online ML Comm DOI 10.3342/kjorl-hns.2009.52.3.207 와우세포주에서겐타마이신에의해유발된세포자멸사의특성 계명대학교의과대학이비인후과학교실, 1 생리학교실, 2 신경외과학교실, 3 경북대학교의과대학생리학교실 4 남성일 1 송대규 2 박성희 2 이재훈 1 이우근 1 김일만 3 박재식 4 Characterization of Gentamicin-Induced Apoptosis in a Cochlear Cell Model Sung-Il Nam, MD 1, Dae-Kyu Song, MD 2, Sung-Hee Park 2, Jae-Hoon Lee, MD 1, Woo-Keun Lee, MD 1, Eal-Maan Kim, MD 3 and Jae-Sik Park, MD 4 1 Department of Otorhinolaryngology; 2 Physiology; 3 Neurosurgery, Keimyung University School of Medicine, Daegu; and 4 Department of Physiology, School of Medicine, Kyungpook National University, Daegu, Korea ABSTRACT Background and Objectives:Aminoglycoside antibiotics are ototoxic. Understanding of the molecular mechanisms underlying the drug-induced ototoxicity, however, has been hampered by limited cell availability. Recently, HEI-OC1 cells, which are of an immortalized cochlear cell line sensitive to ototoxic drugs, have been derived from the auditory sensory organ. This study was performed to confirm whether cultured HEI-OC1 cells can be used to evaluate aminoglycoside-induced ototoxicity and the effect of antioxidants against aminoglycoside-induced colchlear cell damage. Materials and Method:Gentamicin was administered for 3 days in the media containing HEI-OC1 cells. Results:Cell viability was decreased by gentamicin in a dose-dependent manner. The cell number was decreased by 50% 3 days after the exposure to 2 mm gentamicin. Penicillin did not have any significant effect. Flow cytometric analysis revealed that sub G1 arrest representing cellular apoptosis was accelerated by gentamicin treatment but not by penicillin. Expression of p27 Kip1, the cyclin-dependent kinase inhibitor, was exclusively increased by gentamicin. Reactive oxygen species were also increased by gentamicin when compared with those of the control or when penicillin was used. Caspase-3 activity became increased according to the elevation of gentamicin concentrations. N-acetyl cysteine, but not vitamin E or vitamin C, ameliorated cell survival dose-dependently against gentamicin. Conclusion:The present study reveals that the HEI-OC1 cell line is a good model to evaluate gentamicin-induced ototoxicity. The results suggest that gentamicin-induced apoptosis may be, at least partially, linked to the overproduction of a reactive oxygen species called. N- acetyl cysteine, a free radical scavenger, that decreases the gentamicin ototoxicity. (Korean J Otorhinolaryngol-Head Neck Surg 2009;52:207-14) KEY WORDS:Cochlea Gentamicin Caspase-3 p27 N-acetyl cysteine. 서 론 미로내의유모세포 (hair cell) 는머리의움직임, 균형, 그리고음파를감지하는내이에있는기계적수용기 (mechanoreceptor) 이다. 포유동물의감각유모세포는출생후에는재생되지않는다. 1) 그러므로이들수용기들의상실은포유동물의영구적인청각소실과균형감각장애를초래한다. 의미있는청각소실이전인구의 10% 에서나타난다. 청각손상의발생이높게나타나는경우에는아미노글리코시드 (aminoglycoside) 항생제, 헨리계제이뇨제들 (loop 논문접수일 :2008 년 9 월 15 일 / 심사완료일 :2008 년 12 월 10 일교신저자 : 남성일, 700-712 대구광역시중구동산동 194 계명대학교의과대학이비인후과학교실전화 :(053) 250-7715 전송 :(053) 256-0325 E-mail:entnamsi@dsmc.or.kr diuretics) 과항종양성약제들 (antineoplastic agents) 과같은치료용약제들그리고노화, 감염, 소음성장애에의한유모세포손상이관련된다. 2) 겐타마이신 (gentamicin) 같은아미노글리코시드는신장독성 (nephrotoxicity) 과내이독성 (ototoxicity) 이라는 2가지중요한부작용을가지고있다. 아미노글리코시드항생제에의한내이독성의발생률은사용량과사용기간에비례하며, 사용자의 10~63% 에이른다. 여러연구에의하면, 내이세포의항산화방어능력을초과하는활성산소종 (reactive oxygen species) 과유리라디칼의형성이유모세포의손실을초래할수있다고알려져있다. 3,4) 아미노글리코시드에의한내이독성의병리생리학적지식을발전시킨많은연구가있었음에도, 아미노글리코시드에의한청각소실을회복시킬수있는결정적인내이보호 207
겐타마이신에의해유발된세포자멸사의특성 방법은현재까지없다. 그것의가장큰이유중하나는유모세포는순수하게생체로부터분리배양하기어렵기때문에실험에제약이있다. 이로인해내이의독성기전에대한광범위한평가가제한되어왔다. 이러한제한점을해결하기위해유전자도입마우스 (Immortomouse) 의와우각세포의장기배양에서유래되어 HEI-OC1(House Ear Institute-organ of Corti 1) 으로명명된새로운세포주가개발되었다. 5) 이세포주는인터페론-감마유도성프로모터요소 (promoter element) 가통제하는 SV40 large T-antigen(Tag) 유전자의열-민감성돌연변이를가지고있기때문에, 인터페론-감마가있는배지로 33 에서배양하면 (permissive conditions), Tag 단백질의발현이시작된다. 반면, 배양온도를 39 까지올리고인터페론-감마가없는배지에서세포를배양하면 (non-permissive conditions), Tag 단백질이변성되고불활성화되기때문에, 결국증식이억제되고세포는유사분열이전으로돌아가게된다. 그러나 HEI-OC1 세포주가실질적으로아미노글리코시드의독성을잘반영하는지에대해다른여러조건의실험실에서완전히검증된적이없으며, 실제내이세포로실험한 in vitro 및 in vivo 실험과어떤특징적차이점을가지는지연구된바가적은실정이다. 따라서본실험은 HEI-OC1 세포주를사용하여, 실제내이세포에서일어나는약물독성을반영할수있는지를평가하고자하며, 이것을생체의청각기관에서얻은것보다복합적인결과들과비교하고자하였다. 재료및방법 시약겐타마이신, 페니실린 (penicillin), cisplatin, 그리고인터페론- 감마 (interferon-γ) 는 Sigma사 (St. Louis, MO, USA) 에서구입하였다. 겐타마이신, 페니실린, cisplatin 은증류수에녹인후여과하여멸균하였고, 인터페론-감마는 1 M phosphate-buffered saline(pbs, ph 8.0) 에녹인후여과하여멸균하였다. 세포배양 HEI-OC1 세포주는 House Ear Institute(Los Angeles, CA, USA) 에서공급받아사용하였다. HEI-OC1 세포는 10% fetal bovine serum 과 25 U/mL 인터페론 -감마가포함되었지만, 항생제는없고, 고농도 (25 mm) 의포도당이들어있는 Dulbecco s modified Eagle medium에서배양하였다. 이실험에서 HEI-OC1 세포는항상 33, 10% 208 CO 2 의 permissive condition(kalinec 등 2003) 하에서배양하여분화되지않고계속적증식이가능하게하였다. 실험약물은실험의종류에따라적정한세포수를정한후처리하였으며, 약물투여 3일후에지표변화를측정하였다. Trypan blue 염색에의한생존세포수산정세포생존율은 trypan blue 염색법에의해생존세포수를측정하였다. 약물투여 3일후세포에트립신을처리하여배양액에부유시킨후동량의 0.4% trypan blue 염색약 (Gibco Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA) 을첨가하여부드럽게섞어주고실온에서 3분간방치하였다가 hemocytometer를사용하여세포수를산정하였다. Trypan blue 는세포내유입후살아있는세포들에의해서는세포외유출이가능하나, 죽은세포에서는세포외유출이가능하지않아세포를푸르게염색시킨다. 따라서생존세포수산정시푸르게염색된세포는배제하였고, 세포윤곽이명확한염색되지않은세포를살아있는세포로간주하였다. 세포주기의분석약물들의투여나항산화제의추가공급이세포의생존율에영향을미친다면, 세포주기에도변화가올것이다. 이러한세포주기의변화양상을분석하기위하여, 세포를 60 mm 세포배양용기에서배양하였으며, 배양용기당 5 10 5 세포의밀도로분주하였다. 약물투여 3일후배양용기에부착된세포에트립신을처리하고, 1,000 rpm으로 3 분간원심분리하였다. 침전물에 PBS를첨가하여한차례씻은후 PBS를 μl 다시첨가하여부유시켰다. 지속적으로교반하면서 % 에탄올 1 ml를천천히첨가하고 4 에서 1시간동안방치하여세포를고정하였다. Flow cytometry 분석을하기전에세포를 PBS로한차례다시씻고, 50 g/ml RNase A, 50 g/ml propidium iodide, 0.1%(w/v) sodium citrate, 그리고 0.1%(v/v) NP-40 이들어있는차가운 propidium iodide 용액 1 ml로부유시켰다. 그리고 37 의어두운곳에서 30분간반응을시킨후, flow cytometer(facs Caliber, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 와 Cell Quest software로분석을수행하였으며, 각조건마다 10,000개정도의세포가분석에사용되었다. Propidium iodide 는레이저조사에의해발광하는형광성질을가지며, 세포의 DNA에흡착되어 DNA 의양을간접적으로표현해준다. 세포분열과정에들지못하는세포는 DNA의양이적으며, 크기도줄어들고, 이것이 subg1 phase 세포들로분류된다. SubG1 phase 세포비율이증가한다는것은주어진실험조건하에서세포사가
남성일외 증가한다는것을알수있다. 활성산소종측정약물에의한세포생존율의변화가활성산소종의생성과연관되는지를관찰하였다. 활성산소종의생성은 6-carboxy-2, 7 -dichlorofluorescein diacetate(dcfh-da) 를기질로사용하여 flow cytometry 분석을통해측정하였다. DCFH-DA 는형광을가지며, 활성산소종과반응할때많은형광을발산한다. 약물투여나항산화제의투여가활성산소종의발생에어떤영향을주는지알고자하였다. 약물투여 3일후각배양용기당 DCFH-DA 가 20 μm 이되도록첨가하여 37 의어두운곳에서 20분간반응시킨다음세포를모아 PBS로씻고 PBS 1 ml당 1 10 6 세포가되도록부유시켰다. 그리고 FACS caliber flow cytometer로측정한 10,000개세포의 DCF fluorescence intensity(fl-1, 530 nm) 를통해활성산소종의생성을확인하였다. Caspase 활성도약제에의해유도된 caspase-3 활성은 ac-devd-pna enzymatic cleavage 분석법을이용하여측정하였다. 이방법은 caspase-3 효소의기질을일정하게투여하여효소반응결과물의흡광도를측정하여, 그효소의활성을비교, 관찰하는것이다. 약물투여 3일후세포를얼음위에서 lysis buffer{50 mm Tris(pH 7.5), 0.03% NP-40, 1 mm DTT} 와 30분동안반응시켜파괴하였고, 원심분리하여상층액을 Bradford assay(bio-rad, Hercules, CA, USA) 로정량하였다. 단백질추출물 (20 μg) 을전체부피가 0.1 ml가되도록 0.2 mm ac-devd-pna(calbiochem, San Diego, CA, USA) 와반응시킨다음 405 nm 에서흡광도를측정하였고, 분석은 2회반복하여평균흡광도로나타내었다. 사용된항체, 단백질추출및 Immunoblotting 세포생존율이나세포주기에변화가생긴다면, 세포분열을조절하는세포주기조절단백들의발현에변화가생길수있으므로, 그중대표적인단백들의발현을비교하고자하였다. Anti-p27, anti-p16, 그리고 anti-p21(santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA) 은 1:1,000 으로희석하여사용하였다. Anti-β actin antibody(sigma) 는 1:2,000 으로희석하여사용하였다. 약물투여 3일후세포를차가운 PBS 로씻고, lysis buffer{10 mm Tris-Cl(pH 7.4), 130 mm NaCl, 5%(v/v) Triton X-, 5 mm EDTA, 200 nm aprotinin, 20 μm leupeptin, 50 μm phenanthroline, 280 μm benzamidine-hcl} 와 4 에서 20분간반응시켜세포성단백질을추출하였다. 세포파쇄액은원심분리로정제하였고, 단백질은 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel 전기영동을통해분리한다음 Immobilion-P membrane(millipore, Billerica, MA, USA) 으로옮겼다. 이동을끝낸 Immobilion-P membrane 은실온에서 1시간동안 Tris-buffered saline-0.05% Triton X- (TBS-T)-4%(w/v) milk 와반응시켜비특이적인결합을억제한다음 4 에서 TBS-T 4%(w/v) milk 로희석한일차항체와밤새반응시켰다. 그리고 TBS-T 로씻은후 TBS-T 4%(w/v) milk로희석한 horseradish peroxidase 이차항체 (1:5,000;Santa Cruz) 와다시반응시키고 TBS-T 로씻은후, 결합한항체를 enhanced chemiluminescence(amersham Biosciences, Little Chalfont, UK) 로검출하였다. 항산화제들의효과관찰 N-acetyl cysteine(nac, ~500 μm, Sigma), vitamin E(50~500 μm, Sigma) 또는 vitamin C(56~840 μm, Sigma) 를 HEI-OC1 세포주에 1 mm 겐타마이신과함께처리하였다. 약제를처리하고 3일후에 trypan blue 염색을통해, 살아있는세포의수를확인하고, 대조군과서로비교하였다. 통계통계적인유의성은마이크로소프트사의엑셀소프트웨어를이용한 Student s t-test를통해평가하였는데, p- value 가 0.05 보다작은것을유의한것으로간주하였다. 결과 겐타마이신에의한 HEI-OC1 세포주손상의형태학적증거 33 에서인터페론-감마가포함된배지로 HEI-OC1 세포주를배양하였을때 36시간의복제주기를가졌으며, 방추형의전형적인, 신경세포와유사한형태를가지고있었다. 계속적인증식이이루어지는상태로써분화를끝낸세포와는특성상차이가있을것으로생각되었다. 겐타마이신을처리하고 3일후, 투여된겐타마이신농도에비례하여세포수가감소하였고, 겐타마이신처치군의살아있는세포들도납작해지고무딘모양으로변형되었다. 또한 200 μm cisplatin 을처리하였을때는세포사가심하게관찰되 209
겐타마이신에의해유발된세포자멸사의특성 120 Control Gentamicin (10 μm) % Viability 80 60 40 20 A 0 0 1 10 1,000 2,000 Gentamicin (μm) 120 Cisplatin (200 μm) Gentamicin ( μm) Fig. 1. Light microscopic findings. HEI-OC1 cells treated with gentamicin and cisplatin for 3 days ( ). 었으며, 신경돌기들이더많이소실되었다 (Fig. 1). 유의한세포사는 μm의겐타마이신처리후에관찰되었고 (81±11%), 2 mm의겐타마이신을처리하였을때, 58± 6.1% 의세포만이살아있었다 (Fig. 2). 이와같은현저한세포사는치료용량범위의페니실린처리실험에선관찰되지않았으며, 이것은 HEI-OC1 세포주가잘알려진내이독성약물에특이적으로반응하고있다는사실을보여주었다. 겐타마이신과 Cisplatin 에의한활성산소종의증가겐타마이신과 cisplatin 에의한 HEI-OC1 세포주의세포사멸과정에활성산소종의관련성을확인하기위해겐타마이신, cisplatin 또는페니실린을처리한세포들간의세포내활성산소종의농도를비교하였다 (Fig. 3). 활성산소종의농도는약물을처리하고 72시간후에측정하였는데, 활성산소종의농도가증가할수록형광이증가하여도표는오른쪽으로편이를보인다. 겐타마이신, cisplatin 을처리한 HEI-OC1 세포들에서활성산소종의농도가증가된것을확인할수있었다. 예상했던것처럼페니실린의경우에는활성산소종의농도가증가되지않았는데, 이것은겐타마이신이나 cisplatin 에의해유도되는세포사멸은아마도활성산소종에의해매개될것이라는것을암시하였다. % Viability B 80 60 40 20 0 0 2.5 5 7.5 10 12.5 Penicillin (U/mL) Fig. 2. Effect of treatment with gentamicin (A) and penicillin (B) on viability of HEI-OC1 cells. Cell count was performed 3 days after the drug treatment. Data were normalized as percentage of the cell count from untreated control. Data represent mean ±SE from three independent experiments. p<0.05 compared to control untreated with the drug. 확인하기위해세포주기분석을수행하였다 (Fig. 4). 세포분열주기로들어가지못하는세포들은 DNA 함량이적어그림의 M4 분획을증가시킨다. 실험결과, 겐타마이신또는 cisplatin 을처리한세포들에서는 subg1-phase(m4) 세포의비율이늘어난반면, 페니실린을처리한세포들에서는세포주기각단계의세포비율이변하지않는결과를얻었다. 그리고약물처리 3일후에 caspase-3 활성도를기질당발생물질의흡광도로확인하였을때, 약물처리를하지않은대조군의활성도에비해겐타마이신처리군에서는농도에비례하여그활성이증가하였고, 500 μm 겐타마이신과 200 μm cisplatin 처리세포군에서 caspase-3 활성도가각각 2배와 8배증가함을관찰하였다 (Fig. 5). 겐타마이신또는 Cisplatin 에의한세포성세포자멸사 (apoptosis) 내이독성약물로처리하였을때살아있는 HEI-OC1 세포들의수가감소하는것이세포자멸사와관련이있는지 210 겐타마이신처리에의한 Cyclin-dependent kinase inhibitor(cdki) 들의발현변화겐타마이신에의한세포자멸사에 CDKi 가관련되어있을것으로가정하고, p16, p21, 그리고 p27의단백질발
남성일외 현수준을측정하였다 (Fig. 6). 흥미롭게도 p27 단백질이겐타마이신투여에의해발현이증가하는양상을보였다. 하지만, p16과 p21 단백질발현은반복된실험에서도겐타마이신에의해변화하지않았다. NAC 에의한세포사보호효과겐타마이신에의한세포사멸로부터항산화제의단독처리로 HEI-OC1 세포를보호할수있는지확인하기위하여, 항산화제들을겐타마이신과함께처리하였다. 약물처리 3 Control Gentamicin ( μm) Gentamicin (250 μm) Gentamicin (1 mm) Panicillin (15 U/mL) Cisplatin (200 μm) Fig. 3. Effect of treatment with gentamicin, penicillin, and cisplatin on generation of reactive oxygen species of HEI-OC1 cells. Flow cytometric analysis was performed 3 days after the drug treatment. The presented data were chosen among three independent experiments. 051018.001 M4 N1 =9.63 M2 M3 051018.002 =13.98 051018.004 =18.00 0 200 400 600 800 0 0 200 400 600 800 0 0 200 400 600 800 0 Control Gentamicin ( μm) Gentamicin (1 mm) 051018.005 =9.95 051018.006 =7.11 051018.007 =78.09 0 200 400 600 800 0 0 200 400 600 800 0 0 200 400 600 800 0 Penicillin (10 U/mL) Penicillin (15 U/mL) Cisplatin (200 μm) Fig. 4. Effect of treatment with gentamicin, penicillin, and cisplatin on cell-cycle fraction of cultured HEI-OC1 cells. Flow cytometric analysis was performed 3 days after the drug treatment. The presented data were chosen among three independent experiments. 211
겐타마이신에의해유발된세포자멸사의특성 90 1,200 1,000 80 Caspase-3 activity 800 300 250 200 150 % Viability 70 60 50 G 300 500 50 200 500 56 308 560 840 (μm) 50 G+NAC G+Vit. E G+Vit. C 0 Control 250 500 1,000 Gentamicin Fig. 5. Effect of treatment with gentamicin and cisplatin on caspase-3 activity of HEI-OC1 cells. The activity was performed 3 days after the drug treatment. Data represent mean±se from three independent experiments. p<0.05 compared to control untreated with the drug. Gentamicin (μm) 200 (μm) Cisplatin Control 250 500 1,000 Fig. 7. Effect of co-treatment with N-acetyl cysteine (NAC), vitamin E or vitamin C on viability of 3-day gentamicin-treated HEI- OC1 cells. Cell count was performed 3 days after the drug treatment. Data were normalized as percentage of the cell count from untreated control. Data represent mean±se. from three independent experiments. p<0.05 compared to the group treated with gentamicin alone. G:1 mm gentamicin. Gentamicin (mm) NAC (mm) p27 - - 500 300 - - 300 500-300 300 p27 p16 β-actin Fig. 8. Effect of treatment with gentamicin and NAC on expression level of p27 protein of HEI-OC1 cells. Western blot was performed 3 days after the drug treatment. p21 β-actin Fig. 6. Effect of treatment with gentamicin on expression level of p27, p16 and p21 protein of HEI-OC1 cells. Western blot was performed 3 days after the drug treatment. 일후, 세포생존율이 NAC에의해다소증가된것을확인하였다 (Fig. 7). 하지만비타민 E와비타민 C에의해서는세포생존율이현저한변화를보이지않는것으로나타났다. 또한 NAC의처치에의해겐타마이신에의해증가한 p27의발현도감소됨을관찰하였다 (Fig. 8). 고 찰 이연구에서 HEI-OC1 세포주는페니실린에는반응하지 않고, 알려진내이독성약물에의해세포내활성산소종이증가되고이로인해세포사가유도되는특성을잘가지고있음을확인하였다. 본실험에서겐타마이신 1 mm을 3일동안처리하였을때, caspase-3 활성은 2~3배증가하였는데, 이것은겐타마이신처리 12시간후현저한 caspase- 3 활성화가나타나며, 24시간후에최고의활성을보이다가 48시간후에감소한다는이전의보고와일치하였다. 5) 그보고에의하면, 1 mm 겐타마이신처리 24시간후에 caspase 활성도는대조군에비하여 5배증가하였다. 이실험에서 200 μm ciplatin 을처리하였을때 caspase-3 활성이 8~9배증가한것역시선행보고에서활성도가 8배증가하였다는것과일치한다. 5) 겐타마이신에의한내이독성의정확한기전에대해서완전하게알려져있지않음에도불구하고, 아미노글리코시드에의한청력소실의중심에는활성산소종의생성이있다는증거들이많이보고되고있다. 6) 아미노글리코시드에의한활성산소종의생성은철 (Fe 2+ ) 과관련이있는것으로보 212
남성일외 인다. 6) 아미노글리코시드는 phosphatidylinositol-(4, 5)- bisphosphate 와아라키돈산을포함하는세포막지방성분과철의 3중복합체를형성하는것으로알려져있다. 이복합체는산화되어과산화음이온을생산하며, 이들은다른중요한세포구성성분들과반응할수있다. 또한내이조직에서아미노글리코시드는유도성산화질소합성효소 (inducible nitric oxide synthase) 를활성화하여산화질소의증가를자극한다. 이런조건하에서, 과산화물과이용가능한산화질소가반응하여더욱파괴적인 peroxynitrite 라디칼을형성하거나직접적으로세포사유도를개시할수있다. 이와같은관점에서, 항산화제는다양한내이독성약물로부터와우각유모세포를보호할것으로생각되어왔다. 8) 이실험에서, NAC은겐타마이신으로부터세포의생존율을개선할수있었지만, 비타민 E와 C는보호효과가없었다. 다른연구들도이실험과일관되게 NAC은내이유모세포에서내이독소에대하여보호특성을가지고있다고보고하고있다. 8) 최근의보고에의하면, 아미노글리코시드는주로코르티기관의유모세포외측면에손상을입힌다. 12) 이것은세포내부에서만들어지는항산화제이며, NAC의최종산물인클루타티온의수준이코르티기관에있는다른종류의세포들의수준에비해유모세포외측면에서낮다는보고와도잘일치한다. 13) 그러므로 NAC은글루타티온의제공자이기도하기때문에겐타마이신에대해서다른항산화제보다더효과적인내이보호제일수있다고생각된다. 하지만비타민 E는 Hartley albino guinea pig에서 cisplatin- 유도청력소실의보호에효과가적기때문에 tiopronin 과동시에투여하여야청력보호에유용하다는보고가있다. 3,9) 비타민 C의내이독소에대한유의한내이세포보호효과를나타낸다는보고는없어서본실험의결과와일치하는소견이다. 산화질소저해제인 nitro-l-arginine methyl ester 는겐타마이신에의한고주파영역청각소실에대해서는내이보호제로작용하지만, 중주파혹은저주파에대해선보호효과가없다. 10) 그러므로유모세포를내이독소로부터보호하는데있어서항산화제요법만으로는충분한보호효과를기대할수없을것으로보인다. 또다른보고에의하면, 겐타마이신은폴리아민과비슷한특성을가지며, 내이의유모세포에서와마찬가지로중추신경계신경세포의 N- methyl-d-aspartate(nmda) 수용체도직접적으로조절한다. 7) 또한 NMDA 길항제가겐타마이신에의해유도된내이독성을감소시킨다. 11) Glutamate 수용체를통한흥분성독성이오직활성산소종의생성에기인한다고할수없기때문에, 일부활성산소종차단제가겐타마이신에의 한와우각유모세포의손상에현저한보호효과를보이지못하는것도이해할수있다. 과도한활성산소종은유모세포를세포자멸사와세포괴사로유도하는신호를촉발시키는것으로생각된다. 이연구에서겐타마이신-유도세포자멸사에서는 caspase-3 의활성화와 subg1 기세포분획증가가현저하게나타났다. DNA fragmentation 과 chromatin의응축과같은아미노글리코시드-매개세포자멸사의다른증거들은이미보고되어있다. 14) 아미노글리코시드가세포성자멸과정을촉발하면, CDKi 의발현이변할수있다. 세포주기는다양한 cyclin 들과 CDKi에의해조절된다. 성장인자들은이런조절인자들의활성을촉진시키는반면, transforming growth factor-β (TGF-β) 는세포분열과 DNA 합성을멈추기위해이런조절인자들의활성을저해한다. CDKi 에는 2종류가있는데, Cip/Kip(Cdk inhibiting protein/kinase inhibiting protein) group과 Ink4(Inhibitors of Cdk4) group이있다. p21 Cip/Waf1, p27 Kip1 과 p57 Kip2 처럼 Cip/Kip group 에속하는 CDKi 는세포주기의진행을광범위하게저해하는반면, Ink4 group에속하는 CDKi 는세포주기를특이적으로조절한다. 예를들어, p16 INK4a 는 cyclind/cdk4 complex, phospho-rb의인산화, 그리고세포주기에서 G1기에서 S기로의이행을저해한다. 현재까지연구에서 p21 Cip/Waf1 과 p16 INK4a 단백질의발현이겐타마이신에의해유도된다는증거는없다. 일반적으로포유동물성체의와우각지지세포들 (supporting cells) 에서는 p27 Kip1 의발현이관찰되고, 유모세포에선발현이관찰되지않는반면, 생후재생이가능한조류의유모세포에선 p27 Kip1 이발현된다. 15) 정상생쥐에서배아기를지난후에는감각상피조직에새로운세포가추가되지않는것 15,16) 은아마도지지세포에서의 p27 Kip1 의발현이증가하기때문에감각상피조직으로의세포공급이중지되기때문이다. 본연구에서사용된생쥐유래 HEI-OC1 세포주는지지세포들에서만관찰되는 nestin 같은유전자들의발현이확인된다. 5) 마찬가지로본실험에서보듯이 p27 Kip1 의발현도관찰되는바, 유모세포와지지세포들의성격을모두가지는성상을보인다. 그런의미에서본연구결과만으로겐타마이신-유도세포사가 p27 Kip1 발현의증가와연관되어있다고단정적으로말할수는없다. 또한 HEI-OC1 세포주의겐타마이신에의한세포사가 p27 Kip1 의활성증가와연결되어있다고말하기에는본실험의결과만으로는무리가있다. HEI-OC1 세포에서활성산소종의과잉이겐타마이신의독성에어느정도관여할것으로생각되며, p27 Kip1 발현의증가가이와동반되어관찰되었다고말할수있겠다. 그럼에도 HEI-OC1 세포주는아미노글리코시드항생제의 213
겐타마이신에의해유발된세포자멸사의특성 독성과그를예방하는약제연구에는유용한도구로사용될수있다하겠다. 즉, 세포분열을야기하는본실험과같은조건 (33 ) 에서는미분화된내이세포의성상을띄며, 만일세포분열을억제하고세포분화만을유도하는조건 (39 ) 에서는성숙되고재생되지않는내이세포의실험이가능할수도있다고보인다. 중심단어 : 와우세포주 겐타마이신 Caspase-3 p27 N-acetyl cysteine. REFERENCES 1) Roberson DW, Rubel EW. Cell division in the gerbil cochlea after acoustic trauma. Am J Otol 1994;15(1):28-34. 2) Kalinec F, Kalinec G, Boukhvalova M, Kachar B. Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines. Cell Biol Int 1999;23(3):175-84. 3) Fetoni AR, Sergi B, Scarano E, Paludetti G, Ferraresi A, Troiani D. Protective effects of alpha-tocopherol against gentamicin-induced Otovestibulo toxicity: An experimental study. Acta Otolaryngol 2003; 123 (2):192-7. 4) Corbacella E, Lanzoni I, Ding D, Previati M, Salvi R. Minocycline attenuates gentamicin induced hair cell loss in neonatal cochlear cultures. Hear Res 2004;197(1-2):11-8. 5) Kalinec GM, Webster P, Lim DJ, Kalinec F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol Neurootol 2003; 8(4):177-89. 6) Rybak LP, Whitworth CA. Ototoxicity: Therapeutic opportunities. Drug Discov Today 2005;10(19):1313-21. 7) Hong SH, Park SK, Cho YS, Lee HS, Kim KR, Kim MG, et al. Gentamicin induced nitric oxide-related oxidative damages on vestibular afferents in the guinea pig. Hear Res 2006;211(1-2):46-53. 8) Ton C, Parng C. The use of zebrafish for assessing ototoxic and otoprotective agents. Hear Res 2005;208(1-2):79-88. 9) Fetoni AR, Sergi B, Ferraresi A, Paludetti G, Troiani D. Protective effects of alpha-tocopherol and tiopronin against cisplatin-induced ototoxicity. Acta Otolaryngol 2004;124(4):421-6. 10) Nordang L, Anniko M. Nitro-L-arginine methyl ester: A potential protector against gentamicin ototoxicity. Acta Otolaryngol 2005;125 (10):1033-8. 11) Takumida M, Anniko M, Shimizu A, Watanabe H. Neuroprotection of vestibular sensory cells from gentamicin ototoxicity obtained using nitric oxide synthase inhibitors, reactive oxygen species scavengers, brain-derived neurotrophic factors and calpain inhibitors. Acta Otolaryngol 2003;123(1):8-13. 12) Usami S, Hjelle OP, Ottersen OP. Differential cellular distribution of glutathione-an endogenous antioxidant-in the guinea pig inner ear. Brain Res 1996;743(1-2):337-40. 13) Sha SH, Taylor R, Forge A, Schacht J. Differential vulnerability of basal and apical hair cells is based on intrinsic susceptibility to free radicals. Hear Res 2001;155(1-2):1-8. 14) Nakagawa T, Yamane H, Takayama M, Sunami K, Nakai Y. Apoptosis of guinea pig cochlear hair cells following chronic aminoglycoside treatment. Eur Arch Otorhinolaryngol 1998;255(3):127-31. 15) Torchinsky C, Messana EP, Arsura M, Cotanche DA. Regulation of p27 Kip1 during gentamicin mediated hair cell death. J Neurocytol 1999;28(10-11):913-24. 16) Kanzaki S, Beyer LA, Swiderski DL, Izumikawa M, Stöver T, Kawamoto K, et al. p27(kip1) deficiency causes organ of Corti pathology and hearing loss. Hear Res 2006;214(1-2):28-36. 214