RESEARCH ARTICLE 딸기식물체추출물의미백및주름개선효과 오봉윤 1, 이유석 1, 남승희 1, 이선경 1, 권승빈 2, 안인숙 2, 나해영 3, 정경주 1, 강정화 1 * 1 전남농업기술원식품경영연구소, 2 한국피부임상연구소, 3 목포대학교원예학과 Effects of Strawberry Plant Body Extracts on Whitening and Anti- Wrinkle BongYun Oh 1, You-Seok Lee 1, Seung-Hee Nam 1, Sun-Kyung Lee 1, Seung-Bin Kwon 2, In Sook An 2, Haeyoung Na 3, Kyung-Ju Jung 1, Jeong-Hwa Kang 1 * 1 Food & Farm Management Research Institute, Jeollanamdo Agriculture Research and Extension Services 2 Korea Institute for Skin and Clinical Sciences, Konkuk University 3 Major in Horticultural Science, Mokpo National University Abstract In this study, we investigated effects of the Strawberry plant body (SPB) extracts on the improvement of whitening and wrinkle. We confirmed effects of SPB extracts on UVB-exposed hairless mice to measure changes of skin conditions. The cream containing SPB extracts significantly decreases erythema index and melanin value on UVB-exposed hairless mice. Also, transepidermal water loss (TEWL) was significantly decreased in experimental group using cream containing SPB UVB irradiation induces the expression of matrix metalloproteases (MMPs) in skin tissue. The up-regulation of MMPs enhances degradation of collagen and induces skin aging. The cream containing SPB extracts significantly decreases contents of MMP-2 and MMP9 on UVB-exposed hairless mice. These results suggest that SPB extracts might be used as a ingradient for improvement of whitening and wrinkle on UVB-exposed skin. Keywords: Strawberry plant body extract, Melanin, MMP, Whitening, Anti-wrinkle 식물은기초영양소가풍부하여섭취시인체내에기초영 양분을전달하는기능을하며, 식물만이가진독특한유효성분을다량으로함유하여인체신진대사를활성화시키기도한다. 식물유래유효성분에는플라보노이드, 폴리페놀, 베타카로틴, 리코펜등다양한성분들이존재하며이들성분은인체내로흡수되어항산화, 항염, 항암, 피부진정등의효능을나타낸다 ( 정상철등, 2013). 이러한식물성분을추출하는방법으로는열수, 에탄올등의용매를이용한추출과, 압착법, 초임계추출법등이존재한다. 이러한식물유래유용기능성성분을이용한 *Corresponding author: Hyun-sook Bae, Department of Herbal Major in Skin care and Obesity Management, Sungshin Women s University, Gangbukgu, Seoul 142-732, Republic of Korea Tel.: +82 8 920 7558, Fax: +82 2 920 2059 E-mail: hsbae@sungshin.ac.kr Received August 13, 2013; Revised September 27, 2013; Accepted October 9, 2013; Published October 30, 2013 산업은 BT기술의발전을기반으로크게부상되어거대한산업분야로성장하고있으며, 2003년에는세계천연물시장규모가 2,023억달러에달한다고알려져있다. 그러나식물유래성분은식용으로섭취하는부위에서주로행해지고있으며, 미식용부위는사용되지않고폐기되고있는실정이다. 국내에서도채소류, 식용및약용작물이산지또는유통단계에서폐기되는양은전체생산량의 8.2% 에이르므로이들폐기되는작물부위를활용하는기술개발이필요하다. 주요채소미식용부위의유용기능성물질을이용하는기술개발은작물의이용부위를다양화할수있으며, 작물의수확지수를높일수있어전체적으로농가소득증대및관련산업의확대가가능하게된다. 또한, 농작물의폐기율을효과적으로줄일수있기때문에폐기물처리과정에서발생하는환경오염을줄일수있다. 딸기는장미과의여러해살이식물로서전세계적으로다양한종들이존재하며크게초본성인 Fragaria 속과나무딸기류인 Rubus 속으로나눌수있다. 식용하는딸기는씨방이발달하여과실이되는다른열매들과달리꽃턱이발달한것이기때문 www.kosac.or.kr 969
에씨가열매속에존재하지않는다. 딸기는비타민 C와칼륨, 철분이많아피로회복과신경안정에좋으며딸기추출물은자외선에의한세포생장저해와 DNA 손상을효과적으로억제하는것으로알려져있다 (Giampieri et al., 2012). 또한, 딸기에함유된엘라질산 (ellagic acid) 은자외선에의한피부콜라겐의파괴와염증생성을억제하는효능이있다 (Bae et al., 2010; Kim et al., 2010). 이렇듯딸기의과실에대해서는다양한연구가진행되어있으나딸기식물체에대해서는연구가거의진행되어있지않기때문에식물체의활용방안에대한심도있는논의가필요한실정이다. 화장품산업은기술집약적이며, 패션산업등의경제에있는선진국형산업으로국내화장품산업은 4조 5천억으로추정되며, 그파급효과가다양한분야에미치는효과가큰사업이다. 화장품에사용되는화장품원료는 7,000여종으로국내시장규모도 1,800억원으로추정되지만, 현재 90% 이상을수입에의존하고있어국내화장품원료산업은그구조가취약하다고할수있다. 이를타개하기위해다양한화장품신원료의연구와개발이필요한상황이다. 특히, 자외선을비롯하여환경오염유발물질들의피부에대한노출증가로인한피부의색소침착과과도한주름생성을효과적으로억제할수있는식물성원료에대한요구는나날이증가하고있으며다양한식물성분들이연구개발되어지고있다 ( 정은영과이시경, 2010; Bae et al., 2012; Kim et al., 2011; Kim et al., 2012). 따라서본연구에서는효용가치가적은것으로여겨지고있는딸기식물체의유효성분을추출하여미백및주름개선에효과적인화장품신원료로서의가능성을확인하고자한다. 딸기식물체추출물이피부에미치는영향을확인하기위하여전임상단계인실험동물모델을통하여미백과주름개선효능을규명하고자하였다. 식물체추출물은 62.5, 125, 250, 500, 1000, 2000 μg/ml 농도로사용하였다. 여기에 L-DOPA 40 μl를첨가하여 37 에서 1시간반응시킨후 475 nm에서흡광도를측정하였다. 대조군으로는 arbutin을사용하였다. 3. 동물실험 HR-1 hairless 마우스을구입한후 7일동안동물사육실의환경하에서검역및순화시키면서일반건강상태를관찰한후, 건강한개체를선별하여시험에사용하였다. 본실험에사용된마우스는수컷으로 6주령, 20~25 g이며 3주간순화과정후 9 주령, 23~28 g의조건에서시료를투입하였다. 4. 자외선조사및시료처리자외선에의한인공색소반의유발은실험동물의등부위에사각형모양의구멍 (1 1 cm 2 ) 이뚫린흑색테잎을붙인후 sunlamp를이용하여 302 nm의자외선을조사하여시행하였다. 자외선은 2일간격으로총 3회를조사하였으며, 1회당 500 mj/cm 2 씩, 총 1,500 mj/cm 2 조사하였다. 자외선조사에의해형성된인공색소반에딸기열수추출물을도포하는것은색소침착안정화를위해마지막자외선을조사한 5일후부터 24 h 간격으로실시하였다. 딸기열수추출물은 base cream에희석하여 1% (S-1%), 2% (S-2%), 3% (S-3%) 의농도로조제하여도포하였다 (Table 1). 5. 멜라닌양과홍반지수측정멜라닌양 (Melanin value) 과홍반지수 (Erhythema index) 측정은 Mexameter MX18 (Corage+Khazaka electronic GmbH, Germany) 을이용하였다. 측정시실내온도는 20 22, 습도 40 60% 가유지되는조건에서시행하였으며, 시료도포일로부터 2일에 1회씩, 총 8일간측정하였다. 1. 추출딸기식물체는 80 의열수를이용하여 6시간추출후동결건조하여사용하였다. 2. Tyrosinase inhibition assay 딸기식물체의 tyrosinase 활성에대한영향은 L-DOPA를기질로사용하여확인하였다. L-DOPA는 2 mg /ml을 sodium phosphate buffer (0.1M, ph 6.8) 로 100배희석하여사용하였고, tyrosinase는 20 units/ml의농도로사용하였다. 96well plate에 sodium phosphate buffer 100 μl와 tyrosinase 40 μ L를넣은후농도별로희석한시료 20 μl를첨가하였다. 딸기 6. 경피수분손실량측정 경피수분손실량은조사부위에표피피부기능측정시스템 인 Tewameter Tewameter (Corage+Khazaka electronic Table 1. Treatment conditions of experimental groups Group Treatment Sex No. of animal Control - Male 6 N. cont UVB Male 6 P. cont UVB + arbutin 1% Male 6 S. cont UVB + base cream Male 6 S-1% UVB + S-1% Male 6 S-2% UVB + S-2% Male 6 S-3% UVB + S-3% Male 6 970 www.kosac.or.kr
딸기식물체추출물의미백및주름개선효과 GmbH, German) 의 TM300 probe를연결하여센서를표피면 (mm2) 에접지후 10번반복치의평균값을기준으로채택하여표피의수분손실량을측정하였다. 측정장소는실내온도 20 22, 습도 40 60% 가유지하는조건에서유발부위를측정후개체의수치로산출하였다. 피부표면에서공기중으로수분이 Fick의법칙에의해서확산하는것에의하여중기압을구하여표피로부터수분량을산정하였다. (A) 7. Matrix metalloproteinase-2,9 (MMP-2,9) 발현량측정실험종료일에피부조직을채취하여 MMP-2,9 ELISA kit (GE Healthcar. UK) 를이용하여 MMP-2,9의발현량을측정하였다. Standard 용액과 sample 100 μl를각 well에분주하고, 2시간동안상온에서반응시킨후세척완충용액으로 4회세척한다음 peroxidase conjugate 용액을 100 μl를넣고 1 시간상온에서방치하고 4회세척하였다. 여기에 TMB 기질을 100 μl씩분주하고 30분간방치한후 ELISA reader에서 630 nm의흡광도를측정하였다. (B) 8. 조직병리학적평가 (HE염색) 해부도구를이용하여조사및도포부위를절제후 10% formaline 조직고정액에 24 시간동안침적하여고정화하였다. 그후 paraffin을도포하고, microtome을이용하여조직을 0.3 mm 두께로 section 후 slide glass위에부착시켜관찰하였다. Slide상의조직은알콜과증류수를이용하여단계별로수분을제거하고 HE (hematoxylin-eosin) 염색을실시하여표피와진피층을구분하였다. 표피층을 image scanner (Aperoi, USA) 로 scan후 scan scope analysis program을이용하여표피층의두께를산출하여확인하였다. Figure 1. Inhibition of tyrosinase activity by SPB extracts. (A) Arbutin, (B) SPB extracts 9. 통계처리본시험에서는체중데이터에대한분산의동질성을비교하기위하여 SPSS 통계프로그램 (ver 10.1) 을이용하여 F 검정을실시하였고, 분산의동질성이인정되어 student t-test 를실시하였다. 1. 1. 딸기식물체추출물의 tyrosinase 효소저해효능딸기식물체추출물은농도의존적으로 tyrosinase의활성을저해하였으며표준물질인알부틴과도비교하여서도유사한저해능을나타내었다 (Figure 1). 2. 멜라닌양과홍반지수변화 HR-1 마우스에자외선조사후딸기식물체추출물을도포 Figure 2. Change of Melanin value by cream containing SPB *p <.05, **p <.01, ***p <.001 vs the N. cont group. 하여멜라닌양과홍반지수의변화를확인하였다. 멜라닌수준변화는시료도포기간동안 2 일에 1 회, 8 일동 안총 4 회 Mexameter 를이용하여멜라닌수준을측정하였다 www.kosac.or.kr 971
Figure 3. Change of Erythema index by cream containing SPB *p <.05, **p <.01, ***p <.001 vs the N. cont group. Figure 5. Change of MMP-2 content by cream containing SPB *p <.05, **p <.01, ***p <.001 vs the N. cont group Figure 4. Change of TEWL by cream containing SPB extracts on UVB-exposed hairless mice. *p <.05, **p <.01, ***p <.001 vs the N. cont group (Figure 2). 2 day에서는 P. cont군 (531.52±28.31) 과 S-3% 군 (537.54±34.37) 만이 N. cont군 (618.85±38.48) 과비교하여유의적으로멜라닌수준이감소하였으며, 4 day에서는 P. cont군 (364.57±25.28) 과 S-3% 군 (375.31±23.41) 외에 S-2% 군 (404.18±25.35) 또한멜라닌수준이감소하였다. 6 day에는 S-1% 군 (358.14±23.34) 에서도 N. cont군 (428.72 ±48.39) 과비교하여유의적으로멜라닌수준이감소하였다. 8 day 에서는 S-1% 군 (286.43±22.82), S-2% 군 (238.11± 24.18) 에서멜라닌수준이유의적으로감소하였으며, S-3% (213.93±22.14) 에서멜라닌수준이가장크게감소하였다. 홍반수준변화는시료도포기간동안 2일에 1회씩, 8일동안총 4회 Mexameter를이용하여측정하였다 (Figure 3). 2 day에서는 P. cont군 (238.56±22.17) 과 S-1% 군 (243.34± 15.35), S-2% 군 (238.16±16.84) 군, S-3% 군 (237.32±12.42) 에서 N. cont군 (284.14±23.33) 과비교하여유의적으로홍 Figure 6. Change of MMP-9 content by cream containing SPB *p <.05, **p <.01, ***p <.001 vs the N. cont group 반수준이감소하였으며, 4 day 에서는 P. cont군 (203.51± 15.27) 과 S-3% 군 (198.38±17.35) 에서홍반수준이감소함을확인하였다. 6 day와 8 day의시료군에서는 N. cont 군과비교하여유의적인홍반수준의차이는확인할수없었다. 피부에조사된자외선은표피층에존재하는 melanocyte를자극하여멜라닌합성을촉진시키고, 피부에자극을주어홍반을유발한다 ( 박주아와정숙희, 2012; 윤영민등, 2013). 딸기식물체추출물을마우스에도포하면멜라닌과홍반지수가감소하였으므로자외선에의한피부자극또한효과적으로완화시키는것을알수있다. 3. 경피수분손실량변화 피부의최외각인각질층은 10~20% 정도의수분을함유하고 있으며, 수분이부족하게되면피부표면의건조와피부장벽의이상을초래하여피부가거칠어지게된다 ( 권승빈등, 2013). 이러한각질층의수분함유정도는경피수분손실량측정을통해 972 www.kosac.or.kr
딸기식물체추출물의미백및주름개선효과 cont군 (541.46±51.17) 과비교하여, 시료군에서는 S-2% 군 (427.61±23.47), 그리고 S-3% 군 (351.12±35.96) 에서유의적으로 MMP-2 발현량이감소하였으며, 그중 S-3% 군에서가장크게감소함을확인하였다. MMP-9 발현량변화는해부후, 조사및시료도포부분의조직을채취하여 MMP-9 발현량을측정하였다 (Figure 6). N. cont 군 (484.34±48.14) 과비교하여, 시료군에서는 S-1% 군 (438.16 ±29.34), S-2% 군 (418.97±23.48), 그리고 S-3% 군 (395.11± 24.96) 에서유의적으로 MMP-9 발현량이감소하였다. 이와같이 HR-1 마우스에자외선조사한후딸기식물체추출물을도포하면 MMP-2,9의발현량이감소하는것은딸기식물체추출물이주름개선에도효과가있음을보여주는것이라할수있다. Figure 7. Histological changes by cream containing SPB 확인할수있으며경피수분손실량은피부장벽의손상및각질층상태의지표이기도하다 (RIM et al., 2005). 딸기식물체추출물의경피수분손실량변화는시료도포기간동안 2일에 1회씩, 8일동안총 4회 Tewameter를이용하여경피수분손실량을측정하였다 (Figure 4). 2 day에서는 Cont군 (10.47±3.27) 을제외하고 N. cont군 (65.17±6.15) 과비교하여모든군에서유의적차이를확인할수없었다. 하지만 4 day 에서 P. cont군 (35.14±7.62) 과 S-3% 군 (40.15±6.19) 에서경피수분손실량이유의적으로감소함을확인하였으며, 8 day에서는 N. cont 군 (30.18±7.18) 과비교하여 S-3% 군 (17.32±3.14) 에서유의적으로경피수분손실량이감소함을확인할수있었다. 따라서딸기식물체추출물은표피의수분손실을효과적으로억제함을확인할수있었다. 4. MMP 발현량변화 MMP 는인체조직내존재하는다양한섬유상단백질을분 해하는효소로자외선에의해서발현이증가되며, 인체조직내에 10여종이상존재한다 (Jenkins, 2002). 이중 MMP-2,9 은 gelastinase로서 collagen 또한분해할수있으며, MMP- 2,9의증가는광노화를유도하는것으로알려져있다 (Kim et al., 2011; Zague et al., 2011). 자외선에의해발현이증가된 MMP는피부세포기능을저해하고피부에주름을생성시키는광노화현상을일으키므로, MMP의발현을저해하는성분들은광노화를억제하는효능을나타낸다 (Afnan et al., 2012; Lee et al., 2012; Yang et al., 2011). MMP-2 발현량변화는해부후, 조사및시료도포부분의조직을채취하여 MMP-2 발현량을측정하였다 (Figure 5). N. 5. 조직병리학적변화 HR-1 마우스의조직을 section하여 hematoxylin-eosin (HE) 염색을통해조직병리학적변화를측정하였다 (Figure 7). 자외선이조사된 N. cont군의경우, 표피층의손상과주름이다수생성되며, 진피층또한두꺼워짐을확인하였다. 시료를농도별로처리한결과, 표피의손상은감소되었으며, N. cont 군 (8.12±1.31) 과비교하여 S-3% 군 (5.84±0.58) 의진피두께또한유의적으로감소함을확인하였다. 마우스조직의관찰결과딸기식물체추출물이표피의손상과주름생성을효과적으로감소시켰기때문에, 딸기식물체추출물은주름및피부상태개선에도효과적인물질임을알수있었다. 일반적으로딸기는과실부분을식용으로널리사용하고있으나그외부분인식물체는산업적으로도이용되지못하고있다. 따라서, 본연구에서는식용으로사용되는딸기과실외에미식용부위인식물체를화장품원료로서가능성을확인하고자하였다. 딸기식물체를열수추출법을이용하여추출한후 HR-1 마우스를이용하여미백및주름개선의효능을검증하였다. HR-1 마우스에자외선조사후딸기식물체추출물을도포하면서마우스피부의변화를관찰한결과멜라닌색소와홍반지수가유의적으로감소함을확인하였다. 또한, 경피수분손실량도대조군에비하여감소하였으며, 주름생성을유도하는 MMP-2,9의발현량역시유의적으로감소하였다. 이러한결과는딸기식물체열수추출물이색소침착과주름생성을효과적으로완화함을보여주는것으로, 딸기식물체추출물의미백, 주름개선화장품신원료로서의가능성을보여주는것이라할수있다. www.kosac.or.kr 973
감사의글본연구는농촌진흥청아젠다공동연구사업 (Project No. PJ0083132013) 지원으로수행되었으며, 이에감사드립니다. 권승빈, 이강태, 최성진, 이나경, 박현우, 이광식, 이건국, 안규중, 안인숙. 글리세린, 히알루론산, 실리콘오일이피부의보습및경피수분손실량에미치는효과. 대한피부미용학회지, 11: 761-768, 2013. 박주아, 정숙희. 소리쟁이추출물을이용한멜라닌생성억제와피부의멜라닌 홍반값의변화도. 대한피부미용학회지, 10: 291-297, 2012. 윤영민, 배승희, 안성관, 최용범, 안규중, 안인숙. 자외선 (Ultraviolet) 이피부및피부세포내신호전달체계에미치는영향. 대한피부미용학회지, 11: 675-684, 2013. 정상철, 박종호, 김진희. 천연소재로부터피부효능을갖는피부미용식품의개발동향. 대한피부미용학회지, 11: 203-212, 2013. 정은영, 이시경. 제주도토착우뭇가사리의항산화활성및 HaCaT 세포재생효과. 대한피부미용학회지, 8: 1-9, 2010. Afnan Q, Adil MD, Nissar-Ul A, Rafiq AR, Amir HF, Kaiser P, Gupta VK, Vishwakarma R, Tasduq SA. Glycyrrhizic acid (GA), a triterpenoid saponin glycoside alleviates ultraviolet-b irradiationinduced photoaging in human dermal fibroblasts. Phytomedicine, 19: 658-664, 2012. Bae JT, Ko HJ, Kim GB, Pyo HB, Lee GS. Protective effects of fermented Citrus unshiu peel extract against ultraviolet-a-induced photoageing in human dermal fibrobolasts. Phytother. Res,. 26: 1851-1856, 2012. Bae JY, Choi JS, Kang SW, Lee YJ, Park J, Kang YH. Dietary compound ellagic acid alleviates skin wrinkle and inflammation induced by UV-B irradiation. Exp. Dermatol., 19: e182-190, 2010. Giampieri F, Alvarez-Suarez JM, Tulipani S, Gonzàles- Paramàs AM, Santos-Buelga C, Bompadre S, Quiles JL, Mezzetti B, Battino M. Photoprotective potential of strawberry (Fragaria ananassa) extract against UV-A irradiation damage on human fibroblasts. J. Agric. Food Chem., 60: 2322-2237, 2012. Jenkins G. Molecular mechanisms of skin ageing. Mech. Ageing Dev., 123: 801-810, 2002. Kim J, Lee CW, Kim EK, Lee SJ, Park NH, Kim HS, Kim HK, Char K, Jang YP, Kim JW. Inhibition effect of Gynura procumbens extract on UV-B-induced matrix-metalloproteinase expression in human dermal fibroblasts. J. Ethnopharmacol., 137: 427-433, 2011. Kim JA, Ahn BN, Kong CS, Kim SK. Protective effect of chromene isolated from Sargassum horneri against UV-A-induced damage in skin dermal fibroblasts. Exp. Dermatol., 21: 630-631, 2012. Kim YH, Kim KH, Han CS, Yang HC, Park SH, Jang HI, Kim JW, Choi YS, Lee NH. Anti-wrinkle activity of Platycarya strobilacea extract and its application as a cosmeceutical ingredient. J. Cosmet. Sci., 61: 211-224, 2010. Lee YR, Noh EM, Han JH, Kim JM, Hwang JK, Hwang BM, Chung EY, Kim BS, Lee SH, Lee SJ, Kim JS. Brazilin inhibits UVB-induced MMP-1/3 expressions and secretions by suppressing the NF-κB pathway in human dermal fibroblasts. Eur. J. Pharmacol., 674: 80-86, 2012. Rim JH, Jo SJ, Park JY, Park BD, Youn JI. Electrical measurement of moisturing effect on skin hydration and barrier function in psoriasis patients. Clin. Exp. Dermatol., 30: 409-413, 2005. Yang B, Ji C, Chen X, Cui L, Bi Z, Wan Y, Xu J. Protective effect of astragaloside IV against matrix metalloproteinase-1 expression in ultravioletirradiated human dermal fibroblasts. Arch. Pharm. Res., 34: 1553-1560, 2011. Zague V, de Freitas V, da Costa Rosa M, de Castro GÁ, Jaeger RG, Machado-Santelli GM. Collagen hydrolysate intake increases skin collagen expression and suppresses matrix metalloproteinase 2 activity. J. Med. Food., 14: 618-624, 2011. 974 www.kosac.or.kr