13 장. 원형질체의융합 1 절. 원형질체융합방법 원형질체 (protoplast) 는세포벽이없으므로, 세포간의융합에의해서다핵세포가될수있는성질을갖고있다. 예를들면단백질이나핵산등와같은고분자물질을쉽게받아들일뿐만아니라 bacteria의 spheroplast( 세포벽이거의제거된것 ) 나 ribosome, 세포내에존재하는 chloroplast, mitochondria와같은세포내소기관등비교적큰것도받아들일수있다. 또한원형질체끼리서로융합하는것도특징중의하나인데, 이것을체세포융합 (somatic fusion) 또는원형질체융합 (protoplast fusion) 이라한다. 이러한융합을통해새로운합성식물을얻기위하여융합을유도하고있는데, 융합에는작물의특성에따라원형질체가나출되면나출원형질체간에스스로융합이일어나는자발적융합과화학약품의처리와전기충격에의해서융합을유도하는인위적융합으로구분된다. <leaf cell 의엽록체와 petal 의색을띄고있는 vacuole 이융합한것으로가장왼쪽이융합 된원형질체이다 > < 원형질체융합과정 > 1. 자발적융합 (spontaneous fusion) 원형질체를만드는과정에서세포벽분해효소의자국과삼투압의변화로일부원형질체가스스로융합되는자발적인융합이일어날수있다. 이것은세포간의원형질연락사 (plasmodesmata) 가팽창하여접착함으로써일어나는것이다. 이과같이 2개이상의같은원형질체가융합되면동종의핵이 2개이상되는 homokaryon 또는 homokaryocyte라고한다. 자발적인융합은같은기원의원형질체사이에서일어나는것이기때문에아무런의미가없으며오히려이비율이높아지면쓸모있는원형질체의수가감소됨으로이를억제
시켜야한다. 2. 인위적융합 ( 유도융합 : induced fusion) 서로다른기원의원형질체를융합시키기위해인위적인융합이이루어져야하는데, 이를 위해서는원형질체가서로모이고접촉되도록하여야한다. 융합의방법에따라융합촉진 제가필요한화학적융합 (chemical induced fusion) 과전기적융합 (electro fusion) 이있다. 1화학적융합 (chemical induced fusion) 화학적으로다양한융합촉진제가사용되어지는데, 여기에는 NaNO3, 높은 ph, PEG, DMSO, PV(polyvinyl acetate) 등이있다. 융합하기위해서는서로접촉되도록해야하지만, 식물원형질체는표면에음전하 (-10~30mV) 를띄고있고원형질막에는 lipid가있어서서로간의접촉이어렵다. 융합촉진제는접촉이어렵게하는음전하를제거함으로써원형질체의접촉을유도한다. 높은 ph와 Ca2+ 처리융합방법원형질체가 Ca 2 + 이온속에서서로응집되는성질을이용한것이다. 구체적인방법은분리한 0.05M의 CaCl 2. 2H 2O를 0.4M의 Mannitol에용해시키고 ph를 10.5로조절한다음분리된원형질체를현탁시켜 50 g에서 3분동안원심분리시킨다음 37 항온수조에서 30~40분동안처리한후다시현탁하여배양한다. PEG(polyethylene glycol) 와 DMSO(dimethyl sulforxide) 처리융합방법 PEG 처리융합시일반적으로융합산물이용기의표면부근에수일동안떠있어서융합이확인될때에이들을즉시분리하는데어려움이있다. 이를개선하기위해 PEG와 DMSO를함께처리한것이다. 즉, PEG로원형질체를처리한후세척용액에 DMSO를처리함으로써개체별융합산물을쉽게분리하여융합빈도를현저하게증가시켰다. PEG(polyethylene glycol) 와 Ca 2 + 처리융합방법 PEG는대부분의세포에독성이낮고 heterokaryon의형성율이높다. PEG를처리하면원형질막이순식간에응집하여두개이상의덩어리로되는데, PEG가약한음성을띄므로양의극성을가진물, 단백질, 탄수화물등과수소결합을하며, PEG분자의고리가충분히크면인근원형질체표면사이에분자적인다리역할을하여유착이일어나는것이다. 또한 PEG은 Ca 2 + 와기타양이온을결합하여음으로극성을이훈원형질막의단백질무리또는인지질사이에다리를놓아서유착을촉진시킨다. 세척과정에서 Ca 2 + 와결합된 PEG분자는제거되면서전기적하전이재배열된다. 막이밀접하게접촉해있는부위에서전하의재배열은양으로하전된원형질체들을음으로하전된다른원형질에연결시키면원형질체를융합시킬수있다. PEG 융합방법은 2~3개의응집된원형질체사이에서융합이일어나기때문에융합빈도가높다. 2 전기적융합 (electro fusion) 방법 전기적자극에의한물리적인방법으로원형질체가알맞은전계 (electro field) 에놓이면
전기자극에의하여쉽게융합된다. 물리적인융합방법은화학적인융합방법에비하여독성이없으며실험방법이간단하다. 전기융합방법은특수한장치가필요하기때문에일반적으로화학시약방법을더많이사용한다. 전기융합은생물학적. 물리학적인과정으로서두단계로완성된다. 첫번째는현탁된원형질체를두전극사이에넣고교류전류를통과시키면배지에아주불균일한교류전계가형성된다. 이렇게되면입자양쪽이전계강도가서로다르기때문에 dielectrophoresis 현상을일으킨다. 이들은전기영동과는달리입자외부의전압이역전되어도이에따르지못하므로서로밀착하여전극에몇개씩붙거나전극사이에로연결되어원형질체가진주목걸이모양으로배열된다. 두번째단계에서는연결된원형질체에매우짧은직류 pulse를보내면양편의막이파괴되어융합이일어날수있다. 융합이되었을때밀접하게접촉된상태를유지시키기위하여교류전압을짧게보내고난후완전히끊는다. 때로는첫단계의응집과정을거치지않고바로직류펄스를사용하기도하지만잘못조정되어실패할경우도있다. < 전기적충격에의한원형질체융합 > 2 절. 잡종세포의선발 원형질체융합에의해형성된것이잡종으로되어있는지에대해서는재분화식물체의잎이나꽃의형태가중간적이냐아니냐에따라서구분이된다. 그러나개체로되돌리지않더라도세포수준에서잡종여부를알수있다면보다유효하다. 원형질체융합후잡종세포를확인하여우리가원하는융합체를선발해내는것이중요하다. 확인방법에는여러가지가있다. 1) 현미경 - 가장기본적인방법으로현미경으로확인하는방법. 2) 형광성색소 (FAD-fluorescein diacetate) 두가지형의원형질체를상이한형광성색소로염색하여확인하는방법. 3) 흡입식선발 micro-pipette을이용하여융합된원형질체를흡입하여선발하는방법이다. 이방법을이용하기위해서는융합체내의엽록체, 전분립또는색소체같은외형적으로구분이뚜렷한 marker( 표지 ) 가있어야한다. -Rubisco : 녹색잎의세포엽록체내에들어있으며광합성에있어서이산화탄소를고
정시키는역할을담당하고있는 Rubisco는자주사용되는지표이다. Rubisco는핵의유전종보로합성되는작은 subunit과엽록체의유전정보로합성되는큰 subunit으로구성되어있어전기영동을시키면작은 subunit과큰 subunit으로분리되어각 subunit 은몇개의 band로검출된다. 또각 band는종에따라다르기때문에잡종여부는각 band를비교하면된다. Rubisco는핵과세포질에대해서동시에잡종성이확인되기때문에매우편리하다. 4) protein을 marker로하는방법 peroxidase, acid phosphatase, esterase와같이많은 isozyme을갖는효소를사용하는방법. 5) 기타방법 -핵의유전자에대해서리보솜 RNA 유전자나반복배열 DNA와같이염색체중에다수의유전자복사가존재하는것을지표로하는방법 -in situ hybridization, 염색체를직접보는핵형분석 (in situ hybridization : 방사성동위원소로표지된 DNA를변성하여 1개의사슬로한후고정한염색체를혼합하면 DNA의염색체상에서의위치가결정된다.) -세포질유전자에대해서는미토콘드리아나엽록체를분리하여 DNA를추출하고특이적으로 DNA를절단하는제한효소를사용하여절단, 패턴을비교하는방법등이있다. 3 절. 원형질체배양의유지와식물체재생 1) 원형질체배양의유지및배양조건원형질체배양의최적조건은식물의종이나때로는품종에의해좌우된다. 대부분의원형질체는분열을시작하는데빛을필요로하지않으나, 어떤것은빛에민감하다. 온도범위는보통 25~30 로유지되도록하고, petri dish는형광등을이용하여 1000ux로계속조명될수있도록한다. 체세포잡종의식물체를성공적으로얻는데는많은경우에원형질체의분열을촉진시키든지아니면부모의한쪽은성장을억제하지만다른쪽은영향이없는것과같은일방적으로성장을억제하는배지를개발할필요가있다. 그렇게되면체세포잡종의성장이선택적으로촉진될수있으며, 또평가하고자하는다수의배지를바꾸어사용할수있는간단한방법을채택할수있다. 2) 원형질체의분열배양된세포원형질체는평판배양후 24~36시간에 1차분열을, 그리고 21일후에는 colony를기대할수있다. 한천이나 agarose내에있는원형질체의분열을촉진하기위해배지의삼투압을줄이거나, 분열중인원형질체가포함된작은덩어리로더낮은수준의원형질분리촉진제가들어있는배지의표면에옮긴다. 원형질체의재생배양에서는한감수분열기에보통 25% 이상을희석하지않는다. 3) 식물체재생 2 주후에는 colony 를이식하기에충분할만큼커지므로해부용칼의끝을이용하여한 천으로굳혀진재분화배지의표면에옮긴다. 이시기에세포군락과 callus 는 petri dish 나
병에유지될수있으며, 대게계대배양을규칙적으로하여 shoot 를생산하게된다. 싹은 호르몬의수준이낮거나없는배지에옮겨서발근시킨다. a. 식물체A로부터원형질체를분리, 정제 b. 식물체B로부터원형질체를분리, 정제 c.peg solution의첨가 :portoplast fusion d.cell division : protoplast fusion 후10일 e.cell culture & small colonies f. 고체배지로옮긴후자라는 colony들 g.somatic embryo induction h.rooting 배지로 shoot를옮김