Biomaterials Research (2008) 12(2) : 77-81 Biomaterials Research C The Korean Society for Biomaterials Poly(lactic-co-glycolic acid) 와 Hydroxyapatite 복합재료지지체의연골세포적합성연구 (II) The Effect of Poly(lactic-co-glycolic acid)/hydroxyapatite Composite Scaffold on Chondrocyte Cyto-compatibility (II) 이선호 1 서혁진 2 최재봉 2 박종철 3 김정구 1, * SunHo Lee 1, HyokJin Seo 2, Jae Bong Choi 2, Jong-Chul Park 3, and Jeong Koo Kim 1, * 1 인제대학교의용공학과, 2 한성대학교기계시스템공학과, 3 연세대학교의과대학의학공학교실 1 Department of Biomedical Engineering, Inje University, Gimhae, Korea 2 Department Mechanical Systems Eng., Hansung University, Seoul, Korea 3 Department of Medical Engineering, Yonsei University, Seoul, Korea (Received May 6, 2008/Accepted May 15, 2008) The effect of PLGA/HA composite material on cellular adhesion and proliferation was investigated. The composite film was prepared by poly(d,l-lactic-co-glycolic acid) (PLGA) and hydroxyapatite (HA). The PLGA was used as matrix material and the HA particles were incorporated as reinforcing material. The HA particles were mixed in 5, 10 and 15 wt% with PLGA for preparing PLGA/HA composite film and scaffold. Mechanical property of the composite film was characterized by tensile test. The ultimate tensile strength of 10 wt% HA content film was two-fold higher than control group. Surface of the composite films and scaffolds were characterized by contact angle measurement and scanning electron microscope (SEM). The PLGA/HA composites were more hydrophilic than control group. The SEM picture showed that the pores in the PLGA/HA composite scaffold were clearly observed as the pores in the PLGA scaffold (control). For the PLGA/HA composite scaffold, compression test was performed. The compressive stress was decreased with increasing the amount of HA. This is the same phenomenon as the tensile test for composite film. For cell-compatibility, cellular attachment and proliferation were significantly higher on PLGA/HA (10 wt%) composite film than control group (1.5 times higher in attachment test and 1.3 times higher for 6 th -day culture in proliferation assaying, p<0.05). However, the PLGA/HA (10wt%) composite scaffold showed not as good result as the film has. For 3-D scaffold structure, it is presumed that other geometrical factors may important role in cellular adhesion and proliferation. Key words: PLGA, Tissue engineering, Hydroxyapatite, Composite, Chondrocyte 인 서 체의관절부분에존재하는연골은혈관이존재하지않고, 연골세포한종류의세포로만구성되어있다. 연골은재생이어려우며재생이된다고해도재생되는데걸리는시간이매우길다. 현재까지관절연골의치료에사용되는치료법들중에만족할만큼의치료효과를주고있는것은거의없는것으로알려졌다. 1) 현재관절연골치료로사용되고있는치료법들로는관절전체를인공관절로대체하거나또는관절의연골을모두제거하고인공연골로대체하는방법을사용하고있으며이러한방법들은관절운동에제한적이고많은부작용을초래한다. 이러한문제점을해결하기위해조직공학적조직재생을유도하여그문제점을해결하려는노력이많이시도되고있다. 조직공학은질병이나사고, 또는노화로인해퇴화되고 * 책임연락저자 : jkkim@inje.ac.kr 론 손실된조직을살아있는생물학적또는생리학적대체물을이용하여그질병을치료하는데목적이있다. 이러한연골재생을위해현재세포와지지체를이용하는조직공학적방법을통해손상된연골조직재생을유도하는시도가 in vivo/vitro 방법으로행해지고있다. 1-3) 합성고분자중에서, poly(lactic acid), poly(glycolic acid), poly(ε-caprolactone), 그리고이들의공중합체가뛰어난생분해성과생체적합성으로인해많이사용되어지고있다. 하지만고분자가가지는약한물리적강도, brittleness로인해뼈나연골재생에는매우제한적이다. 현재바이오세라믹을도입한고분자 / 바이오세라믹복합지지체가널리연구되어지고있다. 생체재료로사용되어지고있는바이오세라믹중하이드록시아파타이트는 (Hydroxyapatite, HA, Ca 5 (PO 4 ) 3 OH, Ca/P: 1.67) 화학적으로골과하드티슈의미네랄성분과유사하며, 생체내에서무독성이다. 이러한이유로, 생체적합성이뛰어나며생분해도가조절이가능한 poly(lactic acid-co-glycolic 77
78 이선호 서혁진 최재봉 박종철 김정구 acid) (PLGA) 와우수한생체적합성을가지는 HA의복합지지체는생체적합성뿐만아니라물리적강도또한향상시킬수있다. 현재, 많은연구자들이 PLGA/HA 복합지지체의특성과세포와의상호반응에대하여연구하고있다. 4,6,14,15) 또한, 재료를이용하여생체적합성을높이는방법이외에지지체의구조의이점으로인해세포점착을유도하여생체적합성을높이는방법도연구하고있다. 4-7) 따라서, 본연구에서는생분해성고분자중의하나인 PLGA 와바이오세라믹인 HA를복합재료화하여기계적강도를향상시키고, 연골세포의점착및증식에미치는영향을조사하고, 관절연골의재생에필요한 PLGA/HA 복합지지체에가장적절한 HA의비율을찾고자한다. 재료및방법 재료및시약준비 Poly(lactide-co-glycolic acid) (PLGA) 는 Lakeshore-Biomaterials (Brookwood Pharmaceuticals, Inc. U.S.A.) 에서구입하였다. Hydroxyapatite (HA) 는 Sigma-Aldrich 에서구입하였으며, 10~ 100 um 크기의파우더를섞어복합재를준비하였다. Chloroform 은 Dusan Pure Chemical. Co. LTD 에서구입하였다. PLGA/HA 복합필름제작 PLGA/HA 복합필름은 solvent-casting 방식으로제작하였다. PLGA 3 g 을 Chloroform 15 ml 에완전히녹인후, 이용액에 HA 파우더를각각 5, 10, 15 wt% 비율로넣어균일하게분포되도록 1 시간동안교반시킨다. 이 PLGA/HA 용액을 10 11 cm 크기의몰드에부어수평을유지한상태로상온에서 24 시간동안건조시킨뒤다시진공냉동건조기에넣어 48 시간동안잔류용매를완전히제거하였다. 완전히건조시킨필름은 1cm 1cm 의크기로잘라실험을진행하였다. HA 코팅의여부는 FE-SEM(HITACHI S-4300DSE., Japan) 으로확인하였다. PLGA/HA 복합지지체제작 PLGA/HA 복합재지지체는 salt-leaching 방법으로제작을하였다. PLGA 와 NaCl 은 1:15 의무게비로섞어주었으며, NaCl 은크기가 300~355 µm 의범위를가지는 micro sieve 에걸러서크기를결정하였다. 먼저 PLGA 를 chloroform 에녹인후무게비율에맞게 HA 를 PLGA 용액에넣어균일하게교반시킨다. 그런다음, NaCl 과미리녹여놓은 PLGA/HA 현탁액에넣은다음테플론몰드에부어상온에서압축봉을이용하여압축을가하는방법으로제작하였다. 또한, 표면에생기는고분자피막을방지하기위하여 2 단계에걸쳐서압축을가해주었다. 테플론몰드에서 5 시간정도건조시킨뒤, NaCl 제거를위해증류수에담가 48 시간동안녹여내었다. 6 시간간격으로증류수는교환하였다. 그런다음지지체를상온에서 12 시간, 동결건조기에넣어 24 시간동안건조시켰다. PLGA/ HA 복합재지지체는 HA 의함량을 5 wt%. 10 wt%, 그리고 15 wt% 로시편을준비하였다. PLGA/HA 복합필름의표면접촉각측정 PLGA/HA 복합재필름의표면친수성을알아보기위하여 contact angle analyzer (Phoenix 150) 를이용하여측정하였다. 제작된필름을각각그룹별로 n 수를 6 으로하여 sessile drop 방법으로접촉각을측정한뒤평균값으로그차이를비교하였다. 인장및압축실험을통한강도테스트인장테스트와압축테스트를이용하여 PLGA/HA 복합필름과다공성지지체의기계적강도를분석하였다. 시편의단축방향의 stress-strain 값은 Micro-Load System (R & B INC., Korea) 를이용하여측정하였다. 준비된 film 은헤드속도 2 mm/min, 5 kgf 로드셀을이용하여인장테스트를실시하였고, 다공성지지체는헤드속도 0.5 mm/min, 5 kgf 로드셀을각각이용하여압축테스트를실시하였다. 9) 필름의각시편크기는 15 mm 10 mm, 두께는 0.12 ± 0.02 mm (n=5) 이며, PLGA/HA 복합지지체는 5.5(±0.3) 5.5(±0.2) 5.5(±0.23) mm 의크기로제작하였으며, 인장은시편이완전히끊어질때까지, 압축은압축방향의 60% 변형률까지실험을진행하였다. 7) 연골세포의분리와배양연골은돼지의다리무릎관절에서추출하여 collagenase type II 을이용한효소분해법으로연골세포를추출하였다. 연골을 0.5 0.5 0.2 mm 의크기로잘라 0.2% collagenase type II (GIBCO) 용액에넣어 14 시간동안용해시켰다. 용해된연골 collagenase 용액을 70 m nylon sieve (cell strainer, Falcon) 에걸러 1000 rpm 에서 5 분동안원심분리하여연골세포를추출하였다. 추출한연골세포는 Hank's balanced salt solution (HBSS) 으로 2~3 번세척하여잔류해있는 collagenase type II 용액을제거한뒤 2.0 10 4 /cm 2 의밀도로 120 mg/l penicillin 와 200 mg/l streptomycin 을첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Sigma) 배지에넣어 37 o C, 5% CO 2 의조건하에배양하였다. 배지는매 3 일마다교환 하여주었다. 10,11) Immunohistochemistry (IHC) 테스트연골세포의 ECM 단백질의주구성성분인 type II collagen 을분석하기위해 Immunohistochemistry (IHC) 를통하여확인하였다. 플라스크에서단층으로 in vitro 로성장증식하게되는연골세포가 fibroblast 화되었는지를 type II collagen 를염색하여확인하였다. 염색에사용한세포는세포실험에사용할 2~3 번 passage 세포와 control 로사용할 4 번 passage 세포를사용하였다. 각각 antibody 를사용하지않고염색한것을 negative control 로하여비교하였다. IHC 를위해 Biomaterials Research 2008
Poly(lactic-co-glycolic acid) 와 Hydroxyapatite 복합재료지지체의연골세포적합성연구 (II) 79 Anti-Human collagen type II (MP Biomedicals, LLC, USA) 와 Dako Real Envision Detection System (Dako, Denmark) 를사용하였다. 12,13) 세포점착및증식테스트세포의점착및증식에관한연구는각각다른시간간격동안테스트를시행하였다. 세포실험을위해필름시편을 ϕ = 12 mm의크기로준비하고, 지지체시편은 ϕ =7 mm, 높이 =3mm의크기로제작하였다. 각각의시편을 24-well plates (Falcon) 에넣은다음, PBS 용액으로 3번세척하였다. 그리고점착테스트에서는 2-3번분주한연골세포를 1.3 10 5 cells/ film, 2.0 10 4 cells/scaffold(plga/ha) 의밀도로각시편에 seeding 하였고. 시편은 4시간동안 37 o C and 5% CO 2 에서배양한뒤, 배지를첨가하고 4시간더배양을하였다. 그뒤, 시편에점착된세포의수를측정하기위해 Cell Counting Kit (CCK-8, Dogindo Lab, Kumamoto, Japan) 를사용하였다. 10 µl의 CCK-8 용액을각시편위에넣은뒤 4시간동안용액과살아있는세포가반응하도록놓아둔다. 세포와반응한용액은분홍색에서오렌지색으로변하게되며이렇게변화한용액을 96 well plate에옮겨담아 450 nm에서 micro-plate reader (synergy HT, BIO-TEK) 를이용하여흡광도를측정하여시편에점착된세포의수를간접적으로계산하여구하였다. 세포증식실험에서는 1.3 10 4 cells/film, 1.3 10 4 cells/ scaffold (PLGA/HA) 의밀도로각시편에연골세포를 seeding하였다. 증식된세포는각각 1, 3, 6일에측정하였다. 결과및고찰 PLGA/HA 복합필름및지지체특성분석 PLGA 와 PLGA/HA 복합필름의표면의접촉각을측정하였다. 측정한결과는 Table 1 에요약하였다. HA 를섞은복합필름의접촉각이 PLGA (72±2.8 o ) 에비하여감소 (PH5 = 62±4.1, PH10=61±2.1, PH15=62±1.5) 하는경향을보였다 (p<0.05). 소수성이강한 PLGA 의표면성질이상대적으로친수성인 HA 에의해친수화된것으로보인다. PLGA/HA 복합필름간의유의성차이는보이지않았다. 인장및압축실험을통한 PLGA/HA 필름과복합지지체특성분석 PLGA 와 PLGA/HA 복합필름의인장시험결과는 Table 1 에나타내었다. HA 의함유량이증가할수록 tensile strength 가 Table 2. Physical properties of PLGA/HA composite scaffolds (n=5) Compressive Stress (MPa) Young's Modulus (MPa) PLGA (P) 0.410±0.02 0.48±0.05 PLGA/5% (PH5) 1.560±0.15 3.35±0.21 PLGA/10% (PH10) 1.984±0.74 2.97±0.26 PLGA/15% (PH15) 0.440±0.12 3.46±1.49 증가하다가 15 wt% 유한시편그룹에서는오히려감소하였다. 이는복합재료이론에서강화하는 particle 의양이최적선을넘어서서오히려강도가약해진것으로판단된다. 결과를보면 10 wt% 의 HA 함유량이복합재료에서강도가증가하는 mixing point 에가까운값이라고사료된다. Table 2 에는복합지지체의압축시험결과를나타내었다. 지지체도필름과비슷한경향을보이고있지만, 그룹별값이거의비슷한값을나타내었다. 복합지지체의기계적성질은재료자체의물성에영향을받지만, 다공성구조를가지고있기때문에재료의구조적성질에의해많은영향을받기때문에, 비슷한크기의기공과 porosity 를가지고있기때문에기계적성질이비슷한값을나타낸것이라사료된다. 그러나, 10 wt% HA 함유된복합재지지체가가장강도가높은값을나타내었다. FE-SEM 통한필름과지지체의표면및단면의형태학적분석 SEM 촬영을통해필름과지지체의표면과단면을관찰하였다. Figure 1 의 (a) 와 (b) 는필름의대표적인표면을보여주고있다. 전체적으로 PH5 와 PH10 그룹에서는 HA 가균일하게분포된것을확인하였는데, PH15 그룹에서는 HA 가뭉쳐 clot 을형성하고있으며 (Figure 1(b)), clot 안을확대한사진에서는가는 crack 이발견되기도하였다. 지지체의표면 (Figure 1) 과단면촬영결과 P, PH5, PH10 세그룹간의뚜렷한차이는발견되지않았으며, 세그룹모두 pore 의모양이 NaCl 결정모양으로잘유지되었음을확인하였다. 세포점착및증식테스트세포점착및증식테스트를하기위해 2-3 분주한연골세포를사용하였다. IHC 테스트결과 4 번째분주한연골세포에서는 type II collagen 을발견할수없었고, 3 번째분주한연골세포까지 phenotype 을유지하는것을관찰했다 (Figure 2). Table 1. Physical properties of PLGA/HA composite film (n=5) Contact angle Ultimate tensile Strength (MPa) Ultimate tensile strain Stiffness (MPa) PLGA (P) 68 1.89±0.40 6.25±0.52 02.60±0.38 PLGA/5% (PH5) 61.750±4.06 3.40±0.30 4.91±0.16 12.26±2.38 PLGA/10% (PH10) 58.125±2.10 3.90±0.37 4.50±0.87 16.56±5.96 PLGA/15% (PH15) 56000.±1.51 1.77±0.10 3.69±0.39 06.46±1.49 Vol. 12, No. 2
이선호 서혁진 최재봉 박종철 김정구 80 Figure 3. Effect of PLGA/HA composite on chondrocyte attachment (1.3 10 cells/film) (a), and proliferation (1.3 10 cells/film) (b) (*p<0.05). 5 Figure 1. SEM image PLGA/HA composite films and scaffolds : (a) PLGA 10 wt% film, (b) PLGA/HA 15 wt% film, (c) PLGA/HA composite scaffold, (d) PLGA/HA 5 wt% composite scaffold, (e) PLGA/HA 10 wt% composite scaffold (f) PLGA/HA 15 wt% composite scaffold. PLGA/HA 복합재 필름에서의 연골세포의 점착 및 증식은 Figure 3에 나타난 바와 같이 PLGA/HA 복합재군에서 HA 10 wt% (PH10) 군이 대조군 보다는 약 1.5배 더 많은 세포 4 가 점착 되었다(p<0.05). 세포 증식테스트에서는 6일째 배양 했을때, PH10 군이 대조군보다 약 1.3배 높은 증식율을 나타 내었다. 그러나, PH5군 및 PH15군에서는, 세포점착은 대조군 에 비해 조금씩 증가한 양상을 보였으나, 세포 증식 테스트에 서는 대조군보다 감소하거나 비슷한 양상을 보였다. 고분자 재 료의 matrix 필름에 적절한 양의 HA의 혼합은 연골세포의 점 착 및 증식의 향상을 보였다. 그러나, HA 15 wt% 이상에서 는 HA가 필름의 변성을 초래해서 세포의 점착이나 증식에 손 상을 주었던 것으로 사료된다. 필름 형태의 시편에서는, 혼합 된 HA의 양이 연골세포의 점착이나, 증식에 영향를 미친다고 생각된다. 지지체군 에서는 Figure 4에서와 같이 PH10군이 다른 지지 체군에 비해 점착도가 다소 떨어지는 것을 알 수 있었다. 이는 Figure 2. Immunohistochemistry of chondrocyte, collagen type II: 3 passage of chondrocyte (a), 4 passage of chondrocyte (b) and negative control 3 (c) and 4 (d) (non-antibody treatment) rd rd th Biomaterials Research 2008 th
Poly(lactic-co-glycolic acid) 와 Hydroxyapatite 복합재료지지체의연골세포적합성연구 (II) 81 참고문헌 Figure 4. Effect of hydroxyapatite on chondrocyte attachment (2.0 10 4 cells/scaffold) (a), and proliferation (1.3 10 4 cells/scaffold) of (b) (*p<0.05) 서의구조적성질에도의존한다는것을알수있었다. 지지체군에서는, PLGA/HA 복합재로준비된모든시편이배양 3 일, 배양 6 일모두감소된결과를보였다. 이는 HA 의세포에대한화학적효과보다는지지체의구조적성질이세포의증식에큰영향을미친다고생각된다. 결 본연구에서는, 생분해성고분자물질인 PLGA 에 HA 의첨가에의한연골세포의친화성에대해검토하였다. 필름형태의시편에서는 HA 의적절한양에따라서연골세포의점착및증식이향상되었으나, 3-D 형태의지지체구조에서는기하학적인요소에더크게영향을미치는것으로생각된다. 본실험에서, 10 wt% 의 HA 를혼합한 PLGA/HA 복합재가가장연골세포의점착과증식에유리한결과를보였다. 지지체에서는 HA 의혼합으로인한기하학적요인으로인해연골세포의점착과증식이다소감소한것으로보인다. 3-D 지지체에서 HA 를 15 wt% 이상혼합하였을경우 HA 의뭉침현상으로인하여연골세포의증식과정에서지지체의붕괴가나타났다. 이로인해세포유실이발생하여증식효과가감소한것으로사료된다. HA 의 particle size 변화및구조변화등을통하여뭉침현상을방지하여 HA 의함량을 20 wt%, 30 wt% 로증가시킨 PLGA/HA 복합체의기계적성질및세포친화성성질을더향상시킬수있을것이라생각된다. 론 감사의글 1. D. W. Hutmacher, Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage, Biomaterials, 21, 2529-2543 (2000). 2. Y. Z. Wang, D. J. Blasioli, H. J. Kim, H. S. Kim, and D. L. Kaplan, Cartilage tissue engineering with silk scaffolds and human articular chondrocytes, Biomaterials, 27, 4434-4442 (2006) 3. A. Ciorba and A. Martini, Tissue engineering and cartilage regeneration for auricular reconstruction, International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology, 70, 1507-1515 (2006). 4. C. Durucan and P. W. Brown, Low temperature formation of calcium-deficient hydroxyapatite-pla/plga composites, Journal of Biomedical Materials Research, 51, 717-725 (2000). 5. S. -S. Kim, M. S. Park, O. Jeon, and C. Y. Choi, Effects of hydroxyapatite in 3-D chitosan-gelatin polymer network on human mesenchymal stem cell construct development, Biomaterials, 27, 1859-1867 (2006). 6. C. -H. Chang, H. -C. Liu, C. -C. Lin, C. -H. Chou, and F. -H. Lin, Gelatin-chondroitin-hyaluronan tri-copolymer scaffold for cartilage tissue engineering, Biomaterials, 24, 4853-4858 (2003). 7. M. Kikuchi, Y. Suetsugu, J. Tanaka, and M. Akao, Preparation and mechanical properties of calcium phosphate/copoly-llactide composites, J. Mater. Sci. Mater. Med., 8, 361-364 (1997). 8. Chih-Hung Chang et al. Gelatin-chondroitin-hyaluronan tricopolymer scaffold for cartilage tissue engineering, Biometerials, 24, 4853-4858 (2003). 9. Sarah E. Petricca, Kacey G. Marra, Prashant N. Kumta, Acta Biomaterialia, 2, 277 (2006). 10. Chih-Hung Chang, Hwa-Chang Liu, Chien-Cheng Lin, Cheng- Hung Chou and Feng-Huei Lin. Gelatin-chondroitin-hyaluronan tri-copolymer scaffold for cartilage tissue engineering, Biometerials, 24, 4853, (2003). 11. J. J. A. Barry, H. S. Gidda, C. A. Scotchford, S. M. Howdle, Biomaterials, 25, 3559-3568, (2004). 12. H. Janice Lee, Jin-Soo Lee, Thanissara Chansakul, Christopher Yu, Jennifer H. Elisseeff, Seungju M. Yu, Biomaterials, 27, 5268-5276, (2006). 13. Horst Claassen, Joachim Hassenpflug, Michael Schnke, Walter Sierralta, Hubert Thole, and Bodo Kurz, Annals of anatomy, 183, 223-227, (2001). 14. Zhongkui Hong, Peibiao Zhang, Chaoliang He, Xueyu Qiu, Aixue Liu, Li Chen, Xuesi Chen, Xiabin Jing, Nano-composite of poly(l-lactide) and surface grafted hydroxyapatite: Mechanical properties and biocompatibility, Biomaterials, 26, 6296-6304, (2005). 15. J. B. Lee, S. G. Lee, S. M. Yoo, J. -C. Park, J. B. Choi, and J. K. Kim, Improved Attachment and Proliferation of Porcine Articular Chondrocyte onto Hydroxyapatite Incorporated Poly (Lactic-co-Glycolic acid), Biomaterials Research, 10, 196-200 (2006). This work was supported by the Korea Research Foundation Grant funded by the Korea Government (MOEHRD) (D00615). Vol. 12, No. 2