CHEMISTRY TOPICS 1 핵자기공명분광학 (NMR Spectroscopy) 의화학소재에의응용 노정래 군산대학교, jrrho@kunsan.ac.kr 서론 NMR 의가장큰활용분야중의하나가화합물구조해석이다. 특히유기분자의화학구조분석은 NMR 에크게의존하고있다. NMR 기술의발전으로인하여최근에는비전문가도쉽게 NMR 스펙트럼을얻을수있으므로이제는다양한 NMR 실험법을이해하고스펙트럼을해석하는능력이요구되고있다. 따라서여기서분자구조해석에필요한스펙트럼과이와관련된 NMR 펄스시퀀스, 그리고분자구조해석법에대하여설명하고자한다. 본론유기분자들은주로탄소, 수소, 산소, 질소원소로구성되며화합물에따라인, 황등의원소가포함되는경우도있다. 유기분자의구조연구를위하여 NMR 에이용되는핵종은주로수소와탄소이다. 분자내에있는다른핵종들은이들과결합하고있는탄소또는탄소에결합된수소에대한화학적이동값 (chemical shift) 과스핀커플링 (spin spin coupling) 상수로부터추정할수있으며질량분석법과조합하여알수있다. 1/2) 원자들은각각고유한공명주파수를갖는작은막대자석으로생각할수있다. 그리고각수소와탄소들은비교적가까운위치에놓여있을때다른수소와탄소들간에자기적인커플링 (magnetic coupling) 을일으킨다. 이커플링은화학결합전자로인한스핀커플링 (spin-spin coupling) 과짧은공간적인거리때문에일어나는쌍극자커플링 (dipolar coupling) 이있다. 간단한분자의경우구성하고있는탄소와수소원자들의특정적인공명주파수와화학결합으로생기는커플링으로부터분자구조를밝힐수있다. 커플링을하는두핵 ( 수소와수소혹은수소와탄소 ) 은같은커플링상수값을같게되므로수소와탄소스펙트럼만으로화학구조를밝힐수있다. 하지만분자의크기가커짐에따라구성하는수소와탄소수가증가하게되고이들의공명주파수및수소들간의상호커플링이많아져신호의중첩이심한수소스펙트럼이얻어지게되고따라서수소와탄소스펙트럼만으로구조해석에한계가있다. 대신에분자를구성하는탄소와수소들의공명주파수를모두지정할수있다면어떤형태로든커플링을하는두쌍의핵들을서로연결하여복잡한분자구조해석이가능해진다. NMR 의 2D 실험법은이와같은과정을가능하게한다. 1. 자장속의수소와탄소핵 NMR 기기로부터측정되는두가지중요한물리량이화학적이동값과스핀커플링이다. 고정된외부자장에분자가놓여있을때분자를구성하는탄소 (I = 1/2) 와수소 (I = 2. 2D NMR 스펙트럼 1D NMR 스펙트럼은탄소와수소스펙트럼과같이한개의주파수영역으로표현되는것이고 2D NMR 스펙트럼은두개의주파수영역으로표현되는것이다. 1D NMR 스펙 2015. 03 화학세계 13
읽기쉬운총설 2D NMR 실험 COSY 표 1. 2D NMR experiments and couplings Correlations Spin coupling constants 2 J HH : 20 ~ 0 Hz 3 J HH : 0 ~ 16 Hz 3+n J HH : 0 ~ 5 Hz 대하여소개하고자한다. 모든 2D 스펙트럼은스핀커플링 (J) 혹은쌍극자커플링 (NOE) 으로부터일어나며 [ 표 1] 에서이를정리하였다. TOCSY HSQC HMQC HMBC HSQCTOCSY 1 J CH : C(sp 3 ) ~ 125 Hz C(sp 2 ) ~ 165 Hz C(sp) ~ 250 Hz 2 J CH : 10 ~ 12 Hz 3 J CH : 1 ~ 10 Hz 2-1. COSY(COrrelation SpectroscopY) COSY 실험은일반적으로수소와수소간의스핀커플링을하고있을때관측되며두핵간의커플링의세기를알수있게한다. 아래주어진그림은 COSY 실험을위한최신펄스시퀀스이다. 여러종류의 COSY 펄스시퀀스가있지만결과는 2- 결합커플링 ( 제미널커플링, geminal coupling) 또는 3-결합커플링 ( 비셔널커 NOESY ROESY 트럼은시료에펄스를가하고곧바로일정시간 (t) 동안자유유도감소 (Free Induction Decay, FID) 형태로주어지는신호를검출하여한번퓨리에 (Fourier) 전환한것이다. 반면 2D NMR 스펙트럼은 [ 그림 1] 과같은일반적인과정을통하여검출된신호를두번퓨리에전환하여얻은것이다. 준비 전개 혼합 검출 t 1 t 2 그림 1. 2D NMR process 2D NMR 실험은간단히말하면두핵이상호커플링을하는경우, 전개와혼합단계에서다양한펄스시퀀스를사용하여커플링을하고있는두핵간에자기 (magnetization) 가전이 (transfer) 되도록하여커플링을하는두핵의정보를얻는것이다. 2D NMR 이론에대한자세한내용은많은설명이요구됨으로여기서는분자구조해석에필요한중요한 2D 실험과이들실험으로부터얻어지는스펙트럼에 플링, vicinal coupling) 을하는두수소핵을알려준다. 예외적으로 4, 5-결합으로생기는커플링이있다. COSY 실험결과로부터얻어지는스펙트럼의특징은대각선성분과비대각선성분으로나눌수있다. 커플링을하는두핵의정보는비대각선성분에서얻게된다. 또한스펙트럼은대각선을중심으로대칭을이루고있다. 한예로아래설탕분자에대한 COSY 스펙트럼이있다. 가로축에있는 3번수소와세로축에있는 4번수소가비대각선에서만나고있는신호를볼수있는데이는두수소가 3-결합커플링을하고있다는사실을보여주고있다. 14 화학세계 2015. 03
2-2. TOCSY(TOtal Correlation SpectroscopY) 앞의 COSY 실험은 2,3- 결합을통한스핀커플링을하는수소핵만을관측하는반면아래펄스시퀀스를사용하면 2,3- 결합을통하여스핀커플링을하는수소들이연속적으로놓여있을때커플링을하는이들수소를모두보여주는실험이다. TOCSY 스펙트럼에서얻어지는신호는수소핵들의상호간커플링의세기가클때잘나타나며 3-결합으로이루어져있더라도커플링정도가약하면 COSY 와유사한스펙트럼으로주어진다. 그리고위펄스시퀀스에있는 DIPSI 는혼합단계에해당되는펄스시퀀스의일종이며이펄스길이가길수록 5,6- 결합까지의신호를함께보여준다. 일반적으로 60~80 ms가많이사용된다. 아래 TOCSY 스펙트럼은세로축에있는 4번수소가가로축에있는 3번수소외 2번과 5번수소들과모두만나고있는것을보여주고있다. 이것은 4개의수소들이 3-결합을통하여서로커플링을하고있는스핀계를나타내어주고있다. 2-3. HSQC(Heteronuclear Single Quantum Correlation)/HMQC(Heteronulclear Multiple Quantum Correlation) 이실험은 1-결합을하는수소와탄소의커플링을관측하여탄소에직접연결된수소핵을찾는데사용된다. HSQC 와 HMQC 는펄스시퀀스는서로다르지만동일한정보를제공하며특히두펄스시퀀스는 APT(attached Proton Transfer) 라는간단한펄스시퀀스를추가하여탄소종류 (CH 3, CH 2, CH) 를구별할수있게하여기존 DEPT(Distionless Enhancement Polarization Transfer) 을별도로수행하지않아도되는장점이있다. 아래그림은탄소종류를구별할수있는 HSQC 펄스시퀀스이다. H C HSQC/HMQC 실험에서중요한변수는커플링상수 1 J CH 값이다. [ 표 1] 에서알수있듯이탄소의 s 전자의비율에따라이상수값이차이가많이난다. 실험에사용되는변수값이실제분자의커플링값과차이가많이나게되면 2015. 03 화학세계 15
읽기쉬운총설 HSQC/HMBC 신호가매우약하게나타난다. 일반적인경우 1 J CH 값으로 145 Hz를많이사용하고있지만삼중결합에있는탄소와수소와의 HSQC 신호가약하거나관측되지않는이유는바로이때문이다. 이경우해당되는변수값을 200 Hz로하여재실험을실시하면원하는신호를얻을수있다. HSQC 실험은탄소골격을지정할때매우중요한실험이며특히미지시료구조해석에서최우선적으로이루어져야한다. 스펙트럼의해석은비교적간단하다. COSY/TOCSY 와달리대각선성분이없으며관측되는신호는탄소에직접붙은수소핵을알려준다. 아래 HSQC 스펙트럼에서각신호들은수소와탄소의 1- 결합커플링관계를보여주고있다. 빈타원의신호는 CH 스핀계이며채워진타원은 CH 2 스핀계를나타낸다. 2-4. HSQC-TOCSY(HSQC+TOCSY) 분자의크기가큰경우많은수소핵들로중첩되어스펙트럼이복잡하게된다. 이경우가로, 세로축이수소로이루어져있어 COSY/TOCSY 만으로분자구조해석에어려움이있게되는데다른한개의축을분리가잘되는탄소정보를주는실험을고안하면구조해석을용이하게할수있다. 대표적인한예가 HSQCTOCSY 이며이는 HSQC 펄스시퀀스에 TOCSY 펄스시퀀스를혼합한것이다. 오른쪽단락 HSQCTOCSY 스펙트럼에서볼수있듯이 9 번수소는 9번탄소와의커플링외 10번, 11번그리고 12번탄소와도커플링을보여주고있다. 이것은 9번수소가 10번, 11번그리고 12번수소와의 TOCSY 신호때문에일어난다. 2.5. HMBC(Heteronuclear Multiple Bond Correlation) 유기분자의탄소골격을밝히기위하여탄소와탄소연결성을나타내어주는 2D INADEQUATE 라는 NMR 실험법이있지만감도가매우낮아실제적으로사용에어려움이있다. 대신탄소와직접연결된수소들간의연결성을 COSY/TOCSY 실험으로찾을수있지만수소가없는사중탄소 (quaternary carbon) 가있을경우그연결성은끊어져분자전체구조를밝힐수없게된다. 따라서이런문제를해결하기위하여사중탄소와의커플링을하는수소를찾아서연결을가능하게하는실험이 HMBC 이다. 이것은탄소와수소간의 2-3 결합커플링을관측하는실험이다. 그러나 [ 표 1] 에서보듯이이커플링상수값이적고그값의범위가매우넓다. 이런이유로이실험은실험변수에따라스펙트럼결과가많이달라질수있다. 아래그림은흔히사용되는 HMBC 펄스시퀀스이다. H C HMBC 실험은 2-3 결합커플링상수값 n J CH 이중요한다. 일반적인값으로는 8 Hz를사용하고있지만만약분자구조에서이커플링에해당되는값이 2~4 Hz가되면사용된변수값과두배가까운차이가나게되어 HMBC 신호가약하거나관측되지않는다. 대신변수값을 4 Hz로조정하여 16 화학세계 2015. 03
실험을하게되면대신펄스시퀀스길이가 125 ms로매우길어지게되어핵스핀이완현상으로또한신호가약하게된다. 이약한신호를관측하기위하여긴시간동안신호를많이축적을해야하며시료농도가진해야가능하게된다. 분자구조해석에서사중탄소와의연결성이주어지지않을경우 n J CH 값을변경하면서반복적인 HMBC 실험이필요하다. 아래 HMBC 스펙트럼은 1번수소와 8번사중탄소와의 3-결합커플링을보여주고있다. 이로부터 1번탄소가 8번탄소와연결되어있다는것을알수있다. 장이있는상태에서의신호증가를말한다. NOE 와 ROE 세기는거리에따라차이가나며또한용매내에서분자의운동성에도크게영향을받는다. 두수소간의거리가같은분자에서운동에따른 NOE와 ROE관계는아래그림과같다. ROE NOE 소형유기분자와같이용매내에서분자의운동이활발한경우 NOE 와 ROE 는똑같이최대 50% 까지증가가되지만분자크기가증가되어운동성이떨어지면두값은차이 2-6. NOESY(Nuclear Overhauser Enhancement SpectroscopY)/ROESY(Rotating Frame Overhauser Enhancement SpectroscopY) 지금까지설명한 2D NMR 실험은스핀커플링때문에일어나며커플링상수값에따라스펙트럼에나타나는신호의세기가달라진다. NOESY/ROESY 실험은두핵간쌍극자상호작용이있을경우가능하다. 쌍극자커플링은막대자석으로생각되는두핵 ( 대부분수소와수소 ) 이결합과무관하게공간적인거리가가까우면일어나게된다. 이상호작용때문에커플링을하는두수소핵에서한핵에에너지를가하면커플링을하는다른핵에도그영향을받는다. 보통그신호의세기가증가하게되는데그차이를 NOE(Nuclear Overhauser Effect) 라고부른다. 이것은수소핵간의거리에대한정보를주게되므로분자입체구조를밝히는데매우중요하다. NOE 는 Z 축방향으로자장이있는상태에서신호의증가를말하며 ROE 는 X 혹은 Y 축방향으로자 가나게된다. NOE 는분자의크기가증가할때 NOE 효과가 0에가까워진다. 대략적으로분자량이 800~1800 사이가되면두수소가가까이있어도 NOE 현상을관찰할수없다. 반면 ROE 는그대로나타나고있다. NOE 와 ROE 에대한자세한내용을여기서는다루지않지만두현상의차이는중요하다. 이두현상을 2D 실험으로나타낸것이 NOESY 와 ROESY 이다. NOESY ROESY 두펄스시퀀스의차이는 NOE 혹은 ROE 현상을일으키도록하는혼합펄스시퀀스가형태가다르며보통 ROE 관측을위하여 X축혹은 Y 축으로스핀을고정시키기위하여더긴혼합시간을사용한다. 두펄스시퀀스는외형상으로 COSY 와 TOCSY 펄스시퀀스와유사한것을볼수있다. 이때문에경우에따라서 NOESY 와 ROESY 스펙트럼에서스핀커플링으로인한신호가나타나기때문에해석상 2015. 03 화학세계 17
읽기쉬운총설 에많은주의가요구된다. 또한분자량이 800 ~ 1800 사이가되는분자의경우 NOESY 스펙트럼을얻기어려우므로분자량이작은유기분자를제외하곤 ROESY 실험을많이수행한다. NOESY/ROESY 스펙트럼에서나타나는신호는분자의입체구조해석에유용하게사용된다. 왼쪽단락아래 ROESY 스펙트럼에서 1번수소는 2번수소와 7번수소와 ROE 신호를볼수있다. 이정보로부터 1번수소는 2번과 7 번의수소와공간적으로가까이위치하고있다는것을알수있다. 한편 2번수소와의커플링은 COSY 에서도나타나므로스핀커플링과쌍극자커플링을모두하고있다. 소와의부분구조들간연결성을찾는다. 1 H, 13 C HSQC or HMQC COSY, TOCSY, HSQCTOCSY HMBC NOESY or ROESY 2-7. 분자구조해석절차미지의시료또는유기합성으로부터생성되는새로운부산물의화학구조규명은아래와같은순서로진행한다. 먼저 1D NMR 스펙트럼을측정한후, HSQC 실험을수행하여탄소와수소간의 1-결합짝을찾는다. 특히 HSQC 스펙트럼에서는 2-결합으로생기는수소와수소커플링을쉽게찾을수있으며분자내탄소종류를식별할수있다. 두번째로 COSY 와 TOCSY 신호를조합하여수소와수소의 3-결합연결성을찾는다. 이연결성으로부터분자의부분구조를완성한다. 분자가복잡하면 HSQCTOCSY 실험을추가하여부분구조를완성한다. 세번째로 HMBC 신호를이용하여수소들간의스핀커플링으로결정된부분구조들을서로연결한다. 특히사중탄 끝으로 ROESY/NOESY 실험을통하여수소와수소간의거리로부터분자의입체구조를밝힌다. 이 NOESY/ROESY 스펙트럼에서주어지는모든신호는 NOE/ROE 가아니며일부강한 COSY 신호가 NOE 신호로해석될오류가있다. 일반적으로 NOESY/ROESY 스펙트럼에서나타나는강한 COSY 신호는 NOE 때문에생기는것이아니다. 예를들면 anti 배열로되어있는두수소는 COSY 스펙트럼뿐만아니라NOESY/NOESY 스펙트럼에서도나타난다. 하지만이두수소는거리가상대적으로멀리떨어져있으므로 NOE 로해석하면안된다. 결론유기분자구조를해석하는데필요한 2D NMR 실험을간단히소개하였다. 원하는정보를가진스펙트럼을얻기위하여실험변수값을변경하는것이중요하다. 더유익한 NMR 실험과이들에대한자세한설명은참고문헌에주어져있으므로유기분자구조해석에 NMR 을많이활용할수있기를바란다. 18 화학세계 2015. 03
참고문헌 1. N. Jacobsen, NMR spectroscopy Explained: Simplified Theory, Application and Examples for Organic Chemistry and Structural Biology, 2007, Wiley. 2. T. D. W. Claridge, High-Resolution NMR Techniques in Organic Chemistry, Vol 27, 2nd Ed, 2008, Elsevier. 3. H. Friebolin, Basic One- and Two-Dimensional NMR Spectrsocopy, 2010, Wiley-VCH. 4. H. Gunther, NMR Spectroscopy, 3rd, 2013, Wiley-VCH. 노정래 Jung-Rae Rho 서울대학교화학교육학과졸업 (1982-1986) 서울대학교자연대학화학과대학원졸업 (1986-1992) 한국해양연구원해양천연물연구실선임, 책임연구원 (1992-2004) 군산대학교해양생물공학과교수 (2004- 현재 ) 대한화학회발간학술지해외구독료변경안내 Wiley-VCH 와체결한학술지발간협약에따라대한화학회에서발간하는학술지중 Bulletin of the Korean Chemical Society, Journal of the Korean Chemical Society 와화학세계의해외구독료가아래와같이변경됩니다. 구독료 Bulletin 지 (Bulletin of the Korean Chemical Society) 대한화학회지 (Journal of the Korean Chemical Society) 화학세계 (ChemWorld) 기관및단체 US$210 US$170 개인 회원비회원 발송하지않음 US$140 US$170 US$100 US$130 학술지발간협약에따라해외에서는 Bulletin 지의인쇄본을받아볼수없으며, Wiley Online Library 에서온라인으로구독할수있습니다. 그동안해외에서 Bulletin 지를구독하셨던회원들에게이미안내문이발송되었으며, 추후 Wiley-VCH 에서 Wiley Online Library 구독을위한안내문을다시발송해드릴것입니다. 2015. 03 화학세계 19