최신연구동향 방향족아미노산및유래화합물생산을위한미생물개량연구 KAIST 정기준교수, 방현배박사과정 1. 개요 산업적으로고부가가치물질에속하는방향족아미노산및유래화합물생산성증가를목적으로전세계적으로활발히연구되고있다. 특히방향족화합물의경우석유자원에서주로생산되는거대시장의화합물로 naphtha 분해과정에서생성되는벤젠 (benzene), 톨루엔 (toluene), 크실렌 (xylene) 으로부터대부분이생성된다. 그중에서도벤젠은각종화학원료제품의합성에이용되는매우중요한물질이나, 대표적인발암성유해물질이라는치명적인단점이존재한다. 따라서이러한유해물질대신재생가능한 (renewable) 합성생물학적방법을이용해생산할수있는기술의개발이필요하다. 방향족화합물의생합성대사경로는전구물질 (precursor) 인방향족아미노산페닐알라닌 (Lphenylalanine), 트립토판 (L-tryptophan), 티로신 (L-tyrosine) 을생산하는경로로부터생성되며, 또한그중간대사물질 (intermediate) 인 3-dehydroquinic acid, shikimic acid, chorismic acid 등역시의약품, 화장품, 식품, 염료, 농약, 폴리머, 기타특수소재등에직접적 / 간접적으로광범위하게응용될수있는매우유용한대사산물이다. 하지만미생물은각아미노산의생합성을 feedback inhibition을통해제어함으로써특정아미노산을대량으로생산하지않는다. 따라서본보고서에서는이렇게미생물을기반으로하는방향족아미노산및유래화합물의대량생산을위한합생생물학적연구동향에대해서고찰해보고자한다.
2. 방향족아미노산생산미생물개발 앞서언급한바와같이방향족아미노산인티로신 (L-tyrosine), 트립토판 (L-tryptophan), 페닐알라닌 (L-phenylalanine) 은모든생명체의단백질합성에필수적이다. 또한의약품, 식품첨가제, 사료첨가제, 화장품원료등으로사용될수있는다양한이차대사산물들의전구체로써사용되기때문에산업적으로도중요하다. 동물을제외한식물, 균류, 박테리아에서의방향족아미노산의생합성은자연적으로 shikimic acid 생산경로로부터유래되며중간기질로써 chorismate를공유한다. 이후 chorismate에서나눠지며트립토판은 anthranilate를거쳐합성되고, 페닐알라닌및티로신은 prephenate를거침으로써최종적으로합성된다 [ 그림 1]. 물론벤젠과같은유기용매로부터의합성역시가능하지만벤젠은대표적인발암성유해물질이기때문에, petroleum 기반의합성대신친환경적인방법인바이오매스를원료로하는합성생물학적방법을이용해합성하는기술개발이요구된다. 그림 1 방향족아미노산생합성경로균주개량은크게 Random mutagenesis와 rational metabolic engineering으로크게나눠진다. 방향족아미노산을미생물에서대량으로생산하고자하는시도는 1980년대부터시작되어왔으며전통적으로는최소배지 (minimal medium) 에서변이주 (mutant) 를선별하는방법을통한고생산균주개량방법이이용되어왔다. 하지만제한된방법과시간이소모된다는단점과, 합성생물학
(synthetic biology), 생물정보학 (bioinformatics), 단백질공학 (protein engineering), 시스템생물학 (systems biology) 등의발전으로유전자수준에서보다정교한경로조절이가능하게되면서대장균 (Escherichia coli), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 브레비박테리움 (Brevibacterium) 을포함하는균주의대사회로조작을통한생산량증가연구가꾸준히진행되고있다. 미생물에서방향족아미노산생합성대사경로의첫단계효소인 DAHP synthase 및 chorismate에서각방향족아미노산을생산하는효소인 TrpE, PheA, TyrA는각각의최종생산물인트립토판, 페닐알라닌, 티로신에의해 feedback inhibition을받는다. 이로인해생산물의생산성역시감소하기때문에이들방향족아미노산을대량으로생산하는연구에있어, 돌연변이유전자를도입함으로써저해를받지않고생산량을증가시키는방법이공통적으로사용되고있다. 또한전반적으로 TyrR 및 TrpR transcription regulator에의한 repression을받는다는단점이존재하기때문에, 이러한조절단백질들을제거하는방법으로미생물의성장에영향을주지않으면서동시에생산량을늘릴수있다 [ 그림 2]. 표 1 방향족아미노산시장규모및생산추이 아미노산 연간생산량 ( 톤 ) 시장규모 ($US) 최고생산량 출처 L-Phenylalanine 30000 1.0 billion 62 g/l (E. coli) [6] L-Tryptophan 14000 150 million 49 g/l (E. coli) [7], [8] L-Tyrosine 200 50 million 55 g/l (E. coli) [9] 이러한대사공학적접근방법과추가적인발효공정의최적화를통해, 미생물로부터페닐알라닌, 티 로신및트립토판의방향족아미노산을생산한연구는리터당수십그람까지생합성이가능한것으 로보고되어있으며이는화학적인합성에비교해서산업적으로경쟁력을가질수있다.
그림 2 포도당 (Glucose) 으로부터 (A) 페닐알라닌및 (B) 티로신의생합성경로및생산성증가 를위한유전자조작
3. 방향족아미노산유래화합물의생산을위한미생물개량 앞단락에서기술된바와같이, 방향족아미노산은그자체로서식음료및의약산업으로의적용이가능하기때문에전세계적으로수요가증가하고있다. 또한, 방향족아미노산은체내에서다양한목적으로사용될수있는이차대사물질의전구물질로서의중요성을지니기때문에, 미생물내외래효소유전자의도입등을통해방향족아미노산이산업적으로유용한물질생산의출발점이될수있다는연구사례가증가하면서그중요성이더욱대두되고있다. 이러한연구들의공통적인지향점은미생물균주를개량및배양하여고부가가치유용물질을대량생산하고, 이를통해가격경쟁력있는생산플랫폼을구축하는데에있다. 아래 [ 표 2] 은방향족아미노산유래의주요화합물생산연구사례를정리한것이다. 표 2 미생물을이용한방향족아미노산유래화합물생산연구사례 생산물질 적용분야 생산량 참고문헌 Violacein 항암치료제, 그람양성균항생제등 1.75 g/l [15], [16] Slavianic acid A 항산화물질, 심혈관계통의약품 7.1 g/l [17] L-DOPA 파킨슨병치료제 8.67 g/l [18] Hydroxytyrosol 항산화물질, 피부질환및심혈관질환치료제 208 mg/l [19] Caffeic acid 건강, 의약식품 766.68 [20] mg/l Cinnamaldehyde 친환경선충퇴치제 75 mg/l [21] Styrene 폴리스티렌단량체및석유화학공정 836 mg/l [22] Resveratol 건강, 의약식품 ( 심혈관질환및당뇨 ) 2.3 g/l [23] p-coumaric acid 폴리페놀, 플라보노이드등의전구체 1.93 g/l [24] 위의사례들을포함하는대부분의연구들은최종생산물의생산성증대를고려하여고농도배양이 가능한대장균, 코리네박테리아, 효모등다양한균주를사용하였다. 생산물질의생합성경로는일 반적으로이균주내에자연적으로존재하지않으며, 따라서식물등의고등생물의효소유전자를
도입하는시도가진행되어왔다. [ 그림 3] 에표기된예시들모두외래유전자를 1개이상도입함으로써미생물내에새로운생합성경로를구축하였다. 파킨슨병의치료제로가능성이대두되고있는 L- DOPA의경우, 티로신 (L-tyrosine) 을 L-DOPA로전환시킬수있다고알려진쥐유래유전자티로신하이드록실라아제 (tyrosine hydroxylase) 를도입함으로써생산에성공하였다. 신남알데하이드 (cinnamaldehyde) 는농작물의주된생산성저하요인으로꼽히는식물기생선충을친환경적으로제거할수있는제초제로각광받고있으며, 이역시애기장대 (A. thaliana) 및방선균 (Streptomyces sp.) 유래의외래유전자들을도입함으로써페닐알라닌 (L-phenylalanine) 으로부터미생물내생산이가능하다고발표되었다. 마찬가지로쿠마르산 (p-coumaric acid) 역시페닐알라닌또는티로신유래의대사물질로, 그자체로는산업적으로유용한기능을갖는다고보긴힘들지만, 많은종류의폴리페놀, 플라보노이드등의전구물질로전환될수있는분기점으로여겨져미생물내에서생산하는것이중요한의미를갖는다. 트립토판 (L-tryptophan) 유래의고부가가치물질로는항생물질로잘알려진비올라세인 (violacein) 이있다. 트립토판은 vioa, viob, vioc, viod, vioe의다섯유전자에의해비올라세인으로전환되며, 위의예시들과유사한방식으로대장균에외래 vio 유전자클러스터를도입하여생산할수있음이연구되었다. 미생물을기반으로생산할수있는방향족아미노산유래화합물에는건강, 의약관련물질뿐만아니라독성물질도있는데, 페닐알라닌으로부터생산될수있는스티렌 (styrene) 이대표적인사례이다. 스티렌은폴리스티렌중합체의단위체로서의수요및기타석유화학제품의전구물질로사용될수있기때문에전세계적인생산량과수요가크며, 따라서기존의석유화학기반생산공정을대체할수있는미생물기반생산이연구되어왔다. 특히, 스티렌이대장균성장에미치는저해효과를해소하기위하여생적합성유기용매 (biocompatible organic solvent) 를첨가하여생산즉시유기용매로추출될수있도록시도함으로써생산성증가에성공한사례도보고되었다.
그림 3 방향족아미노산으로부터생산가능한다양한물질방향족아미노산유래의고부가가치화합물은세포내의이차대사산물 (secondary metabolite) 이다. 이러한이차대사산물의생산성을증가시키기위해서는외래유전자의도입뿐만아니라전구물질을많은양으로확보하는것이중요하다. 따라서타겟물질의생합성경로에놓인불필요한유전자를제거하거나, 주요유전자들을과발현하는연구가시도되어왔다. [ 그림 4] 는포도당 (glucose) 으로부터방향족아미노산, 더나아가최종생산물인 violacein 또는 L-DOPA를생산하는생합성경로를최적화하기위한시도를나타낸다. 대장균의단일탄소원으로서포도당이공급되고, 방향족아미노산및그유도체의고생산에있어불필요한유전자는세포의성장을저해하지않는선에서제거되었으며, 일부핵심유전자들은플라스미드를이용하여추가적으로과발현하였다. 이와같은대사공학적접근 (metabolic engineering) 을통해타겟물질의생산성을극대화할수있다.
그림 4 방향족아미노산으로부터대사공학적방법을이용한방향족화합물생산 (A) Violacein (B) L-DOPA 비록앞선단락들에있어서는불필요하거나경쟁경로의유전자제거 (knock-out) 및플라스미드를
통한강화 (overexpression) 등에대해서만언급을하였다. 하지만단순히경로를제거및강화하는것만이생산성을증가시킬수있는것만은아니다. 예를들면중간물질 (intermediate) 의축적이미생물에독성을나타내거나, 성장에반드시필요한경로이기때문에제거할수없을가능성또한존재하기때문이다. 따라서최근에는모듈의조절을통해효율을높이는방법또한사용되고있다. 합성프로모터를사용하거나 biosensor/riboswitch를사용하여특정유전자의발현을 ON/OFF, 또는 srna/ncrna를이용하여유전자의제거가아닌 down-regulation을하는방법을통해 finetuning 등이이에해당한다. 4. 고찰 이렇듯합성생물학을기반으로다양한방향족화합물의합성이성공적으로연구되고있다. 하지만미생물기반의화합물생산의가장큰쟁점은가격경쟁력이다. 초기연구사례들은주로미생물내에서새로운물질을생산하는것자체에큰의미를두어국한되어왔으나, 유기합성및석유화학기반의기존생산시스템을대체하고자한다면추가적인생산성증대및원가절감에대한고려가필요하다. 따라서리그노셀룰로오스 (lignocellulose) 혹은미세조류 (microalgae) 등의가수분해물 (hydrolysate) 등을포함한값싼원료물질을탄소원으로써공급하고, 이를이용한고부가가치물질을생산함으로써상용화에한걸음더다가갈수있을것이다. 참고문헌 [1] Lee JH, Research trend about the development of white biotech-based aromatic compounds. Kor. J. Microbiol. Biotechnol. 2009, 37: 306-315. [2] Bongaerts J, Kramer M, Muller U, Raeven L, Wubbolts M, Metabolic engineering for microbial production of aromatic amino acids and derived compounds. Metab. Eng. 2001, 3: 289-300. [3] Lim SH, Park SK, Ha sh, Choi MJ, Kim DH, Lee JY, Kim YM, Biosynthetic pathway of shikimate and aromatic amino acid and its metabolic engineering in plants. J. Plant Biotechnol. 2015, 42:
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