大韓本草學會誌제 35 권제 4 호 (2020 년 7 월 ) Kor. J. Herbol. 2020;35(4):1-8 ISSN 1229-1765(Print), ISSN 2288-7199(Online) http://dx.doi.org/10.6116/kjh.2020.35.4.1. 참당귀, 중국당귀, 일당귀의헤모글로빈활성도비교 이장천 1#, 조수인 1, 김형우 1, 김정훈 1, 성대동 2, 이부균 1 1 : 부산대학교한의학전문대학원약물의학부, 2 : 고려대학교신소재화학과 Comparison of Hemoglobin Activity of Angelica gigas, Angelica sinensis and Angelica acutiloba roots Jang-Cheon Lee 1#, Suin Cho 1, Hyungwoo Kim 1, Jung-Hoon Kim 1 Dae Dong Sung 2, Boo-Kyun Lee 1 1 : Division of Pharmacology, School of Korean Medicine, Pusan National University 2 : Department of Advanced Chemistry, Korea University ABSTRACT Objectives : Angelicae gigas, A. sinensis and A. acutiloba are three types of plants used as Angelicae Radix (Dang-Gui). Many doctors of Korean medicine want to know the difference in clinical use of these three species. This study aimed to compare the hemoglobin-related activity of the extracts of Angelicae gigas, A. sinensis and A. acutiloba roots by measuring the intensity of binding oxygen to hemoglobin using Raman spectroscopy. Methods : Hemoglobin activity was measured by chemical analysis and Raman spectroscopy to compare the pharmaceutical efficacy of three Angelica root extracts. The oxygenated hemoglobin intensity, blood decursinol and acetylcholinestrase(ache) concentration in mice were measured. In addition, the effects of three Angelica root extracts on oxygenated hemoglobin intensity, decursinol and AChE concentration in red blood cells (RBC) from human were also investigated. Results : The contents of decursin, decursinol and decursinol angelate, which affected physiological activity and RBC properties, were higher in the extract of A. gigas root than in those of A. sinensis and A. acutiloba roots. Moreover, oxygenated hemoglobin intensity in the A. gigas extract was higher than that of other two species in the blood of mice and human RBCs. Also, the blood decursinol and AChE concentrations of A. gigas root extract were higher than that of A. sinensis and A. acutiloba roots. Conclusions : These results suggest that A. gigas is more effective in treating disease related oxygen deficiency in RBC deformation under oxidative stress. 1) Key words : Angelica gigas, Angelica sinensis, Angelica acutiloba, oxygenated hemoglobin, Raman spectroscopy Ⅰ. 서론 當歸는 神農本草經 에처음기재된이후시대를거치면서 본초서마다그효능에관한내용이점차추가되어기록되고 있는한의학에서많이사용하고있는한약재중하나이다. 현재산형과 ( 繖形科, Umbelliferae) 에속한참당귀 Angelica gigas Nakai와중국당귀 A. sinensis (Oliv.) Diels의뿌리는當歸로사용되고 1.2), 일당귀 A, acutiloba (Siebold & Zucc.) Kitag. 의 *Corresponding author : Boo-Kyun Lee. Division of Pharmacology, School of Korean Medicine, Pusan National University, 49, Busandaehak-ro, Mulgum-eup, Yangsan-si, Gyeongsangnam-do, 50612, Republic of Korea. Tel : +82-51-810-8460 Fax : +82-51-810-8460 E-mail : samzon58@pusan.ac.kr #First author : Jang-Cheon Lee. Division of Pharmacology, School of Korean Medicine, Pusan National University, 49, Busandaehak- ro, Mulgum-eup, Yangsan-si, Gyeongsangnam-do, 50612, Republic of Korea. Tel : +82-51-810-8459 Fax : +82-51-810-8460 E-mail : jcl7788@pusan.ac.kr Received : 07 July 2020 Revised : 16 July 2020 Accepted : 25 July 2020
2 大韓本草學會誌 Vol. 35 No. 4, 2020 뿌리는日當歸로사용된다 3). 當歸는補血和血, 調經止痛, 潤 燥滑腸의효능으로月經不調, 經閉腹痛, 癥瘕結聚, 崩漏, 血 虛頭痛, 眩暈, 痿痺, 腸燥便難, 癰疽瘡瘍, 跌打損傷등을치료 한다 4). 東醫寶鑑 중당귀가배합된처방 ( 四物湯또는四物가미 처방들포함 ) 은 69 개의병증門에걸쳐 1,000 개가넘게사용 되었으며, 빈도순으로보면婦人門, 胞門, 風門, 癰疽門虛勞 門과眼門의질환을치료하기위해사용되었고, 주로부인과 관련된질환의치료에제일많이사용되고있다. 이렇게다양한 당귀배합처방을혈과관련된질환을치료하기위하여사용한 용어 ( 이하治血용어라한다 ) 로는養血安神湯, 當歸補血湯, 瀉血湯등처방이름에포함된것들을포함하여養血, 補血 生血滋血益血, 活血, 和血, 調血, 通血, 勻血, 行血, 血運導血, 凉血, 淸血, 瀉血, 止血, 破血, 下瘀血등이있다 5). 3 종당귀의대표적인유효성분을살펴보면, 참당귀는 decursin 과그의이성질체인 decursinol angelate, 중국당귀 와일당귀의경우 z-ligustilide, n-butylidenephthalide 및 ferulic acid 로알려져있다 6). 참당귀의약리작용은뿌리의 decursin 과 decursinol 에의해발현되는것으로알려져있으며, decursin 과 decursinol 은혈관내피의성장인자로서혈관형성 제어기능에관여하는중요한역할을한다 7). 또한, 혈액내에서 산소분자들 (oxygen species) 의헤모글로빈결합능력에관여 하는중요한화합물로알려져있다 8). 이에저자들은임상에서당귀를사용함에있어질환의특 성에맞게선택적으로사용하여야치료효과를높일수있을 것이라생각하여 3 종당귀의활성비교연구를기획하였다. 이러한연구는이전연구자들에게의해서도수행된바있다 6,9). 김등은당귀및구성성분에대한약리학적작용에대한 고찰에서중국당귀와일당귀의주요유효성분은유사하지만 참당귀는약간다른것으로나타났으며, 3 종당귀의효과는 대체로공통적이나작용기전에차이가있다고하였다 6). 송 등은 hydrocortisone acetate 로유발된어혈병태모델에서 참당귀가다른 2 종의당귀에비해약간더우수한효과를보 이는것으로판단했다 9). 본연구에서는참당귀. 중국당귀, 일당귀뿌리추출물이헤 모글로빈의산소분자활성화정도에미치는영향을알아보기 위하여각당귀추출물의 decursin 계열성분을분석하였고 라만스펙트럼 (Raman spectroscopy) 상에서나타나는 oxygenated hemoglobin(o-hb) 의상대적농도의크기로부 터헤모글로빈의산소분자활성화정도를알아보았으며, decursinol 과 acetylcholinestrase(ache) 의농도에미치는 영향을관찰하였다. 1. 시료의준비 Ⅱ. 재료및방법 본실험에사용된참당귀, 중국당귀, 일당귀뿌리는건조된 상태로 광명당 ( 울산, 한국 ) 에서구입하여세척한후진공 건조하였다. 참당귀와일당귀는각각경북봉화와충남서산 에서재배된것을사용하였으며, 중국당귀는쓰촨성 ( 四川省 ) 에서재배된것을수입하여사용하였다. 구입된시료는이장천교수가동정하여기원을확인하였다. 시료는 vortex mixer (Gilson, Middleton, WI, USA) 를이용하여분말로만든다음추출에사용하였다. 500 g의참당귀, 중국당귀, 일당귀분말을증류수 25% 와정제한에틸알코올 (C 2H 5OH) 75% 혼합용매에서 16시간속슬렛 (Soxhlet) 추출기를이용하여환류추출한후진공회전증발기를이용하여농축하였다. 최종적으로얻는건조분말은참당귀, 중국당귀, 일당귀각각 7.13 g, 9.06 g, 6.84 g으로수율은각각 1.43, 1.81, 1.37% 였다. 3종당귀의추출물은 3차증류수에녹여 3% 농도로사용하였다. 2. 실험동물 생후 6개월, 체중 25~30 g인수컷 BALB/C 생쥐 20 마리를두열바이오텍 ( 서울, 한국 ) 에서구입하여사용하였다. 이들생쥐들은 25 ± 10, 습도 55 ± 1%, 환기횟수 2~3회 / 시간과사료와물을자유롭게먹을수있는환경에서사육되었다. 시료의채취는 24시간동안의절식이후에이루어졌다. 모든생쥐는국제실험동물사육법 (The Guide for Care and Use of Laboratory Animals ) 과미국보건성 (National Institute of Health, NIH) 의규정을준수하여관리되었고, 동물실험의프로토콜은고려대학교동물실험윤리위원회의승인을받아진행하였다 ( 승인번호 : KUIACUI-2020-17). 3. 인체혈액시료 건강한사람의적혈구 (Red Blood Cell, RBC) 는 Cedarlance 사 (Ontario, Canada) 로부터구입하여사용하였다. 이들의평균혈액지수 (hematological parameters) 는 RBC가 4.6 ± 0.07 1012/L, 헤모글로빈 (Hb) 은 136.1 ± 4.34 g/l 였다. 모든측정은세계의사협회 (WMA) 의헬싱키선언규칙을준수하였다. 4. 화학분석법 각당귀시료에함유된성분을분리할때사용한 HPLC는 ThermoFisher제 UltiMateTM 3000 RSLCnano System에서수행하였다. 시료성분의분자확인에사용한 1H-NMR과 13C-NMR 스펙트럼은 Bruker Fourier 300HD를사용하여얻었고, 분자량은 Shimadzu, LCMS-9030과 ThermoFisher 제 Q ExactiveTM HF Hybrid Quadrupole-OrbitrapTM Mass Spectrometer를사용하였다. 시료성분분자확인에사용한 FT-IR과 UV/vis 분광광도계는 PerkinElmer제 Spectrum TwoTM L160000T와 Shimadzu제 UV-2700 UV/vis spectrophotometer 를사용하였다. Raman 스펙트럼은 BioPAT Spectro Raman Spectroscopy에서얻었다. 5. 생쥐의혈액시료채취 증류수에녹인 3종당귀추출액 3% 시료를 10 μl /g의양으로생쥐의정맥에주사하고 30분후미정맥에서혈액을채
참당귀, 중국당귀, 일당귀의헤모글로빈활성도비교 3 취하였다. 이후 15 초이내에라만분광기를이용하여스펙트 럼을얻었다. 6. 인체유래 RBC 의처리 RBC 에대한처치는두그룹으로나눈다음 Oktyabrsky 등의 방법 10,11) 에따라수행하였다. 간략히정리하면, 3 종당귀의 시료는 dimethylsulfoxide(dmso) 에녹여 0.3 mm 농도로 하였다. 시료의평균몰농도는 Natural Compound Molecular Fingerprint program (NC-MFP) 를이용하여구하였다. 이 것을 RBC 에분산시켜최종농도가 3 μm이되게하고 37 에서 30 분간배양하였다. 배양은두그룹으로나눠진행하였다. 첫 번째그룹은참당귀, 중국당귀, 일당귀시료를가하여배양 시켰다. 두번째그룹은 3 종당귀각시료를추가한후산화적 스트레스 (oxidative stress) 를유발하였다. 여기에 10 mm 의 KH 2PO 4 와 3.5 mm 의 KCl, 1.5 mm 의 MgCl 2, 145 mm 의 NaCl 과 NaHCO 3 6 mm 를가하여 10 배희석한다음 30 분동안 배양하였다. 산화적스트레스에대한반응을측정하기위해 20 μm농도의 H 2O 2 를배양액에가하였다. 7. 헤모글로빈의라만분광법측정 Hemoporphyrin 의테트라피롤고리 (tetrapyrrolic ring) 구조변화를보기위하여라만분광법을 V. V. Revin et.al. 방법 12) 에의거하여측정하였다. 이때사용한레이저는 DL7 140 Sanyo 다이오드레이저로 100 lens, 100 mw 의최대 광출력에서 532 nm파장의라만스펙트럼을여기시켰다 (excitation). 각시료에 15 mw 광원을조사하였으며, 100 1.3 NA 유침 (oil immersion) 장치에연결된 Nikon TE-U 위상차현미경에다이오드레이저로부터나오는레이저빔을 쪼여주었다. 스펙트럼은 Peltier 냉각장치로 1,200C 까지냉각 하면서 1024 256 픽셀의 CCD 검출기로 1,800 lines/ mm grating 에서측정하였다. 스펙트럼은 4 cm -1 스펙트럼해상 도로측정하였고, OriginPro 2015 software 를이용하여기 준선을보정하였다. 시료의라만분광측정치는각각세번씩 측정하여평균값으로제시하였다. 8. Oxygenated Hemoglobin(O-Hb) 의상대적 크기관찰 생쥐와인간유래 RBC 에상기한바와같이 3 종당귀시료를 30 분간처리한후, 라만분광기의 1,124 cm -1 파장에서스펙 트럼을얻고각당귀시료별로산소화헤모글로빈 (O-Hb) 의 상대적크기를구하였다. 또한, 과산화수소 (H 2O 2) 로산화적 스트레스를가하여각당귀뿌리추출물과함께배양시킨후 O-Hb 의상대적크기를구하였다. 9. Decursinol 농도측정및 AChE 농도환산 생쥐와인간유래 RBC 에상기한바와같이 3 종당귀시료를 30 분간처리한후, decursinol 의라만스펙트럼피크인 1,620 과 1,718 cm -1 의크기변화로부터 decursinol 의농도를측정 하였다. AChE 의농도는 532 nm광원을이용하였을때나타 나는광여기 (photo-excitation) 현상을관찰하여구하였으며, 1,620 과 1,718 cm -1 위치의라만스펙트럼피크의크기를측정 하여환산하였다. 10. 통계처리 연구로부터얻어진결과는 SPSS (Chicago, IL, USA) 프 로그램을이용하여처리되었으며 One way ANOVA 로유의 성을검정하였다. Ⅲ. 결과 1. 참당귀, 중국당귀및일당귀의 decursin 계열 성분에대한분석결과 참당귀의 decursin 의함량이 2449.3 μg 10-3 /g 로중국 당귀와일당귀에비해높게나타났다. Decursinol 의함량은 1876.5 μg 1 0-3 /g, decursinol angelate 는 1230.2 μg 10-3 /g 의함량을보였다. 중국당귀에서 decursin 의함량은 38.2 μg 10-3 /g, decursinol 의함량은 46.9 μg 10-3 /g 로 참당귀에비해낮게나타났다. 일당귀에서 decursin 의함량은 29.7 μg 10-3 /g, decursinol angelate 의함량은 37.5 μg 10-3 /g 로역시참당귀에비해낮게나타났다 (Table 1). Table 1. Chemical Components of decursin, decursinol, and decursinol angelate in the extracts of Angelica gigas, A. sinensis and A. acutiloba roots ( μg 10-3 /g: ppt) Chemical component A. gigas A. sinensis A. acutiloba Decursin 2449.3 38.2 29.7 Decursinol 1876.5 46.9 - Decursinol angelate 1230.2-37.5 2. 참당귀, 중국당귀및일당귀의헤모글로빈활 성도라만스펙트럼 헤모글로빈이각당귀뿌리추출물존재하에서활성산소 (reactive oxygen species, ROS) 와반응하여산소화헤모글 로빈 (O-Hb) 을형성하는과정을라만분광기로측정하였다. 당귀추출물시료를가한헤모글로빈분자를 532 nm레이저 빔으로여기 (excitation) 시켰을때산소와결합한포르피린 (porphyrin) 분자구조인 oxygenated hemoglobin(o-hb) 의 진동은 1642, 1607, 1590, 1378, 1248, 1124, 756 cm -1 파 장의라만스펙트럼에서관측되었다. 헤모글로빈만측정했을 때는 1638, 1605, 1585 와 1360 cm -1 에서피크가관측되었다. 헤모글로빈의테트라피롤 (Tetrapyrrole) 포르피린의라만스 펙트럼을 Fig. 1 에표시하였다 (Fig. 1).
4 大韓本草學會誌 Vol. 35 No. 4, 2020 Fig. 1. Raman spectra of hemoglobin and oxygenated hemoglobin in human blood before and after treatment of the extract of Angelica gigas roots. O-Hb, oxygenated hemoglobin; Hb, hemoglobin; a.u., arbitrary unit. 3. 3 종당귀가헤모글로빈의산소결합력에대한 상대적강도에미치는영향 본연구에서는 1124 cm -1 피크의상대적크기로참당귀, 중 국당귀및일당귀뿌리추출물의각시료에반응하는 O-Hb 활성을측정하였다. 3 종당귀가산소와 Hb 결합의상대적강 도에미치는영향을살펴본결과, 참당귀가다른두종의당 귀에비해 Hb 와산소의결합을강화시키는것으로나타났다. 과산화수소를이용하여산화적스트레스를유발한경우에도 참당귀가다른두종의당귀에비해우수한산소결합력을유 지하였다. 이러한경향은생쥐의혈액과인간의 RBC 에서유 사하게나타났다 (Table 2). Fig. 2. Raman spectra of decursinol 3 종당귀가혈중 decursinol 함량에미치는영향을살펴본 결과, 참당귀가다른두종의당귀에비해더높은혈중 decursinol 함량을보였다. 이는산화적스트레스환경에서도 마찬가지였으며, 생쥐의혈액과인간의 RBC 를이용한연구 에서도유사한경향을보였다 (Table 3). Table 3. Blood decursinol concentration with or without oxidative stress (mmol/ dl ) Mouse Human A. gigas A. sinensis A. acutiloba without H 2O 2 18.7 9.36 6.28 with H 2O 2 4.92 2.05 0.348 without H 2O 2 19.3 15.3 4.29 with H 2O 2 6.20 2.04 0.092 Blood decursinol concentration is shown as the average value of the peaks. Table 2. Oxygenated hemoglobin intensity with or without oxidative stress Mouse Human A. gigas A. sinensis A. acutiloba without H 2O 2 0.284 0.191 0.197 with H 2O 2 0.0182 0.0093 N.D. without H 2O 2 0.381 0.182 0.023 with H 2O 2 0.0196 0.0127 N.D. Oxygenated hemoglobin intensity is shown as the average value of the relative size of the peak. N.D., not detected. 4. 3 종당귀가혈중 decursinol 함량에미치는 영향 혈중당귀추출물농도를알아보기위하여당귀에포함된 decursin 이대사과정에서생성되는대표적인생리활성화합 물인 decursinol 을라만분광법으로측정하였다. 당귀추출물중 decursinol 의라만스펙트럼피크는 1,620 과 1,718 cm -1 에서 크게나타났다 (Fig. 2). 5. 혈액내 AChE 농도에미치는영향 3 종당귀가혈중 AChE 함량에미치는영향을살펴본결과, 참당귀가다른두종의당귀에비해더높은혈중 AChE 함량을 보였다. 이는산화적스트레스환경에서도마찬가지였으며, 생쥐의혈액과인간의 RBC 를이용한연구에서도유사한경향을 보였다 (Table 4). Table 4. Blood AChE concentration with or without oxidative stress (mmol/ dl ) Mouse Human A. gigas A. sinensis A. acutiloba without H 2O 2 5.78 2.06 1.82 with H 2O 2 1.04 0.023 N.D. without H 2O 2 9.26 4.35 2.62 with H 2O 2 3.19 2.06 0.073 Blood AChE concentration is shown as the average value of the peaks. AChE, acetylcholinestrase; N.D., not detected.
참당귀, 중국당귀, 일당귀의헤모글로빈활성도비교 5 Ⅳ. 고찰 中華本草 에는참당귀와중국당귀, 일당귀를각각朝鮮當歸, 當歸, 東當歸라는명칭으로수재하고있다. 저서의내용에따르면참당귀는祛風通絡, 活血止痛의효능으로風濕痺痛, 跌打腫痛등의증상을치료하고, 중국당귀는補血, 活血, 調經止痛, 潤燥滑腸의효능으로血虛諸證, 月經不調, 經閉, 痛經, 癥瘕結聚, 崩漏, 虛寒腹痛, 痿痺, 肌膚麻木, 腸燥便難, 赤痢後重, 癰疽瘡瘍, 跌打損傷등의증상을치료하며, 일당귀는중국당귀와효능과적응증이비슷하다 13). 이렇듯 3종당귀의효능을祛風通絡과補血의개념으로대별하고참당귀는祛風通絡의효능위주로, 중국당귀와일당귀는補血위주의효능을위주로기술하고있다. 東醫寶鑑 의다양한治血용어도補血, 調血, 活血, 破血 ( 袪瘀血 ) 로대별할수있을것이며, 현재활용되고있는혈과관련된동물모델의가장대표적인것은血虛모델과瘀血모델이다. 血虛동물모델로대표적인것으로失血모델과혈액세포계항암제를이용한모델이있다. 전등은실혈동물모델에서의활성산소및항산화력에미치는영향을연구하여발표한바있으며, 피부특성을포함한일반적특성에대한영향을제시한바있다 14,15). 김등은참당귀가포함된當歸補血湯이실혈로유발된흰쥐의 RBC count와 Hematocrit의수치를유의한수준으로개선하였음을발표한바있다 16). 최근에는瘀血에관한다양한연구가시도되어순환장애에의하여유발되는貧血, 鬱血, 血栓, 水腫등과염증으로인한조직의삼출, 변성, 괴사, 위축혹증식, 대사장애로일어나는조직의반응등을어혈의병태와유사하다고판단하고있다 17). 현재 endotoxin을이용한어혈병태모델이가장많이이용되고있으며, 이외에도 hydrocorisone acetate나 dextran을이용한고점도혈증모형, 타박을이용한외상모형등이활용되고있다 17). 송등은和血活血의기능을비교하기위해 hydrocorisone acetate을이용한고점도혈증어혈병태모델에서 3종당귀의효능을비교분석하여 3종당귀중에서참당귀가약간더우수한것으로판단하고있다 9). RBC는혈액의혈구세포중가장많은수를차지하고있으며고도의산소보유능력을가진헤모글로빈 (Hb) 을포함하고있다. 헤모글로빈은폐로부터산소를공급받아산소-헤모글로빈의형태로결합한후신체각부위의조직으로이동한후이러한조직들에산소를공급하는데중요한역할을한다 18). 헤모글로빈의산소화상태는또한, 헤모글로빈과막단백질간의상호작용, 효소활동과세포내이온농도를포함한중요한 RBC의특성에영향을끼친다 19). RBC의형태에따라산소- 헤모글로빈의친화도는달라질수있으며이는 RBC의형태가그기능에영향을미칠수있음을나타낸다. 이러한 RBC의기능을관찰하는데라만스펙트로스코피분석법이효율적으로활용될수있다 20). 최근 Bin 등이중약또는중성약이심혈관질환개선, 뇌신경보호, 항염증작용등을나타내는기전중에헤모글로빈과산소의결합에관여하는단백질인 heme oxygenase 1(HO-1) 이주요하게작용한다는연구결과를발표한바있다 21). 이는헤모글로빈과산소의결합능이다양한질환의개선에활용될수있음을시사한다. Decursin은 AchE의활성화를촉진시켜혈액의산소공급능력을증대시켜주는화합물이다 19). AChE는헤모글로빈의 Fe 2+ 이온농도를유지하기위해아세틸콜린을분해하여콜린 (Choline) 이되게하며, RBC 노화시 RBC 박막재형성에관여한다. 최근연구에서건강한사람의혈액내의 AChE 효소작용이활성화되어있음이보고된바있다 8). 당귀중에포함된 decursin은인체내간미소체대사과정을통하여 O-Hb를활성화시켜주는 decursinol 로변한다. Decursinol 과 decursinol angelate는 O-Hb를활성화시키는데관여한다. 본연구에서참당귀의 decursin 함량은 2449.3 μg 10-3 /g로중국당귀와일당귀보다높았다. Decursinol의함량은 1876.5 μg 10-3 /g이며, decursinol angelate는 1230.2 μg 10-3 /g로이역시중국당귀와일당귀에비해높다 (Table 1). 이는 decursin 및이와관련한화합물의함량이높은참당귀가헤모글로빈과산소의결합력강화에중국당귀나일당귀보다더많은영향력이있음을시사한다. 본연구에서는생쥐를이용한 in vivo연구와사람유래의 RBC를이용한 in vitro 연구의두가지방법을이용하였다. 생쥐에는 3종당귀추출물 3% 시료를 10 μl /g 농도로주사하였다. 이는추출물을기준으로대략 0.3 g/ kg분량에해당한다. 천연물추출물과같이복합성분을희석하여낮은농도로처리할때는평균몰농도를사용할수있다. 평균몰농도는평균몰질량 (Average Molar Mass) 과용매의양으로계산할수있는데평균몰질량은 Molecular ACCess System key fingerprint (MACCS) 나본연구에서사용한 NC-MFP 등의프로그램에분석된성분의종류와함량을입력함으로써계산이가능하다. 본연구에서 RBC를이용한시험관내연구에최종농도 3 μm을사용하였는데이는대략적으로 0.5 μg / ml에해당한다. 저자들은다양한농도를이용한예비연구를통하여 0.5 μg / ml농도가최적의스펙트럼을보여주는농도임을확인하였다 (data not shown). 또한, H 2O 2 의적정처리시간을정하기위하여투여시간을달리하며예비시험을시행한결과 30분투여군에서최적스펙트럼을보여주었다 (data not shown). Fig. 1에서보는바와같이 Hb의피크는헤모글로빈이산소종과결합하면장파장쪽으로이동하여나타난다. Hb의피크, 1585 cm -1 는 O-Hb에서 1590 cm -1 로 5 cm -1 정도이동하고있으며피크 1605 cm -1 는 O-Hb에서 1607 cm -1 로 2 cm -1 정도이동하였다. 또한피크 1638 cm -1 는 O-Hb에서 1642 cm -1 로 4 cm -1 정도이동하였고, 피크 1360 cm -1 는 O-Hb에서 1378 cm -1 로 18 cm -1 정도이동하였다. William 등의연구 22,23) 에의하면헤모글로빈에산소종이결합하면라만스펙트럼상에서헤모글로빈에결합한산소종의진동에의하여스펙트럼피크는파장이큰방향으로이동한다고하였다. Fig.1의 O-Hb의라만스펙트럼은헤모글로빈분자에산소가결합하여산소종과헤모글로빈분자의진동이장파장쪽으로이동하였음을잘설명해준다. Thomas 등 24) 의연구결과에서도글루코스가헤모글로빈과결합하여나타내는라만스펙트럼피크가같은경향으로변화하고있다. 본연구의결과에서헤모글로빈에산소가결합하여나타나는 O-Hb의진동은 1642, 1607, 1590, 1378, 1248, 1124와 756 cm -1 파장의스펙트럼띠에서났는데, 이러한결과는 Hidetosh 등의결과 25,26) 와일치한다.
6 大韓本草學會誌 Vol. 35 No. 4, 2020 생쥐혈액의라만스펙트럼에서 O-Hb 의피크상대적크기는 참당귀추출물은 0.284 로중국당귀나일당귀추출물보다약 1.44 ~ 1.49 ± 0.04 배가량많았고, 인간의 RBC 를이용한 연구의라만스펙트럼에서는 0.381 로나타나중국당귀나일당 귀에비해약 2.1 ~ 16.6 ± 0.06 배가량많다 (Table 2). 이는참당귀뿌리추출물을투여한경우중국당귀와일당귀 보다헤모글로빈의산소결합능력이커졌음을보여준다. 이는 3 종당귀의 decursin 계열성분분석을통하여예측한결과 (Table 1) 와일치한다. RBC 는 superoxide dismutase(sod) 등의효소를가지고있어강력한산화적스트레스제거활성을 가지고있다. 또한, 당귀를포함한많은한약재들이항산화 효과를가지는성분을함유하거나직접적으로항산화작용을 하는것으로있다. 따라서, 산화적스트레스환경에서헤모글 로빈의산소결합력차이여부를살펴볼필요가있다. 본연구의 결과를살펴보면, H 2O 2 가존재하는환경내에서모든실험군의 산소결합능력이크게감소하였음을알수있다. 이는당귀 자체혹은당귀의항산화효과를가진성분이 20 μm의 H 2O 2 에서발생하는산화적스트레스가헤모글로빈의산소결합능 력을감소시키는것에대하여특별한억제효과를발휘하지 못한다는것을시사한다. 천연물과한약의많은활성성분들이생체내에서대사되어 구조가바뀐다. 또한, 일부성분들은대사되어사라지게된다. 그런이유로표적장기에도달하는대사체의종류와양은효 능에직접적인영향을미칠수있다. 본연구에서는 decursin 의 대사체인 decursinol 의혈중함량을관찰하였다. 당귀추출물중 decursinol 의라만스펙트럼피크는 1,620 과 1,718 cm -1 에서크게나타났다. 이두개의피크는 decursinol 분자에있는 카르보닐기 (-C=O) 의진동에의한것임을알수있다 (Fig. 2). 3 종당귀추출물을투여한후 decursinol 혈중함량을비 교한결과생쥐혈액내 decursinol 의농도는참당귀, 추출물 에서 18.7 mmol/ dl로다른당귀에비해 2.0 ~ 3.0 ± 0.03 배 가량큰농도를보였으며, 인간의 RBC 를이용한연구에서는 19.3 mmol/ dl로중국당귀에비해 1.26 ± 0.07 배많고일 당귀에비해 4.5 배가량많았다 (Table 3). 이는참당귀에함 유된 decursin 과 decursinol 이생체내에서대사되어사라지지 않고, 일정기간혈중에존재함으로써표적장기에도달할수 있음을시사한다. 산화적스트레스환경에서는모든군에서 decursinol 농도가 떨어졌다. 생쥐의혈액에서참당귀의 decursinol 함량은 4.92 mmol/ dl로약 26.3% 수준으로감소했으며, 중국당귀는 21.9%, 일당귀는 5.5% 로나타났다. 인간의 RBC 를이용한연구에서는 참당귀, 중국당귀, 일당귀가각각 32.1%, 13.3%, 2.1% 수준을 보여약간의차이를보였다 (Table 3). 이는사람의 RBC 를 이용한결과에서참당귀를투여한경우산화적스트레스에의해 감소되는대사활성을억제한것처럼보이며, 생쥐혈액의결 과와상이하다. 이러한결과는사람의항산화효소체계에영 향을미칠가능성으로해석될수있으나후속연구를통하여 재확인할필요가있다. 생쥐혈액내 AChE 의농도는참당귀에서 5.78 mmol/ dl로 다른당귀에비해 2.8 ~ 3.2 ± 0.06 배가량큰농도로나 타나며, 인간의 RBC 를이용한연구에서는 9.26 mmol/ dl로 중국당귀뿌리추출물에비해약 2.1 배많고일당귀뿌리추 출물에비해약 3.5 ± 0.05 배가량많다 (Table 4). 이는참당귀뿌리추출물이중국당귀, 일당귀뿌리추출물에비해헤모글로빈의산소결합능력을돕는 AChE 대사가더활발하게진행됨을뜻한다. Ⅴ. 결론 참당귀. 중국당귀, 일당귀뿌리추출물이헤모글로빈의산소분자활성화정도에미치는영향을알아보기위하여각당귀의 decursin 계열성분을분석하였고생쥐에 3종당귀추출물을투여하거나인간의 RBC에직접처리한후라만스펙트럼상에서나타나는 oxygenated hemoglobin의활성화정도와혈중 decursinol 및 acetylcholinestrase(ache) 의농도를알아보았다. 1. 성분분석결과에서 decursin 과 decursinol 및 decursinol angelate 함량은참당귀에서각각 2449.3 μg 10-3 /g, 1876.5 μg 10-3 /g, 1230.2 μg 10-3 /g로중국당귀와일당귀보다높았다. 2. 생쥐와인간의 RBC 모두에서헤모글로빈의산소결합력은참당귀에서다른두종의당귀보다상대적으로크게나타났다. 3. 생쥐와인간의 RBC 모두에서 decursin의유도체인 decursinol 의함량은참당귀에서다른두종의당귀보다높았다. 4. 생쥐와인간의 RBC 모두에서 acetylcholinestrase (AChE) 함량은참당귀에서다른두종의당귀보다높았다. 이상의결과로부터참당귀는중국당귀나일당귀에비해적혈구의산소결핍으로인한질환, 산화스트레스에의한적혈구변형에따른질환등을치료하는데더효과적일것으로짐작할수있다. 감사의글 이논문은부산대학교기본연구지원사업 (2년) 에의하여연구되었음. References 1. Korea Food&Drug Administration. The Korean Herbal
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