고분자특성분석지상강좌 3 차원홀로그래픽현미경의원리와응용 Principles and Applications of Three-Dimensional Holographic Microscopy 김규현 1 ㆍ신승우 1 ㆍ박용근 1,2 Kyoohyun Kim 1 ㆍSeungwoo Shin 1 ㆍYongKeun Park 1,2 1 Department of Physics, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 291, Daehak-ro, Yuseong-gu, Daejeon 31414, Korea 2 Tomocube Inc. F721 KAIST Munji Campus, Munjiro 193, Yousung-gu, Daejeon 34051, Korea E-mail: yk.park@kaist.ac.kr 1. 서론 17세기안톤반레벤후크 (Anton van Leeuwenhoek) 가광학현미경을만든후, 수백년동안광학현미경은생명과학, 의학, 공학등다양한분야에사용되어왔다. 특히광학현미경은마이크로미터크기의작은시편을비파괴, 비침습방식으로관찰할수있다는큰장점이있다. 일반광학현미경은시편에서빛의흡수도를영상화하기때문에투명한물체를관찰하기어렵다는한계가있다. 이로인해세포와조직같은생체시편이나플라스틱이나액정같은투명시편들을관찰하기가어려웠다. 이문제를해결한기술이위상차현미경 (phase contrast microscopy) 이다. 1950년대 Fritz Zernike는일반광학현미경에위상필터를추가하는방식으로빛의간섭현상을이용하여, 시편을지난빛의위상정보를밝기정보로변환하는위상차현미경기술을개발하여노벨상을수상하였다. 이기술을이용하면간단한장비만으로투명한시편의윤곽을쉽게영상화할수있어서, 현재에도다양한과학기술분야에서폭넓게사용되고있다. 위상차현미경이추가염색과정없이투명한시편을관찰할수있게해주었지만, 시편의윤곽만정성적으로보여주는점, 2차원영상만획득가능한한계가있었다. 이두문제를해결한것은정량위상현미경 (quantitative phase microscopy) 기술이다. 1,2 2000년대중반들어 2차원디지털홀로그래피기술을이용하여레이저간섭패턴을측정함으로서시편의위상지연정보를정량적으로측정할수있었다. 따라서, 단순히시편의윤곽정보 김규현 2011 KAIST 물리학과 ( 학사 ) 2011-현재 KAIST 물리학과석박통합과정 신승우 2014 KAIST 물리학과 ( 학사 ) 2014-현재 KAIST 물리학과석박통합과정 박용근 2010 Harvard-MIT ( 박사 ) 2010-현재 KAIST 물리학과조교수, 부교수 2015-현재 토모큐브 CTO 고분자과학과기술제 27 권 2 호 2016 년 4 월 159
고분자특성분석지상강좌 3 차원홀로그래픽현미경의원리와응용 뿐만아니라, 두께정보역시측정할수있었다. 하지만 2차원홀로그래피방식으로는, 시편내부가균일하다는가정하에서만두께정보를측정할수있다는한계가있었다. 이를극복한기술이 3차원홀로그래피기술이다. 본총괄논문에서는, 3차원홀로그래픽현미경의기본원리를소개하고, DMD(dynamic micromiror device) 를이용한가장발전된형태의 3차원홀로그래픽현미경기술을설명한다. 또한 3차원홀로그래픽현미경기술의장점과한계, 그리고응용분야에대해서논한다. 2. 본론 2.1 3차원홀로그래픽현미경의원리 3차원홀로그래픽현미경또는광회절단층촬영 (optical diffraction tomography, ODT) 의기본원리는엑스선전산화단층촬영 (X-Ray CT) 의원리와유사하다. X-Ray CT의경우, 시편에여러각도로 X-Ray 빔을조사하고, 촬영된여러장의 2차원영상을복원하여 3차원흡수율분포영상을얻게된다. 3-5 X-Ray는전자기파의한종류이고 X-Ray CT에사용되는지배방정식은단일파장파동방정식인헬름홀츠방정식 (Helmholtz equation) 이기때문에, X-ray CT 원리를가시광선영역에서도그대로적용할수있다. 차이점이라면, X-ray CT는주로생체조직의 X-ray 흡수율분포를측정하는데반해, ODT의경우시편의 3차원굴절률을획득하게된다. X-Ray는파장이시편의크기에비해매우짧기때문에, X-Ray 를조사하여측정한 2차원영상을단순사영 (projection) 이라가정하여, 역투영복원방식을사용할수있다. 하지만가시광선의경우파장이시편의크기와비슷하여시편에의한굴절및회절이발생한다. 따라서시편에의한빛의굴절과회절등을고려한복원알고리즘이주로사용된다. 광회절단층촬영은 1969년 E. Wolf에의해이론적으로제안되었고, 6 70년대후반실험적으로구현되었다 7. 2000년대초반 CCD 카메라의발전, 컴퓨터계산능력의향상등에힘입어세포등다양한시편의 3차원굴절률분포를별도의형광표지를사용하지않고측정할수있는기술로발전되었다. 8-11 물리적인관점에서 ODT 기술은여러입사각에따른시편에의한광산란을측정하여, 시편의굴절률분포를 3차원으로재구성하는것이다. 시편의산란정도가상대적으로적은경우근사를통해푸리에회절이론을얻게된다. 이에따르면특정각도로빛을입사했을때시편에의해회절된광학장의 2차원푸리에스펙트럼 ( 그림 1a) 은 3차원푸리에공간상에서구면으로사영 (mapping) 될수있다 ( 그림 1b). 다양한각도로시편에빛을입사시켜광학장을측정하고, 3차원푸리에공간상에사영하고, 이를 3차원역푸리에변환하면시편의 3차원굴절률분포를얻게된다 ( 그림 1c). 2.2 DMD를이용한광회절단층촬영기존 3차원홀로그래피기술에서는입사각을제어하기위해시편을돌리거나, 회전거울을이용하는데, 이방식들은 E( x, y) E% ( k, k ) θ x y μ μ π π 그림 1. (a) 두 polystyrene bead 에서로다른각도의레이저빔을입사했을때광학장의위상지연및 2 차원 Fourier 스펙트럼, (b) Fourier 회절이론에의해 2 차원 Fourier spectrum 들을 3 차원 Fourier 공간에사영한결과, (c) 복원한 3 차원굴절률분포. 160 Polymer Science and Technology Vol. 27, No. 2, April 2016
김규현ㆍ신승우ㆍ박용근 회전에의한측정결함이발생하며, 광학시스템이불안정해미세한보정이필요하다는한계가있었다. 이문제를해결하기위해본연구진은디지털미소거울장치 (digital micromirror device, DMD) 를이용한 3차원홀로그래피현미경기술을개발하여, 12 최근상용화에성공하였다. DMD는마이크로미터크기의수백만개의거울을개별적으로작동시켜, 반사광의패턴을빠르게제어하는장치이다. 각각의미소거울은 ±12 로기울어질수있고, 각미소거울의각도는반사되는빛의세기의 on/off 상태에대응하게된다. 또한미소거울에서반사된빛의세기을다양하게표현하기위해각미소거울을동적으로고속제어하기도한다. 본연구실에서는이러한 DMD의특정을활용하여, 안정된 3차원홀로그래픽현미경기술에적용하였다. 핵심기술의원리는회절격자 (diffraction grating) 에의해레이저가회절되는각도가격자의간격에반비례하다는점과유사하다. DMD에회절격자패턴을넣어주면입사광의방향과각도가회절격자패턴의방향과간격에의해조절된다는점을이용하여, 시편에다양한각도로레이저를입사할수있다. DMD에서제어한빛이시편에정확히입사되고, 시편에서회절된파면이기록될수있도록 ( 그림 2) 와같이광학계를구성하였다. 2 2 단일모드광섬유커플러에서갈라진두빔이각각시편빔과기준빔이되어간섭계를이루고, 시편빔은입사각제어를위해 DMD에입사된다. DMD 에서제어된빛은 2개의렌즈를거쳐시편에입사되게된다. 시편을투과한빛은렌즈들을거쳐카메라에전달되고, 기준파면과의간섭으로형성된이미지가카메라에기록된다. 이렇게기록된간섭이미지에서디지털홀로그래피기술을이용하면시편을통과한파면만을다시복원할수있게된다. 13 DMD 화면을연속적으로제어하여시편에입사되는빛의각도를바꾸고, 이에대응하는 2차원홀로그래피정보들을 ODT 원리를이용하여시편의 3차원굴절률분포를구할수있다. 3 BS DMD Laser Pol Cam 그림 2. DMD 를이용한 ODT 기술구현을위한광학계구성. 2 x 2 단일모드광섬유커플러를통해시편및기준파면으로레이저빔이갈라져서 Mach-Zehnder 간섭계를구성. DMD 를이용한 3 차원홀로그래피현미경의상용화모습. 거울을기계적으로회전시키는기존방식에비해 DMD 를이용하는방식은진동이크게줄어들어정밀한측정이가능하고, 광경로정밀제어가가능하며, 또한거울회전방식에비해저렴하게제작이가능하다는장점이있다. DMD를이용한 3차원홀로그래피기술은구조적으로단순하고, 역학적으로움직이는부분이없다. 본연구실에서는개발한기술의이러한장점을활용하여, 시편의 3차원굴절률을정밀하고안정적으로측정할수있는 3차원홀로그래피현미경을상용화하였다. 14 3. 응용분야 3.1 세포의 3차원굴절률분포측정 3차원홀로그래픽현미경을이용하면세포를염색하지않고세포의형광과내부세포소기관들을관찰할수있다. 공초점현미경 (confocal microscopy) 이나다광자현미경 (multi-photon microscopy) 등세포를 3차원영상으로관찰할수있는기존기술들은세포를염색해야한다는제약이있었다. 형광단백질, 유기염료, 또는양자점 (quantum dot) 을이용해서세포를염색하는기존기술들은염색과정자체가시간과노력이소요될뿐만아니라, 염색과정자체가세포의본래생명현상에영향을주는문제가발생할수도있다. 또한, 줄기세포나면역세포등다시체내로주입이필요한응용분야의경우염색과정사용이불가능하다는한계도있다. 이에비해세포가본래가지고있던광학성질인굴절률자체를측정하는 3 차원홀로그래피기술은, 염색과정이필요없기때문에위해서언급한문제들을해결할수있다. 또한굴절률자체를정량적으로측정할수있다는장점은세포의질량을측정할수있게해준다. 용액의굴절률은농도에비례하기때문에, 세포질의굴절률은세포내단백질등구성성분의농도에비례하게된다. 15 3차원영상정보에서부피를알수있고, 굴절률값에서농도를측정할수있기때문에질량을계산할수있는원리이다. 따라서 3차원홀로그래피현미경측정을통해생명시편의부피, 질량, 단백질농도등을정량적으로측정할수있다. 2 그림 3a는말라리아에감염된인간적혈구의 3차원굴절률분포측정영상이다. 인간적혈구에침입한말라리아기생충은감염된인간적혈구의구조적, 화학적성질을변화시키는데, 3차원홀로그래피측정을통해말라리아기생충이인간적혈구내부의헤모글로빈 (hemoglobin) 단백질을물질대사하고, 파생물로만들어내는헤모조인 (hemozoin) 과액포 (parasite vacuole) 등의 3차원구조를고해상도로측정할수있다. 16 또한 3차원굴절률분포측정을통해감염단계에따른감염적혈구와기생충의부피, 질량변화등을정량적으로추출가능했다. 향후말라리아감염여부진단, 말라리아 고분자과학과기술제 27 권 2 호 2016 년 4 월 161
고분자특성분석지상강좌 3 차원홀로그래픽현미경의원리와응용 치료제개발등에활용될것으로기대된다. 17 이밖에바베시아, 혈액관련유전병, 겸상적혈구등다양한적혈구관련질병연구에응용되었다. 18-22 3차원홀로그래피기술은적혈구뿐만아니라백혈구와같이더복잡한내부구조를가진진핵세포에도적용될수있다. 23 그림 3b-c는최근상용화된제품 (HT-1, TomoCube, Inc., Republic of Korea) 으로측정한유핵세포 (eukaryotic cell) 의괴사 (necrosis) 및세포사멸 (apoptosis) 영상이다. 14 3차원홀로그래피현미경을통해세포의괴사및사멸과정을별도의형광표지없이고속으로측정할수있었다. 세포사멸및괴사는발생 (development), 암세포사멸, 약물반응등에큰연관이있는바, 실제의료및생명공학연구현장에서다방면으로활용될수있을것이다. 3.2 유체내교질입자의 3차원운동분석교질 (colloidal) 입자는유체내에서분자들간의상호작용에의해복잡한 3차원브라운운동 (Brownian motion) 을하게된다. 교질입자의 3차원운동을분석함으로써교질입자와주변유체의점성등을측정할수있으며, 입자의크기와모양에따른 3차원운동양상의분석은연성물질물리학 (soft matter physics), 화학공학분야에서활발하게논의되고있다. 기존연구에서는마이크로미터크기의폴리스티렌구술 (polystyrene bead) 와같이모양과크기가잘알려진교질입자의 3차원운동분석이주로이루어졌으나, 광축 (axial) 방향으로의해상도가제한되었고, 구형이아닌복잡한교질입자의 3차원운동의경우입자의위치뿐만아니라방향성분도추가되므로분석에어려움이있었다. 하지만 3차원홀 로그래피측정의경우입자의모양과광학적특성에상관없이 3차원굴절률분포를측정할수있으므로교질입자의 3 차원브라운운동을분석하는데에활용가능하다. DMD를이용한 3차원홀로그래픽현미경기술을통해폴리스티렌구술의 3차원굴절률분포를고속 (1초당 100장 ) 으로측정하였으며, 폴리스티렌구슬의차원움직임을분석하여주변유체의점성을측정할수있었다 ( 그림 4a-b). 12 또한석영이량체 (silica dimer) 와같이모양이복잡한교질입자의 3차원운동을실시간으로측정하여위치및방향변화를분석할수있었다. 24 그림 4c는교질입자를홀로그래픽광집게 (holographic optical tweezers) 로포획하여복잡한 3차원운동을인가하고, 이때의운동양상및구조변화를 3차원홀로그래피현미경으로분석한결과이다. 25 여러개의교질입자가광축방향으로정렬한경우에도교질입자의 3차원위치와화학조성을정밀하게측정할수있었다. 홀로그래픽광집게와광회절단층촬영기술을결합하여다양한모양의교질입자의복잡한 3차원브라운운동을분석할수있으며, 생체시편과교질입자의상호작용을분석하여생체시편이가하는힘을측정하는등의미세유변학 (microrheology) 분야에활용될수있을것이라기대된다. 3.3 광학플라스틱렌즈의굴절률측정핸드폰등에내장되어있는카메라렌즈는광학고분자 (optical polymer) 를사출성형하여제작한다. 렌즈를사출성형할때사용하는금형이매우정밀하게제조되었다고하더라도, 플라스틱을용융하고금형내에서고체화하는동안금형온도의비균일성, 플라스틱원료의순도등에따라제조 (a) (a) (b) (b) μ (c) μ (c) (d) μ μ 그림 3. (a) 말라리아에감염된인간적혈구, (b) 간세포 (Huh-7) 세포괴사및 (c) HeLa 세포사멸 3 차원굴절률분포. 그림 4. (a) 광회절단층촬영한 polystyrene bead 의 3 차원 Brownian 운동궤적. (b) polystyrene bead 의 3 차원 Brownian 운동궤적의 Mean square displacement. (c) 홀로그래픽광집게로포획한 silica bead 의 3 차원굴절률분포. (d) 광학고분자로제조된플라스틱렌즈의 3 차원굴절률영상. 162 Polymer Science and Technology Vol. 27, No. 2, April 2016
김규현ㆍ신승우ㆍ박용근 렌즈의 3 차원굴절률분포가고르지못하거나형태가달라져 렌즈의수차가발생할수있으며, 이에따라렌즈의성능이 저하될수있다. 기존에는핸드폰렌즈의품질검사를위해렌즈에의해맺 힌이미지를분석하거나, 렌즈표면의영상을측정하였다. 하 지만이러한방법들은렌즈의정밀한품질검사에는어려움이있었으며나아가렌즈의불량원인을찾아제조환경을개선하는데에제한이있었다. 3차원홀로그래피현미경을이용해플라스틱렌즈전체의 3차원굴절률분포를측정함으로써렌즈의표면뿐만아니라내부의물질분포를측정할수있었으며, 렌즈에발생한흠집, 불량의 3차원위치를특정할수있었다 ( 그림 4d). 26 4. 결론 본총설에서는 3차원홀로그래피현미경기술과관련된현미경의간단한역사에서시작하여, 3차원홀로그래피현미경의원리, 기술의구현방법을설명하였다. 또한, 3차원홀로그래피현미경을이용한다양한시편의측정예와앞으로의응용가능성에대해서소개하였다. 3차원홀로그래피기술은 40여년전에최초시작되었으나오랜기간동안제한적으로활용되고있었다. 앞서소개한것처럼 2000년대에들어서야본격적으로기술구현수준이높아지고, 다양한응용분야에적용되기시작하면서다시활발하게연구되고있다. 기술적인부분에서도최근다양한새로운광학기술이개발되어응용의폭을넓히고있다. 다양한파장에서 3차원영상을측정하는초분광 (hyperspectral) 기술을굴절률의파장상관도를통해제한적인수준의분자정보획득이가능해졌으며, 27,28 graphics processing unit(gpu) 를이용해서 ODT 계산을신속하게처리하는기술도실용화에큰도움을주었다. 24 시편을염색하지않고도, 마이크로미터크기의시편을형상과내부정보를정량적으로측정가능한 3차원홀로그래피현미경기술은앞으로도다양한새로운응용분야로확장될수있을것이다. 또한, 최근들어상용화가이루어지면서더많은연구분야에폭넓게활용될수있을것이라기대한다. 참고문헌 1. G. Popescu, Quantitative Phase Imaging of Cells and Tissues, McGraw-Hill Professional, New York, 2011. 2. K. Lee, K. Kim, J. Jung, J. Heo, S. Cho, S. Lee, G. Chang, Y. Jo, H. Park, and Y. Park, Sensors, 13, 4170 (2013). 3. K. Kim, J. Yoon, S. Shin, S. Lee, S.-A. Yang, and Y. Park, arxiv preprint arxiv:1603.00592 (2016). 4. T. Kim, R. Zhou, L. L. Goddard, and G. Popescu, Laser Photon. Rev., 10, 13 (2016). 5. J. Lim, K. Lee, K. H. Jin, S. Shin, S. Lee, Y. Park, and J. C. Ye, Opt. Express., 23, 16933 (2015). 6. E. Wolf, Opt. Commun., 1, 153 (1969). 7. A. F. Fercher, H. Bartelt, H. Becker, and E. Wiltschko, Applied Opt., 18, 2427 (1979). 8. V. Lauer, J. Microsc., 205, 165 (2002). 9. T. Kim, R. Zhou, M. Mir, S. D. Babacan, P. S. Carney, L. L. Goddard, and G. Popescu, Nat. Photonics, 8, 256 (2014). 10. Y. Cotte, F. Toy, P. Jourdain, N. Pavillon, D. Boss, P. Magistretti, P. Marquet, and C. Depeursinge, Nat. Photonics, 7, 113 (2013). 11. K. Kim, Z. Yaqoob, K. Lee, J. W. Kang, Y. Choi, P. Hosseini, P. T. C. So, and Y. Park, Opt. Lett., 39, 6935 (2014). 12. S. Shin, K. Kim, J. Yoon, and Y. Park, Opt. Lett., 40, 5407 (2015). 13. M. Takeda, H. Ina, and S. Kobayashi, J. Opt. Soc. Am. A, 72, 156 (1982). 14. S. Shin, K. Kim, T. Kim, J. Yoon, K. Hong, J. Park, and Y. Park, Proc. SPIE, 9718, 971814 (2016). 15. G. Popescu, Y. Park, N. Lue, C. Best-Popescu, L. Deflores, R. R. Dasari, M. S. Feld, and K. Badizadegan, Am. J. Physiol. Cell Ph., 295, C538 (2008). 16. K. Kim, H. Yoon, M. Diez-Silva, M. Dao, R. R. Dasari, and Y. Park, J. Biomed. Opt., 19, 011005 (2014). 17. S. Cho, S. Kim, Y. Kim, and Y. Park, Trends Biotechnol., 30, 71 (2011). 18. H. Park, T. Ahn, K. Kim, S. Lee, S. Y. Kook, D. Lee, I. B. Suh, S. Na, and Y. Park, J. Biomed. Opt., 20, 111208 (2015). 19. H. Park, S. H. Hong, K. Kim, S. H. Cho, W. J. Lee, Y. Kim, S. E. Lee, and Y. Park, Sci. Rep., 5, 10827 (2015). 20. H. Park, M. Ji, S. Lee, K. Kim, Y.-H. Sohn, S. Jang, and Y. Park, arxiv preprint arxiv:1506.05259 (2015). 21. Y. Kim, H. Shim, K. Kim, H. Park, J. H. Heo, J. Yoon, C. Choi, S. Jang, and Y. Park, Opt. Express, 22, 10398 (2014). 22. Y. Kim, H. Shim, K. Kim, H. Park, S. Jang, and Y. Park, Sci. Rep., 4, 6659 (2014). 23. J. Yoon, K. Kim, H. Park, C. Choi, S. Jang, and Y. Park, Biomedical Opt. Express, 6, 3865 (2015). 24. K. Kim, K. S. Kim, H. Park, J. C. Ye, and Y. Park, Opt. Express, 21, 32269 (2013). 25. K. Kim, J. Yoon, and Y. Park, Optica, 2, 343 (2015). 26. K. Kim, J. Yoon, and Y. Park, Opt. Lett., 41, 934 (2016). 27. J. Jung, K. Kim, J. Yoon, and Y. Park, Opt. Express, 24, 2006 (2016). 28. J. Jung, K. Kim, H. Yu, K. Lee, S. Lee, S. Nahm, H. Park, and Y. Park, Appl. Opt., 53, G111 (2014) 고분자과학과기술제 27 권 2 호 2016 년 4 월 163