으로연결된 잔기의 와 위치에서또다시측쇄가분지됨을알수있었다 이는오탄당인 가결합가능한모든위치에서분지된다는결과로타다당에서는거의찾아볼수없는특징적결합으로고도로분지됨을반증하고있다

6 하는사실로부터측쇄에붙어있는 잔기는 결합으로연결되어존재함을알수있었다 특이한사항은 가상대적으로높게검출된사실 로써 이는 결합으로연결된 잔기의 와 위치에서또다시측쇄가분지됨을알수있었다 이는오탄당인 가결합가능한모든위치에서분지된다는결과로타다당에서는거의찾아볼수없는특징적결합으로고도로분지됨을반증하고있다 한편 는 결합또한높은비율로검출되었다 이중 가낮은비 율로검출된것은 이천년초다당 의주쇄 를구성하고있음을지적하였다 특히 잔기가 로높게검출된것 은 의주쇄가 형태로존재하며 의존재는 의 및 과 위치에서각각 측쇄가연결되어존재할가능성이확인되었다 특히 에서는 가검출되었는데 및 이는 결합으로연결된 사슬중

7 최정호 신광순 위치에서 가닥의사슬이측쇄로분지됨을나타내는것으로이처럼완전히분지된 잔기의존재는천년초다당에서나타나는특이결합임을인정할수있었다 가분자량 만의다당체이며고도의점성을보유한특성을보인것은아마도주쇄및측쇄의고도분지구조에기인한것으로판단된다 한편 잔기는모두 만으로검출되었는데이는본잔기가 형태로측쇄의말단에존재함을시사한다 이상의결과들은 가고도로분지된 으로존재할가능성이매우높음을강력히시사한다 Exo-α-L-arabinofuranosidase 처리및해석다당은고분자의특성에기인하여전체구조를한번에분석할수있는방법이개발되어있지않으므로 화학적또는효소처리에의해단편을조제하고각단편의미세구조를규명하여최종적으로전체구조를추정하는것이일반적이다 따라서본연구에서는활성다당 를각종효소를처리하여단편화하고이들을정제 분석하고자하였다 의측쇄부분의말단잔기를절단할목적으로 를처리하고 을이용한 를행한결과 에나타난바와같이 및 의 개획분으로정제할수있었다 의 처리단편획분들의구성당을분석한결과는 와같다 저분자획분인 의경우대부분 로구성되어있고그외 가일부함유되어있었으며 고분자획분인 은상대적으로 의함량이급격히감소된결과를보여주었다 는 α 로연결된 에서비환원성말단부터한분자씩 를제거하여 를반응물로만들어내는 의효소이므로 는모두 로존재하는 와일부이에연결된 로구성되어있음을추정할수있었다 또한 주쇄에붙어있는 가비환원말단으로부터분해된결과로 은 사슬이제거된다당형태또는말단 잔기가제거되어짧은 가곁사슬로붙어있는 으로존재함을추정할수있었다 그러나 의처리가 에존재하는모든 를절단할수는없었는데이러한사실은측쇄의 의말단혹은또다른측쇄로 잔기가결합되어있을가능성을강력히시사한다 의 화분석결과에서도 이높은비율로검출된사실과일반적으로 의효소가분지쇄부위에이르면입체구조적장애 를받아절단이어려운특징을보이는점등은이러한사실을잘뒷받침해주었다 Fraction number Fraction number α α β α β

8 Endo-β-(1 4)-galactanase 처리및해석 처리후 고분자로남아있던 은 로재차처리하고동일 을이용 분획한결과 에나타난바와같이 과 의 개획분으로분획할수있었다 이 처리에의해단편을생성했다는사실 은면역활성다당 중에 β 이존재할가능성과측쇄로비환원말단 를갖는 β 이 으로존재할가능성이강력히시사되었다 천년초의면역활성다당 CNC-Ia 의전체구조추정 의결합양식분석과 차례의효소처리과정을거쳐얻어진단편의구조적해석을행하고이들로부터얻어진모든정보를종합한결과 천년초의주다당체 의예상되는전체구조는 에도식화한바와같다 즉 은 주쇄는 β 결합으로연결된 으로존재하며주쇄의대부분은 의 위치에서한가닥 및 위치에서두가닥또는 위치에서동시에세가닥의측쇄가연결되어존재한다 측쇄는주로 α 결합으로연결된짧은 로구성된 당으로존재하며일부 α 결합의 사슬이연결되어있다 α 결합으로연결된 잔기의 위치에서한가닥또는 α 결합의 사슬의 및 위치에서두가닥 의비환원말단 가다시연결된구조로존재함을추정할수있었다 결론적으로천년초유래다당 는큰의미에서 에속하는다당이나 주쇄가 측쇄에의해고도로분지된구조를형성하고있으며 측쇄는다시비환원말단의 가고도로결합된특이다당류로최종제안되었다 요약천년초에존재하는점질다당의새로운이용방안을모색하기위해천년초로부터다당을분리하여항전이활성을평가하고구조분석을행하였다 종양세포를이용한폐암전이모델에서천년초조다당 는농도의존적으로높은항전이활성을나타냈다 천년초조다당 는 및 를이용한연속적 를행하여 으로정제하고이들의구조적특성을검토하였다 는분자량약 의다당체로구성당조성을확인한결과 및 를높은비율로함유하고있었으며 와 를미량함유하고있었다 본당쇄의결합양식을규명하기위해 를행한결과 은 와를포함한총 종의결합으로구성되어있었으며 및 와같은 종의 고유의특징적결합을포함하고있었다 또한 의미세구조를규명하기위해 α 와 β를이용한연속가수분해및해석도행하였다 이상의결과로부터천년초유래다당 는 β 주쇄에 당이측쇄로분지된 으로판단되었으며주쇄및측쇄모두고도로분지된특징이있음을알수있었다 감사의글본연구는 주월드웨이의연구비지원에의하여수행되었으며이에감사드립니다

9 최정호 신광순 문 β β 헌 년 월 일접수 년 월 일채택

Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No μ μ

Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,