(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 10-2010-0044492 (43) 공개일자 2010년04월30일 (51) Int. Cl. C07D 249/10 (2006.01) (21) 출원번호 10-2008-0103647 (22) 출원일자 2008 년 10 월 22 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 15 항 2008 년 10 월 22 일 (71) 출원인 고려대학교산학협력단 서울성북구안암동 5 가 1 고려대학교내 (72) 발명자 김종승 경기도성남시분당구수내동파크타운롯데아파트 130-2402 김현정 경기도화성시반송동시범한빛마을금호어울림아파트 242 동 304 호 이종해 대전광역시유성구노은동 495 번지카운티스 102-203 (74) 대리인 특허법인충현 (54) 구리이온선택성을갖는쿠마린유도체, 이의제조방법, 이를이용한구리이온검출방법및형광화학센서 (57) 요약 본발명은구리이온선택성을갖는하기화학식 (1) 의쿠마린 (coumarin) 유도체, 이를제조하는방법, 이를이용한구리이온검출방법및형광화학센서에관한것으로서, 더욱상세하게는구리이온선택성을갖는이미노 - 쿠마린 (imino-coumarin: IC) 이구리이온과착물을형성할때나타나는형광방출증가를이용하여구리이온을검출하는방법에관한것이다. 대표도 - 도 1 (1) - 1 -
특허청구의범위 청구항 1 구리이온선택성을갖는하기화학식 (1) 로표시되는쿠마린유도체. (1) 청구항 2 7-디에틸아미노쿠마린-3-알데히드와 4-아미노-5-페닐-4H-1,2,4-트리아졸-3- 타이올을반응시켜제 1항에따른쿠마린유도체를제조하는방법. 청구항 3 제 1항의쿠마린유도체를이용하여시료중에서구리이온을선택적으로검출하는방법. 청구항 4 제 3항에있어서, 상기구리이온의검출은상기쿠마린유도체와구리이온의착물형성에따른형광변화측정에의해이루어지는것을특징으로하는구리이온을선택적으로검출하는방법. 청구항 5 제 4항에있어서, 상기형광변화는상기쿠마린유도체와구리이온의착물형성에따른형광방출증가인것을특징으로하는구리이온을선택적으로검출하는방법. 청구항 6 제 4항에있어서, 상기쿠마린유도체와구리이온은 1:1로착물을형성하는것을특징으로하는구리이온을선택적으로검출하는방법. 청구항 7 제 4항에있어서, 금속이온을포함하는수용액에상기쿠마린유도체용액을첨가하여빛을조사함으로써여기 (excited) 시키는단계와 ; 상기용액에서방출된형광을측정하는단계를포함하는것을특징으로하는구리이온을선택적으로검출하는방법. 청구항 8 제 7항에있어서, 상기빛은파장이 450nm 내지 470nm인것을특징으로하는구리이온을선택적으로검출하는방법. 청구항 9 제 7항에있어서, 상기쿠마린유도체용액은 HEPES 버퍼용액인것을특징으로하는구리이온을선택적으로검출하는방법. 청구항 10 제 9항에있어서, 상기 HEPES 버퍼용액은 ph가 7.2 내지 7.4인것을특징으로하는구리이온을선택적으로검 - 2 -
출하는방법. 청구항 11 제 3항에있어서, 상기시료는수용액인것을특징으로하는구리이온을선택적으로검출하는방법. 청구항 12 제 11항에있어서, 상기수용액은 H 2 O과 CH 3 CN의혼합용액인것을특징으로하는구리이온을선택적으로검출하는방법. 청구항 13 제 12항에있어서, 상기 H 2 O과 CH 3 CN의부피의비는 4:6 또는 6:4인것을특징으로하는구리이온을선택적으로검출하는방법. 청구항 14 제 3항에있어서, 상기시료는동물의폐, 심장, 간, 근육, 신장, 및비장및소변중에서선택되는생체시료인것을특징으로하는구리이온을선택적으로검출하는방법. 청구항 15 제 1항에따른쿠마린유도체를이용하여구리이온을선택적으로검출하는화학센서. 명세서 발명의상세한설명 [0001] 기술분야본발명은구리이온선택성을갖는쿠마린 (coumarin) 유도체, 이를제조하는방법, 이를이용한구리이온검출방법및형광화학센서에관한것으로서, 더욱상세하게는구리이온선택성을갖는이미노-쿠마린 (iminocoumarin:ic) 이구리이온과착물을형성할때나타나는형광방출증가를이용하여구리이온을검출하는방법에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] 배경기술구리는인체에존재하는필수중금속중에서세번째로풍부한금속으로서, 다양한생리학적과정에서중요한역할을수행하는것으로알려져있다. 비정상적인구리이온의섭취는윌슨병, 위장질환, 저혈당증, 난독증, 유아간질환을유발하는데, 이러한질환들은특히여러기관들중에서도주로간과신장에서의구리이온들의축적에의해발생하는것으로알려져있다. 따라서생체시스템및환경분야에서잔류구리이온의양을검출하는것은매우중요하다. 최근에는구리이온을검출하기위한도구로서, 수용액중의구리이온을선택적으로인식하여형광을발산하는화학적수용체가개발되고있다. 이러한방법들은근래들어그들의잠재적인응용가능성때문에임상학적생화학분야및환경과학분야에서상당한관심을받아왔다. 이러한형광방출화학적수용체들은검출가능한형광신호를생산하는방법과마찬가지로화학종과상호작용을통해생리화학적특성이변화되는분자시스템이다. 구리이온검출을위한새로운형광방출을유발하는화학센서를개발하기위해서는, 신속한신호전달메카니즘을야기하는적절한형광방출체가선택되어야하며, 새로운형광방출체뿐만아니라구리이온을인식하고, 이를신호로서제공하는유닛을개발하는것이매우중요하다. 지금까지여러가지형광방출체및다양한종을광학적으로검출하기위한신호전달메카니즘이개발되어왔는데, 대표적인신호전달메카니즘으로주로이용되었던것으로는 PET(photo-induced electron/energy transfer), ICT(intramolecular charge transfer), eximer/exciplex formation 및 ESIPT(excited-state intra-/intermolecular proton transfer) 를들수있다. 한편가장최근에는 Wu 등이 Zn 2+ 에의해유발되는형광방출센서로서쿠마린유도체를개발하였다고보고하였는 - 3 -
데, 상기유도체는 Zn 2+ 와착물을형성하여착물형성전에비해약 200배정도형광방출이증가하는것으로나타났다. 이와유사한방법으로 Bharadwaj 등은 Mg 2+ 의첨가로따라강한형광방출을나타내는이민-이성질화현상에기초한새로운형광방출체를고안하기도하였다. 그러나구리이온의검출을위해 FEGIB(fluoroscence enhancement by geometric isomerization blocking) 메카니즘이실제사용된경우는아직까지없었다. [0006] 종래에는구리이온결합은고유의형광감소를유발시키는것으로알려져왔으며합성된수많은형광방출화학적수용체들이구리이온과결합하여형광감소를유발하여형광방출을중단시키는센서로알려져있다. 그러나실용적인적용을위해서는형광방출중단센서보다는형광방출작동센서가더유용하며, 이에따라구리이온과결합하여형광방출을유발하는화학적수용체에대한관심이지속되어왔다. 그러나현재까지는구리이온에의해형광강화를보이는예는거의없었으며, 지금까지진행된대부분의연구도용해도문제로인해수용액상이아닌아세토나이트릴 (CH 3 CN) 이나테트라하이드로퓨란 (THF) 와같은유기매질을대상으로진행되어왔다. 그러나이러한유기매질에서사용할수있는화학적수용체는수용액상으로이루어진환경적또는생물학적시 스템에적용하는데에본질적인문제가있었다. [0007] [0008] 한편국내등록특허제10-690199호 (2007. 2. 27 등록 ) 에는구리이온선택성을갖는플루오레세인유도체및이를이용한구리이온검출방법이개시되어있는데, 구리이온과강하게결합하는플루오레세인유도체를이용하여, 생체내에서트랜스페린단백질또는아밀로이드단백질의양이증가함에따라형광이증가하는현상을이용하여구리이온을검출하는것이특징이다. 그러나그동안개발되었던구리를검출하기위한형광화학센서는수용성이낮고, 응답시간이나감도도좋지않았기때문에실제산업에적용하기에는적합하지않았다. 따라서생물학적, 환경공학적공정에적용할수있도록수용성환경에서구리이온검출성능이우수한형광화학센서의개발이요구되어왔다. 발명의내용 해결하고자하는과제 [0009] [0010] [0011] [0012] 본발명이해결하고자하는첫번째과제는구리이온 (Cu 2+ ) 과착물을형성했을때현저한형광강화현상을보여주며, 특히수용액에서구리이온의검출성능이우수한쿠마린유도체를제공하는데있다. 본발명이해결하고자하는두번째과제는상기구리이온검출용쿠마린유도체의제조방법을제공하는데있다. 본발명이해결하고자하는세번째과제는상기쿠마린유도체를이용하여구리이온을검출하는방법을제공하는데있다. 본발명이해결하고자하는네번째과제는상기쿠마린유도체를이용하여구리이온검출하기위한고감도형광화학센서를제공하는데있다. [0013] 과제해결수단 본발명은상기첫번째과제를해결하기위하여, 구리이온선택성을갖는하기화학식 (1) 로표시되는쿠마린 유도체를제공한다. [0014] [0015] [0016] (1) 본발명은상기두번째과제를해결하기위하여, 7- 디에틸아미노쿠마린 -3- 알데히드와 4- 아미노 -5- 페닐 -4H- - 4 -
1,2,4- 트리아졸 -3- 타이올을반응시켜상기화학식 (1) 로표시되는쿠마린유도체를제조하는방법을제공한다. [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] [0022] [0023] 본발명의상기세번째과제를해결하기위하여, 상기화학식 (1) 로표시되는쿠마린유도체를이용하여시료중에서구리이온을선택적으로검출하는방법을제공한다. 본발명의일실시예에의하면, 상기구리이온의검출은형광변화측정에의해이루어지는것일수있으며, 예를들어구리이온결합에따른형광방출증가를측정하여이루어질수있다. 본발명의또다른일실시예에의하면, 상기쿠마린유도체와구리이온은 1:1로착물을형성하는것일수있다. 본발명의또다른일실시예에의하면, 상기형광변화는금속이온을포함하는수용액에상기쿠마린유도체를포함하는용액을첨가하여빛을가하여여기 (excited) 시키는단계와 ; 상기용액에서방출된형광을측정하는단계를포함하는것일수있다. 본발명의또다른일실시예에의하면, 상기빛은파장이 450nm 내지 470nm일수있다. 본발명의또다른일실시예에의하면, 상기쿠마린유도체를포함하는용액은 HEPES 버퍼용액일수있다. 이때, 상기 HEPES 버퍼용액은 ph가 7.2 내지 7.4일수있다. 본발명의다른일실시예에의하면, 상기시료는수용액일수있으며, 상기수용액은 H 2 O과 CH 3 CN의혼합용액 이사용가능하며, 상기 H 2 O 과 CH 3 CN 의부피의비는 4:6 또는 6:4 일수있다. [0024] [0025] 본발명의또다른일실시예에의하면, 상기시료는동물의간, 신장또는소변인것일수있다. 본발명의상기네번째과제를해결하기위하여, 상기화학식 (1) 로표시되는쿠마린유도체를이용하여시료 중에서구리이온을선택적으로검출하는화학센서를제공한다. 효과 [0026] 본발명에의한형광화학센서인이미노쿠마린 (imino-coumarin) 은구리이온 (Cu 2+ ) 과착물을형성했을때, 현저한형광방출증가현상을보여주기때문에구리이온검출을위한고감도형광화학센서로이용할수있으며, 특히수용액에서구리이온의검출성능이우수하기때문에생물학또는환경공학공정에쉽게적용할수있어매우유용하다. [0027] [0028] 발명의실시를위한구체적인내용이하본발명을더욱상세하게설명한다. 본발명에따른구리이온선택성을갖는쿠마린 (coumarin) 유도체는하기화학식 (1) 의이미노-쿠마린 (iminocoumarin:ic) 이다. [0029] [0030] [0031] [0032] (1) 본발명에따른이미노-쿠마린의제조방법은 7-디에틸아미노쿠마린-3-알데히드와 4-아미노-5-페닐-4H- 1,2,4-트리아졸-3-티올을반응시키는것이특징이다. 본발명은상기화학식 (1) 로표시되는쿠마린유도체를이용하여시료중에서구리이온을선택적으로검출하는방법을제공하며, 본발명의일실시예에의하면, 상기구리이온의검출은형광변화, 구체적으로형광방출증가에의해이루어지는것일수있는데, 그원리는다음과같다. - 5 -
[0033] 본발명에따른고감도형광화학센서는기하이성질체화저해에의한형광증가 (Fluorescence Enhancement by Geometric Isomerization Blocking: FEGIB) 메카니즘에의해구리이온을검출할수있는데, 구체적으로수용 액중에존재하는구리이온 (Cu 2+ ) 과착물을형성할때나타나는뚜렷한형광증가현상을통해구리이온을검 출할수있다. [0034] 도 1 은이미노쿠마린과 Cu 2+ 이온이결합하여형광이증가되는메카니즘을도시한그림이다. 도 1 을참조하면, 이미노쿠마린의 C=N 이성질화가 Cu 2+ 과착물형성에의해차단되면서, C=N 이성질화에의해발생하는비방사성 (non-radiative) 의감쇄가여기상태에서일어날수없기때문에이미노쿠마린의형광방출이작동된다. 이는 ' 압이니쇼 '(AB INITIO) 연산들을통해서확인되었다. [0035] 본발명의일실시예에의하면, 상기시료는수용액일수있고, 상기수용액은바람직하게는 H 2 O 과 CH 3 CN 의혼합 용액일수있으며, 상기 H 2 O 과 CH 3 CN 의부피의비는 4:6 또는 6:4 일수있다. CH 3 CN 을포함하는수용액에구리를 포함하는금속이온이잘용해되며, 바람직하게는 H 2 O 과 CH 3 CN 의부피의비가 4:6 내지 6:4 인경우에이미노쿠마 린과수은이온이결합하였을때형광이강하게나타내기때문이다. [0036] [0037] [0038] 상기이미노쿠마린은상기수용액에 0.1μM 내지 1mM의농도로가해주는것이바람직한데, 이미노쿠마린의농도가 0.1μM 미만의경우에는결합하는구리이온의양도감소하여형광의증가가뚜렷하게나타나지않으며, 1mM을초과하게되면, 이는더적은양의이미노쿠마린에의해분석에필요한충분한형광을검출할수있음에도필요이상의이미노쿠마린을가하게되어이미노쿠마린을불필요하게소모하는것이기때문이다. 본발명의다른일실시예에의하면, 상기쿠마린유도체를포함하는용액은 HEPES 버퍼용액일수있고, 상기 HEPES 버퍼용액은 ph가 7.2 내지 7.4일수있다. HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid) 는흔히세포배양액의 ph를일정하게유지시키는역할을하는완충용액으로서무기나트륨바이카보네이트완충시스템에비해, HEPES는 ph 7.2 내지 7.6의범위에생리학적완충범위에적합하다. HEPES는양이온화및음이온화모두가가능한그룹을포함하고있어버퍼로서의필요한우수한성질을가지고있다. 2차아민및 3차아민그룹은양전하를제공하고술폰산과카르복실산그룹은음전하를제공한다. 본발명의또다른일실시예에의하면, 상기형광변화는금속이온을포함하는수용액에상기이미노쿠마린을포함하는용액을첨가하여빛을가하여여기 (excited) 시키는단계와상기용액에서방출된형광을측정하는단계가포함될수있는데, 이때, 상기빛의파장은 450nm 내지 470nm이바람직하다. 이는상기파장의빛을가하여여기시킨경우에형광의강도가증가되어형광의검출이용이해지기때문이다. [0039] [0040] 실시예 1 : 이미노쿠마린의합성 7-디에틸아미노쿠마린-3-알데히드 (245.0mg, 1.0mmol) 와 4-아미노-5-페닐-4H-1,2,4-트리아졸-3- 타이올 (222.4 mg, 1.10 mmol) 을 20.0mL의고온의순수에탄올에혼합하여순식간에주홍색침전을얻었다. 그후상기용액을 4시간동안환류시키면서교반하였으며, 침전물을여과시킨후고온의순수에탄올로 3회세척한다음 CHCl 3 /C 2 H 5 OH (v/v, 1/3) 로재결정하여황색결정의이미노쿠마린 (366.4 mg, 0.85 mmol) 을 85 % 수득률로얻 었다. 녹는점은 186 ~ 187 였으며, IR, 1 H-NMR, 13 C-NMR 및 FAB MS 데이터는다음과같았다. [0041] [0042] IR (KBr pellet, cm -1 ): 1698, 1616, 603; 1 H-NMR (DMSO-d6, 200 MHz) δ14.14 (s, 1H), 9.56 (s, 1H), 8.54 (s, 1H), 7.89-7.86 (m, 2H), 7.65-7.60 (d, J = 9.3Hz, 1H), 7.51-7.50 (s, 3H), 6.79-6.74 (d, J = 9.1Hz 1H), 6.59 (s, 1H), 3.34 (s, 4H), 1.15 (t, J = 6.79Hz, 6H); [0043] 13 C-NMR (DMSO-d6, 50 MHz) δ162.3, 160.0, 157.8, 152.7, 148.5, 142.9, 138.7, 132.0, 130.6, 128.7, 128.3, 125.6, 110.2, 109.4, 180.0, 96.4, 44.4, 40.7, 40.3, 39.9, 39.5, 39.1, 38.6, 38.2, 12.4 ppm; - 6 -
[0044] FAB MS m/z (M + ): calcd, 419.5. Found, 416.0. [0045] [0046] 실시예 2: 세포배양 두개의세포주 LLC-MK2 및 NCTC 1469 가형광이미지측정을위해사용되었다. 세포주들은 10%(v/v) 광 - 불활성 화된송아지태아의세럼 (HyClone), 100.0 ug/ml 페니실린, 100.0 ug/ml 스트렙토마이신및 0.25 mm 이미노쿠 마린-글루타민이첨가된 DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium, GibcoBRL사, 미국 ) 에서, 37 o C, 5% CO 2 가습된공기를주입하여, 연속배양으로준비되었다. 세포들이로그대수기에도달하였을때, 세포밀도를한웰당 1 ㅧ 10 5 로맞추었다. 이렇게배양된세포들은각웰당 1.0mL의세포용액이되도록 12 웰플레이트에접종되었다. 세포부착후, 배양액을제거하고, 세포층을 PBS(phosphate buffered saline) 로두번세척한후, 각웰마다 1.0mL의배양액을첨가했다. [0047] [0048] 실험예 1 : 이미노쿠마린의형광변화관찰 형광스펙트럼은 RF-5301PC 스펙트로플루오로포토미터를이용하여측정하였다. 염화금속염의스탁용액 (1.00mM) 을 H 2 O:CH 3 CN(1:1, v/v) 에용해시켜준비하였다. 이미노쿠마린의스탁용액 (0.030mM) 또한 H 2 O:CH 3 CN (1:1, v/v) 에용해시켜준비하였다. 모든여기슬릿의폭은 1.5nm 및방출슬릿의폭은 3.0nm 로하였으며, 460nm 파장으로 여기시켰다. [0049] 도 2 는다양한금속양이온의존재하에서이미노쿠마린의형광변화를나타내는그래프이다. 도 2 에나타난이 미노쿠마린의형광방출스펙트럼은 ph 가 7.4 인 HEPES 버퍼용액에용해된 3.0μM 이미노쿠마린에, CH 3 CN/H 2 O (1:1, v/v) 에용해된 Cu 2+ 이온및여러가지다른양이온 (X는알칼리와알칼리토금속이온및 Zn 2+, Hg 2+, Pb 2+, Cd 2+, Fe 2+, Co 2+, Ni 2+ ) 각각 20μM을 460 nm에서여기시킨후형광방출을측정하였다. Cu 2+ 이온은주로형광방출을감소시키는소광금속양이온으로알려져있지만, 이미노쿠마린의경우, Cu 2+ 이온에의해형광방출이유발됨으로써다른금속이온들중 Cu 2+ 이온에대하여우수한선택성을보여준다. C=N 과 C=O와같은킬레이트형성그룹은알칼리금속및알칼리토금속에대하여는결합친화도가낮은반면에, 전이후금속뿐만아니라전이금속에대해서는높은친화도를보이는데, 이는 Cu 2+ 이온에대한높은선택성원인의가능성이되는, 금속들간의전자구조상의차이에서기인한다. [0050] 도 2 를참조하면, 이미노쿠마린용액에 Cu 2+ 이온이가해졌을때, 형광방출의증가가약 8 배정도로관측되었음 을알수있는반면에, 다른여러금속이온들 (Zn 2+, Co 2+, Ni 2+, Fe 3+, Fe 2+, Cr 3+, Cd 2+, Pb 2+, 알칼리금속양이 온및알칼리토금속양이온 ) 이가해진경우에는형광방출증가가거의이루어지지않았음을확인할수있다. 이는 FEGIB 방법에기초한의도한결과였다. [0051] [0052] 실험예 2 : 이미노쿠마린의형광적정스펙트럼관찰 도 3 은이미노쿠마린과구리이온 (Cu 2+ ) 의결합특성을관측하기위해서,CH 3 CN/H 2 O (1:1, v/v) 에용해된구리이 온 (Cu 2+ ) 을점진적으로가해얻은이미노쿠마린의형광적정스펙트럼을나타내는그래프이다. 도 3에나타난이미노쿠마린의형광적정스펙트럼은 ph가 7.4인 HEPES 버퍼용액에용해된 3.0μM 이미노쿠마린용액에, CH 3 CN/H 2 O (1:1, v/v) 에용해된 CuCl 2 를 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 및 20 μm의순으로점진적으로가하고, 460 nm에서여기시킨후형광방출을측정하였다. [0053] 도 3을참조하면, 이미노쿠마린은 515nm에서최대방출파장을가지는약한형광성을나타낸다. 이때도면으로나타내지않았지만, 형광적정스펙트럼의 Job 플롯분석은 Cu 2+ 의 0.5 몰분율에서최대치를보여주었는데, 이는이미노쿠마린과 Cu 2+ 사이에 1:1 착물을형성하는것을암시하는결과이다. 또한, 도면으로나타내지않았지 - 7 -
만, MALDIF-TOF 질량분석스펙트럼도이미노쿠마린과 Cu 2+ 사이에강력한 1:1 착물을형성함을나타내는증거인 m/z 482.167 피크를보여주었다. 그리고 1:1 화학양론과형광적정데이터에기초하여 Cu 2+ 이온과이미노쿠마린의결합상수를계산한결과, 2.39 ㅧ10 4 M -1 의값을얻었다. [0054] [0055] 실험예 3 : DFT 연산실행을통한메카니즘예측 이미노쿠마린은 Cu 2+ 의존재하에서상당한형광증가를나타낸다. 수용액에서이미노쿠마린의약한방출은 C=N 다이나믹이성질체화를통한비방사성 (non-radiative) 의감쇄가원인으로보이는데, 반면에 Cu 2+ 의존재하에서 515nm 에서강한방출은 C=N 다이나믹이성질체화가저해됨으로써발생하는것으로보인다. 도 4 는 Cu 2+ 와이미 노쿠마린의착물형성및형광감지메카니즘을나타내는그림이다. [0056] [0057] [0058] 이미노쿠마린과 Cu 2+ 이온들이결합하는메카니즘을관측하고, FEGIB 메카니즘을충분히이해하기위해서, 한세트의 Gaussian 03 프로그램을사용한 6-31G * 베이시스세트로실행된 DFT(density functional theory) 연산을수행하였다. 먼저이미노쿠마린의도 4에나타난구조식및크리스탈구조인두개의구조들의기체및용액상에서의안정도를각각비교하였다. 용액상에서 PCM(polarizable continuum model) 이가장널리사용되며, 다양한예들에서성공적인설명을제공하므로 PCM 연산을채택하였다. 다만, 아세토나이트릴과물을 1:1로혼합한용매가본발명에사용되었지만, PCM 연산에서혼합용매는사용할수없어, 물을용매로한 PCM 연산을적용하였다. 또한이는이미노쿠마린이수소결합이가능하기때문에물이아세토나이트릴보다용매화에보다우세한역할을할것으로예상되기때문이었기도하다. 기체상에서의연산결과는크리스탈이미노쿠마린구조가예상된이미노쿠마린구조보다 4.351 kcal/mol 정도로더안정한것으로나타났으나, 물에서의 PCM 연산결과는예상된이미노쿠마린구조가크리스탈이미노쿠마린구조보다 0.278 kcal/mol 정도더안정한것으로나타났다. 이는주로제안된구조가용매화에의해크리스탈구조보다훨씬더안정화되기때문인데안정한형태가용매화에너지, 팩킹효과, 다른여러요인들을고려할때, 기체, 액체, 고체상태에의존한다는것을고려하면당연한결과이다. 또한제안된이미노쿠마린구조가크 리스탈이미노쿠마린구조보다 Cu 2+ 와더욱단단히결합하는데, 이는제안된이미노쿠마린구조가보다유기적 이기때문이다. [0059] 이미노쿠마린과이미노쿠마린 -Cu 2+ 착물사이에중요한구조적차이점은 C=N-N-C 의 2 면각 (dihedral angle) 으로 표시되는쿠마린과크리아졸링들사이의 2 면각이다. 이미노쿠마린의 C=N-N-C 의 2 면각은 44.2 ㅀ이고, 이미노쿠 마린-Cu 2+ 의 C=N-N-C의 2면각은 22.0ㅀ인데, 이는이미노쿠마린이 Cu 2+ 와착물을형성할때트리아졸-타이올부분의회전에의해더평면화됨을의미한다. 형광의약화나강화는 FMT(frontier molecular orbital) 에기초하여종종이론적으로설명된다. 도 5는이미노쿠마린 (IC), 이미노쿠마린-Cu 2+ (IC-Cu 2+ ) 및이미노쿠마린 @ 이미노쿠마린-Cu 2+ (IC@IC-Cu 2+ ) 경계분자궤도함수를나타내는그림이다. 여기에서이미노쿠마린 @ 이미노쿠마린-Cu 2+ (IC@IC- Cu 2+ ) 은최적화된이미노쿠마린-Cu 2+ (IC-Cu 2+ ) 의기하학적배열에서 Cu 2+ 가제거된쿠마린에기초한센서를의미하고 HOMO-1은 second highest occupied molecular orbitals를의미한다. [0060] 도 5 를참조하면, 이미노쿠마린에서의 HOMO(the highest occupied molecular orbitals ) 와 LUMO(the lowest unoccupied molecular orbitals) 는전자들이거의트리아졸 - 타이올과쿠마린부위에제각각거의배타적으로분 포되어있다. 반대로이미노쿠마린-Cu 2+ 에있어서는 HOMO와 LUMO는오직쿠마린부위에전자들이주로분포되어있음을알수있다. 이시스템에서쿠마린부분은주형광발산체이므로여기되었을때, 이미노쿠마린은형광방출상태로뛰어들지않는반면에, 이미노쿠마린-Cu 2+ 는형광방출상태로뛰어들것으로보인다. 이는형광방출감소가비방사성 (non-radiative) 의감쇄를유발하는동적인이성질화과정에기인하기때문에동적인개념이다. [0061] 이미노쿠마린 @ 이미노쿠마린 -Cu 2+ 의 HOMO 및 LUMO 가이미노쿠마린 -Cu 2+ 의 HOMO 및 LUMO 와매우유사한데, 이는형 - 8 -
광방출모습이 Cu 2+ 의전자적인효과보다는이미노쿠마린의구조적인변화에의해이해될수있음을암시한다. 또한형광발산체와이웃한부위사이의상반각 (dihedral angle) 에서의그러한변화가형광방출에있어중요한변화를일으키도록영향을미칠수있음을알수있게한다. 더나아가이성질화과정이연산된결과에포함되지않음을고려할때, 형광감소 / 증가는단지동적인이성질화과정뿐만아니라정적인형태의변화에의해조절될수있음을알수있다. [0062] 이미노쿠마린및이미노쿠마린-Cu 2+ 의 HOMO 에서 LUMO로의전이기여도를확인하기위하여, TDDFT(Timedependant DFT) 연산이실행되었다. TDDFT(Time-dependent density functional theory) 는닫힌쉘시스템 (closed shell systems) 의여기에너지연구에는성공적으로사용되어온반면에, 열린쉘시스템 (often shell systems), 특히전이금속화합물들의열린쉘시스템에서는여전히제한적으로적용되어왔다. 이미앞서상술한바와같이 Cu 2+ 의전자적효과는착물에서구조적변화와비교하여적게영향을미치는것으로예상된다. 따 라서 TDDFT 연산을위해이미노쿠마린 -Cu 2+ 은이중스핀다중도를갖기때문에이미노쿠마린 -Cu 2+ 대신에이미노 쿠마린 @ 이미노쿠마린 -Cu 2+ 의기하학을사용하였다. [0063] 이미노쿠마린에서는 HOMO-1 에서 LUMO 로의전이에일치하는전자적오실레이터의기여도는 96.44% 이고, HOMO 에 서 LUMO로의전이의경우에는 3.56% 로계산되었다. 이와달리, 이미노쿠마린 @ 이미노쿠마린-Cu 2+ 의경우, HOMO에서 LUMO로의전이에일치하는전자적오실레이터의기여도는 100% 로나타났다. 상기경계분자궤도모습과여기특성에따라, Cu 2+ 과착물을이룬이미노쿠마린의형광방출증가는 FEGIB 메카니즘에의해명확하게이해될수있었으며, 이는구리이온을검출하는새로운형광방출유발센서를디자인하는데유용하게사용될수있을것이다. [0064] [0065] [0066] 실험예 4 : 세포형광이미지측정이론적으로계산된형광방출유발센서를가지고, 생물학적시스템에적용을시도하였다. 최근의생체시스템으로유입된종을선택적으로추적하는바이오센서분자들과마찬가지로이미노쿠마린을이용하여생물학적시험이수행되었다. 첫째로이미노쿠마린의세포투과성을확인하기위하여, 원숭이의신장세포 (LLC-MK2) 가이미노쿠마린 (20.0μM) 과함께배양되었다. 공초점현미경이미지를사용하여관측한결과, Cu 2+ 이온 (80.0μM) 을배양액에가하였을때, 37 에서 5분간 배양후에의미있는형광방출의증가가관측되었다. 도 6 은 D-MEM 용액에있는 LLC-MK2 세포에서의 Cu 2+ 이온에 의한공초점형광이미지를나타내는그림이다. 사용된공초점현미경은 Zeiss LSM 510 META 공초점 현미경이고, 형광을위해 458nm 에서여기시켰다. [0067] 도 6 의 (a) 는이미노쿠마린을 20μM 가한 LLC-MK2 세포의형광이미지이고, (b) 는이어서 Cu 2+ 이온을 80μM 가한 후의이미지이고, (c) 는 Cu 2+ 이온을 50μM 가한후의 LLC-MK2 세포의명시야투과이미지이며, (d) 는 (b) 와 (c) 의이미지를오버레이 (overlay) 시킨것이다. 도 6의 (a) 를참조하면, 이미노쿠마린은 Cu 2+ 이온이존재하지않으면형광을방출하지않는다는것을알수있으며, (b) 를참조하면, Cu 2+ 이온을가할경우 (4당량) 에강한공초점이미지를보인다는것을알수있었다. 이러한형광증가는상기도 3에서보여준용액에서의실험결과와도일치하는것이다. 따라서생체밖에서 Cu 2+ 이온을추적하는데있어이미노쿠마린이잠재적인적용가능성이크다는사실에주목할필요가있다. [0068] [0069] 실험예 5 : 쥐의기관형광이미지측정세포주연구에덧붙여, Cu 2+ 이온과결합한이미노쿠마린의상반되는증가효과가 ICR(Institute for Cancer Research) 의쥐를이용하여생체내에서확인되었다. 구리이온을구강으로주입한지 3일이지난쥐를대상으로부검을실시하였다. 폐, 심장, 간, 근육, 신장및비장이추출되었고, 상기각기관들은 0.5% 이미노쿠마린으로 20분간처리되었으며, 잔류하는이미노쿠마린을제거하기위하여 PBS(phosphate buffered saline) 로 - 9 -
세척되었다. [0070] 도 7은구리이온투여전후의폐, 심장, 간, 근육, 신장및비장의형광이미지이다. 상기기관들에대해사용된이미노쿠마린은 20.0μM 이었다. 도 7을참조하면, 구리이온이오직간과신장에만축적되는것을알수있는데, 이는구리이온이이러한기관들에선택적으로축적된다는것을보고한이전의연구결과와일치되는것이다. 또한, 이러한이미지의결과는 FEGIB에의해촉진된이미노쿠마린이생체밖에서구리이온에대해강한흡착력을가지고있는것으로관찰된것과일치하는결과이다. [0071] [0072] 실험예 4 : 쥐의오줌형광측정쥐의오줌은기본적인대사과정과깊히관련된것으로알려져있다. 구리로중독시킨쥐와중독시키지않은쥐로부터오줌을수집한후오줌에있는구리이온을검출하기위하여이미노쿠마린을사용하였다. 구리이온으로중독된쥐로부터수집된오줌을 450nm로여기시킨후에 460 내지 700nm의파장에서방출되는형광을측정하였더니, 531nm에서강한형광이검출되었다. 그러나구리이온으로중독되지않은쥐의오줌이나구리이온으로중독시키더라도이미노쿠마린이가해지지않은쥐의오줌의경우에는형광이약했다. 이러한결과들은생물학적시료에서이미노쿠마린이구리이온을위한신호전달시스템으로서사용될수있음을제안하는것이며, 인간의소변에있어서도구리이온을검출하는가능한수단임을나타내는것이기도하다. 도면의간단한설명 [0073] [0074] 도 1 은이미노쿠마린과 Cu 2+ 이온이결합하여형광방출이증가되는메카니즘을도시한도면이다. 도 2 는여러금속양이온의존재하에서이미노쿠마린의형광변화를나타내는그래프이며, X 는알칼리와알칼리 토금속이온및 Zn 2+, Hg 2+, Pb 2+, Cd 2+, Fe 2+, Co 2+, Ni 2+ 이다. [0075] 도 3 은이미노쿠마린과구리이온 (Cu 2+ ) 과의결합특성을관측하기위해서, CH 3 CN/H 2 O(1:1, v/v) 에용해된구리 이온 (Cu 2+ ) 을점진적으로가해얻은이미노쿠마린의형광적정스펙트럼을나타내는그래프이다. [0076] 도 4 는구리이온 (Cu 2+ ) 과이미노쿠마린의착물형성및형광방출메카니즘을나타내는화학구조도이다. [0077] 도 5 는이미노쿠마린, 이미노쿠마린 -Cu 2+ 이다. 및이미노쿠마린 @ 이미노쿠마린 -Cu 2+ 경계분자궤도함수를나타내는도면 [0078] [0079] 도 6 은 D-MEM 용액에있는 LLC-MK2 세포에서의구리이온 (Cu 2+ ) 에의한공초점형광이미지사진이다. 도 7 은구리이온투여전후의폐, 심장, 간, 근육, 신장및비장의형광이미지이다. 도면 도면 1-10 -
도면 2 도면 3-11 -
도면 4 도면 5 도면 6-12 -
도면 7-13 -