52(3)-09(010 김진우).fm

Size: px

Start display at page:

Download "52(3)-09(010 김진우).fm"

정용 영
6 years ago
Views:

1 Korean Chem. Eng. Res., 52(3), (2014) PISSN X, EISSN 단신 목질계농부산물을이용한고체발효에서발효조건최적화를통한구연산생산증대 김진우 맥길대학교바이오시스템공학과, 몬트리올, 캐나다, H9X 3V9 (2014 년 1 월 23 일접수, 2014 년 2 월 24 일수정본접수, 2014 년 2 월 27 일채택 ) Optimization of Fermentation Conditions for the Production of Citric Acid by Aspergillus niger NRRL 567 Grown on Agricultural by Products Jin-Woo Kim Department of Biosystems Engineering, McGill University, Montreal, Canada, H9X 3V9 (Received 23 January 2014; Received in revised form 24 February 2014; accepted 27 February 2014) 요 약 본실험에서는농부산물인밀짚을고체배지로사용하여 Aspergillus niger NRRL 567 에서구연산생산시, 발효조건과첨가제가구연산생산에미치는영향을단일변수 (one-factor-at-a-time) 최적화를이용하여주요인자의순차적최적화를수행하였다. 발효 72 시간에서온도, 수분함량, 입자크기, ph 와첨가제농도를최적화했을때, 각각 30 o C, 70%, 0.5~1.0 mm, ph 5.5 와 4% 메탄올첨가조건에서최대구연산생산인 g/kg 건조중량 (DM) 을확인할수있었다. 이는최적화이전구연산최고생산인 74.5 g/kg DM 대비 177% 증가한결과이다. 최적화실험에서도출된조건을밀짚, 옥수수대와피트모스 (peat moss) 에적용하여고체발효를수행하였을때, 발효 120 시간에서각각 231.8, 213.8, g/kg DM 구연산생산을확보하였다. 본실험결과는밀짚과옥수수대등의목질계농부산물을이용한구연산생산시, 고체발효법이기존의액체발효법의대체가가능함을시사하였다. Abstract The present study was carried out to evaluate the potential of lignocellulosic byproducts for the production of citric acid through solid-state fermentation by Aspergillus niger NRRL 567. A sequential optimization based on onefactor-at-a-time method was applied to optimize fermentation conditions and media constituents. The results obtained from the optimization indicated that 30 o C, 70% moisture content, 0.5~1.0 mm particle size, ph 5.5 and 4% methanol were found to be the optimum condition at 72 hr fermentation. The application the optimization resulted in an improvement of maximum citric acid production from 74.5 to g/kg dry material (DM) from wheat straw. The optimal condition was used to produce citric acid from A. niger grown on different lignocellulosic byproducts, including wheat straw, corn stover and peat moss. A. niger produced the highest citric acid levels of 231.8, and g/kg DM at 120 hr fermentation, respectively. Key words: Solid State Fermentation, Citric Acid, Rice Straw, Optimization, Agricultural by Products 1. 서론 구연산 (2-hydroxy-1,2,3-propanetricarboxylic acid) 은다양한곰팡이균에의해생산되며상업규모로생산되고있는대부분의구연산은 Aspergillus niger를이용하여호기조건하에서액체배양을통해대량생산된다 [1,2]. 구연산은식품, 의약품그리고화장품등다양한부분에서사용되고있으며, 년간 1.8백만톤생산이되며 70% 는식 To whom correspondence should be addressed. kimjw1028@hotmail.com This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License ( which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 품용으로사용되고있다. 특히, 최근에는생분해성고분자의전구체또는원료로서구연산및숙신산등의수요가매년 5% 이상증가하고있어보다경제적이고친환경적인발효법을이용한유기산생산에관심이집중되고있다 [3,4]. 기존의액체배양법이외에농부산물을이용한고체발효법은유기산과효소생산에있어부산물생산최소화가가능한경제적인발효공정으로활용분야가확대되고있다 [5-8]. 고체발효법은부착성장형미생물에유리한배양공정으로미생물성장에필요한탄소및질소원의공급이외에부착표면을제공하여곰팡이균과같은균사체형성미생물을유래산물생산에널리적용되고있다. 특히밀짚, 옥수수대, 감자껍질, 오렌지껍질및맥주생산부산물 (spent brewers grains) 등과같은농 / 산업부산물을기질로사용할수있다는장점과 402

2 목질계농부산물을이용한고체발효에서발효조건최적화를통한구연산생산증대 403 함께용수사용량이적고고농도산물생산이가능하여분리및정제비용이액체발효법대비절감된다는장점을지닌다 [9-15]. 고체발효는잉여수분 (free flowing water) 가최소화된고체기질에서발효가진행되며세포성장및산물생산은고체기질의수분함량, 온도, 산도, 입자크기, 부피팽창 (swelling) 정도와통기량에의해크게영향받는다고알려져있다 [13-17]. 위와같은발효조건영향인자이외에배지성분 ( 탄소, 질소, 인, 염류등 ) 과첨가제 ( 에탄올, 메탄올, 지방산 ) 에의해구연산생산은크게영향을받으므로고체발효에서산물생산증대를위해서는발효조건과함께배지성분최적화가필수적이라하겠다 [8,18]. 본연구의목적은 A. niger NRRL 567에서농부산물인밀짚을고체기질로활용하구연산생산시, 발효조건최적화를통한구연산생산증대이다. 이를위해기존의구연산생산에유의한영향을준다고알려진영향인자인수분함량, 온도, 입지크기, 산도와첨가제농도를순차적으로최적화를진행하였다. 또한, 구연산생산능평가를위해밀짚, 옥수수대와피트모스 (peat moss) 를고체기질로사용하여고체발효에있어목질계농부산물의이용가능성을평가하였다. 2. 실험재료및방법 2-1. 재료 A. niger NRRL 567는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA) 에서분양받아계대배양하여사용하였다. A. niger의포자 (spores) 생산을위해 potato dextrose agar (Sigma, St. Louis, MO, USA) 에서 7일간 30 o C 정체배양하였다. 배양후 7일된고체배지 (plate) 에서 0.1% Tween 80 (sigma, Sigma, St. Louis, MO, USA) 용액으로포자를회수하여희석을통해접종에사용하였다 고체발효용배지고체발효실험을위해 McGill 대학농장으로부터밀짚과옥수수대를제공받아당과염류를첨가하여고체기질로사용하였다. 고체기질에첨가된당과염류성분은기존피트모스 (Schultz Company, Ontario, Canada) 를이용한구연산생산최적화실험에서도출된결과에근거하였으며첨가량은아래와같다 (/kg DM): g glucose, 15.4 g (NH 4 ) 2 SO 4, 43.9 g KH 2 PO 4 and 4.0 g NaCl [12,13]. 87H column ( mm, Bio-Rad, USA) 이창착된 Waters HPLC를사용하였다. 이동상은 N 황상용액을사용하였으며구연산분석을위한 HPLC 운전조건은아래와같다 : 0.6 ml/min flow rate; 50 o C column temperature, 20 μl sample injection. 3. 결과및고찰 3-1. 수분함량에따른영향고체기질로사용된밀짚의초기수분함량이구연산생산에미치는영향을평가하기위해초기수분함량을 30~90% 로변화시켜실험을수행하였다. Fig. 1의결과와같이밀짚의초기수분함량이구연산생산에미치는영향이유의함을수있으며, 수분함량 70% 이하에서수분함량증가에따라구연산생산이크게증가함을알수있었다. 특히, 수분함량 50% 이하의경우구연산생산이크게감소해 16.2 g/kg DM 이하임을확인할수있었다. 한계수준보다낮은수분함량은고체기질중의액체를통한물질확산과가스교환을감소시켜구연산생산저해의원인이된다고보고되고있다 [19]. 발효 72시간에서수분함량 70% 적용시, 74.5 g/kg DM를확인할수있었다. 반면수분함량 80% 이상에서는구연산농도가감소하는경향을보였는데, 이는기존의피트모스를이용한고체발효의최적수분함량인 80% 보다낮은수치로파쇄밀짚의최대함수량이피트모스보다낮아 80% 이상에서수분함유한계를넘어잉여수분 (free flowing water) 이생성되어통기율제한, 산소공급저해및균사체성장저해가발생했다고판단된다 [13] 배양온도에따른영향구연산생산에미치는배양온도의영향을평가하기위해기본발효조건에서온도를변화시켜 (20~45 o C) 구연산생산을비교하였다. Fig. 2에서보는바와같이발효온도는구연산생산에유의한효과를주며, 발효 72시간에서구연산생산최적온도는 30 o C임을알수있다. 발효온도 30 o C까지구연산생산은 92.8 g/kg DM로증가하나 40 o C 이상의발효온도에서급격한감소를확인할수있었다. 이는 2-3. 고체발효고체배지의수분함량이구연산생산에미치는영향을평가하기위해 7 g의건조고체기질에각각 4.7, 7.0, 10.5, 16.5, 28, 62 ml의액체배지를첨가하여수분함량을 40~90% 로조절하고밀폐한후, 121 o C에서 15분간멸균하였다. Tween 80로회수한 1 ml의포자용액 ( spores/ml) 을접종하여고체발효를수행하였다. 구연산과글루코오스정량을위해각 flask에서고체시료를채취하여증류수와혼합한후상등액을 filtration하여시료로사용하였다. 순차적최적화를위한기본발효조건은수분함량 80%, 배양온도 26.5 o C, 고체기질산도 4.4로고정하였다. 고체기질에첨가된성분은 (NH 4 ) 2 SO 4, KH 2 PO 4 과 NaCl이며각성분은 20배농축용액으로제조하여첨가하였다 분석방법구연산정량은 refractive index detector (RID) 와 Aminex HPX- Fig. 1. Effect of the initial moisture content of solid substrate on citric acid production from wheat straw at 72 hr. The other variables were fixed at: fermentation temperature 26.5 o C, particles 0.5~1.0 mm, solid substrate ph of 4.4.

3 404 김진우 구연산생산은동등수준이나입자크기 0.1~0.25 mm 구간에서구연산생산이현저하게감소함을보였다. 입자크기 0.25~0.5 mm 구간에서구연산최대생산농도인 g/kg SSD가확인되었으며입자크기가증가함에따라구연산생산이감소함을확인할수있었다. Kim[18] 에따르면고체기질의입자크기감소는입자표면적증가에따른고착표면증가와더불어수분량을증가시켜발효후반까지균주의활성을유지하여산물생산증가를가능케한다고보고하고있다. 반면입자크기 0.2 mm 이상에서는통기율감소, 막힘 (clogging), 표면적감소및함수량감소에따라구연산생산이감소된다고보고되고있다. 본결과는기존피트모스를이용한실험에서와같이 0.25~0.5 mm 구간에서최대구연산생산을보여주며기준배양조건인 0.5~1.0 mm 구간대비구연산생산이 11% 증가된결과이다. Fig. 2. Effect of fermentation temperature on citric acid production from wheat straw at 72 hr. The other variables were fixed at: fermentation temperature of 30 o C moisture content 70%, particles 0.5~1.0 mm, solid substrate ph of 4.4. 구연산생산을위한 TCA 회로의관련효소들이고온에서활성저하가발생하여구연산생산이감소했다고예상할수있다. 또한, 높은온도에서수분증발에의한고체기질의수분감소가급격하게발생하여포자생성및영양분공급제한에의해구연산생산감소가발생했다고판단된다 [20]. 본결과는기준배양조건인 26.5 o C에서진행된고체발효실험대비구연산생산이약 16% 증가된결과이다 입자크기에따른영향고체기질입자크기는고체배양중통기율, 가스교환, 열전달, 수분함유량, 채널링및미생물고정에영향을주는인자로구연산에영향을미친다 [12]. 파쇄밀짚의입자크기가구연산생산에미치는영향을평가하기위해입자크기 0.1~2.0 mm 범위에서 72시간고체발효를수행하였다. Fig. 3에서보는바와같이밀짚입자크기에따라 3-4. 고체기질산도에따른영향유기산생산을위한고체배양에서고체기질의초기산도는유기산생산에중요한변수로알려져있다 [21,22]. 고체기질의초기산도변화가구연산생산에미치는영향을파악하기위해염류배지 (salt solution) 의산도를 NaOH와 HCl을첨가하여조절한후파쇄밀짚과혼합하여고체기질의산도를변화시켰다. 발효조건은앞선실험의최대생산조건인발효온도 30 o C, 수분함량 70%, 입자크기 0.25~0.5 mm으로실험을수행하였다. Fig. 4에서보는바와같이고체기질의산도가 5.5로증가함에따라구연산생산이크게증가하여최고농도인 g/kg DM에도달하였다. 일반적으로정체발효인고체발효는액체발효와달리염기투입에의한산도조절이없는 ph-stat 환경확보가어려워고체발효중생산되는구연산및기타유기산은고체기질산도증가를진행시키며이는세포성장을저해하고구연산생산감소의주요원인이된다 [23]. 이에, 고체기질의초기산도가높을경우, 발효중생산되는유기산에의한산도감소가지연되어구연산생산이증가된다고판단할수있다. 실험에서보는바와같이고체기질의초기산도는구연산생산에가장큰영향인자이며최적화이전수준에비해 43% 증가한생산량을보였다. 고체기질의초기산도도중요하나발효중산도변화도구연산생산에중요한영향을준 Fig. 3. Effect of the particle size of solid substrate on citric acid production from wheat straw at 72 hr. The other variables 30 o C, solid substrate ph of 4.4. Fig. 4. Effect of the initial ph of solid substrate on citric acid production from wheat straw at 72 hr. The other variables 30 o C, particles size 0.25~0.5 mm (Mixed particle size < 2.0 mm).

목질계농부산물을이용한고체발효에서발효조건최적화를통한구연산생산증대 405 Fig. 5. Effect of additives (Methanol, Ethanol ) on citric acid production from wheat straw at 72 hr. The other variables 30 o C, particles size 0.25~0.

4 목질계농부산물을이용한고체발효에서발효조건최적화를통한구연산생산증대 405 Fig. 5. Effect of additives (Methanol, Ethanol ) on citric acid production from wheat straw at 72 hr. The other variables 30 o C, particles size 0.25~0.5 mm, solid substrate ph of 5.5. 다고판단됨으로향후 ph-stat 운전을위한고체발효장치개발이필수적이라하겠다 첨가제에따른영향구연산생산은 methanol, ethanol, phytate, vegetable oil, oximes, n-dodecane과 fluoroacetate와같은첨가제에의해증가된다고보고되고있다 [19,21]. 이들중, 에탄올, 메탄올과지방산이구연산생산증가를위한첨가제로가장널리사용되었으며다양한균주를대상으로 1~8%(w/w) 첨가시, 구연산생산이증대된다고보고되고있다. 본실험에서는두가지첨가제가구연산에미치는영향을파악하기위해 0~10%(w/w) 에탄올과메탄올을각각고체기질에첨가하여구연산생산에미치는영향을평가하였다. Fig. 5에서보는바와같이, 각각의농도가 4% 로증가함에따라구연산농도는비례하여증가하며에탄올에비해메탄올이구연산생산증대효과가큼을알수있다. 각각의농도 4% 이상에서구연산생산은다시감소함을볼수있는데, 이는 Roukas[19] 이보고한 carob pod를이용한고체발효에서메탄올의첨가농도와일치하는결과임을확인할수있다. 첨가제농도최적화를통해최적화이전수준에비해 27.1% 증가한생산량을확인할수있었다. 일반적으로메탄올첨가는세포의투과도 (permeability) 증가에따른영양성분과산물의투과를용이하게하여구연산생산증대에기여한다고알려져있다. 또한메탄올은 TCA 회로전단계중간체인 acethyl-coa pool을증가시켜구연산생산량을증대시킨다고보고되고있다. 반면, 에탄올의경우구연산 (TCA) 회로에서구연산생산에기여하는 citrate synthetase 활성을증대시키고 aconitase의역반응을감소시켜구연산생산을증대한다고알려져있다 [22]. Fig. 6. Time course behavior of citric acid production and residual glucose under the optimal fermentation condition ( : what straw-citric acid, : corn stover-citric acid, : peat moss-citric acid, : wheat straw - residual glucose, : corn stover - residual glucose, : peat moss-residual glucose). Moisture content 70%, fermentation temperature 30 o C, particles size 0.25~0.5 mm, solid substrate ph of 5.5, 4% methanol. 량 70%, 고체기질크기 0.25~0.5 mm, 산도 5.5와 4% 메탄올첨가로, 상기의조건에서 72시간발효하여구연산최대생산량 g/kg DM를얻을수있었다. 앞선실험에따르면피트모스를이용한고체발효에서구연산생산최적조건은배양온도 35 o C, 수분함량 80%, 고체기질크기 0.25~0.5 mm, 산도 5.5와 1.5% 메탄올첨가였으며상기의조건에서구연산최대생산량 g/kg DM을보고하고있다. 밀짚을이용한고체발효에서결과의재현성을확인하기위해동일균주를이용해상기의최적조건에서밀짚, 옥수수대 (corn stover) 와피트모스를대상으로고체발효를진행하였다. 옥수수대는밀짚과동일한발효조건을적용하여발효를진행하였으며, 피트모스는기존실험에서도출된최적조건에기반하여발효를진행하여그결과를비교하였다 [12]. Fig. 6에서보는바와같이, 밀짚을이용한고체발효의경우, 발효 72시간에서기존최적화실험의결과에유사한 g/kg DM을재확인하였으며발효 120시간에서구연산최대값인 g/l를얻을수있었다. 피트모스를이용한고체발효의경우발효 120시간에서 g/kg DM의최대구연산생산농도를보였다. 반면, 옥수수대를이용한고체발효에서는피트모스와밀짚대비낮은구연산생산농도를보였는데, 이는적용된고체발효조건밀짚을대상으로도출된것에기인한다고판단된다. 피트모스의경우섬유질함량이 66% 이상으로수분함량이높은특징을지님으로밀짚과옥수수대대비 A. niger 성장과구연산생산에필요한수분을지속적으로공급함에구연산생산이높았던것으로해석된다 [23]. 4. 결론 3-7. 구연산생산검증본실험에서는 A. niger NRRL 567을이용한구연산생산증대를위해구연산생산에유의한영향을미친다고알려진발효조건및배지성분을순차적으로최적화하였다. 밀짚을이용한고체발효에서단일변수최적화를통해도출된최적조건은배양온도 30 o C, 수분함 구연산의활용범위확대에따른생산량증가에따라, 기존의액체발효가아닌농부산물활용이가능하고용수의사용이적은고체발효법이친환경적이고경제적인발효공정으로주목을받고있다. 본실험에서는고체발효에서널리사용되는목질계농산물인밀짚과옥수수대를고체기질로사용하여발효조건과배지성분최적화를통해

5 406 김진우 구연산생산을효과적으로증대시킬수있었다. 밀짚을이용한고체발효에서단일변수최적화방법을적용하였을때, 발효 72시간에서최대구연산생산농도는 g/kg DM로최적화이전수준인 74.5 g/kg DM에비해 2.8배증가함을확인할수있었으며구연산생산에유의한효과를주는독립변수를규명할수있었다. 향후, 단일변수최적화에서영향이크다고판단되는변수들은반응표면분석법에적용하여조건최적화, 변수간상관관계및최대값예측에활용이가능하다고하겠다. 본실험에서는구연산생산을위해농부산물을이용한고체발효에서외부에서공급된당을이용하여고체발효를수행하였으나, 향후밀짚과옥수수대와같은농부산물에서 lignocellulosic enzyme 생산균주 (Trichderma reesei 등 ) 와구연산생산균주 (Aspergillus niger 등 ) 의혼합배양 (co-culture) 을이용하여외부에서글루코오스와같은발효당공급이최소화된고체발효시스템개발도가능하다하겠다. References 1. Haq, I., Khurshid, S., Ali, K., Ashraf, H., Qadeer, A. and Rajoka, I., Mutation of Aspergillus niger for Hyper Production of Citric Acid from Black Molasses, W. J. Microbiol. Biotechnol., 17(1), 35-37(2001). 2. Betiku, E. and Adesina, O. A., Statistical Approach to the Optimization of Citric Acid Production Using Filamentous Fungus Aspergillus niger Grown on Sweet Potato Starch Hydrolyzate, Biomass Bioenerg., 55, (2013). 3. Vandenberghe, L. P. S., Soccol, C. R., Pandey, A. and Lebeault, J. M, Solid State Fermentation for the Synthesis of Citric Acid by Aspergillus niger, Bioresource Technol., 74(2), (2000). 4. Dhillon, G. S., Brar, S. K., Kaur, S., Verma, M., Bioproduction and Extraction Optimization of Citric Acid from Aspergillus niger by Rotating Drum Type Solid-state Bioreactor, Ind. Crop. Prod., 41, 78-84(2013). 5. Honda, Y., Hattori, T., Kirimura, K., Alvarez, V. F., Gonzalez, A. C. and Torres, N. V., Visual Expression Analysis of the Responses of the Alternative Oxidase Gene (aox1) to Heat Shock, Oxidative, and Osmotic Stresses in Conidia of Citric Acid-producing Aspergillus niger, J. Biosci. Bioeng., 113(3), (2012). 6. Kim, J. W., Barrington, S., Sheppard, J. and Lee, B., Nutrient Optimization for the Production of Citric Acid by Aspergillus niger NRRL 567 Grown on Peat Moss Enriched with Glucose, Process Biochem., 41(6), (2006). 7. Angumeenal, A. R. and Venkappayya, D., An Overview of Citric Acid Production, LWT-Food Sci. Technol., 50(2), (2013). 8. Barrington, S., Kim, J. S., Wang, L. and Kim, J. W., Response Surface Optimization of Fermentation Parameters for Citric Acid Production in Solid Substrate Fermentation, Korean Chem. Eng. Res., 50(5), (2012). 9. Kim, J. W. and Barrington, S., Response Surface Optimization of Medium Components for Citric Acid Production by Aspergillus niger NRRL 567 Grown in Peat Moss, Bioresour. Technol., 99(2), (2008). 10. Wen, Z. Y. and Chen, F., Application of Statistically-based Experimental Designs for the Optimization of Eicosapentaenoic Acid Production by the Diatom Nitzschia Laevis, Biotechnol. Bioeng., 75(2), (2001). 11. Kim, J. W., Effect of Buffers on Citric Acid Production by Aspergillus niger NRRL 567 in Solid Substrate Fermentation, Korean Chem. Eng. Res., 50(5), (2012). 12. Ellaiah, P., Srinivasulu, B. and Adinarayana, K., Optimization Studies on Neomycin Production by a Mutant Strain of Streptomyces marinensis in Solid State Fermentation, Process Biochem., 39(5), (2004). 13. Barrington, S., Kim, J. S., Wang, L. and Kim, J. W., Optimization of Citric Acid Production by Aspergillus niger NRRL 567 Grown in a Column Bioreactor, Korean J. Chem. Eng., 26(2), (2009). 14. Mahadik, N. D., Puntambekar, U. S., Bastawde, K. B., Khire, J. M. and Gokhale, D. V., Production of Acidic Lipase by Aspergillus niger in Solid State Fermentation, Process Biochem., 38(5), (2002). 15. Kumar, D., Verma, R. and Bhalla, T. C., Citric Acid Production by Aspergillus niger van. Tieghem MTCC 281 Using Waste Apple Pomace as a Substrate, J. Food Sci. Technol., 47(4), (2010). 16. Rezaei, P., Darzi, G. and Shafaghat, H., Optimization of the Fermentation Conditions and Partial Characterization for Acidothermo Philic α-amylase from Aspergillus niger NCIM 548, Korean J. Chem. Eng., 27(3), (2010). 17. Kim, J. W., Response Surface Optimization of Fermentation Parameters for Citric Acid Production in Solid Substrate Fermentation, Korean Chem. Eng. Res., 50(5), (2012). 18. Roukas, T., Citric Acid Production from Carob Pod by Solidstate Fermentation, Enz. Microb. Tech., 24(1), 54-59(1999). 19. Nampoothiri, M. K., Baiju, T. V., Sandhya, C., Sabu, A., Szakacs, G. and Pandey, A., Process Optimization for Antifungal Chitinase Production by Trichoderma harzianum, Process Biochem., 39(11), (2004). 20. Betiku, E. and Adesina, O. A., Statistical Approach to the Optimization of Citric Acid Production Using Filamentous Fungus Aspergillus niger Grown on Sweet Potato Starch Hydrolyzate, Biomass Bioenerg., 55, (2013). 21. Jianlong, W. and Ping, L., Phytate as a Stimulator of Citric Acid Production by Aspergillus niger, Process Biochem., 33(3), (1998). 22. Lotfy, W. A., Ghanem, K. M. and El-Helow, E. R., Citric Acid Production by a Novel Aspergillus niger isolate: I. Mutagenesis and Cost Reduction Studies, Bioresour. Technol., 98(18), (2007). 23. Dhillon, G. S., Brar, S. K., Verma, M. and Tyagi, R. D., Utilization of Different Agro-industrial Wastes for Sustainable Bioproduction of Citric Acid by Aspergillus niger, Biochem. Eng. J., 54(2), 83-92(2011).

(....).hwp

(....).hwp sugar cane 계분 (%) a ATCC : American type Culture Collection, b IFO : Institute for fermentation, osaka, c MPNU : Mycological lab. Pusan National University d Mycelial