초고해상도미세영상기법을이용한 Mouse 뇌의자기공명영상연구 한덕영 1 윤문현 2 최보영 2 목적 : 본연구는핵자기공명분광기를개조한미세영상기법을이용하여, 동물실험에주류를이루는 mouse를대상으로, 0.1 mm 이내의초고해상도자기공명영상을 5분정도시간안에획득할수있는방법을개발하고자하였다, 대상및방법 : 사용된 mouse는 C57BL/6로서무게 50 그램이내의 mouse를사용하였다. 본연구에활용된초전도자석은구경 89 mm, 4.7 T 의자기장세기를가진수직형자석이며, 사용된샘플코일의직경은 30 mm 이고, 사용된펄스시퀀스는 fast spin echo (FSE) 및 gradient echo (GE) 기법들이다. 결과 : 최적의자기공명영상파라미터를확보하면서 2차원영상으로서수소밀도및 T2 강조영상을획득하였다. 영상으로부터 mouse 뇌의미세부분까지상세히해부학적구조를확인할수있었고, 또한입체적인정보를획득하기위하여 3D 영상도부가적으로획득하였다. 조영제를이용한 dynamic contrast 연구에 3D 영상이매우유용하였다. 결론 : 본연구를통하여 mouse 뇌에대한고해상도자기공명영상획득을위한최적의파라미터를확보할수있었고, 또한성공적인자기공명영상도획득하였다. 즉, 사람이나다른소동물뇌의경우와같이 mouse 뇌조직의다양한부위의미세부분을확인할수있는충분한고해상도의영상을획득하였다. 최근국내에서 mouse를이용한자기공명영상연구가시작되었으나아직초기단계라고평가할수있고, mouse는다른동물에비하여취급 / 관리하기쉬우므로향후 mouse를이용한뇌연구가활성화될것으로사료된다. 서론자기공명영상 (magnetic resonance imaging: MRI) 의장점은살아있는상태에서, 비파괴적으로, 생체내부의고해상도영상을조영제의도움없이도얻을수있는것이다. 다양한연부조직 (soft tissue) 들에대해, CT 나초음파에의한영상보다고해상도의영상을제공할수있고, 생체에비침습적인방법으로서의무해하다는것도장점이다. 따라서실험동물로많이사용되는 mouse에대한연구에 MRI 기법을사용하고자하는 의도는매우타당하다고사료된다 (1, 2). mouse에대한 MRI 영상연구에임상용 MRI 기기를사용하는것은사용상의문제점도있으려니와, mouse에적절한고해상도의영상을얻을수있는프로브를얻기힘들고, 영상변수들을최적화하는것도쉽지않다. 따라서 mouse에대한 MRI 연구를하기위하여는일반적으로동물용 MRI 전용기기가필요하며현재국내에도한국기초과학지원연구원을비롯한몇몇대학병원에서도입되어운영되고있다. 그러나동물용 MRI 전용기기가없는경우에도기존의 NMR 장비를개조한 micro-imaging 장비를활용하면, 일반 NMR 대한자기공명의과학회지 12:142-147(2008) 1 한국기초과학지원연구원나노바이오팀 2 가톨릭대학교의과대학의공학교실접수 : 2008 년 12 월 7 일, 채택 : 2008 년 12 월 12 일통신저자 : 최보영, (137-701) 서울시서초구반포동 505 번지, 가톨릭대학교의과대학의공학교실 Tel. (02)-590-2427 Fax (02)-590-2425 E-mail: bychoe@catholilc.ac.kr - 142-
초고해상도미세영상기법을이용한 Mouse 뇌의자기공명영상연구 실험실에서도 mouse에대한고해상도의영상연구가가능하다. 그이유는 NMR 실험실에서는기본적으로 4.7 T 이상의자기장을제공하는초전도자석과수소뿐아니라, 핵스핀이있는대부분의핵종들, 예를들면중수소, 탄소, 인, 질소등에서나오는핵자기공명신호들을측정할수있는분광기가구비되어있기때문이다. NMR 장비를 MRI 장비로변환하기위하여필요한것은영상을만들어내는데필요한 frequency encoding 및 phase encoding 을수행할수있는기능만추가하면된다. 하드웨어측면에서볼때, NMR 장비에, 경사자기장을만들수있는, gradient amplifier 와 gradient 코일, 그리고핵자기공명신호를수신할수있는프로브만추가하면, MRI 장비로전용될수있다. 이와같이 NMR 로부터개조된 micro-imaging 장비는자동화된동물전용 MR 장비의운용에비하여, 각요소를최적화할수있는전문적인인력이요구되는단점은있으나, 장비의모든요소를제어할수있다는면에서, 새로운 MR 기법연구에는적합한장점도있다. 전통적으로 NMR 장비는 Unix 를기반으로한 OS 위에, GUI 운용소프트웨어가탑재되어있는데, 펄스시퀀스를포함한대부분의프로그램이 C 로쓰여져있다. 따라서사용자가연구의목적에따라다양한펄스시퀀스를쓰는것이허용되어있다. 또한모든실험과정이수동으로이루어지며, 최적화를하게되므로, 영상의질이뛰어나다. 관련소프트웨어가사용자에게편리하지는않지만, 하드웨어의각부분을제어할수있는기본적인모든요소가주어졌기때문에, 새로운기능을사용자가필요에따라추가할수있다. 이런점들은임상용기기에서는불가능한일들이다. 하드웨어적인면에서보면, NMR 기기들은 4.7 T 이상의수직형초전도자석을사용한다. 다양한프로브를갖춘임상용이나동물전용 MR 기기에비하여, micro-imaging 기기는하나의프로브로 mouse의모든부위에대한영상을얻는다. 대부분의경우, 하나의프로브로도임상에서와같은 MRI, MRS 의모든기법들을모든부위에대하여적용할수있다. 이것이가능한이유는프로브에들어가는 mouse의 filling factor가크기때문에, 매우높은 S/N 비가보장되기때문이다. Filling factor란프로브내의전체공간중에서실제로시료가차지하는공간의비율로 1 에가까울수록동일프로브내의신호는커지게된다. 이 filling factor 는 MR physics 에서많이쓰이는 90 도펄스에필요한 rf-amplifier의요구조건에도본논문에서는 micro-imaging 장비를이용한다양한영상연구가가능함을보이고자한다 (3-5). 결론적으로, micro-imaging은임상용 MRI 장비에비하여몇배높은자기장 (1-3T vs 4.7-14.1T) 을가짐과동시에프로브내에서측정대상의 filling factor가높다는두가지요인에의하여수소핵자기공명신호의감도가매우높아지게된다. 이런고감도의신호획득이가능하기때문에, 작은 pixel (0.1-0.01 mm 해상도 ) 의 MRI 영상및작은 voxel ( 한변이 1-2 mm 인정육면체 ) 에대한 MRS 연구가가능하다. 이상의논의 를정리하면다음과같다. 첫째, 자기장이높고 (4.7~14.1 Tesla) rf-코일내의 filling factor가매우크기때문에, 고해상도의영상과 MRS 연구가가능하다. 둘째, 프로브내경의크기가 mouse의크기와비슷하므로, mouse 전체의 3 차원영상획득이비교적짧은시간에가능하다. 2차원영상에비하여 3차원영상은 mouse의상태를한층더용이하게파악할수있게해준다. 셋째, 3차원영상에입각하여원하는 ROI를정확히파악할수있으며, MRS 를위한 3차원 voxel의위치선정도매우정확하게할수있다. 본논문의목적은핵자기공명분광기를개조한 microimaging 기법을이용하여, 동물실험에주류를이루는 mouse 를대상으로, 0.1 mm 이내의초고해상도자기공명영상을 5 분정도시간안에획득할수있는방법을개발하고자하였고, 이기술을토대로국내 micro-imaging 관련연구자들에게본실험실에서얻는 mouse의 2차원및 3차원영상의질을소개함으로써 mouse를이용한 MRI 연구가필요한연구자들에게는현재의연구상태를알리어참고가되고, 비슷한관련연구를수행하는실험자들과상호교류의장을활짝열고자하였다. 대상및방법마우스처리방법실험용 mouse로는가장일반적으로많이쓰이는 C57BL/6 를사용하였다. 복강에주사로마취액을주입하였으며, NMR 장비에변온실험용으로장착되어있는온도조절용공기를섭씨 35 도를유지하여마취된 mouse에게공급하였다. 이와같은온도조절은 mouse의생환에매우중요하였으며, 본실험실에서실시한 6개월간 20 마리의 mouse에대하여 240 여회의실험을진행하였던경우에도단 2 마리만폐사하였었다. 마취액은케타민 ( 유한양행제품 ) 과럼푼 ( 바이엘코리아제품 ) 을 50 대 50으로혼합하였고용량은 30 ml/kg을사용하였다. 마취시간은 2 시간내외로지속되었다. 실험시간을자유롭게조절할수있는가스에의한마취법보다는제약이있지만본실험실에서수행한거의모든실험에복강마취는충분히유용하였다. 실험프로토콜 Micro-imaging 기기는 NMR 기기를개조한것이기때문에, 모든실험변수들을단계적으로최적화하는과정이필요하다. 이과정은복잡하지않으며, 따라서단점이라기보다는높은 S/N 의영상을얻기위하여반드시필요한과정이라고할수있다. mouse를마취한후영상획득실험순서는다음과같다. 1. single hard pulse를사용하며, 얻어진신호를 Fourier 변환한다. 이신호는프로브내의 mouse 샘플전체에서오는신호이다. mouse의 NMR peak 는지방과물의 peak로양분 - 143-
한덕영외 되며, 각각의위치는, TMS를기준으로, 4.7 ppm 및 1.1 ppm 에나오게된다. shimming 을하여각각의 linewidth 가 1 ppm 이내로하여준다. 본실험실의경우에는 4.7 T 의초전도자석을사용하였기때문에 1 ppm 은약 200 Hz 에해당한다. rf-pulse 의 carrier frequency 를 on-resonance 조건으로맞추어준다. single pulse 의길이를변하여가며, 180 도펄스의조건을찾는다. 여기에서주어진조건은주어진샘플에대한프로브의특성으로파악될수있으며, 후에사용될다른영상기법들의 90 도 pulse 의최적조건을확립하는데이용된다. 2. 고속영상기법을이용하여 scout image를얻는다. 주로 gradient echo 기법이나 fast spin echo 기법을이용한다. 양기법모두여러면에대한영상을얻을수있다. 실험시간은 10초내외이다. 3. 원하는부위가결정되면, 고해상도의영상을얻는다. 대부분의경우 fast spin echo 기법을이용하였다. 원하는평면과부위가결정되면 matrix size 와 ROI 를조절하여최적화된영상을얻는다. 마이크로이메이징기기사양사용된기기는미국베리안회사의 Unity Inova 모델이며, 초전도자석및기기의하드웨어사양은 Table 1 과같다. Table 1. Hardware Specifications Magnet type 4.7T vertical type Magnet ID 89 mm Shimming unit (OD/ID) 89/73 mm Gradient 코일 (OD/ID) 73/45 mm Probe (OD/ID) 45/30 mm Rf-코일 (ID/length) 30/50 mm Max. Field Gradient 80G/cm rf-amplifier output 100 Watt 결과그림 1-4 는 mouse에대한 2차원및 3차원영상자료들이다. 그림 1은 mouse 뇌의 sagittal 영상을얻은것이다. 영상의 ROI 는 30 20 mm였으며, matrix 는 512 256 이었다. 영상획득시간, 4분 10초. TR/TE 시간은 2000/13 ms이며, 수소농도영상조건이다. 여기에제시된 2 차원영상의 slice thickness 는공히 1 mm 이다. 펄스시퀀스기법은 fast spin echo (FSE) 를사용하였고, ETL 8, NEX 4를사용하였다. 부수적으로 mouse의이와눈으로가는신경들도확인할수있다. 여기서얻은모든영상들은 mouse가살아있는상태에서얻은것들이다. 그림 2 는 mouse의눈을포함한평면에대한수소밀도영상과 T2 강조영상을대비하여놓았다. T2 영상의포인트라고할수있는 CSF 부분이분명히구분되었다. 각각의영상획득시간은 1분 2초및 6분 17초였다. ROI 는공히 40 20 mm, matrix 512 256을사용하였다. 그림 3 은뇌부위에 ROI를한정함으로써관심있는부위만을확대하는효과를얻을수있음을보여주고있다. ROI는 20 15 mm, matrix는 512 256 이었다. 영상획득시간은 4분 14초였고, 눈의미세구조가잘확인되었다. 이상의결과로판단하건대, 뇌의해부학적정보를 39 59 마이크론정도의해상도로어렵지않게얻을수있음을알수있었다. 그림 4 는 mouse의머리부분과다리부분에대한 3차원영 Fig. 1. Sagittal image of mouse brain. ROI, 30 20 mm; Matrix, 512 256; image acquisition time, 4 min. 10 sec. a b Fig. 2. (a) Proton density image (b) T2 weighted image. Fast spin echo is used respectively, with TR/TE, 2000/13, 2000/30 ms; ETL 8; NEX 1, 6. Image acquisition time was 1 min. 2 sec and 6 min. 17 sec., respectively. - 144-
초고해상도미세영상기법을이용한 Mouse 뇌의자기공명영상연구 상을 in-vivo 상태에서구한것이다. mouse 상반신에대한 3 차원영상이내부혈관과함께나타나있음을볼수있다. Maximum intensity projection 방법으로표시하였다. 다리부분의영상은 Gd 제재를정맥주사 5분후획득한영상이다. 크게밝은부분은신장이며, 작고밝은부분은암조직이다. 3 차원영상기법은암조직, 지방조직과같이 3차원적공간및부피변화를관측해야하는경우특히유용할것으로판단된다. 두영상의획득시간은각각 5분소요되었으며, ROI 및 matrix 는 50 30 30 mm, 256 128 128 이었다. 영상기법으로는 gradient echo가사용되었다. 고 찰 Fig. 3. ROI is reduced from the condition of figure 2. ROI, 20 15 mm; Matrix, 512 256. Image acquisition time was 4 min. 14sec. 초고해상도자기공명영상의장점으로서, 고자장 NMR 기기를개조한 micro-imaging은 mouse의크기에최적화된프로브코일의크기때문에, mouse에대한 100 마이크론이하의초고해상도영상이 5분이내의시간에가능하였다. NMR 기기가가지는고자기장과프로브내에서시료의 filling factor 가높았기때문에, 높은 S/N의 MR 신호획득이가능하였다. NMR physicist 들에게는실험과정에서핵스핀들에일어나는모든일들과하드웨어에서실제로수행되는일들을숙지하는것이일반적이며, 기존의 NMR 실험변수를최적화하는것과같은과정을거쳐 MR 영상실험의최적화조건을찾아낼수있다. 그럼으로써, 자동화된기기에비하여더정밀하게실험조건을설정할수있다. 초고해상도자기공명영상획득시어려운점은수직형자석을사용하기때문에, mouse를적절한위치에위치하기가쉽지않다. 또한소동물전용기기처럼필요한주변장치들이없어, 직접개발하여야하는어려움이있다. 그러나실험을수행하면서외국전문연구자들의자문을받아하드웨어및소프트웨어상문제점들을해결하였다. 국내에서는아직소동물전용기기이외의기기로 mouse MR 영상연구를하는실험실은없기때문에본연구결과를토대로앞으로많이시도할필요성이있다고사 a b Fig. 4. Three-dimensional images for cranial and inferior part of mouse. (a) Head image obtained without contrast agent (b) Cancer tissue image contrasted by Gd-based agent. - 145-
한덕영외 료된다. 기존초고해상도영상의현황으로서최근국제적으로 mouse 에대한 MR 연구가매우활발하다. 국내에도소동물전용 MR 기기가한국기초과학지원연구원을포함하여, 여러곳에설치되어운용중이며, 최근에는국제적인학술지에도발표된바있다. 그러나아직국내의관련연구는초창기에해당한다고볼수있고앞으로국내의관련연구자들간활발한교류가있기를희망한다. 본실험실의장비는전술한대로 NMR 장비를개조한것이기때문에, mouse 이외의다른동물, 예를들어 rat 에대한 MR 연구는불가능하다. 또한자기장이 4.7 T 이어서, 현재나오는 9.4 T 이상의기기들에비하여불리한점이있다. 그러나본문에서도지적된바와같이, 신호의세기는자기장의세기에도의존하지만프로브의성능에서도많은차이가있을수있고, 실험의최적변수에도상당부분의존한다. 지금의연구결과는본인들이앞으로진행하려는연구목적에적합하기때문에, 하드웨어의사양에대하여부족함을느끼지는않는다. 그러나앞으로표면코일을개발하여활용할계획은가지고있다. 향후본연구팀은 mouse의뇌를주대상으로연구를진행할계획이다. 3 차원영상의 ROI 를뇌에만한정하여, 50 미크론미만의영상을 10분이내에얻는것을목표로하고있다. 이와같은초고해상도 3차원영상을이용함으로써, 정확한 voxel 을설정하고, 1-, 2-차원 MRS 기법개발을추진할계획이다 (6-9). mouse의마취방법에있어서도가스에의한방법으로실험시간을자유로이제어할계획이며, 나아가심장박동및호흡과동기화되는펄스기법과하드웨어를개발하여, 초고해상도영상을뇌뿐아니라전신이가능하도록준비중이다 (10). 결론 NMR 장비를개조한 micro-imaging 장비를이용하여, mouse의뇌에대한고해상도영상을얻을수있었다. 영상의해상도는소동물전용기기와대등하였다. 이것이가능한이유는프로브의 filling factor 가높은것과, 4.7T 의고자기장, 그리고최적화된실험변수에기인하는것으로추정된다. 3차원영상을통하여 mouse의상반신혹은하반신에대한 3차원해부학적정보를얻을수있었다. 앞으로이와같은고해상도의 2 차원및 3 차원영상을이용한 mouse뇌의영상정보와정확한 voxel 설정에이은 MRS 연구를추진하고있다. 본학회지에서 mouse에대한 MRI 연구발표가이보고서가처음인것은의외로생각하며, 앞으로 mouse 관련 MRI 관련연구자들의정보교환이활성화되기를저자들은기대하며, 다양한분야의기초의학연구자들과의공동연구도바라고있다 (5, 10-13). Acknowledgement 본연구는한국기초과학지원연구원서울센터기관고유사업으로지원되었고, 또한 Seoul R&BD Program (10550), the Korea Health 21 R&D Project, Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (02-PJ3-PG6-EV07-0002) (A081057) and a grant (R01-2007-000-20782-0) from the Purpose Basic Research Grant of the KOSEF로지원되었다. 참고문헌 1.Pautler RG. Mouse MRI: Concepts and applications in physiology. Physiology 2004;19:168-175 2.Kovacevic N, Henderson JT, Chan E, Lifshitz N, Bishop J, Evanx AC, Henckelman RM, Chen XJ. A 3-dimensional MRI atlas of the mouse brain with estimates of the average and variability. Cerebral Cortex 2005;15: 639-645 3.Natt O, Watanabe Boretius TS, Radulovic, Frahm JJ, Michaelis T. High-resolution 3D MRI of mouse brain reveals small cerebral structure in vivo. J. Neuro. Meth. 2002;120:203-209 4.Falangnola MF, Dyakin VV, Lee SP, Bogart A, Babb JS, Duff K, Nixon R, Heipern JA. Quantitative MRI reveals aging-associated T2 changes in mouse models of Alzheimer s disease. NMR in Biomedicine 2007; 20: 343-351 5.Na HB, Lee JH, An K, Park YI, Park M, Lee IS, Nam DH, Kim ST, Kim SH, Kim SW, Lim KH, Kim K, Kim SO, Hyeon T. Development of a T1 contrast agent for MRI using MnO nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 2007;46,:5397-5401 6.Frahm J, Bruhn H, Gyngell ML, Merboldt KD, Hanicke W, Sauter R. Localized high resolution proton NMR spectroscopy using stimulated echoes: initial application to human brain in vivo. Magn. Reson. Med. 1989;9:79-93 7.Yongbi NM, Payne GS, Collins DJ, Leach MO. Quantification of signal selection efficiency, extra volume suppression and contamination for ISIS, STEAM and PRESS localized 1H NMR spectroscopy using an EEC localization test object. Phys. Med. Bio. 1995;40:1293-1302 8.Lange T, Schulte R, Boesiger P. Quantitative J-resolved prostate spectroscopy using two-dimensional prior-knowledge fitting. Mag. Reson. Med. 2008;59:966-972 9.Thomas MA, Hattori N, Umeda M, Sawada T, Naruse S. Evaluation of two-dimension L-COSY and JPRESS using a 3T MRI scanner: from phantoms to human brain in vivo. NMR in Biomedicine 2003;16:245-251 10.Guilfoyle DN, Dyakin VV, OShea J, Pell, JA Helpern GS. Quantitative measurements of proton spin-lattice (T1) and spin-spin (T2) relaxation times in the mouse brain at 7T. Mag. Reson. Med. 2003;49:576-580 11.Benveniste H, Blackband S. MR microscopy and high resolution small animal MRI: application in neuroscience research. Prog. Neurobiol. 2002;67: 393-420 12.Dhenian M, Ruffins SW, Jacobs RE. Three-dimensional mouseatlas using high-resolution MRI. Dev. Biol. 2001;232:458-470 13.Watanabe T, Michaelis T, Frahm J. Mapping of retinal projections in the living rat using high-resolution 3D gradient-echo MRI with Mn++ induced contrast. Magn. Reson. Med. 2001;46:424-429 - 146-
초고해상도미세영상기법을이용한 Mouse 뇌의자기공명영상연구 J. Korean Soc. Magn. Reson. Med. 12:142-147(2008) High-Resolution MRI Study on Mouse Brain Using Micro-Imaging Doug-Young Han 1, Moon-Hyun Yoon 2, Bo-Young Choe 2 1 Nano-bio team, Korea Basic Science Institute, Seoul, Korea 2 Department of Biomedical Engineering, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea Purpose : By using the micro-imaging unit modified from NMR spectrometer, the high resolution MRI protocols of finer than 100 micron in 5 minutes, is sought for mouse, which plays a central role in animal studies Materials and Methods : C57BL/6 mouse, lighter than 50 gram, is used for the experiments. The superconducting magnet is vertical type with 89 mm inner diameter at 4.9 Tesla. The diameter of rf-coil is 30 mm. Mostly used techniques are the fast spin echo and the gradient echo pulse sequence. Results : For 2D images, proton density and T2 weighted images are obtained and their optimum experimental variables were sought. Minute structure of mouse brain can be recognized and 3D brain image is also obtained additionally. 3D image will be useful particularly for the dynamic contrast study using various contrast agents. Conclusion : Like the case of human and other small animals, the high resolution of mouse brain is e- nough to recognize the minute structure of it. Recently, similar studies are reported domestically, but it seems only a beginning stage. Due to easiness of breeding /control, mouse MRI study will soon play a vital part in brain study. Index words : Micro-imaging Mouse brain 2D/3D imaging Proton density T2-weighted MR imaging Corresponding author : Bo-Young Choe, Ph.D., Department of Biomedical Engineering, College of Medicine, The Catholic University of Korea, #505 Banpo-Dong, Seocho-Gu, Seoul 137-040, Korea. Tel. 82-2-590-2427 Fax. 82-2-590-2435 E-mail: bychoe@catholilc.ac. kr - 147-