2016-10-25 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 1 KNUmbl 경북대학교미생물공학연구실 6 장. 유기산발효
2016-10-25 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 2 유기산이란? 1. 정의 : 생체에서합성되는산 : CHO 로구성 2. 용도 1) 식품첨가물 : 구연산 - 산미료 (food acidulants), 향미개선 (flavor enhancer) 2) 유해미생물억제 : 주류공업에서잡균오염의억제 3) 유화제 (emulsifier) : steroyl lactylate 로합성하여사용 *** 유화제의예 :..\ 다당류와유화제.ppt 4) 의약및화장품 : 혈액응고방지제 5) 젖산발효, 초산발효의식품에이용 : 발효유제품, 침채류, 식초 6) 합성수지원료 : dicarboxylic acid(hooc-(ch2)n-cooh) 3. 생성경로 1) EMP or TCA 관련유기산 : lactic, citric, succinic, fumaric, malic acid 2) 당또는알코올의직접산화에의한유기산 : acetic, gluconic acid 3) 탄화수소의산화에의한유기산 : 식품과는무관 섬유, 플라스틱등
2016-10-25 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 3 6-1. 젖산 ( 유산, lactic acid) 의발효생산 1. 원료 가. 당질원료 1) Glucose, maltose, 전분당화액 : L. delbrueckii subsp. delbrueckii 2) 우유나유청 : L. delbrueckii subsp. bulgaricus - 우유 : 4~5% lactose, 유청 : 2-5% lactose 함유 나. 전분질원료 : 고구마, 감자, 옥수수 - 당화방법에따라분류 1) 단행복발효법 - 가장일반적방법 : 효소 ( 코오지, 맥아효소 ) 당화후젖산발효 - 균주 : L. delbrueckii subsp. delbrueckii - 전분당화액 (10-15% 당 ), 부원료 ( 질소원 - 밀기울, 겨,CSL), CaCO3, 종모 2) 병행복발효법 : 효소에의한당화와젖산균에의한젖산발효를동시에진행 - L. plantarum - 10-15% 의전분과 koji 를동시에사용하여당화및발효동시에유도 3) 산당화법 : 산 ( 황산, 염산 ) 으로당화한후젖산발효 - L. delbrueckii subsp. delbrueckii
발효공학 6장 : 유기산 발효 2. 발효관리 : 젖산 생산 - ph 감소로 젖산균 작용 약화 - 원료 : CaCO3 첨가하여 ph를 약 6으로 조절 후 살균(젖산균의 생육 양호) - 발효 중 CaCO3 or Ca(OH)2 연속첨가 및 교반 - ph 최적조건 유지(pH6.0) 2CH3CHOHCOOH + Ca++ ----------- Ca-lactate로 침전 유도 3. 젖산의 분리 및 정제: 젖산칼슘(Ca-lactate)으로 분리 1) 발효액 Ca(OH)2 첨가하여 가열 : 알칼리(pH 10)에서 젖산칼슘 용해도 증가 : 가열에 의해 젖산균 사멸과 단백질 응고 2) 고온여과 : 고온에서 젖산칼슘은 용액 내에 존재 3) 냉각 : 젖산칼슘의 침전 4) Ca의 제거 : 물에 용해(고온이면 용해 용이)후 황산 처리 Ca-lactate + H2SO4 --------- CaSO4 + 2lactic acid (용액 중 존재--농축하여 제품화) 2016-10-25 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 4
발효공학 6장 : 유기산 발효 6-2. 구연산(Citric acid) * 구연산의 어원 HO-C-COOH : 구연- 귤속의 식물에 citron의 한자어 Citrate : citric acid 감귤류의 citrus에서 유래 - GRAS(generally regarded as safe) : 다양한 식품에 이용 가능 * 구연산의 용도 : 세계적으로 약 40만 톤 생산 60% 이상 : 식품공업 - food, beverage 산미료의 75% 차지 - 과일주스, 캔디, 아이스크림, 마아멀레이드의 향기보존, 식욕증진제 25% : 화학공업 -직물, 금속정제, antifoam reagent, 계면활성제 10% : 의학 Ca와 칼슘염 형성하여 혈액의 응고방지 -혈액보존 5% : 기타 * 구연산의 생산 1923 미생물에 의한 발효시작 - 이전에는 citrus 미숙과에서 추출, 현재 99% 이상이 발효에 의해 생산 lemon: 7-9%의 구연산 함유 -남미, 멕시코에서 일부 추출사용 2016-10-25 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 5
구연산생산경로 CoASH CO2 CH3COCOOH Pyruvate NAD+ NADH2 CH3CO~SCoA Acetyl CoA COCOOH H2O Oxaloacetate HO-CHCOOH Malate CHCOOH Ⅱ HOOC-CH Fumarate NADH2 NAD+ H2O CoASH FADH2 TCA cycle 1Pyruvate : 3NADH2, 1NADPH2, 1FADH2, 1GTP, 3CO2 전자전달계에서 14ATP 생성 HO-C-COOH Citrate FAD Succinate CCOOH Ⅱ Cis-Aconitate NAD(P)+ NAD(P)H2 CoASH CO2 GTP GDP + Pi NADH2 NAD+ CH2CO~SCoA Succinyl CoA CO2 CoASH CHCOOH HO-CHCOOH Isocitrate CHCOOH COCOOH Oxalosuccinate CH2 COCOOH a-kg 2016-10-25 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 6 H2O
2016-10-25 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 7 1. 구연산생산균주 가. 일반적특성 1) 구연산생산력강 : Citrate synthetase 활성강 * 구연산생성경로 CoASH CO2 NAD+ NADH2 H2O CoASH EMP 2 3 Glucose Pyruvate Acetyl CoA Citrate CO2 1 Oxaloacetate COCOOH TCA COHCOOH - OAA 생성 : pyruvate or PEP 에 CO2 고정 (pyruvate carboxylase) - Acetyl CoA 생성 - pyruvate 산화적탈탄산 (pyruvate dehydrogenase) - OAA 와 acetyl CoA 의축합 (citrate synthetase)--citrate 생성 2) 구연산분해력약 : Aconitase(aconitate hydratase) 활성약 aconitase aconitase Citrate cis-aconitate isocitrate Fe++ H2O Fe++ COHCOOH CCOOH =CHCOOH CHCOOH CHOHCOOH
발효공학 6장 : 유기산 발효 나. 원료에 따른 구연산 생산균주 1) 당질원료 : A. niger 변이주를 사용하여 당밀, 전분당화액으로부터 생산 가) 균주: 유전적으로 불안정 -포자 또는 pellets의 이용, 균사체의 경우 전배양 여러 번 하지 말 것 발아시킨 짧은 균사체(0.2-0.5mm) 나) 원료: 당밀 (단당류 함유) - 단발효법 전분당화액 단행복발효법 당화, 발효 구분 감자전분 - 병행복발효법 당화, 발효 동시 2) 탄화수소원료(n-paraffin) : Candida lipolytica - aconitase 활성 강 - isocitrate 생성 - Fe++의 조절 : Cu의 첨가(Fe와 길항작용) - Monofluoroacetate(CH2FCOOH) 감수성 변이주 - aconitase 활성저하 * 야생주 : aconitase 활성 강 - CH2FCOOH(aconitase 저해제) 존재 하 생육 감수성변이주 : 생육불가 - aconitase 활성 약 2016-10-25 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 8
2016-10-25 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 9 2. 구연산의발효생산 가. 발효 : A. niger 변이주를이용하여고체발효또는액체발효 - 배지 : 당밀또는전분당화액 1) 표면발효법 (surface process) : 당화과정무 고체배지경우 : 발효접시를사용하여표면에균을배양하여발효 -고체배지 8-12cm - 공기공급 : 산소공급, CO2 제거, 냉각효과 - 발효후열수로추출하여정제 2) 심부배양법 (submerged process) : 액체배지내에산소를공급하며발효 - 일반적인액체배양 : 산소공급및발효액혼합 - Stirred fermentor( 통기교반조 ), air lift fermentor( 기포탑형 ) - A. niger: amylase 생산하나당화후또는당화동시발효유리단행 ( 전분당화액경우 ) 또는병행복발효법으로생산 : 발효조건 - 당10-15%, 25-30ºC, 7-10일
2016-10-25 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 10 나. 발효의관리 : 균사체 small pellets 유지, 부산물생성억제, 구연산분해억제 1) Fermentor materials : aluminium or stainless steel 사용보통발효조 ph 1-2에서 Fe ++ 방출 : aconitase 활성촉진 -구연산분해증가, oxalic acid 함량증가, 황색색소생성 ( 구연산회수방해 ) 2) 배지의 Fe ++ /Cu ++ 유지 : 균사체구조-small pellets 유지-수율증가 Fe ++ /Cu ++ 고 : aconitate hydratase 활성증가-citric acid 분해 Fe ++ /Cu ++ 저 : aconitate hydratase 활성감소-균체생육불량 * Fe ++ 과다의경우 -당밀에상당량함유 : 양이온교환체통과, Cu ++ 첨가, 2-3% 메탄올, 에탄올, 프로판올등첨가 3) 적당한산소의공급 : 비교적적은양의산소요구, 그러나결핍에민감 - 0.2-1.0 volume/min 공급 O2 고 : 균의증식강 - 균사체발달 O2 저 : 발효중지, lactate & ethanol등혐기성발효산물증가 4) ph : 최적산생성 ph 1.7-2 -ph 5에서시작하여균의생육유도하여산생성기에는 ph 3.0 이하유지 -특히 5 이상에서는 oxalic acid or gluconic acid 생성증가
2016-10-25 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 11 다. 구연산의회수및정제 1) 균사체의제거 : 발효액또는열수추출액 - 여과하여균사체제거 - 여액에구연산함유 ( 약 15%) 2) 수산의제거 : 여액혼합액에 Ca(OH)2 첨가하여 ph 3으로조절하여여과 - ph 3.0 : 구연산은용해, 수산은침전 Ca-oxalate로침전 3) 구연산의침전및정제 : 여액에 Ca(OH)2 첨가하여 ph 7(Ca-citrate 침전 ) 조절후여과 - 수세한다음황산첨가후여과로 CaSO4 제거 : citrate 용액 - 이온교환수지통과및농축하여제품화황산해리도강하여음이온교환수지로제거가능
6-3. Fumaric acid ( 푸마르산 ) 1. 용도 : 산미료, 유화안정제, aspartic acid 및 malic acid 의원료 2. 발효생산 1) 균주 : R. stolonifer(r. nigricans, 고구마연부병균 ) + 주 ( 수정모있는것 ) - 접합균류는자웅분화불확실하나 R. stolonifer 는분화되어있음 : 수정모있으면 +, 없으면 - 로표시 2) 발효방법 : 2 단계배양으로발효균의생육 산생성유도저농도전분 (C : 5-10%) 고농도전분 (C : 20%) ZnSO 4 첨가 Fe 2 (SO 4 ) 3 첨가로산생성촉진 (Zn:Fe = 1:2) PEP Fumarate + NH3 Ca-fumarate + H2O CO2 Aspartase Fumarase NADH2 NAD+ Asp + H2O Ca-malate 결정 Pyruvic acid oxaloacetic acid malic acid fumaric acid Citric acid acetyl CoA malate dehydrogenase fumarase PEP carboxylase, pyruvate carboxylase, citrate synthase 2016-10-25 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 12 H2O
2016-10-25 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 13 6-4. Malic acid ( 사과산, 능금산 ) * Malic acid 용도 : 산미료, 마요네즈의유화제, Na-malate 로서식염대용 * 효소법에의한사과산의생산 : enzymatic transcrystallization ( 효소적재결정 ) - Ca-fumarate 포화용액에 fumarase 반응시켜 Ca-malate 결정으로석출 H2O Ca-fumarate 포화용액 Ca-malate 결정 ( 용해도약 ) L. brevis 의균체또는 fumarase 효소 - 고농도에서단시간에진행, 90% 이상이전환 - 용해도차에의해 Ca-malate 분리 (Ca-malate 용해도 : 0.8%, Ca-fumarate 용해도 1.3%)
6-5. Gluconic acid ( 글루콘산 ) * Gluconic acid : 당의직접산화에의해생산 -D-glucose 의 1 번위치가산화되어 COOH 로변화 * 직접산화 : 당이나알코올산화시켜생산 인산화과정필요무 : 초산, 글루콘산 1. 용도 1) Na-gluconate : 세병제 (+NaOH, + 인산 ), 보일러관석방지 (+NaOH) -Ca, Mg 침전억제 2) Ca-gluconate : Ca 보급제 - 소량의젖산, saccharic acid or heptanoic acid 첨가로용해도증가 3) GDL : 두부응고제 glucose oxidase : Aspergillus sp. Penicillium sp. O2 H2O2 D-glucono-δ-lactonase or spontaneous H2O β-d-glucose D-glucono-δ-lactone D-gluconic acid C=O COOH NAD(P)+ NAD(P)H2 C- C- glucose O -C -C dehydrogenase C- C- : Gluconobacter sp. C C- CH2OH CH2OH 2016-10-25 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 14
2016-10-25 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 15 2. 발효 : A. niger 액침배양--다른유기산생성약, 대당수득율증가, 균체제거용이 * Gluconobacter, Penicillium (notatin-h 2 O 2 살균력유 ) 등도효소생산 1) Glucose 농도 -고농도존재시대당수득률감소 -저농도포도당에서 glucose oxidase 유도후고농도 (15-20%) 포도당첨가 2) 질소원농도의제한 -고농도질소원존재시수득율감소 (TCA cycle 활성화 ) 3) 배양중 gluconic acid 생성으로균주활성감소 -배양중 NaOH or CaCO3 첨가로 ph5.5-6.5 유지 * Gluconic acid 의유도체 : D-ketogluconic acid - 산화방지제 - D-gluconate dehydrogenase 에의해 2, 5 위치탈수소로생성 - Ascorbate 특히 isovitamin C 합성중간체 - 산화방지제 - 5-ketogluconic acid, 2-ketogluconic acid, 2,5-diketogluconic acid * 이소비타민 C 의생산 : 산화방지제 D-Glc 2-ketogluconate 2-KGA methyl ester isovitamin C 미생물의이용 : Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens
2016-10-25 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 16 6-6. 기타의유기산 1. Succinic acid - 청주, 간장, 조개류의정미성분 : 청주효모에의해부생 1) C. glutamicum, B. flavum : 산소결핍하에서포도당으로부터호박산생산 2) 2가지미생물 : glucose ----- fumaric acid ----- succinic acid fumaric acid 생산균 succinate dehydrogenase 생산균 2. Acetic acid( 초산 ) : 에탄올의직접산화에의해생성 : 식초에서설명 CH3CH2OH ------ CH3CHO ------ CH3COOH 3. Itaconic acid : A. itaconicus - 화학반응성매우강 - 합성수지, 플라스틱, 계면활성제원료, 유기합성시약 4. Kojic acid : 코지추출액에서분리 : 플라스틱, 살미제, 살충제원료 - A. oryzae, A. flavus 생산