Korean Chem. Eng. Res., 54(1), 135-139 (2016) http://dx.doi.org/10.9713/kcer.2016.54.1.135 PISSN 0304-128X, EISSN 2233-9558 식물세포배양으로부터파클리탁셀회수를위한무기염이첨가된액 - 액추출 하건수 김진현 공주대학교화학공학부 31080 충남천안시서북구천안대로 1223-24 (2015 년 7 월 16 일접수, 2015 년 8 월 12 일수정본접수, 2015 년 9 월 8 일채택 ) Liquid-Liquid Extraction for Recovery of Paclitaxel from Plant Cell Cultures by Adding Inorganic Salts Geon-Soo Ha and Jin-Hyun Kim Department of Chemical Engineering, Kongju National University, 1223-24, Cheonan-daero, Seobuk-gu, Cheonan, Chungnam, 31080, Korea (Received 16 July 2015; Received in revised form 12 August 2015; accepted 8 September 2015) 요 약 본연구에서는무기염을첨가한액 - 액추출에의해식물세포인바이오매스로부터파클리탁셀회수방법을획기적으로개선하고자하였다. 다양한무기염 (NaCl, KCl, K 2 HPO 4, NaH 2 PO 4, NaH 2 PO 4 2H 2 O) 을이용하여추출효율을조사한결과, NaCl 에서가장낮은분배계수 (0.053) 로가장높은파클리탁셀수율 (~96%) 을얻을수있었다. NaCl 을이용한액 - 액추출에서최적의 NaCl/ 용매비와메틸렌클로라이드 / 메탄올비는각각 1%(w/v) 와 26%(v/v) 이었다. 또한최적의 NaCl/ 용매비와메틸렌클로라이드 / 메탄올비에서파클리탁셀함량에따른영향을조사한결과, 순수파클리탁셀함량 0.066% (w/v) 에서가장낮은분배계수 (0.053) 로가장높은수율 (~96%) 을얻을수있었다. 기존액 - 액추출의경우총 3 회의추출로파클리탁셀을 95% 정도회수가능한반면무기염을이용한방법의경우단 1 회추출로대부분의파클리탁셀을회수 (~96%) 가능하였다. Abstract We developed a liquid-liquid extraction method using an inorganic salt to dramatically improve the recovery efficiency of the anticancer agent paclitaxel from plant cell cultures. As a result of liquid-liquid extraction using a diverse types of inorganic salt (NaCl, KCl, K 2 HPO 4, NaH 2 PO 4, NaH 2 PO 4 2H 2 O), NaCl gave the highest yield (~96%) and lowest partition coefficient (0.053) of paclitaxel. The optimal NaCl/solvent ratio, methylene chloride/meoh ratio, and pure paclitaxel content for liquid-liquid extraction using NaCl were 1% (w/v), 26% (v/v), and 0.066% (w/v), respectively. Under the optimal conditions developed in the present method, most of the paclitaxel (~96%) was recovered from biomass by a single extraction step. In addition, this method facilitated 3-fold higher recovery efficiency of paclitaxel in a shorter extraction number than the conventional liquid-liquid extraction method. Key words: Paclitaxel, Recovery, Liquid-Liquid Extraction, Inorganic Salt, NaCl 1. 서론 파클리탁셀 (paclitaxel) 은주목나무 (yew tree) 의표피에서발견된디테르페노이드 (diterpenoid) 계열의항암물질이다. 난소암, 유방암, 두경부암 (head and neck cancer), 카포시종양 (kaposi s sarcoma), 비소세포성폐암 (non-small cell lung cancer, NSCLC) 치료에효과적이며현재가장많이사용되고있는항암제이다 [1]. 또한, 류마티스성관절염, 알츠하이머치료등의적응증이계속확대되고여러다른 To whom correspondence should be addressed. E-mail: jinhyun@kongju.ac.kr This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/bync/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 치료방법들과의복합처방에관한임상시험이진행중에있어향후파클리탁셀수요는계속늘어날전망이다 [2,3]. 파클리탁셀의주요생산방법으로는주목나무에서직접추출 (extraction) 하는방법, 주목나무의잎에서전구체 (baccatin III, 13-dehydroxybaccatin III, 10- deacetylbaccatin III, 10-deacetylpaclitaxel 등 ) 를얻어 side chain을화학적으로결합하는반합성 (semi-synthesis) 방법, 주목나무에서 callus를유도하고종균배양 (seed culture) 을거쳐주배양기 (main bioreactor) 에서식물세포를배양하여얻는방법이있다 [4-6]. 이들중식물세포배양방법은기후, 환경등의외부인자에의한영향을받지않고생물반응기내에서안정적으로생산이가능하기때문에일정한품질의파클리탁셀을대량생산할수있다 [5,7]. 식물세포배양에의하여생산된파클리탁셀은대부분식물세포와세포조각 (debris) 에포함되어있으며 [8], 식물세포배양으로부터항암물질파 135
136 하건수 김진현 클리탁셀의생산은여러단계의추출및정제공정으로이루어져있다 [9-11]. 먼저세포내에포함되어있는파클리탁셀을높은수율로분리 / 회수하는것이경제적인관점에서매우중요하다. 기존문헌 [12,13] 에의하면, 분리 / 회수공정은먼저유기용매 ( 주로메탄올 ) 을이용한바이오매스추출후추출액에존재하는다량의극성불순물 (polar impurity) 을액-액추출 (liquid-liquid extraction) 에의해제거하는것이일반적이다. 또한여러가지유기용매 ( 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 디에틸에테르, 헥산 / 메틸렌클로라이드등 ) 를이용하여액-액추출경향을조사한결과, 메틸렌클로라이드의경우높은극성불순물제거효과뿐만아니라높은파클리탁셀순도와수율을얻어액-액추출에가장효과적임을알수있었다 [14]. 하지만액-액추출공정에서의주요공정변수인유기용매첨가량, 추출횟수, 혼합시간, 상분리에소요되는정체시간등에대한정보는매우미흡한실정이다. 2009년에개선된액-액추출공정에서주요공정변수를최적화하여높은순도와수율의파클리탁셀을얻을수있었다 [15]. 하지만기존의액-액추출방법에의해높은파클리탁셀회수 (>95%) 를위하여 3회이상의추출과정이요구되어많은유기용매사용뿐만아니라액-액추출에많은시간이소요되었다. 따라서산업적대량생산을위해추출횟수를획기적으로단축할수있는고효율액-액추출공정개발이여전히필요한실정이다. 무기염을이용한액-액추출공정은목적성분의추출효율을향상시킬수있다는점에서매우효과적인방법으로보고되고있다 [16-19]. 이러한무기염을이용한방법은공정이단순하며기존의추출방법에비하여추출효율향상, 조업시간단축, 그리고에너지절감등다양한효과를기대할수있다 [19]. 따라서본연구에서는무기염을접목한액-액추출에의해파클리탁셀회수방법을획기적으로개선하고자하였다. 또한무기염을이용하여파클리탁셀을효율적으로회수할수있는최적의액-액추출조건인 NaCl/ 용매 ( 메탄올 + 메틸렌클로라이드 ) 비, 메틸렌클로라이드 / 메탄올비, 순수파클리탁셀함량을선정하여궁극적으로단 1회의액-액추출로대부분 (~96%) 의파클리탁셀를회수하고자하였다. 이러한연구결과는식물세포배양으로부터항암물질파클리탁셀을효율적으로회수하는데유용하게활용될수있을것으로판단된다. 2. 재료및방법 2-1. 식물재료및배양조건본실험에사용된식물세포배양액은 Taxus chinensis의잎으로부터얻은세포주 (cell line) 를이용하여배양하였다. Taxus chinensis 로부터기원된현탁액세포는 24 o C 암조건 (darkness condition) 에서 150 rpm으로교반하여배양하였다. 현탁 (suspension) 세포는수정된 Gamborg s B5 배지, 30 g/l sucrose, 10 mm naphthalene acetic acid, 0.2 µm 6-benzylaminopurine, 1 g/l casein hydrolysate, 1 g/l 2-(Nmorpholino) ethanesulfonic acid에서배양하였다. 세포배양은 2 주마다새로운배지 (medium) 로갈아주었고, 배양시간을연장시키기위해 7 일과 21 일째되는날에 1~2%(w/v) 의 maltose를첨가해주고 elicitor로서배양초기에 4 mm의 AgNO 3 를첨가해주었다 [7,20]. 식물세포배양후배양액으로부터 decanter (Westfalia, CA150 Claritying Decanter) 와고속원심분리기 (α-laval, BTPX205GD- 35CDEEP) 를이용하여식물세포와세포조각 (cell debris) 을회수하였다. 회수한식물세포와세포조각을합하여바이오매스라하였다. 본연구에사용 Fig. 1. Schematic diagram of the liquid-liquid extraction process with inorganic salt. 된바이오매스는 ( 주 ) 삼양제넥스로부터제공받았다. 2-2. 바이오매스추출및액-액추출식물세포배양액으로부터회수한바이오매스와메탄올의비율을 1:1(w/v) 로하여상온 (room temperature) 에서 30분동안교반하에서 4회반복추출하였다 [14]. 추출후여과지 (150 mm, Whatman) 로감압여과하여파클리탁셀추출여액을회수하고농축기 (CCA-1100, EYELA, Japan) 를이용하여농축 ( 원액의 30%) 하였다. 메탄올농축액에메틸렌클로라이드와다섯종류의무기염 (NaCl, KCl, K 2 HPO 4, NaH 2 PO 4, NaH 2 PO 4 2H 2 O) 을첨가하여무기염농도 1%(w/v) 으로조절한후상온에서혼합후 30분동안정체시켜상분리 ( 상층 : 메탄올농축액층, 하층 : 메틸렌클로라이드층 ) 를유도하였다. 액-액추출에서의주요공정변수 (NaCl/ 용매비, 메틸렌클로라이드 / 메탄올비, 순수파클리탁셀함량 ) 를각각최적화하였다. 액-액추출후상분리로부터파클리탁셀을함유하고있는하층인메틸렌클로라이드층을회수하여농축기를이용하여농축하고진공건조 (40 o C, overnight, 760 mmhg) 하여 HPLC 분석을통하여파클리탁셀순도와수율을계산하였다. 무기염첨가에의한액-액추출공정을 Fig. 1에나타내었다. 또한액-액추출에서파클리탁셀수율과분배계수는각각다음과같이계산하였다. Yield(%) = [amount of paclitaxel in bottom phase/amount of paclitaxel in feed] 100 (1) Partition coefficient (K p ) = Concentration of paclitaxel in top phase/ Concentration of paclitaxel in bottom phase (2) 2-3. 파클리탁셀분석파클리탁셀함량분석을위해 HPLC 시스템 (Waters, USA) 과 Capell Pak C 18 (250 4.6 mm, Shiseido, Japan) 칼럼을사용하였다. 이동상은증류수와아세토니트릴혼합용액 (65/35~35/65, v/v, 구배용매조성법 ) 을유속 1.0 ml/min 으로흘려주었다. 시료주입량은 20 µl 이며 227 nm에서 UV에의해검출하였다 [9,13]. HPLC 분석은표준정량곡선을이용하였으며표준시료는 Sigma-Aldrich 제품 ( 순도 : >97%) 을사용하였다. 3. 결과및고찰 3-1. 무기염첨가에따른영향식물세포배양에의하여생산된파클리탁셀은대부분바이오매스에
식물세포배양으로부터파클리탁셀회수를위한무기염이첨가된액 - 액추출 137 로부터얻을수있어파클리탁셀회수를위한액-액추출에서최적의무기염임을알수있었다. 이러한결과는무기염첨가에따른 saltingout 효과로상층 ( 메탄올농축액 ) 에존재하는파클리탁셀이하층 ( 메틸렌클로라이드층 ) 으로효과적으로이동하였기때문으로판단된다 [16-18]. 특히 NaCl에서가장효과적인이유는상층에적절한점도제공에의한효과적인물질전달때문으로판단된다 [21]. 무기염첨가유무에관계없이액-액추출에서얻은파클리탁셀순도 (>16%) 는거의차이가없음을알수있었다 (data not shown). 결과적으로액- 액추출에서무기염 NaCl을사용하였을때 1회추출로가장높은수율 (~96%) 을얻어파클리탁셀회수를위한최적의무기염으로선정하였다. Fig. 2. Effect of liquid-liquid extraction number on the yield of paclitaxel using conventional liquid-liquid extraction method. The methylene chloride/meoh ratio and pure paclitaxel content were 25% (v/v) and 0.066% (w/v), respectively. 포함되어있으며 [8], 파클리탁셀의생산을위해서는먼저유기용매를이용한바이오매스추출이이루어진다. 유기용매 ( 메탄올 ) 를이용한바이오매스추출물에는다량의극성불순물이포함되어있는데메틸렌클로라이드를이용한액-액추출에의해이러한극성불순물을매우효과적으로제거할수있다 [15]. 무기염을첨가하지않은기존의액-액추출은 1회추출시 77%, 2회추출시 12%, 3회추출시 6% 파클리탁셀이각각회수되어총 3회의추출로대부분의파클리탁셀회수 (~95%) 가가능하였다 (Fig. 2). 액-액추출공정에서파클리탁셀의추출효율을극대화하기위하여, 기존에여러가지유용물질의회수를위한액-액추출공정에많이사용되고있는무기물 (NaCl, KCl, K 2 HPO 4, NaH 2 PO 4, NaH 2 PO 4 2H 2 O) 을각각첨가하여액-액추출을 1회수행하였다. Fig. 3에서보는바와같이모든무기염 (NaCl, KCl, K 2 HPO 4, NaH 2 PO 4, NaH 2 PO 4 2H 2 O) 에서무기염을첨가하지않은 control ( 수율 : 77%, 분배계수 : 0.282) 보다높은수율과낮은분배계수를얻었다. 특히 NaCl에서가장낮은분배계수 (0.053) 로가장높은파클리탁셀수율 (~96%) 을하층 ( 메틸렌클로라이드층 ) 으 Fig. 3. Effect of inorganic salt on the extraction yield and partition coefficient of paclitaxel. The methylene chloride/meoh ratio, pure paclitaxel content, and salt concentration of top phase for liquid-liquid extraction were 26% (v/v), 0.066% (w/v), 1% (w/v), respectively. 3-2. 무기염을첨가한액-액추출공정의최적화다양한종류의무기염을첨가한 1회액-액추출공정에서 NaCl을사용하였을때가장높은파클리탁셀수율 (~96%) 을얻을수있었다. 액-액추출에서무기염첨가량과상층 / 하층부피비는매우중요한공정변수로알려져있다 [16-19]. 이들주요공정변수의영향을조사하기위하여, NaCl/ 용매비 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2%(w/v), 메틸렌클로라이드 / 메탄올비 16, 20, 26, 31, 36%(v/v) 으로각각조절하여 1회액-액추출을수행하였다. Fig. 4에서보는바와같이 NaCl/ 용매비 1%(w/v), 메틸렌클로라이드 / 메탄올비 26%(v/v) 에서가장높은파클리탁셀수율 (~96%) 을얻을수있었다. 처음으로상분리가일어나기시작하는메틸렌클로라이드 / 메탄올비 16%(v/v) 에서낮은파클리탁셀수율 (>70%) 을보이다가메틸렌클로라이드 / 메탄올비가증가할수록파클리탁셀수율또한증가하여메틸렌클로라이드 / 메탄올비 26%(v/v) 에서가장높은파클리탁셀수율 (~96%) 얻을수있었다. 반면메틸렌클로라이드 / 메탄올비 26%(v/v) 이후수율은감소하는경향을보였다. 이러한현상은추출용매가증가할수록목적성분의수율또한증가하다가메틸렌클로라이드 / 메탄올비 26%(v/v) 이후에는많은양의추출용매로인한희석효과로수율이감소하는것으로판단된다 [17]. 또한 NaCl/ 용매비가증가할수록파클리탁셀수율이증가하여 NaCl/ 용매비 1%(w/v) 에서가장높은수율 (~96%) 을얻을수있었다. 이러한결과는상층 ( 메탄올농축액 ) 에존재하는파클리탁셀이 salting-out 효과에의해하층 ( 메틸렌클로라이드층 ) 으로원활히이동하여파클리탁셀추출효율을향상된것으로판단된다 [16-18]. 반면 NaCl/ 용매비 1%(w/v) 이상에서는파클리탁셀수율이감소하였다. 액-액추출을위한시료내파클리탁셀함량은수율뿐만아니라처리량 (throughput) 에도많은영향을미친다 [22]. 시료내파클리탁셀함량에따른영향을조사하기위하여, 최적의무기염첨가량 [NaCl/ 용매비 1%(w/v)] 과상층 / 하층부피비 [ 메틸렌클로라이드 / 메탄올비 26%(v/v)] 에서순수파클리탁셀함량 0.045, 0.066, 0.099, 0.130%(w/v) 로각각변화시켜 1회액-액추출을수행하였다. Fig. 5 에서보는바와같이수율은순수파클리탁셀함량 0.066%(w/v) 까지는최대치 (~96%) 를보였으나이후감소하였다. 분배계수는순수파클리탁셀함량 0.066%(w/v) 까지는감소하였으나이후증가하였다. 순수파클리탁셀함량 0.066%(w/v) 에서가장높은수율 (~96%) 과가장낮은분배계수 (0.053) 를나타내어액-액추출을위한최적파클리탁셀함량임을알수있었다. 이러한현상에대한이유를조사하기위하여순수파클리탁셀함량변화에따른하층 ( 메틸렌클로라이드층 ) 에존재하는파클리탁셀함량을분석하였다. Fig. 5에서보는
138 하건수 김진현 Fig. 4. 3D response surface and contour plots for the optimization of liquid-liquid extraction process with NaCl. (NaCl, KCl, K2HPO4, NaH2PO4, NaH2PO4 2H2O)을 첨가하여 액-액 추출을 수행한 결과, NaCl에서 가장 낮은 분배계수(0.053)로 가장 높은 파클리탁셀 수율(~96%)을 하층(메틸렌 클로라이드 층)으로부터 얻을 수 있었다. 무기염 NaCl을 이용한 액-액 추출 공정에서 NaCl/ 용매 비 1%(w/v), 메틸렌 클로라이드/메탄올 비 26%(v/v)에서 가장 높은 수율(~96%)을 얻어 파클리탁셀 회수를 위한 최적의 조건임을 알 수 있었다. 또한 최적의 NaCl/용매 비와 메틸렌 클로라이드/메탄 Fig. 5. Effect of pure paclitaxel content on the yield, partition coefficient, and paclitaxel content in bottom phase. The NaCl/solvent ratio and methylene chloride/meoh ratio were 1% (w/v) and 26% (v/v), respectively. 바와 같이 순수 파클리탁셀 함량 0.066%(w/v)부터 거의 일정한 파 클리탁셀 함량(~0.65%, w/v)을 보였다. 즉, 액-액 추출의 동일 조건 하에서 하층에 용해될 수 있는 최대 파클리탁셀 함량(포화 농도)이 순수 파클리탁셀 함량 0.066%(w/v)부터 일정함을 알 수 있었다. 따 라서 액-액 추출을 위한 시료 내 순수 파클리탁셀 함량 0.066%(w/v) 까지는 최대 수율을 보이다가 이후 수율이 점차 감소하고, 분배계수는 순수 파클리탁셀 함량 0.066%(w/v)까지는 감소하다 이후 증가하게 된다. 결과적으로 NaCl/용매 비 1%(w/v), 메틸렌 클로라이드/메탄올 비 26%(v/v), 순수 파클리탁셀 함량 0.066%(w/v)에서 가장 높은 수 율(~96%)을 얻어 파클리탁셀 회수를 위한 최적의 액-액 추출 조건 임을 알 수 있었다. 4. 결 론 본 연구에서는 식물세포배양으로부터 파클리탁셀을 효율적으로 회수하기 위해 무기염을 첨가한 액-액 추출방법을 도입하였다. 기존 액-액 추출의 경우 총 3회의 추출로 파클리탁셀을 95% 정도 회수 가능한 반면 무기염을 이용한 방법의 경우 단 1회 추출로 식물세포 내 대부분의 파클리탁셀을 회수(~96%) 가능하였다. 다양한 무기염 올 비에서 파클리탁셀 함량에 따른 영향을 조사한 결과, 순수 파클 리탁셀 함량 0.066%(w/v)에서 가장 낮은 분배계수(0.053)로 가장 높은 수율(~96%)을 얻을 수 있었다. 이러한 연구결과는 식물세포배양으 로부터 항암물질 파클리탁셀을 효율적으로 회수(공정 편리성, 높은 추출 효율, 조업시간 단축, 에너지 절감 측면)하는데 유용하게 활용 될 수 있을 것으로 판단된다. 감 사 이 논문은 2015년도 정부(교육부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업의 결과물입니다(과제번호: 2015016271). References 1. Kim, J. H., Paclitaxel : Recovery and Purification in Commercialization Step, Korean J. Biotechnol. Bioeng., 21, 1-10(2006). 2. Kim, G. J. and Kim, J. H., Enhancement of Extraction Efficiency of Paclitaxel From Biomass Using Ionic Liquid-methanol Co-solvents Under Acidic Conditions, Process Biochem., 50, 989-996 (2015). 3. Hsiao, J. R., Leu, S. F. and Huang, B. M., Apoptotic Mechanism of Paclitaxel-induced Cell Death in Human Head and Neck Tumor Cell Lines, J. Oral Pathol. Med., 38, 188-197(2009). 4. Rao, K., Hanuman, J., Alvarez, C., Stoy, M., Juchum, J., Davies, R. and Baxley, R., A New Large-scale Process for Taxol and Related Taxanes from Taxus Brevifolia, Pharm. Res., 12, 10031010(1995). 5. Choi, H. K., Son, J. S., Na, G. H., Hong, S. S., Park, Y. S. and Song, J. Y., Mass Production of Paclitaxel by Plant Cell Culture, J. Plant Biotechnol., 29, 59-62(2002).
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