전기영동의원리와실험 Principles and Practice of Agarose Gel Electrophoresis #101-1 -
1. 전기영동 (Electrophoresis) 이란? 전기영동은주로생체고분자들의성질을연구하고, 그것들을분석, 분리, 정제하는중요한방법중에하나이다. 전기영동은 DNA, RNA나단백질같은것들이고유의전하를띠고있고, 그것들이어떤전기장에놓이게되면이동할수있다는사실을기본으로하고있다. DNA 전기영동은크기, 전하또는구조가다른 DNA 조각을분리하는기본적인방법입니다. DNA는구조상 Backbone의 Phosphate group을가지고있어전기영동에사용되는 Buffer안에서음전하를띄고있으며두전극사이에위치했을때 (+) 극으로움직이는기본적인원리를가지고있습니다. 이때, Agarose 나 Polyacrylamide와같은 Gel Matrix 사이를 DNA 분자가통과하는속도는분자량이커질수록, Gel의농도가높을수록늦어지게됩니다. 그림 3. DNA 의구조 그림 4. 핵산을분리하기위한전기영동 - 2 -
2. 아가로즈겔전기영동 아가로즈겔은해상도는낮지만, DNA 단편을 200 bp에서부터 50 kb까지분리할수있으며사용이간편하고, 다루기가쉽기때문에현재가장많이사용되고있는전기영동이다. 아가로즈는해초로부터추출되는물질로서선형중합체의형태를하고있다. 아가로즈겔은적당한완충용액 (TAE buffer) 에녹여서원하는크기의틀에부어지며, 겔이굳은후에사용된다. 겔이굳는동안아가로즈는지지체 (matrix) 형태가되며, 그밀도는아가로오스의농도 (%) 에따라정해진다. 이러한겔에전기장이주어지면, 음전하를띠는 DNA는양극으로이동한다. 이때 DNA가이동하는정도는여러가지요인의영향을받는다 그림 5. 아가로즈의화학적구조 (a) 와겔을형성할때만들어지는중합체의구조 (b) 3. 아가로즈겔전기영동시 DNA 의이동에영향을주는요인들 1) DNA 분자의크기가클수록느리게이동한다. 그림 6. 아가로즈젤내에서의분자이동 - 3 -
2) Agarose 의농도가높을수록느리게이동한다. 3) DNA 형태 ( 구조 ) 에따라이동속도가다르다. 일반적으로 supercoiled DNA 가가장빨리, 그다음 linear DNA, open circular DNA 의순으로빠르게이동한다. 그림 7. 아가로즈젤에서 DNA 의이동순서 4) 부하되는전압이높을수록이동속도가빠르다. 4. TAE 버퍼 (TAE buffer) TAE buffer 에는 Tris, Acetate, EDTA 라는세가지성분이들어있는데, Tris 는양이온을공급하여 (-) charge 를띠고있는 DNA 를끌어주는역할을합니다. 그러나 Tris 는 ph 가 11 에가까울정도로높기때 문에 DNA 가해리될수있습니다. 따라서이높은 ph 를낮추기위해 Acetate 가들어갑니다. EDTA 의역할은두가지로다음과같습니다. 1) DNase inhibition에의한 DNA 분해방지 DNA sample prep 과정에포함될수있는 DNase는전기영동중에 DNA 를분해할수있습니다. DNase 의활성에는 Mg2+ 와같은 2가양이온이필요한데, EDTA는 ethylenediamine tetraacetic acid로 4개의 (-) charge를띤 acetate 기를가져 Mg2+ 와같은양이온을잡아주는 chelate로작용하며, 결과적으로 DNase의활성을억제하고전기영동중 DNA 분해를방지하게됩니다. 2) 전기영동에필요한 DNA의 (-) charge 유지 DNA는당, 염기, 인산으로구성되어있는데, 그중인산은당과당을연결하는 backbone구조를형성하고있고 DNA에 (-) charge을띠게합니다. 앞서언급한 2가양이온 (Mg2+, Ca2+) 은 DNA의 backbone 에존재하는 phosphate의 (-) charge를중화시킴으로써 DNA 구조를안정화시키는역할을합니다. 이러한 DNA backbone의 (-) charge는 DNA 전기영동시 agarose gel에서 (-) 극에서 (+) 극으로이동하게합니다. 따라서 DNA 구조에서 (-) charge를중화시키는 2가양이온을 EDTA로제거해주면 DNA의구조는 - 4 -
염기를제외하고는일정하므로분자량에따라일정하게 (-) charge 를띠게되며, agarose gel 상에서분 자량에따라분리되게됩니다. 이는단백질전기영동시 SDS 를 sample buffer 에포함시켜단백질이균일 하게 (-) charge 를띠게하는것과유사한역할을하게됩니다. 5. TBE 버퍼 (TBE buffer) TBE 버퍼에는 Tris-borate-EDTA 세가지성분이들어있습니다. 일반적으로 TBE 버퍼가 TAE 버퍼보다 Gel 에서의 Resolution 이좋습니다. 그래서 TAE 버퍼는 DNA 분자량이큰 agarose electrophorsis 에서 주로사용되고 TBE 는 DNA 분자량이작은경우에쓰이며주로 DNA sequencing 할때씁니다. 6. DNA staining dye 1) EtBr EtBr은실험실에서많이사용되는대표적인 staining dye로써, 얇은판모양의고리화합물로, DNA 나선의염기사이에들어가결합하므로강력한발암물질이자돌연변이원 (mutagen) 으로알려져있으며, UV에노출되면결합한 DNA를통해가시광선으로변화시켜발광된 band를확인할수있습니다. 또한, EtBr은 DNA의이동속도를 10~15% 감소시키며, 취급시반드시 glove 및 mask를착용해야하고사용후에는폐기해야합니다. 2) 다양한 DNA staining dye Green Red Yellow / Gold - 5 -
가로스겔전기영동의원리와연습 [ 실험목적 ] 이실험의목적은학생들이다음의내용을배우는것이다. 전기영동이론의기본적인이해를돕는다 다른단위들로분리하기위한아가로스겔전기영동이포함된과정을통해직접체험하여습득한다. [ 제품구성 ] 전기영동을위한 Ready-To-Load 염색샘플 - A Orange - B Purple - C Red - D Blue 1 - E Dye Mixture - F Blue Dye Mixture(Blue 1 + Blue 2) 시약 & 기구 - 연습용겔로딩용액 - 아가로스분말 - 전기영동버퍼 - 1ml 피펫 - 분주용피펫 [ 기타실험에필요한장비 - 별도구매 ] 수평형겔전기영동장치 D.C 전원공급장치 마이크로피펫, 팁 저울 전자레인지혹은핫플레이트 250ml 플라스크혹은비커 100ml 눈금실린더 장갑 백색광조명 증류수 주의 모든제품구성품은교육적연구를목적으로개발되었으며인간또는동물의진료용으로사용될수없 습니다. - 6 -
[ 실험개요 ] 이실험의목적은학생들이다음의내용을배우는것이다. 전기영동이론의기초적인이해를도우며다른분자를분리하는아가로스겔전기영동을포함하는과 정을직접실행하여학생들에게익숙하도록하는데목적을둔다. - 7 -
[ 안전유의사항 ] 1. 보호장갑및보호안경을반드시착용한다. 2. 시약을가열하거나녹이는장비를다룰때에는특별히주의해야한다. 3. 입으로피펫을사용하지않는다. 피펫펌프나벌브를사용한다. 4. 전기장비를사용할경우특별히조심한다. 장비의커버를벗기면파워소스로부터나오는전기전류는자동으로끊기지만, 먼저전원을빼고플러그를뽑은후전선을분리하고커버를벗긴다. 사용하지않을때는파워를끄고플러그를뽑는다. 5. EDVOTEK 전기영동실험장치는전기가샐이음매가없다. 그러나만약에전기영동실험중전기가샌다고생각하면즉시전원을끄고장비를사용하지않는다. 6. 항상시약이나생물학적물질을다루는실험이끝나면비누로손을깨끗이닦는다. [ 겔트레이준비하기 ] 1. 깨끗하고물기가없는겔트레이의열린부분을넓은고무캡또는테이프를이용해막는다. A. 고무막이이용하기 트레이의양쪽을고무캡으로막는다. 고무캡을트레이의양쪽과하단에잘맞춘다. B. 테이프를이용하기 폭이약 2cm 넓이인테이프를이용해트레이의양쪽과하단에맞게붙인다. 테이프를붙이고옆으로삐져나온부분은트레이의옆면이나아래부분에붙인다. 2. 콤 (comb) 또는 well-former template을겔트레이의가운데홈에끼워넣는다. 콤 (comb) 은한쪽으로기울어지지않도록트레이에정확하고고르게놓는다. 일반적인전기영동실험의경우콤을트레이의가장바깥홈에끼우지만이번실험에서는가운데홈에끼워넣는다. [ 아가로스겔캐스팅하기 ] 3. 250ml 플라스크를사용해겔용액을준비한다. [ 표 A] 를참조하고실험에필요한다음내용물을플라스크에첨가한다. 버퍼농축액 증류수 아가로스파우더 - 8 -
[ 표 A] 0.8% 울트라스펙아가로스겔 겔트레이크기 50 버퍼 증류수 아가로스 총부피 7 7 0.6ml 29.4ml 0.23g 30ml 7 10 1.0ml 49.0ml 0.39g 50ml 7 14 1.2 58.8ml 0.46g 60ml 4. 혼합물을충분히저어아가로스파우더가뭉치지않게한다. 5. 펜으로플라스크외벽에용액의용량을표시해둔다. 6. 혼합물에열을가해아가로스파우더를용해시킨다. 용해되지않은분자없이모두투명하게용해되어야한다. [ A. 전자레인지를이용하는방법 ] 플라스틱랩으로플라스크를막아증발을최소화시킨다. 혼합물에 1분동안열을최대한가한다. 혼합물을젓고열을 25초동안최대로가해아가로스가완전히용해되도록한다. [ B. 핫플레이트를이용하는방법 ] 알루미늄호일로플라스크를막아증발을최소화시킨다. 버너로혼합물에열을가해간간히저으면서끓인다. 아가로스가완전히용해되도록한다. 7. 아가로스파우더를용해시킨후용액의증발이감지되면증류수를넣어 5단계에서표시한원래높이를유지한다. 아가로스용액을천천히저어용액의온도를 60 C까지낮춘다. 8. 냉각된아가로스용액을트레이에붓는다. 트레이는평평한데놓여있어야한다. 9. 겔이굳도록기다린다. 약 20분후면겔은단단하면서도차가워진다. 10. 겔이두꺼우면 20분이상충분히굳도록기다린다. - 9 -
[ 전기영동을위해겔준비하기 ] 11. 겔이완전히굳어지면조심스럽게고무캡또는테이프를겔트레이에서떼어낸다. 이때겔웰 (well) 이상하지않도록각별히조심한다. 특히로딩시피펫의끝등으로겔사이를찌를수있으니조심한다. 12. 콤 (comb) 을천천히수직으로들어올린다. 마찬가지로겔웰 (well) 이상하지않도록각별히조심한다. 13. 겔을전기영동기챔버내의트레이에방향을맞추어겔이찢기지않도록올려놓는다. 14. 전기영동기챔버에겔이충분이잠길만큼 1 버퍼를넣는다. EDVOTEK 50x 농축버퍼를 1 버퍼로희석시키는배율은 [ 버퍼농축액 : 증류수 = 1 : 49] 이다. 15. 겔이버퍼에충분히담겨지는지확인한다. 16. 샘플을로딩하고전기영동을실시한다. ➊ 첫번째실험 : 겔로딩연습 샘플을정확히이동시키는기술은가장좋은겔결과를얻는데필수적이다. 피펫을사용하다발생하는실수는샘플이버퍼와희석되게만들거나겔을로딩하면서피펫팁으로겔에난홈을손상시킬수있다. 아가로스겔에샘플을올리는작업이익숙하지않다면실제실험에앞서샘플을정확히이동시키는기술을연습할필요가있다. EDVOTEK 전기영동실험키트에는연습에필요한연습겔로딩용액튜브가하나들어있다. 분리된연습겔을캐스팅할것을권한다. 예를들어겔로딩연습은다음과같이이루어질수있다. 1. 겔트레이에난홈의수에맞춰최대한으로콤을끼우고아가로스젤을붓는다. 2. 겔이굳어지면전기영동기챔버내버퍼에담근다. 필요하면콤을기준으로겔을열대로조각낼수도있다. 주의 : 아가로스겔은 잠수함겔 이라고도불린다. 그이유는샘플로딩이 이루어지는동안그리고전기영동이이루어지는동안버퍼에잠기기때문이 다. 3. 연습겔로딩솔루션을샘플홈 (well) 으로이동시키는연습을한다. 피펫팁으로홈을손상시키지않도록조심한다. 염료의전기영동시샘플 35~38μl를홈에로딩한다. 샘플이동에일반피펫을사용한다면각홈에가득찰때까지로딩한다. 4. 연습이더필요하면연습겔로딩용액을피펫을이용해홈사이로짜내어제거한다. 5. 연습겔을새로운겔로대체하여실제실험을준비한다. - 10 -
[ 마이크로피펫으로샘플이동하기 ] 1. 마이크로피펫의용량을적당히설정하고깨끗한팁을마이크로피펫에연결한다. 버튼을 1단계까지누르고팁을샘플에담근다. 2. 팁이샘플에잠기면버튼을천천히놓아샘플을팁으로빨아들인다. 3-1. 피펫팁을들어올려겔의홈에이동시킨다. 이때팁이홈을상하지않도록조심한다. 3-2. 피펫버튼을 2단계까지눌러샘플을분주시킨후내용물을완전히비운다. 3-3. 샘플을이동시킨후팁이버퍼에서완전히나올때까지피펫버튼을놓지않는다. 4. 버튼을눌러팁을제거한다. 다음샘플에는새팁을사용한다. [ Notice ] 마이크로피펫의버튼은최초 Rest Position과 1단계멈춤단계와, 2단계멈춤단계로구분된다. 피펫의버튼을눌렀을때 1단계멈춤단계까지가정확한용량이며더세게눌렀을경우 2단계멈춤단계까지눌러지는것은용액을옮길때피펫팁에남아있는용액을내보낼때사용한다. 따라서 1단계멈춤단계까지만눌러용액을취하고옮길때는 2단계멈춤단계까지눌러피펫팁안에남아있는용액을모두내보낸다. 또한팀에용액이담긴상태에서피펫을거꾸로세워서피펫의팁홀더로용액이흘러들어가지않도록 조심해야한다. - 11 -
➋ 두번째실험 : 아가로스겔전기영동실시 [ 전기영동샘플 ] 사전표본된퀵스트립 연결튜브 퀵스트립 튜브에서샘플을꺼내려면마이크로피펫끝으로호일상단을찌른후 샘플을빨아들인다. [ 샘플로딩하기 ] 1. 샘플용량확인하기때로는적은양의샘플이튜브벽면에붙게된다. 샘플전체가겔을로딩하기전에튜브끝에위치해야한다. 샘플이퀵스트립 튜브에남아있다면호일상단을가볍게두드려샘플이튜브하단에떨어지게한다. 샘플이 1.5ml 또는 0.5ml 마이크로테스트튜브에들어있다면샘플튜브를원을그리며돌리거나또는튜브를가볍게두드려샘플이튜브하단에모이게한다. 2. 샘플로딩하기 A~E 튜브에있는염료샘플을각각순서대로홈에로딩한다. 이때로딩할양은 35~38μl 정도면된다. 1번 : A튜브 : 오렌지색 2번 : B튜브 : 보라색 3번 : C튜브 : 빨간색 4번 : D튜브 : 파란색 1 5번 : E튜브 : 혼합염색 6번 : F튜브 : 혼합파란색 [ 겔러닝하기 ] 3. 샘플을올린후조심스럽게커버를전극터미널위로눌러내린다. 커버에있는 +, - 칼라인디케이터와챔버의방향이맞아야한다. 4. 검정색선플러그를파워소스의검정색입력단자 (-) 에연결한다. 적색선플러그를파워소스의적색입력단자 (+) 에연결한다. 5. 파워소스의전압에설정하고실험시간에따라전기영동을실시한다. 일반적인내용은표 C와같다. 표 C. 염료의전기영동에필요한시간및전압 전압 권장실험시간 125 20분 70 45분 50 90분 - 12 -
6. 전류가잘흐르고있는지확인한다. 플래티넘전극에공기방울이형성되는것이보여야한다. 7. 약 10분후에색깔있는염료가분리되는것을보게될것이다. 7. 전기영동이끝나면전원을끄고플러그를뽑고전선을분리한후커버를연다. 9. 겔결과를정리한다. 문서화하는방법은다양하다. 겔사진을넣거나사진을찍거나겔이미지를스캔할수있다. [ 비판적사고및가설의수립 ] 다음문제에답한다. 필요하면별도용지에기록한다. 1. 어떻게아가로스겔전기영동이 DNA 를분리시키는가? 2. 전하에따른이동을설명하라 3. 샘플 F 의결과에서어떤결론을얻을수있는가? 4. well 안으로로딩하기전에왜글리세롤을샘플용액에첨가하는가? 5. 버퍼용액대신에챔버용액혹은겔용액에증류수로대체시킨다면어떤일이발생할까? - 13 -
전기영동의원리와실험 Principles and Practice of Agarose Gel Electrophoresis #101 교사용가이드북 - 14 -
[ 실험준비소요시간 ] 1. 울트라스펙 - 아가로스겔준비 : 스케줄에따라아가로스겔을언제준비할것인지를결정한다. 직접 아가로스겔을준비하든아니면학생들에게준비하도록지시하든아가로스겔을준비하는데약 30 ~ 40 분이필요하다. 일반적으로이시간중약 20 분은겔이응고되는데걸리는시간이다. 2. 전기영동에걸리는시간은약 20 분에서 2 시간까지차이가발생할수있다. [ 실험준비 ] EDVOTEK 실험키트에들어있는전기영동샘플과시약은다음중한가지방법으로포장된다. 1) 퀵스트립 튜브 2) 개별튜브 (1.5ml 또는 0.5ml) 퀵스트립 튜브 만일퀵스트립 샘플이잘분리되지않으면 1. 가위등날카로운도구를이용해튜브를하나씩 떼어낸다. 주의 : 실험키트에따라비어있는튜브도있다. 2. 샘플과샘플사이의호일을조심스럽게분리한다. 샘플윗면을덮고있는호일을찢지않도록조심 한다. 3. 각실험그룹당한개의스트립을사용한다. 4. 겔로딩을하기전에튜브나호일을살짝두드려모든샘플이튜브바닥에모이도록한다. [ 일반적인위험요소회피방법 ] 다음과같은방법으로위험요소또는잠재적인문제를피할수있다. 염료가잘용해될수있도록겔의혼합비율을잘맞춘다. ( 표 A 참조 ) 그리고전기영동은권장시간동안만실시한다. 정확한농축버퍼의희석은겔과전기영동버퍼를위한준비과정이다. 겔에버퍼가없이는샘플의이동성이없다는것을기억한다. 버퍼준비에증류수만사용하고수돗물은절대사용하지않도록한다. 최상의결과를얻기위해서는실험지도서에따라만든신선한전기영동버퍼를사용한다. 실제실험에앞서겔로딩중발생할수있는샘플희석을막기위해샘플이동기술을훈련한다. 버퍼로샘플이유실되는것을방지하기위해겔이적절하게위치가되었는지확인하여샘플이겔의올바르지않는방향으로전기영동되지 - 15 -
[ 실험결과및분석 ] 1번 : A튜브 : 오렌지색 2번 : B튜브 : 보라색 3번 : C튜브 : 빨간색 4번 : D튜브 : 파란색 1 5번 : E튜브 : 혼합염색 6번 : F튜브 : 혼합파란색 [ 학습관련질문및그에대한해답 ] 1. 어떻게아가로스겔전기영동이 DNA 를분리시키는가? 아가로스겔전기영동은크기, 전하, 모양을토대로분리한다. 2. 전하에따른이동을설명하라 분자는음극전하를가지고있어서양극전극을향해이동한다. 양극전하를가진분자는음극전극을 향해이동한다. 3. 샘플 F 의결과에서어떤결론을얻을수있는가? 파란색 2 는양전하를갖는다. 파란색 1 은음전하를갖는다. 4. well 안으로로딩하기전에왜글리세롤을샘플용액에첨가하는가? 글리세롤은샘플밀도를높여버퍼와웰안에가라앉게해준다. 5. 버퍼용액대신에챔버용액혹은겔용액에증류수로대체시킨다면어떤일이발생할까? 증류수에는이온이없다. 따라서전기영동이이루어지지않는다. - 16 -