6Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS 와 Mass Profiler Professional 을이용한위스키내비휘발성물질의 UHPLC/MS 프로파일링 응용자료 식품 저자 Thomas S. Collins, Susan E. Ebeler Department of Viticulture & Enology and the Food Safety and Measurement Facility University of California Davis, CA USA 개요 UHPLC와 accurate-mass Q-TOF 질량분석기의연결, 그리고다변량통계분석과의조합은위스키프로파일링에있어유망한도구임이입증되어왔습니다. 이러한기법을통해위스키종류, 버번생산업체, 위스키숙성기간에따른판별을할수있게하는화합물을식별할수있습니다. Jerry A. Zweigenbaum Agilent Technologies, Inc. Wilmington, DE USA
소개 미국위스키산업이산지의지역경제및전미국경제에미치는영향이높기때문에, 생산업체들은위조를비롯한각종사기수법에공격받기쉽습니다. 프로세스최적화또한위스키생산업체들의핵심동력입니다. 위스키의화학적조성및그변화요인들에대한상세한이해는고품질제품의효율적생산을촉진하고각종사기행위로부터제품을보호하는데도움이될수있습니다. 위스키조성연구를위해다양한분석적접근을사용해왔습니다. 위스키분석법은복잡한시료전처리과정없이빠르게진행될수있어야함과동시에다수의화합물분리및식별이가능해야합니다. Quadrupole time-of-flight (Q-TOF) MS 를이용한초고압액체크로마토그래피 / 질량분석기 (UHPLC/MS) 가바로그러한요건을충족시키는분석법입니다. 이응용자료에서는 63 종의버번, 호밀, 테네시및기타미국산위스키내비휘발성성분에대한비표적 UHPLC/Q-TOF MS 분석을사용하는발표된연구를설명합니다 [1]. 이분석법을 Mass Profiler Professional (MPP) 을이용한다변량통계분석과결합하여다양한위스키종류를판별할수있는화합물을최적으로검출할수있습니다. Agilent 6530 Q-TOF LC/MS 는화학식결정에필요한질량정확도를제공하며, 다수의관심대상화합물에대한구조를규명할수있는탠덤질량분석기 (MS/MS) 성능을제공합니다. 이접근법을통해위스키종류, 버번생산업체, 위스키숙성기간에대한판별정보를제공하는화합물세트 ( 세트당대략 40 개화합물로구성 ) 를식별하였습니다. 이분석법에서는시료전처리가필요하지않으며, 12 분만에크로마토그래피분리가완료되므로프로세스최적화및품질관리에적합합니다. 실험 위스키본연구에서는버번 37종, 호밀위스키 13종, 테네시위스키 6종, 기타미국산위스키 7종등시판중인 63종의위스키시료를분석하였습니다. 분석은미개봉순수 ( 아무것도타지않은 ) 위스키를대상으로진행하였습니다. 각시료에대해무작위순서로 UHPLC/MS 분석을 3회반복수행하였으며, 시료마다프로파일링을위한비표적 MS 분석과마커화합물식별을위한 Auto MS/MS 분석을수행하였습니다. 시약및표준물질시약및참조표준물질은문헌에설명된것과같이구하여사용하였습니다 [1]. 실험기기이프로파일링접근법은 Agilent 1290 Infinity LC 시스템과 Agilent 6530 Q-TOF LC/MS를연결하여개발하였습니다. HPLC와 MS 분석조건은표 1에정리되어있습니다. 표 1. 기기분석조건 LC 조건 컬럼 Agilent ZORBAX Eclipse Plus RRHD C18, 5cm 2.1mm, 1.8μm (p/n 959757-902) 컬럼온도 60 C 주입량 5µL 이동상 A) 0.1 % Acetic acid in water B) 20 % A/80 % Methanol 유량 0.6mL/ 분 그레디언트 시간 ( 분 ) % A % B 0.00 97 3 1.00 97 3 선형그레디언트 9.00 0 100 10.00 0 100 11.00 97 3 12.00 97 3 총분석시간 12분 Q-TOF MS 조건 이온화모드 ESI, 음이온 수집모드 Profile 및 centroid 수집속도 3 spectra/ 초 질량범위 m/z 75 1,500 N 2 건조가스온도 350 C N 2 건조가스유량 10L/ 분 분무기압력 45 psig Sheath 가스온도 400 C Sheath 가스유량 11L/ 분 캐필러리전압 3,000V 노즐전압 1,000V Q-TOF Auto MS/MS 조건 수집속도 MS 및 MS/MS에대해 3 spectra/ 초 질량범위 m/z 75 1,500( 단일 MS), m/z 50 1,450(MS/MS) Octopole 1 RF 전압 750V Skimmer 전압 65V Fragmentor 전압 175V 충돌에너지 20eV 분리폭 전구이온왼쪽으로 0.3 Da, 전구체이온의 오른쪽으로 3.7 Da ( 중간 ) 전구이온선택 최대존재비에서 2, 임계값 200 cps Active exclusion 2 spectra 및 0.1분후 2
데이터분석 LC/MS 데이터의초기처리에는 Agilent MassHunter Qualitative Analysis 소프트웨어 (6.00 버전 ) 를사용하였으며, 화합물은소프트웨어의 Molecular Feature Extractor(MFE) 도구를사용해밝혀냈습니다. 세트내시료의질량과머무름시간데이터를정렬하고, 주성분분석 (PCA) 을포함한시료프로파일링에필요한통계분석을수행하기위해 Agilent Mass Profiler Professional (MPP) 소프트웨어 (12.6.1 버전 ) 를사용하였습니다. MS/MS 스펙트럼에기반한화합물식별에는 Agilent Metlin Metabolite Personal Compound Database & Library (PCDL, 5.0 버전 ) 를사용하였습니다. 결과및토의 버번, 테네시, 호밀위스키의비교버번, 호밀, 테네시위스키의판별을위해 PCA 분석을수행하였습니다. 미국식블렌딩및수제위스키는다른위스키와의차이가확연하여, 이시료세트에서제외하였습니다 ( 그림 1). 대부분의테네시위스키는버번및호밀위스키와구별되었으나몇종은테네시위스키가다른종류와뚜렷하게구분되는것을막으며분리되지않았습니다. 호밀위스키는버번위스키에대해일부가구별되었으며, 버번위스키와잘구별된호밀위스키는주로호밀위스키에중점을둔소규모생산업체들의것이었습니다. 반대로호밀위스키와버번위스키를모두생산하는업체의호밀위스키에서는버번위스키와구별이잘되지않는양상이나타났습니다. 위스키종류를판별할수있는화합물의식별모든위스키시료는 3회반복분석하였습니다. MFE를이용한피크식별및 MPP를이용한질량과머무름시간정렬을통해, 모든위스키시료에약 7,600종의화합물이존재함을밝혀냈습니다. 한시료의모든반복분석에서검출되지않은화합물을제외시킨결과, 그수가 3,100종으로줄어들었습니다. 다음스크리닝단계에서적어도한위스키종류의모든시료에존재하지않는화합물을제외시킨결과, 총 266종의화합물이남았습니다. 최소피크존재비수준인 1 10 6 카운트를충족하는화합물만을선택하면, 세트는 43종으로줄어들게됩니다. 분산분석 (ANOVA) 을통해 p < 0.05 수준에서변이를보이는화합물들로제한한결과, 최종적으로 40종의화합물세트가남았으며, 이들을대상으로이후의통계분석을수행하였습니다. 그림 1. MPP 로생성한 60 종의버번, 호밀및테네시위스키에대한 2 차원 (2D) PCA 도표. 테네시위스키와호밀위스키사이의부분적인구별이나타남 3
여러생산업체의버번비교 주요버번생산업체의위스키특성규명에가장적합한화합물을사용하기위해, 이생산업체들의 35 가지위스키를 MPP 로다시분석하였습니다. 이시료들은총원본시료세트와동일한방법으로필터링하였습니다. 2D PCA 도표는 4 번생산업체의버번위스키만이나머지 5 개주요생산업체의제품과뚜렷하게구별되었다는것을그래프로나타냈습니다 ( 그림 2). 위스키숙성기간판별주요생산업체의 33가지위스키를숙성기간에따라 4년이하, 4 ~ 8년및8년이상의 3개카테고리로분류하였습니다. 그림 3은각위스키의 3회분석평균값을이용한 PCA 결과를보여줍니다. 숙성기간이중간 (4 ~ 8 년 ) 인위스키들은숙성기간이최장인위스키들과완벽하게구별되지않은반면, 숙성기간이가장짧은그룹 ( 4년이하 ) 의위스키들은나머지위스키들과구별되었습니다. 숙성기간을완벽하게구별할수없었던이유중일부는여러제품의정확한숙성기간정보를얻는것이어렵기때문일수있습니다. 특히, 일부 8년이상숙성된위스키는여러숙성기간의위스키들을혼합한제품일수있습니다. 그림 2. MPP 로생성된버번생산업체 6 곳의 35 개위스키에대한 2D PCA 도표, 4 번생산업체의나머지위스키생산업체에대한뚜렷한구별을보여줌 그림 3. MPP 로생성된다양한숙성기간의위스키에대한 2D PCA 도표. 4 년이상숙성된위스키와 4 년이하숙성된위스키간구별가능 4
표 2 는위스키숙성기간과관련이있는화합물을보여줍니다. 위스키시료의 Auto MS/MS 스펙트럼은 Metlin PCDL 에대한 MS/MS 라이브러리검색및문헌상스펙트럼과 MS/MS 스펙트럼의비교를통해식별하였습니다 [2]. 예상한대로, 나무와관련된화합물들이각위스키숙성기간카테고리와연관되어있었습니다. 가장짧은숙성기간의위스키들은짧은사슬 (C8 C12) 의지질및지방산에의해특성이규명되었고, 가장긴숙성기간의위스키들은긴사슬 (C18, C20) 의지방산과연관되어있었습니다. 표 2. 위스키숙성기간과관련된화합물 화합물 Accurate mass RT ( 분 ) 식별기준 숙성기간이상대적으로짧은위스키 Octanoic acid 144.1097 7.30 Metlin MS/MS* Decanoic acid 172.1459 8.56 Metlin MS/MS Coniferaldehyde 178.0502 4.08 Metlin MS/MS Diferulic acid 386.094 3.54 Metlin MS/MS 숙성기간이상대적으로긴위스키 Syringaldehyde 182.0548 3.53 Metlin MS/MS Ellagic acid 302.0035 4.52 Metlin + standard Octadecanoic acid, dihydroxy- 또는 hydro-peroxy 346.2327 7.25 Metlin MS/MS Dodecanoic acid 200.1791 5.39 MacNamara Vanillin 152.0473 3.14 MacNamara 미지성분 518.3223 8.02 MacNamara 결론 Agilent Infinity 1290 LC 시스템의 UHPLC 성능과 Agilent 6530 Q-TOF LC/MS 의높은질량정확도, 고분해능질량분석을결합한비표적분석접근은버번, 호밀, 테네시및기타미국산위스키의프로파일링에효과적입니다. MPP 를이용한다변량통계분석은서로다른위스키종류를판별하고서로다른위스키생산업체들과숙성기간이다른위스키들의특성을규명할수있습니다. 이는해당접근법이다양한종류의위스키에대한진위확인에유용할수있음을시사합니다. MS/MS 분석및 Agilent Metlin PCDL 을포함하는스펙트럼라이브러리의활용으로위스키판별에사용되는화합물을식별할수있었습니다. 이들화합물은또한품질관리프로그램의일상적모니터링을위한마커로서사용될수있습니다. * Agilent Metlin Personal Compound Data Base and Library (PCDL) 참고문헌 2 참조 5
참고문헌 1. T. S. Collins, J. Zweigenbaum, S. Ebeler. Profiling of novolatiles in whiskeys using ultra high pressure liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UHPLC-QTOF MS). Food Chem. 163, 186-96 (2014). 2. K. MacNamara, D. Dabrowska, M. Baden, N. Helle. Advances in the ageing chemistry of distilled spirits distilled in oak barrels. LC/GC 14, 6 22 (2011). 자세한정보 이러한데이터는일반적인결과를나타냅니다. 애질런트제품에대한더자세한정보를알아보시려면 www.agilent.com/chem 을방문하십시오. www.agilent.com/chem 애질런트는이문서에포함된오류나이문서의제공, 이행또는사용과관련하여발생한부수적인또는결과적인손해에대해책임을지지않습니다. 이발행물의정보, 설명및사양은사전공지없이변경될수있습니다. Agilent Technologies, Inc., 2014 2014 년 11 월 25 일한국에서인쇄 5991-5328KO 서울시용산구한남대로 98, 일신빌딩 4층우 )04418 한국애질런트테크놀로지스 ( 주 ) 생명과학 / 화학분석사업부고객지원센터 080-004-5090 www.agilent.co.kr