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임상검사와정도관리 : 제 3 권제 2 호 2009 J Lab Med Qual Assur 2009; 3:275-9 275 SLAN real-time PCR 장비를이용한 Artus HBV LC PCR kit 의평가 김민기 이동영 장윤환 이진경 홍석일 홍영준 원자력병원진단검사의학과 Evaluation of Artus HBV LC PCR kit using SLAN Real-time PCR Minki Kim, Dong Young Lee, Yoon Hwan Chang, Jin Kyung Lee, Seok-Il Hong, and Young Joon Hong Department of Laboratory Medicine, Korea Cancer Center Hospital, Seoul, Korea Background: Real-time PCR has been widely used not only for quantification of disease-related genes but also for detection of bacteria or viruses. In this study, we evaluated the performance of Artus HBV LC PCR kit (Qiagen, Hilden, Germany) using recently developed SLAN real-time PCR detection system (Shanghai Hongshi Medical Technology Co., Shanghai, China) to assess clinical relevance of the new instrument. Methods: Precision, linearity and detection limit of Artus HBV LC PCR kit were evaluated using SLAN real-time PCR detection system. We also compared the SLAN real-time PCR detection system with LightCycler.5 (Roche Molecular System, Branchburg, NJ, USA) and ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). WHO International Standard for HBV DNA Nucleic Acid Amplification Techniques (NIBSC code:97/750) and 40 HBV DNA positive sera were tested for this evaluation. Results: Within-run and between-day coefficients of variation were 5.63%, 4.0% at 6.2 0 3 IU/mL and.2%, 0.80% at 2. 0 IU/mL, respectively. Linearity was verified from.0 0 to.0 0 5 IU/mL (r 2 =.000; slope=.42). Detection limit for HBV DNA was verified to be 7.54 IU/mL. It showed a good correlation with LightCycler.5 (r=0.9723) and ABI PRISM 7500 (r=0.9768). Conclusions: Artus HBV LC PCR kit using SLAN real-time PCR detection system showed a good precision, linearity and assay sensitivity. It correlated well with LightCycler.5 and ABI PRISM 7500. We conclude that it can be used in clinical laboratories for nucleic acid quantification. Key Words:SLAN real-time PCR, Artus HBV LC PCR kit, Performance evaluation, HBV DNA 서 Real-time PCR 은각종질병관련유전자들의발현을정량적으로분석할뿐아니라세균및바이러스의검출을목적으로임상검사실에서널리사용되고있는방법으로, 그적용범위가점차확대되고있다 [,2]. Real-time PCR 은 교신저자 : 홍영준우 ) 39-706 서울시노원구공릉 2 동 25-4 원자력병원진단검사의학과전화 :02)970-2492, 팩스 :02)973-743 E-mail: clinchem@hotmail.com 론 hepatitis B virus (HBV)[3], Epstein-Barr virus (EBV)[4], cytomegalovirus (CMV)[5], human herpesvirus (HHV)[6] 등다양한종류의바이러스검출에사용될수있다. 특히 HBV DNA 정량은환자의예후를예측하고치료효과를판정하는데필수적이다. 과거에는 HBV DNA 농도가 20,000 IU/mL 이하인경우비활동성보유자로간주되어약물치료의대상이아니었으나, 최근미국간학회의만성 B형간염치료가이드라인에서 2,000-20,000 IU/mL인경우라도지속적인추적검사와함께적극적인치료도필요할수있다고하여 [7], 20,000 IU/mL 이상뿐아니라그이하에서도정확한정량이필요하게되었다. 그러므로낮은농도의 DNA 에서도

276 김민기 이동영 장윤환 이진경 홍석일 홍영준 정확한정량을할수있는 real-time PCR 장비들이요구되며, 이러한장비들의성능평가시낮은농도에서의검출한계에대한신중한평가가필요하다. Real-time PCR 은기존의 PCR 방법과달리증폭산물을형광의양으로실시간정량검출할수있는방법으로 [8], 현재많은종류의 real-time PCR 장비들이이용되고있는데, LightCycler.5 (Roche Molecular System, Branchburg, NJ, USA), ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 등이대표적인장비들이다. 따라서최근중국으로부터새로도입된 SLAN real-time PCR (Shanghai Hongshi Medical Technology Co., Shanghai, China) 에대해 Artus HBV LC PCR kit (Qiagen) 를이용하여정밀도, 직선성, 검출한계등의성능을평가하고, 기존장비들인 LightCycler.5 (Roche Molecular System) 및 ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems) 와결과들을비교함으로써일치율을평가하고자하였다.. 재료 재료및방법 본연구는 HBV DNA 핵산검사를위한 WHO 국제표준물질 (NIBSC code: 97/750) 및 2009 년 월 5일부터 2009 년 월 6일까지원자력병원에내원한환자중 Modular Analytics E70 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) 으로측정한 B형간염표면항원결과가양성이고, Artus HBV LC PCR kit (Qiagen, Hilden, Germany) 를사용하여 LightCycler.5 (Roche Molecular System) 로분석한결과가양성인환자 40명의혈청 DNA 를대상으로하였다. 직선성평가에는 HBV DNA 표준물질을단계희석한, 0, 0 2, 0 3, 0 4 그리고 0 5 IU/mL의 5가지농도를이용하였고, 검출한계측정에는 4, 8, 2, 20 IU/mL 의 4가지농도로희석된 HBV DNA 표준물질을이용하였다. 장비간일치율에사용한SLAN real-time PCR 장비와 ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems) 장비에는 Artus HBV TM PCR kit (Qiagen, Hilden, Germany) 시약을사용하였다. 2. 방법 ) 정밀도 LightCycler.5 (Roche Molecular System) 로 HBV DNA 를정량한값이 6.2 0 3 와 2. 0 IU/mL 인두개의환자검체를이용하여 0일동안 일 2회, 각회당두번씩측정하여검사내정밀도 (within-run precision) 와검사일간정밀도 (between-day precision) 를구하였다. 정밀도는 CLSI EP5-A2 에따른방식에의해산출하였다. 2) 직선성 CLSI EP6-A 의지침에따라단계희석한 HBV DNA 표준물질 (0, 0 2, 0 3, 0 4, 0 5 IU/mL) 을각 2회씩측정한값들로회귀방정식과결정계수를구하여직선성을평가하였다. 3) 장비간일치율 SLAN real-time PCR 장비에의한결과와 LightCycler.5 (Roche Molecular System) 및 ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems) 에의한결과와의일치율을 CLSI EP9-A2 의지침에따라 40명의 B형간염환자검체로부터추출한 DNA 를이용하여각장비에의한결과값들로상관계수를구하여평가하였다. 4) 검출한계측정 Probit 분석을통해 95% 신뢰수준으로결정되는검출한계를설정하였다. Probit 분석은주로독물학에서 Lethal Dosage 50 ( 반치사량 ) 을구하는데주로사용되고있으며, 일부진단적검사의검출한계를평가하는데도사용되고있다 [9]. ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems) 을이용하여국산시약인 BioSewoom Real-Q HBV quantification kit (BioSewoom Inc., Seoul, Korea) 를평가한황등의연구에서도 probit 분석을이용하여검출한계를구하였다 [0]. 4가지농도로희석된 HBV DNA 표준물질 (4, 8, 2, 20 IU/mL) 을하루에 6회씩 3일동안측정한값들로검출한계를구하였으며, 통계소프트웨어는 SPSS version 0.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 을이용하였다.. 정밀도 결 정밀도는검사내정밀도 (within-run precision) 와검사일간정밀도 (between-day precision) 두가지를구하였다. 농도가 6.2 0 3 IU/mL 인검체의검사내정밀도의변이계수 (within-run CV) 는 5.63% 였고검사일간정밀도의변이계수 (between-day CV) 는 4.0% 였다. 그리고농도가 2. 0 IU/mL인검체의검사내정밀도의변이계수 (within-run CV) 는.2% 이고검사일간정밀도의변이계수 (between-day CV) 는 0.80% 였다. 2. 직선성 SLAN real-time PCR 장비 (Shanghai Hongshi Medical Technology) 로 HBV DNA 농도를측정하였을때 0-0 5 IU/mL 의범위에서선형회귀모델 (y=a+b X) 과

Artus HBV PCR using SLAN 277 Estim ated H BV D NA concentration (IU/mL) 000000 00000 0000 000 00 0 y =.42x R 2 =.0000 0 00 000 0000 00000 000000 Nominal HBV DNA concentration (IU/mL) SLAN HBV DNA concentration (Log 0 IU/μL) 0 IU/μL) 7 6 5 4 3 2 0 - y =.0745x - 0.3549 R = 0.9723-2 -2-0 2 3 4 5 6 7 LC HBV DNA concentration (Log0 IU/μL) Fig.. Linearity of HBV DNA concentration analysed by SLAN real-time PCR detection system using Artus HBV TM PCR kit (Qiagen). Fig. 2. Inter-instrument comparison of SLAN real-time PCR detection system using Artus HBV TM PCR kit (Qiagen) with LightCycler.5 (LC) using Artus HBV LC PCR kit (Qiagen) for HBV DNA quantification. SLAN HBV DNA concentration (Log 0 IU/μL) 0 IU/μL) 7 6 5 4 3 2 0 - -2 y = 0.8978x + 0.2252 R = 0.9768-3 -3-2 - 0 2 3 4 5 6 7 ABI HBV DNA concentration (Log 0 IU/μL) Fig. 3. Inter-instrument comparison of SLAN real-time PCR detection system with ABI PRISM 7500 for HBV DNA quantification. 에서 b =.42, r 2 =.0000 으로직선성이잘유지되었다 (Fig. ). 3. 장비간일치율 LightCycler.5 (Roche Molecular System) 와 SLAN real-time PCR 장비 (Shanghai Hongshi Medical Technology) 간의 HBV DNA 농도의 r값은 0.9723 이었다 (Fig. 2). 그리고 ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems) 과 SLAN real-time PCR 장비 (Shanghai Hongshi Medical Technology) 간의 HBV DNA 농도의 r값은 0.9768 이었다 (Fig. 3). 4. 검출한계 HBV DNA 의농도가 20 IU/mL 와 2 IU/mL 일때는 00% 검출이가능하였고, 8 IU/mL 에서는 94.4%, 4 IU/mL 에서는 83.3% 검출이가능하였다 (Table). SPSS Table. Detection limit of HBV DNA concentration analysed by Artus HBV TM PCR kit using SLAN real-time PCR detection system HBV (IU/mL) Replicates Positive Detection rate (%) 20 8 8 00.0 2 8 8 00.0 8 8 7 94.4 4 8 5 83.3

278 김민기 이동영 장윤환 이진경 홍석일 홍영준 를이용한 probit 분석결과상 95% 신뢰수준으로결정되는 HBV DNA 의검출한계는 7.54 IU/mL 이었다. 고 본연구에서는최근중국으로부터새로도입된 SLAN real-time PCR 장비 (Shanghai Hongshi Medical Technology) 를이용하여 Artus HBV LC PCR kit (Qiagen) 을평가하였는데, 두가지농도 6.2 0 3 IU/mL (4.3 0 4 copies/ml) 와 2. 0 IU/mL (.5 0 2 copies/ml) 에대한검사내정밀도의변이계수는각각 5.63%,.2%, 그리고검사일간정밀도의변이계수는각각 4.0%, 0.80% 이었다. 이것은 real-time PCR 장비 ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems) 을이용하여국산시약인 BioSewoom Real-Q HBV quantification kit (BioSewoom Inc.) 를평가한황등의연구 [0] 에서, 고농도인 0 6 copies/ml 에서검사내정밀도 8.7%, 검사일간정밀도 0.5%, 저농도인 0 3 copies/ml 에서검사내정밀도.9%, 검사일간정밀도 4.7% 을얻었던것보다우수한결과였다. 이는한편 real-time PCR 장비인Abbott m2000rt (Abbott Molecular Inc. Abbott Park, IL, USA) 를이용하여 Abbott RealTime HBV Quantification kit (Abbott Molecular Inc.) 를평가한김등의연구 [] 에서 0 6 copies/ml와 7.8 0 3 copies/ml 두농도에대해서검사내정밀도의변이계수는 3.56-4.7%, 검사일간정밀도의변이계수는 3.03-4.98% 이었던것과비교할때유사한결과를보였다. 그리고본연구에서는다른연구들보다더욱낮은농도인 2. 0 IU/mL 를이용하였고, 검사내및검사일간정밀도모두높은농도보다오히려더우수함을보여낮은농도에서도유용하게사용될수있을것으로생각된다. 제조사에서제시한 95% 신뢰수준에서의검출한계와측정가능범위는각각 Artus HBV LC PCR kit (Qiagen) 를사용하여 LightCycler.5 (Roche Molecular System 에서검사한결과는 5.8 IU/mL, 5 0 2-0 IU/mL, Artus HBV TM PCR kit (Qiagen) 를사용하여 ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems) 에서검사한결과는 4 IU/mL,.6 0 2-0 IU/mL 였다. 그리고 Artus HBV TM PCR kit (Qiagen) 를사용한 SLAN real-time PCR 장비 (Shanghai Hongshi Medical Technology) 에대한검증자료는없었다. 직선성평가에서는.0 0 -.0 0 5 IU/mL 의범위에서기울기.42, r 2 값.0000 으로이구간에서직선성이잘유지되는것으로보여제조사가제시한범위인 2.5 0 2-5.0 0 0 copies/ml 에비해더낮은농도까지측정이가능한것으로나타났다. 황등의연구 [0] 에서는.0 0 2 -.0 0 0 copies/ml 구간에서, 김등의연구 찰 [] 에서는 5.3 0 -.0 0 9 copies/ml 구간에서직선성이잘유지됨을확인하였다. Artus HBV LC PCR kit (Qiagen) 를사용한 LightCycler.5 (Roche Molecular System) 및 Artus HBV TM PCR kit (Qiagen) 를사용한 ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems) 장비간의비교에서는 r값이각각 0.9723, 0.9768 로우수한상관성을보였다. 검출한계는 95% 신뢰수준에서 7.54 IU/mL 로 Ho 등의연구 [2] 에서 LightCycler (Roche Molecular System) 의검출한계 2.5 0 2 copies/ml (35.7 IU/ ml) 보다민감한결과이며, 황등의연구 [0] 에서나타난 ABI Prism 7000 (Applied Biosystems) 의 5.6 0 copies/ml (8 IU/mL) 와큰차이가없었다. 결론적으로 Artus HBV LC PCR kit (Qiagen) 을이용한 SLAN real-time PCR detection system (Shanghai Hongshi Medical Technology) 은검사내정밀도 (within-run precision), 검사일간정밀도 (between-day precision) 및직선성이우수하였고, LightCycler.5 (Roche Molecular System) 및 ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems) 의결과와높은일치율을보여검사실에서 B형간염의정량검사에유용하게사용될수있을것으로생각된다. 요 배경 : Real-time PCR 은질환관련각종유전자들의발현을정량적으로분석할뿐아니라세균및바이러스검출등의목적으로임상검사실에서사용되고있는방법이다. 본연구에서는최근새로도입된 SLAN real-time PCR 장비를이용하여 hepatitis B virus (HBV) DNA 정량검사시약을평가하고자하였다. 방법 : SLAN real-time PCR 장비를이용하여 Artus HBV LC PCR kit (Qiagen) 의검사내정밀도 (within-run precision), 검사일간정밀도 (between-day precision), 직선성, 검출한계를평가하였다. 또한 LightCycler.5 (Roche Molecular System, Branchburg, NJ, USA) 및 ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 을이용한결과와비교하여일치율을평가하였다. 본연구에서는 HBV DNA 핵산검사를위한 WHO 국제표준물질 (NIBSC code:97/750) 및 HBV DNA 양성인환자검체 40 개를이용하였다. 결과 : 검사내및검사일간정밀도의변이계수는 6.2 0 3 IU/mL 농도에서 5.63%, 4.0% 였고, 2. 0 IU/mL 농도에서 0.80%,.2% 이었다. 표준물질을이용한직선성의평가에서는.0 0 -.0 0 5 IU/mL 의범위에서기울기가.42, r 2 값이.0000 으로나타나직선성이우수함을알수있었다. HBV DNA 의검출한계는 7.54 IU/mL 였으며. 기존장비 LightCycler.5 및 ABI 약

Artus HBV PCR using SLAN 279 PRISM 7500 과의비교에서각각 r=0.9723, r=0.9768 로우수한상관성을보였다. 결론 : HBV DNA 를이용한성능평가결과 SLAN real-time PCR 장비를이용한 Artus HBV LC PCR kit (Qiagen) 는검사내정밀도, 검사일간정밀도, 직선성이우수하였고, 성능이입증된기존장비인 LightCycler.5 와 ABI PRISM 7500 과도높은상관성을보여 HBV 정량검사법으로서임상적으로유용하게사용될수있을것으로생각된다. 참고문헌. Mackay IM, Arden KE, Nitsche A. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res 2002;30:292-305. 2. Niesters HG. Molecular and diagnostic clinical virology in real time. Clin Microbiol Infect 2004;0:5-. 3. Chen CJ, Yang HI, Su J, Jen CL, You SL, Lu SN, et al. Risk of hepatocellular carcinoma across a biological gradient of serum hepatitis B virus DNA level. JAMA 2006;295:65-73. 4. Kimura H, Morita M, Yabuta Y, Kuzushima K, Kato K, Kojima S, et al. Quantitative analysis of Epstein-Barr virus load by using a real-time PCR assay. J Clin Microbiol 999;37:32-6. 5. Tanaka N, Kimura H, Iida K, Saito Y, Tsuga I, Yoshimi A, et al. Quantitative analysis of cytomegalovirus load using a real-time PCR assay. J Med Virol 2000;60:445-62. 6. Tanaka N, Kimura H, Hoshino Y, Kato K, Yashikawa T, Asano Y, et al. Monitoring four herpesviruses in unrelated cord blood transplantation. Bone Marrow Transplant 2000;26:93-7. 7. Lok AS and McMahon BJ. Chronic hepatitis B. Hepatology 2007;45:507-39. 8. Mackay IM. Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin Microbiol Infect 2004;0:90-22. 9. Smieja M, Mahony JB, Goldsmith CH, Chong S, Petrich A, Chernesky M. Replicate PCR testing and probit analysis for detection and quantitation of Chlamydia pneumoniae in clinical specimens. J Clin Microbiol 200;39:796-80. 0. Hwang SH, Cha CH, KimYL, Kwon OJ, Oh HB. Performance evaluation of Real-Q HBV quantification kit for HBV DNA by real-time PCR. Korean J Lab Med 2006;26:442-8.. Kim MH, Cha CH, An D, Choi SE, Oh HB. Performance evaluation of Abbott real time HBV quantification kit for HBV viral load by real-time PCR. Korean J Lab Med 2008;28:44-50. 2. Ho SK, Yam WC, Leung ET, Wong LP, Leung JK, Lai KN, et al. Rapid quantification of hepatitis B virus DNA by real-time PCR using fluorescent hybridization probes. J Med Microbiol 2003;52:397-402.