별지제 13 호서식 자체연구개발과제최종보고서 단위과제명 화장품 의약외품평가기술개발연구과제번호 12171 화의안461 연구과제명 화장품중배합금지성분분석법확립연구 책임자 소속 의료제품연구부화장품연구팀 성명 김은정 연구자 책임자김은정 15 % 연구자민충식 15 % 연구자박재현 10 % 연구자김도정 15 % 및참여율 연구자 김현주 15 % 연구자 안재형 10 % 연구에참여한모든연구자기재 연구자김상섭 10 % 연구보조원강화정 5 % 연구보조원유아름 5 % 연구보조원 % 화장품품질관리및검정등의정확하고신속한시험을위해 배합금지성분에대한선재적인분석법확립이요구됨. 연 구 필요성 및 목표 화장품관련신규유해물질의안전관리를위한모니터링과과학적인위해평가에근거한안전관리가요구됨 화장품원료중배합금지성분으로지정된성분중아직분석법이확립되지않은사프롤, 디에칠렌글라이콜의분석방법을확립하고시중유통화장품검정에활용하고자함. 또한카본블랙원료중 결방법및과결과기대성과활용계획 순도시험에대한개선방법을연구하여화장품안전관리에기여 사프롤, 디에칠렌글라이콜분석법개발 카본블랙원료중순도시험에대한방법개선 확립된시험법을통해배합금지성분함유화장품의품질관리에활용하여부정 불량화장품색출에기여 화장품중유해물질분석법가이드라인개정 ( 안 ) 마련 연구성과를바탕으로화장품유해물질검정에적용 고시및분석법가이드라인제개정에활용 연구비 ( 천원 ) 책정액 80,000 사용액 80,000 발표 ( 게재 ) 계획연보 학술지명학술대회명비고보안성유 ( ) 무 ( ) - 1 -
위와같이자체연구개발과제최종보고서를제출합니다. 2012 년 11 월 30 일 과장성명 : 김은정 ( 서명혹은인 ) 식품의약품안전청장또는식품의약품안전평가원장귀하 - 2 -
( 뒷면 ) ( 측면 ) ( 앞면 ) 주의 ( 주의내용기재 ) ( 글 14 point 고딕체 ) 화장품중배합금지성분분석법확립연구 2 0 1 2 최종보고서 12171 화의안 461 화장품중배합금지성분분석법 확립연구 Study on analysis of prohibited ingredients in cosmetics 2012. 12. 31 식품의약품안전청 의료제품연구부화장품연구팀 - 3 -
주의내용 주 의 1. 이보고서는식품의약품안전청에서시행한자체연구개발과제의최종 보고서입니다. 2. 이보고서내용을발표할때에는반드시식품의약품안전청에서시 행한자체연구개발과제의연구결과임을밝혀야합니다. 3. 국가과학기술기밀유지에필요한내용은대외적으로발표또는공개 하여서는아니됩니다. 4. 이보고서내용을신문, 방송, 참고문헌, 세미나등에인용시에는 해당주관부서또는연구책임자와사전에상의하여주시기바랍 니다. - 4 -
국문요약문 과제명 화장품중배합금지성분분석법확립연구 수행부서화장품연구팀연구책임자김은정 연구기간 2012. 1. 1-2012. 12. 31 연구비 ( 원 ) 80,000,000 성명 김은정 소속 의료제품연구부화장품연구팀 민충식 의료제품연구부화장품연구팀 박재현 의료제품연구부화장품연구팀 저자 김도정 의료제품연구부화장품연구팀 김현주 의료제품연구부화장품연구팀 안재형 의료제품연구부화장품연구팀 김상섭 의료제품연구부화장품연구팀 강화정 의료제품연구부화장품연구팀 유아름 의료제품연구부화장품연구팀 본연구는화장품중배합금지성분이지만비의도적으로혼입될수있는사프롤과 DEG에대한분석 법을마련하였다. 사프롤은화장품중주로정유성분의원료가되는 창포 / 석창포, 육두구, 세신, 정 향 ( 클로브 ) 추출물중에혼재되어화장품에잔류할가능성이있는물질로식약청은 천연에센스에 자연적으로함유되어그양이최종제품에서 100ppm 을넘지않는경우는제외 로관리하고있다. DEG는글리세린, 폴리에칠렌글리콜의유연물질로화장품에서잔류할가능성이있어 비의도적잔류 물로서 0.1% 이하인경우는제외 로관리하고있다. 화장품중사프롤, DEG 분석법을확립하기위 해 GC-MS를사용하였고, 내부표준물질은 benzyl chloride 로설정하였다. 사프롤을정량범위 0.05-0.8 ppm에서크림, 스킨, 샴푸기제를대상으로회수율을조사한결과, 회수율 92.9 ~ 127.3%, RSD 0.5 ~ 13.6% 결과를얻었다. 확립된분석법으로유통화장품 30종을분석한결과모든제품에서사프 롤은검출되지않았다. DEG은정량범위 1-15 ppm에서크림, 스킨, 샴푸기제를대상으로회수율 을조사한결과, 회수율 92.4 ~ 107.6%, RSD 0.0 2.7 ~ 10.5% 결과를얻었다. 확립된분석법으로유 통화장품을분석한결과, 56종중 2종의제품에서 DEG가기준치 (0.1% 이하 ) 이하로검출되었고, 사프롤은 30종제품에서검출되지않았다. 사프롤, DEG 분석법은우수한직선성과회수율결과를 나타내유통화장품안전관리에기여하리라사료된다. 다환방향족탄화수소 (PAHs) 는유기물의불완전 연소시부산물로발생하는물질로화장품성분인카본블랙에서도잔존할수있기때문에식약청에 서는 카본블랙규격가이드라인 순도시험항에서 PAHs 시험을수행하도록규정하고있다. 본연구 에서는 18종 PAHs에대한 GC-MS 및 HPLC-형광검출기 (anthracene 의경우 DAD 검출기사용 ) 의 분석감도를비교하였고, 흡착력이강한카본블랙에서의 PAHs 추출법을수행하였다. GC-MS 및 HPLC-형광검출기의 PAHs 검출감도를비교한결과, 대체로 HPLC-형광검출기의정량범위가 GC-MS의정량범위에비해유사하거나더좋은결과를나타냈다. 카본블랙중 PAHs 추출을여러 가지가혹한방법으로수행한결과, 공시험은물론 spike한시료에서도 PAHs가검출되지않았다. 이러한결과로미루어화장품에사용된카본블랙은통상적인사용방법, 환경등에서는쉽게용출되 지않으리라사료된다. 중심단어 배합금지성분 분석 화장품원료 - 5 -
Summary Title of Project Study on analysis of prohibited ingredients in cosmetics Institute Cosmetics Research Team Project Leader Kim Eun-Jung Project Period 2012. 1. 1-2012. 12. 31 Project Budget 80,000,000 won Name Institute K im Eun-Jung Cosmetics Research Team M in Chung-Sik Cosmetics Research Team Park Jae-Hyun Cosmetics Research Team Authors K im Dojung Cosmetics Research Team K im Hyunju Cosmetics Research Team A hn Jae-Hyun Cosmetics Research Team K im Sangseop Cosmetics Research Team K ang Hwa-Jung Cosmetics Research Team Ryu A-Rum Cosmetics Research Team The purpose of the present study is to establish analytical methods for safrole and diethylene glycol (DEG) that are classified as ' prohibited ingredients' but inevitably allowed as trace residues in finished cosmetics, accounted for 100ppm and 0.1%, respectively. Safrole is originated from sassafrus plants, spices such as cinnamon, nutmeg, black pepper and herbs like basil. DEG is traced in glyrol, polyethylene glycol, and so on. Safrole was analyzed at the range of 0.05-0.8 ppm and DEG for 1-15 ppm. For recovery test, basic matrix of cream, skin, and shampoo were utilized to spike safrole or DEG standard solution with benzyl chloride as a internal standard and were analyzed using GC-MS. As a result, the recoveries for safrole and DEG were 92.9 ~ 127.3% with RSD 0.5 ~ 13.6% and 92.4 ~ 107.6% with RSD 0.0 2.7 ~ 10.5%, respectively. Finished cosmetics were tested for safrole and DEG followed by the validated methods. DEG was detected in 2 of 56 products under the standard value (0.1%). Safrole was not detected in any products. The analytic methods for safrole and DEG would contribute improvement of quality and safety of cosmetics. Polycyclic aromatic hydrocarbons(pahs) were environmental pollutants and also occur in oil, coal, and tar deposits. Carbon black as cosmetic ingredient readily contains PAHs. I this study, 18 PAHs were tested in carbon black using GC-MS and HPLC-DAD fluorescence detector with various extraction methods such as ultrasonication and reflux. As a result, the detection sensitivity of PAHs was better in HPLC-DAD-FLD than GC-MS. However, PAHs spiked to carbon black products were not extracted by various extraction methods, which suggested that PAHs in carbon black might not be in hazard. Although these result happened, carbon black should be tested to control and assure its quality. K ey W ords Prohibited ingredients A nalysis Cosmetics ingredient - 6 -
목 차 Ⅰ. 연구개발과제연구결과 제 1 장연구개발과제의개요 제 2 장연구개발과제의국내 외연구개발현황 제 3 장연구개발과제의연구수행내용및결과 제 4 장연구개발과제의연구결과고찰및결론 제 5 장연구개발과제의목표달성도및관련분야에의기여도 제 6 장연구개발과제연구개발결과활용계획 제 7 장 참고문헌 제 8 장 첨부서류 - 7 -
연구개발과제연구결과 제1장연구개발과제의개요제1절연구개발과제의목표 화장품원료중배합금지성분으로지정된성분중아직분석법이확립되지않은디에칠렌글리콜등 3품목의정량분석방법을확립하고시중유통화장품검정에활용하고자함 제2절연구개발과제의필요성 화장품품질관리및검정등의정확하고신속한시험을위해배합금지성분에대한선재적인분석법확립이요구됨. 화장품관련신규유해물질의안전관리를위한모니터링과과학적인위해평가에근거한안전관리가요구됨 제2장연구개발과제의국내 외연구개발현황화장품은현재일상생활에없어서는안될생활필수품이되었다. 화장품은한제품에다양한성분들이포함되어있고세계각국은자국민보건향상을위해서화장품성분의안전성평가및유해성분모니터링을통한품질을확보하고있다. 최근에는유기농, 천연물을이용한화장품의개발도활발히진행되고있어합성성분이아닌천연성분에대한안전성평가및잔류가능유해성분의모니터링도필요한실정이다. 화장품의사후관리를엄격히수행하고미국이나유럽처럼, 우리나라도식약청에서화장품원료의안전성과우수한품질의화장품이유통될수있도록배합금지및배합한도성분에대한분석법및기준의선진화연구를지속적으로수행하여왔다. 배합금지로지정된성분중에는그분석법이확립되어있지않아수거검정등사후품질관리의신속대처가어려운경우가있어이성분들에대한분석법이필요한실정이다. 또한고품질의화장품을생산하기위해원료단계부터의관리가필요하므로카본블랙과같이제조과정중비의도적으로생성되는유해물질의관리가필요한원료의유해물질분석법마 - 8 -
련이필요한실정이다. 본연구는배합금지성분중사프롤, 디에칠렌글리콜 (DEG) 의신속하고신뢰성있는확인및정량법을확립하고, 또한카본블랙원료중순도시험에대한방법을개선하여화장품의안전성확립에기여하고화장품업계및관련검사기관에서의품질관리에도움을주고자계획되었다. 사프롤은무색또는미황색의정유성분으로 sassafras 식물의뿌리및열매에서주로추출되는성분으로, 계피, nutmeg, 흑후추같은다양한향신료및바질같은허브에널리존재하고있다. 사프롤은살충제인 piperonyl butoxide, 향정신성물질인 3,4-methylenedioxymethamphetaine(= 엑스타시 ) 의합성원료성분으로사용되고, 살충제, 향수, 다른화학물질의제조에사용된다. 미국정부는사프롤을 weak carcinogen ( 랫트 ) 으로분류하고있으며유럽에서도유전독성및발암성이있다고보고하고있다. 현재식약청은사프롤을 마약류관리에관한법률제2조4항및제19조제 3항관련원료물질 1군 으로관리하고있고화장품에서도배합금지로관리하고있으나, 단천연에센스에자연적으로함유되어있는사프롤의경우에는그양이최종제품에서 100ppm 을넘지않는경우에 trace 개념으로허용하고있다. 유럽이서도완제화장품에서 100 ppm 으로관리하고있고미국에서는완제화장품에대한사프롤의관리는없으나 Materials of Concern' 원료로지정되어있고북미향료협회는완제향료제품에서 0.01% 이하로제한하고있다. DEG는무색액체로글리세린, 폴리에칠렌글리콜 (PEG) 등의제조과정시부산물로서생성된다. 과거에는자연적인감미로인해의약품등에사용되었으나급성신부전, 위장장애, 마비등의부작용으로인해의약품에서의사용은금지되었고, 글리세린중유사물질로서 0.1% 이하, PEG 400 및 1500 중 0.25% 이하로관리되고있다. 화장품에서도배합금지로관리되고있으나, 단비의도적인잔류물로서 0.1% 이하인경우에는 trace 개념으로허용하고있다. 유럽에서도배합금지로관리되고있으나, 유럽 Scientific Committee on Consumer Safety(SCCS) 은위해평가결과완제화장품에서 0.1% 까지는인체안전수준이라고발표하였다. 미국도따로완제화장품에서의규정은없으나구강에사용하는개인용품에는 0.1% 로관리하고있다. 표. 국내외화장품및개인용품에서의사프롤및 DEG 관리현황 - 9 -
사프롤 DEG 한국 유럽 미국 배합금지 배합금지 ( 천연에센스에 자연적으 ( 천연에센스사용완제 북미향료협회 : 배합금지 로함유되어그양이최 화장품에서 100 ppm 이 ( 완제품에서 0.01% 이하제 종제품에서 100ppm 을넘 하, 구강용품에서 50 외 ) 지않는경우는제외 ) ppm 이하 ) 배합금지 배합금지 ( 다만, 비의도적인잔류물 (SCCS의견: 완제화장품 구강적용 제품에 0.1% 로서 0.1% 이하인경우는 에서 0.1% 까지안전수 이하로관리 제외 ) 준임 ) 카본블랙은아이라이너, 마스카라등화장품에사용되었던검정색색소로그간벤조피렌등발암물질로분류되어있는다환방향족탄화수소류 (Poly aromatic hydrocarbons, PAHs) 가함유할가능성이있어원료로써사용이금지되어왔다. 그러나 2010 년 3월, 식약청에서는카본블랙의사용제한을완화하여제품개발을지원하고관련산업을활성화하고자카본블랙의사용기준을마련하고이에적합한경우화장품원료로사용할수있도록하였다. 이에따라카본블랙의규격가이드라인을제정하여카본블랙의불순물중벤조 (a) 피렌과디벤즈 (a,h) 안트라센각각 5 ppb, 총 PAHs 0.5 ppm이하로관리하도록하였다. 사프롤, DEG, 벤조 (a) 피렌, 디벤즈 (a,h) 안트라센, 총 PAHs는화장품또는원료중에불순물로서미량존재하기때문에이를분석하기위하여최신분석기기인 HPLC, LC-MS/MS, GC, GC-MS 등을활용하여분석법을확립하고자한다. 사프롤, DEG 분석의경우적절한분석법의확립은물론화장품의다양한성분으로인한사프롤, DEG 정량분석의어려움을최소화하기위한표준처방유형별로분석방법을적용하여최종적인분석조건확립하고자계획하였다. 사프롤에대한분석법은보고된것이많지않으나, 대부분의향신료나정유성분의분석은일반적으로 GC나 GC-MS 를이용하여분석하는것이유리하므로, 이들과유사한사프롤도 HPLC 보다는 GC-MS 를이용하여정성및정량분석하고자하였다. DEG는 HPLC 검출을위한발색단이없기때문에 HPLC로분석하기위해서는유도체화가필요하다. 그러나화장품성분에포함되어있는다양한성분으로인해유도체화반응을통한화장품내 DEG를분석하기에는상당한어려움이따른다. DEG 분석은주로 GC를통해수행되고최근에는 GC-MS 를이용해분석하는문헌들이보고되고있다. 그러나 DEG는분자량이 106 으로작아 GC-MS 를이용하여분석하더라도검출감도가그다지좋지는못하다. 미국 FDA에서는치약에오용되거나비의도적으로잔류하는 DEG를분석하기위해 GC-MS Screening Procedure for the Presence of - 10 -
Diethylene Glycol and Ethylene Glycol in Toothpaste 를발표했는데이가이드라인에서 DEG 분석범위는 100-500 ppm이었다. 이처럼 DEG 분석의관건은얼마나검출감도를낮출수있는가하는점이다. PAHs는토양이나대기, 수질에서관리기준이설정되어있고이에따른분석법도다양한매질을대상으로보고되어있다. PAHs는 HPLC나 GC를이용한분석법이개발되어있다. HPLC의경우 UV 검출기보다는형광검출기를이용하여검출하는방법이많이보고되고있고, GC의경우 MS 검출기사용으로정성과정량을동시에수행할수있는장점이있다. PAHs는이온화반응의어려움으로 LC-MS를이용한방법은소개되고있지않다. 다만, 카본블랙의벤조피렌, 디벤즈 (a,h) 안트라센, 총 PAHs 분석의경우카본블랙의우수한흡착성으로인해벤조피렌, 디벤즈 (a,h) 안트라센, 총 PAHs 정량분석의어려움이예상된다. 본연구에서는이러한전처리의어려움을최소화하기위한여러가지전처리방법을시도하여분석법을최적화하고자하였다. 확립된시험법은시판화장품에대한모니터링을통하여양질의화장품공급에기여하게될것이며최종적으로소비자가믿고사용할수있는화장품의유통에기여하고, 또한화장품원료관리시스템마련을위한기초자료를제공할것으로사료된다. 제3장연구개발과제의연구수행내용및결과제1절연구수행내용 1. 시료및시약본연구의분석대상물질인사프롤, DEG, PAHs (acenaphthene, acenaphthylene, anthracene, benz[a]anthracene, benzo[a]pyrene, benzo[k]fluoranthene, benzo[ghi]perylene, benzo[b]fluoranthene, chrysene, dibenz[a,h]anthracene, fluoranthene, fluorene, indeno[1,2,3-cd]pyrene, 1-methylnaphthalene, 2-methylnaphthalene, naphthalene, phenanthrene, pyrene, 총 18종 ) 및내부표준물질로사용한 2,2,2-trichloroethanol (TCE), 1,4-dichlorobenzene (DCB), benzyl chloride (BzC), 3-methylchloanthrene 은 Sigma-Aldrich 에서구입하였다 ( 그림 1). 분석에사용된메탄올 (MeOH), 아세토니트릴 (AcCN), 헥산, ethyl acetate(ea), dichloromethane(dcm), toluene, 물은 HPLC 급으로 Merck 및 J&Baker 에서구입하였다. 분석법밸리데이션을위해기본성분들로구성된화장수, 크림, 샴푸가기질로사용되었고원료분량은표 1과같다. 카본블랙시험을위해시약급 active carbon black 은 Sigma-Aldrich 에서구입하였고, 액상및분말카본블랙은화장품원료로사 - 11 -
용되는것을제공받았다. 확립된분석법을시판화장품을대상으로적용하기위해사프롤을함유할가능성이있는창포 / 석창포, 육두구, 세신, 정향 ( 클로브 ) 등을포함하는시판화장품 30종을구입하였다. DEG 경우에는거의모든화장품이글리세린, PEG 등을사용하기때문에화장품유형별로다섯제품이상의시판화장품총 56종을구매하여분석하였다. 또한사프롤과 DEG의경우현재홈메이드화장품또는식품향신료로인터넷에판매되는창포 / 석창포, 육두구, 세신, 정향 ( 클로브 ) 등의원료를구매하여사프롤과 DEG를분석하였다. - 12 -
사프롤 DEG 2,2,2-Trichloroethanol 1,4-Dichlorobenzene Benzyl chloride 3-Methylchloanthrene Acenaphthene Acenaphthylene Anthracene Benz[a]anthracene Benzo[a]pyrene Benzo[b]fluoranthene Benzo[ghi]perylene Benzo[k]fluoranthene Chrysene Dibenz[a,h]anthracene Fluoranthene Fluorene Indeno[1,2,3-cd]pyrene 1-Methylnaphthalene 2-Methylnaphthalene Naphthalene Phenanthrene Pyrene [ 그림 1] 사프롤, DEG, 총 PAHs, 내부표준물질구조 - 13 -
[ 크림기제 ] NO. 전성분 ( 한글명 ) 함량 (%) 1 water 57.91 2 glycerin 10 3 dipropylene glycol 7 4 caprylic/capric triglyceride 5 5 neopentyl glycol dicaprate 5 6 squalene 4 7 cetearyl alcohol 2.5 8 glyceryl stearate 2 9 1,2-hexanediol 2 10 PEG-40 stearate 1 11 sorbitan stearate 1 12 butyrospermum parkii(shea)butter 1 13 tromethamine 0.08 14 carbomer 0.08 15 PEG-100 stearate 0.5 16 dimethicone 0.4 17 trisodium EDTA 0.4 18 xanthan gum 0.03 19 tocopherol 0.1 100 [ 스킨기제 ] [ 샴푸기제 ] 전성분 ( 한글명 ) 함량 (%) 1 water 90.325 2 dipropylene glycol 3 3 sd alcohol 40-B 3 4 glycerin 2 5 1,2-hexanediol 0.5 6 trisodium EDTA 0.4 7 PEG-60 hydrogenated castor oil 0.3 8 phenoxyethanol 0.3 9 tromethamine 0.15 10 acrylates/c10-30 alkyl acrylate crosspolymer 0.015 11 xanthan gum 0.01 100 전성분 ( 한글명 ) 함량 (%) 1 water 84.40925 2 sodium laureth sulfate 9.45 3 sodium chloride 3.1 4 sodium lauryl sulfate 2.4 5 disodium cocoamphodiacetate 0.45 6 polyquaternium-10 0.08 7 citric acid 0.06 8 tetrasodium EDTA 0.05 9 methylchloroisothiazolinone, methylisothiazolinone(3:1) 0.00075 100 [ 표 1] 기제원료분량 - 14 -
2. 사프롤분석가. 표준액조제사프롤표준품을 MeOH를사용하여표준원액 20 ppm, 50 ppm, 80 ppm을만들었다. 따로내부표준품 TCE, DCB, BzC를 MeOH에녹여각각 200 ppm, 40 ppm, 60 ppm 이되게내부표준물질혼합원액을만들었다. 검량선작성을위하여 100 ml 용량플라스크에세가지내부표준원액각각 1 ml을넣고, 사프롤 20 ppm 0.5 ml, 1 ml, 2 ml, 사프롤 80 ppm 1 ml, 2 ml를각각넣고 MeOH를적당량추가한후초음파진탕에서 40 C, 30분간혼합하였다. 이에 MeOH를넣어 100 ml로맞추고시린지필터 (PVDF, 0.45 μm) 를이용하여필터하였다. 이액을 MeOH를이용하여 1/2로희석하여검량선농도 50, 100, 200, 400, 800 ppb를만들었다. 이때내부표준물질은 TCE 1 ppm, DCB 200 ppb, BzC 300 ppb로동일한농도를유지하였다. 나. 밸리데이션사프롤에대한회수율및일내-일간시험을위하여화장품기제크림, 스킨, 샴푸에표준액을주입하여분석하는방법을수행하였다. 각기제 1 g을 100 ml 용량플라스크에취하고내부표준물질혼합원액 (TCE 200 ppm, DCB 40 ppm, BzC 60 ppm) 1 ml를넣고사프롤 50 ppm 0.4 ml, 1 ml, 2 ml를각각넣고 MeOH를적당량추가한후초음파진탕기에서 40 C, 30분간균질혼합하였다. 이에 MeOH를넣어 100 ml로맞추고시린지필터 (PVDF, 0.45 μm) 를이용하여필터하였다. 이액을 MeOH 를이용하여 1/2로희석하여검액으로하였다. 최종분석농도는사프롤 100, 250, 500 ppb이었고내부표준물질은 TCE 1 ppm, DCB 200 ppb, BzC 300 ppb이었다. 따로사프롤표준원액을넣지않은기제공시험액과기제만을포함하는공시험액을함께제조하여함께분석하였다. 모든검액은 3회반복하여조제하고분석하였다. 다. 원료및유통중화장품분석시판화장품 1 g을 100 ml 용량플라스크에취하고내부표준물질혼합원액 (TCE 200 ppm, DCB 40 ppm, BzC 60 ppm) 1 ml를넣고 MeOH를적당량추가한후초음파진탕기에서 40 C, 30분간균질혼합하였다. 이에 MeOH를넣어 100 ml로맞추고시린지필터 (PVDF, 0.45 μm) 를이용하여필터하였다. 이액을 MeOH를이용하여 1/2로희석하여검액으로하였다. 원료는 0.1 g을 100 ml 용량플라스크에취하고내부표준물질혼합원액 1 ml를넣고위와동일한방법으로전처리한후분석하였다. - 15 -
라. 분석기기조건 조제된검액은 GC-MS 를이용하여표 2 와같은분석조건에서분석하였다. 표 2. 사프롤분석 GC-MS 조건 GC 조건 칼럼 Rxi 624sil MS(30m, 0.32mm, 1.8um, Restek) 주입구온도 250 오븐온도 Rate Final temp. hold temp. - 100 3 min 10 /min 280 5 min 주입모드 split (20:1) 주입량 1 μl MS 조건 Ion source 온도 230 Interface 온도 250 Solvent delay time 3 min 사프롤 : 131, 162 TCE: 49, 77, 113 SIM 모드 DCB: 111, 146, 148 BzC: 126, 128 3. DEG 분석가. 표준액조제 DEG 표준품을 MeOH를사용하여표준원액 100 ppm, 1000 ppm, 5,000 ppm을만들었다. 따로내부표준품 TCE, DCB, BzC를 MeOH에녹여각각 1000 ppm, 200 ppm, 300 ppm이되게내부표준물질혼합원액을만들었다. 검량선작성을위하여 100 ml 용량플라스크에세가지내부표준원액각각 1 ml을넣고, DEG 100 ppm 1 ml, DEG 1000 ppm 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5 ml를각각넣고 MeOH를적당량추가한후초음파진탕기에서 40 C, 30분간혼합하였다. 이에 MeOH를넣어 100 ml로맞추고시린지필터 (PVDF, 0.45 μm) 를이용하여여과하여, 검량선농도 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 15 ppm으로만들었다. 이때내부표준물질은 TCE 10 ppm, DCB 2 ppm, BzC 3 ppm으로동일한농도를유지하였다. - 16 -
나. 밸리데이션 DEG에대한회수율및일내-일간시험을위하여화장품기제크림, 스킨, 샴푸에표준액을주입하여분석하는방법을수행하였다. 각기제 1 g을 100 ml 용량플라스크에취하고내부표준물질혼합원액 (TCE 1000 ppm, DCB 200 ppm, BzC 300 ppm) 1 ml를넣고 DEG 1000 ppm 0.25 ml, 0.5 ml, 1 ml를각각넣고 MeOH를적당량추가한후초음파진탕기에서 40 C, 30분간균질혼합하였다. 이에 MeOH를넣어 100 ml로맞추고시린지필터 (PVDF, 0.45 μm) 를이용하여필터하였다. 최종분석농도는 DEG 2.5, 5, 10 ppm이었고내부표준물질은 TCE 10 ppm, DCB 2 ppm, BzC 3 ppm이었다. 따로 DEG 표준원액을넣지않은기제공시험액과기제만을포함하는공시험액을함께제조하여함께분석하였다. 모든검액은 3회반복하여조제하고분석하였다. 다. 원료및유통중화장품분석시판화장품 1 g을 100 ml 용량플라스크에취하고내부표준물질혼합원액 (TCE 1000 ppm, DCB 200 ppm, BzC 300 ppm) 1 ml를넣고 MeOH를적당량추가한후초음파진탕기에서 40 C, 30분간균질혼합하였다. 이에 MeOH를넣어 100 ml로맞추고시린지필터 (PVDF, 0.45 μm) 를이용하여필터하였다. 원료는 0.1 g을 100 ml 용량플라스크에취하고내부표준물질혼합원액 1 ml를넣고위와동일한방법으로전처리한후분석하였다. 라. 분석기기조건 조제된검액은 GC-MS 를이용하여표 3 와같은분석조건에서분석하였다. 표 3. DEG 분석 GC-MS 조건 GC 조건 칼럼 Rxi 624sil MS(30m, 0.32mm, 1.8um, Restek) 주입구온도 250 오븐온도 Rate Final temp. hold temp. - 100 3 min 10 /min 280 5 min - 17 -
주입모드 split (20:1) 주입량 1 μl MS 조건 Ion source 온도 230 Interface 온도 250 Solvent delay time SIM 모드 3 min DEG: 75, 76 TCE: 49, 77, 113 DCB: 111, 146, 148 BzC: 126, 128 4. 카본블랙가. 표준액조제 PAHs (acenaphthene, acenaphthylene, anthracene, benz[a]anthracene, benzo[a]pyrene, benzo[k]fluoranthene, benzo[ghi]perylene, benzo[b]fluoranthene, chrysene, dibenz[a,h]anthracene, fluoranthene, fluorene, indeno[1,2,3-cd]pyrene, 1-methylnaphthalene, 2-methylnaphthalene, naphthalene, phenanthrene, pyrene) 를각각취해 DCM과 MeOH 1:1 혼합용매에녹여표4와같은검량선농도를조제하였다. 총 PAHs 분석은검출시간의겹침을피하기위해총 PAHs를두그룹으로나누고, HPLC-DAD-형광검출기와 GC-MS를이용하여분석을수행하였기때문에각기기별로검량선농도를조제하였다. 내부표준물질 3-methylcholanthrene 은 100 ppb가되도록첨가하였다. 표 4. 총 PAHs 의기기별검량선농도범위 Set-1 PA Hs HPLC-DA D- 형광검출기 GC-M S Napthalene 20-100 ppb 20-100 ppb Anthracene 2.5-40 ppb 2.5-40 ppb lndeno(1,2,3-cd)pyrene 2-200 ppb 5-200 ppb Dibenzo(a,h)anthracene 0.1-4 ppb 20-100 ppb Acenaphthylene 50-600 ppb 50-600 ppb 1-Methylnaphthalene 0.3-5 ppm 2-20 ppm Acenaphthene 1.25-20 ppb 1.25-20 ppb Benz(a)anthracene 2.5-50 ppb 2.5-50 ppb Benzo(k)fluoranthene 2.5-50 ppb 5-100 ppb Set-2 2-Methylnaphthalene 5-100 ppb 100-1000 ppb - 18 -
Fluorene 5-60 ppb 5-60 ppb Fluoranthene 2.5-80 ppb 2.5-80 ppb Phenanthrene 10-80 ppb 10-80 ppb Chrysene 10-80 ppb 10-80 ppb Benzo(a)pyrene 0.1-4 ppb 20-100 ppb Pyrene 5-60 ppb 5-60 ppb Benzo(b)fluoranthene 5-200 ppb 10-200 ppb Benzo(ghi)perylene 5-400 ppb 10-400 ppb 나. 시료전처리총 PAHs의추출방법을확립하기위해초음파진탕기, reflux, 분액깔대기를이용하여추출율을비교하였다. 초음파진탕기추출을위해서활성탄및액상카본블랙 1 g을각각취하고벤조피렌 100 μg, 디벤즈안트라센 100 μg, 내부표준물질 (3-methylchloanthrene) 2000 μg을넣은후 AcN, 톨루엔, DCM-MeOH(1:1), 아세톤을각각 20 ml 넣고초음파진탕기 40 C에서 30분, 1, 3, 6, 12, 20시간추출하였다. 각추출액을 3000 rpm, 15분간원심분리하고상등액을취하여시린지필터 (PTFE, 0.2 μm) 를이용하여여과하고이를검액으로하였다. reflux 추출을위해서활성탄및액상카본블랙 1 g을각각취하고벤조피렌 10 μg, 디벤즈안트라센 10 μg, 내부표준물질 (3-methylchloanthrene) 200 μg을넣은후톨루엔, DCM, 헥산을각각 300 ml 넣고 10분간초음파진탕기에서충분히분산시켰다. 이액에마그네틱바를넣고 condenser 를연결시킨후각용매의끓는점에서 ± 10 C 온도범위를유지하면서 24시간동안 reflux 하였다. 이액을여과지 (Whatman 43) 으로여과하고여액을감압농축한후 DCM으로녹이고이를질소농축하였다. 잔류물은 AcCN 2 ml를사용하여녹이고시린지필터 (PTFE, 0.2 μm) 를이용하여여과하고이를검액으로하였다. 분액깔대기를이용한추출을위해서활성탄및액상카본블랙 1 g을각각취하고벤조피렌 10 μg, 디벤즈안트라센 10 μg, 내부표준물질 (3-methylchloanthrene) 200 μg을넣은후헥산 100 ml 넣고 30분간격렬히진탕하였다. 이액을여과지 (Whatman 43) 으로여과하고여액을감압농축한후 DCM으로녹이고이를질소농축하였다. 잔류물은 AcCN 2 ml를사용하여녹이고시린지필터 (PTFE, 0.2 μm) 를이용하여여과하고이를검액으로하였다. 따로활성탄및액상카본블랙을제외하고위와동일한방법으로분액깔대기를이용한추출을수행하여추출법을확인하였다. 다. 분석기기조건 - 19 -
조제된검량표준액은 HPLC-DAD- 형광검출기및 GC-MS 를이용하여표 5 와같은 분석조건에서분석하였다. 추출법으로부터조제된검액은 HPLC-DAD- 형광검출기를 이용하여분석하였다. 표 5. PAHs 분석조건 HPLC-DA D-형광검출기 : set-1 Column : SUPELCOSIL LC-PAH (25cm x 4.6mm, 5um) Column Temp. : 25 유량 : 0.75 ml/min 주입량 : 10 μl 이동상및 : A-AcCN PDA: 230 nm(acenaphthene 분석 ) 검출파장 B-AcCN: 물 (6:4) FLD: Time 이동상 A Time Ex Em 이동상 B 0-16 280 340 (%) (%) 16.1-18 264 407 0-2 100 2-10 0-75 100-25 18.1-20 325 400 10-20 75-100 25-0 21.0-22.3 320 340 20-50 100 22.4-50.0 325 400 50-60 100 50.1-60 280 340 HPLC-형광검출기 : set-2 Column : SUPELCOSIL LC-PAH (25cm x 4.6mm, 5um) Column Temp. : 25 유량 : 0.75 ml/min 주입량 : 10 μl 이동상및 : A-AcCN 검출파장 B-AcCN: 물 (6:4) Time 이동상 A 이동상 B (%) (%) 0-2 100 2-10 0-75 100-25 10-20 75-100 25-0 20-50 100 50-60 100 FLD: Time Ex Em 0-16 280 340 16.1-18 264 407 18.1-50 325 400 50.1-60 280 340 GC 조건칼럼 HP-5MS(30m, 0.25mm, 0.25um) 유량헬륨 1 ml/min 주입구온도 300 오븐온도 - 20 -
Rate Final temp. Hold - 90 1 min 25 /min 180 0 min 5 /min 280 10 min 20 /min 320 6 min 주입모드 split (20:1) 주입량 1 μl MS 조건 Ion source 온도 260 Interface 온도 270 Solvent delay time SIM 모드 Set-1 2 min Napthalene 102, 128 Anthracene 152, 178 lndeno(1,2,3-cd)pyrene 138, 276 Dibenzo(a,h)anthracene 139, 278 Acenaphthylene 152, 153 1-Methylnaphthalene 141, 142 Acenaphthene 152, 178 Benz(a)anthracene 114, 228 Benzo(k)fluoranthene 126, 252 2-Methylnaphthalene 141, 142 Fluorene 82, 166 Fluoranthene 101, 202 Phenanthrene 152, 178 Set-2 Chrysene 114, 228 Benzo(a)pyrene 126, 252 Pyrene 101, 202 Benzo(b)fluoranthene 126, 252 Benzo(ghi)perylene 138, 276 IS 3-Methylcholanthrene 266, 268 제2절연구수행결과 1. 사프롤분석법확립화장품에사용되는원료는매우다양하기때문에내부표준물질을선별하는데어려워배합금지물질로분류되어있는 TCE, DCB, BzC를사용하여분석하고그결과를비교하여최선의내부표준물질을설정하여시판화장품분석에적용하였다. GC-MS 분석결과 TCE, DCB, BzC, 사프롤의머무름시간은각각 5.0, 6.4, 6.6, 11.3 분이었고, 설정한정량이온들은 TCE 49, 77, DCB 111, 146, BzC 126 및사프롤 162 m/z이었다. 각내부표준물질의이온들을가지고검량선을작성한결과모두상관계수 1.000 으로 - 21 -
우수한직선성을나타냈다. [ 크로마토그램 ] [ 사프롤스펙트럼 ] [TCE 스펙트럼 ] [DCB 스펙트럼 ] [BzC 스펙트럼 ] - 22 -
그림. 사프롤및내부표준물질의크로마토그램및 MS 스펙트럼 표. 각이온별사프롤검량선식 성분이온 검량식 R 2 TCE(49) vs. safrole(162) y = 2.636x + 0.013 1.000 TCE(77) vs. safrole(162) y = 3.600x + 0.019 1.000 DCB(111) vs. safrole(162) y = 4.796x + 0.040 1.000 DCB(148) vs. safrole(162) y = 3.133x + 0.016 1.000 BzC(126) vs. safrole(162) y = 4.618x + 0.020 1.000 크림기제를가지고회수율시험을수행한결과, 일내시험에서회수율 106.2 ~ 127.8%, RSD 2.7 ~ 7.0% 결과를얻었다. 일간시험에서는회수율 96.7 ~ 117.7%, RSD 3.4 ~ 10.5% 를나타냈다. TCE BzC DCB Safrole 그림. 크림기제공시험및 spike 시료크로마토그램 표. 크림에대한사프롤회수율결과 ( 일내시험 ) 성분이온 0.1 ppm 0.25 ppm 0.5 ppm 회수율 (%) RSD(%) 회수율 (%) RSD(%) 회수율 (%) RSD(%) - 23 -
TCE(49) vs. safrole(162) 112.5 4.9 120.3 1.3 118.7 6.8 TCE(77) vs. safrole(162) 114.9 5.3 119.6 1.0 113.5 4.0 DCB(111) vs. safrole(162) 112.5 6.7 127.8 5.1 123.1 2.5 DCB(148) vs. safrole(162) 107.7 7.0 119.8 2.9 118.4 3.9 BzC(126) vs. safrole(162) 106.2 5.5 114.3 3.6 110.5 2.7 표. 크림에대한사프롤회수율결과 ( 일간시험 ) 성분이온 0.1 ppm 0.25 ppm 0.5 ppm 회수율 (%) RSD(%) 회수율 (%) RSD(%) 회수율 (%) RSD(%) TCE(49) vs. safrole(162) 111.3 8.0 118.0 4.0 117.7 3.4 TCE(77) vs. safrole(162) 115.5 10.5 117.0 5.2 117.1 3.5 DCB(111) vs. safrole(162) 102.1 5.3 111.6 8.0 116.2 6.8 DCB(148) vs. safrole(162) 96.7 6.0 108.6 6.2 111.3 6.7 BzC(126) vs. safrole(162) 96.7 5.6 104.2 5.4 106.7 6.0 스킨기제를가지고회수율시험을수행한결과, 일내시험에서회수율 102.0 ~ 122.1%, RSD 0.5 ~ 5.1% 결과를얻었다. 일간시험에서는회수율 97.7 ~ 107.1%, RSD 1.8 ~ 11.3% 를나타냈다. TC E B zc DC B S afrole 그림. 스킨기제공시험및 spike 시료크로마토그램 - 24 -
표. 스킨에대한사프롤회수율결과 ( 일내시험 ) 성분이온 0.1 ppm 0.25 ppm 0.5 ppm 회수율 (%) RSD(%) 회수율 (%) RSD(%) 회수율 (%) RSD(%) TCE(49) vs. safrole(162) 105.7 3.1 111.6 1.5 110.5 2.5 TCE(77) vs. safrole(162) 106.5 5.1 116.4 3.9 111.3 3.8 DCB(111) vs. safrole(162) 122.1 2.8 120.9 4.3 102.3 3.3 DCB(148) vs. safrole(162) 115.3 0.5 118.5 4.4 102.0 2.3 BzC(126) vs. safrole(162) 106.7 1.7 104.8 1.7 103.8 2.1 표. 스킨에대한사프롤회수율결과 ( 일간시험 ) 성분이온 0.1 ppm 0.25 ppm 0.5 ppm 회수율 (%) RSD(%) 회수율 (%) RSD(%) 회수율 (%) RSD(%) TCE(49) vs. safrole(162) 103.6 4.0 102.4 6.4 105.5 4.3 TCE(77) vs. safrole(162) 102.7 5.8 103.9 7.8 105.8 4.9 DCB(111) vs. safrole(162) 104.6 11.3 101.6 11.6 104.0 3.1 DCB(148) vs. safrole(162) 107.1 6.5 102.5 9.8 102.6 2.3 BzC(126) vs. safrole(162) 104.8 2.9 97.7 5.3 100.9 1.8 샴푸기제를가지고회수율시험을수행한결과, 일내시험에서회수율 103.1 ~ 127.3%, RSD 0.8 ~ 7.7% 결과를얻었다. 일간시험에서는회수율 92.9 ~ 120.9%, RSD 2.9 ~ 13.6% 를나타냈다. - 25 -
TCE BzC DCB Safrole 그림. 샴푸기제공시험및 spike 시료크로마토그램 표. 샴푸에대한사프롤회수율결과 ( 일내시험 ) 성분이온 0.1 ppm 0.25 ppm 0.5 ppm 회수율 (%) RSD(%) 회수율 (%) RSD(%) 회수율 (%) RSD(%) TCE(49) vs. safrole(162) 111.3 7.0 119.4 0.4 126.4 1.6 TCE(77) vs. safrole(162) 109.0 5.4 117.5 0.4 123.8 2.1 DCB(111) vs. safrole(162) 109.4 7.7 123.2 4.6 127.3 1.0 DCB(148) vs. safrole(162) 104.1 6.9 114.1 4.4 124.8 2.1 BzC(126) vs. safrole(162) 103.1 6.1 109.3 3.8 116.1 0.8 표. 샴푸에대한사프롤회수율결과 ( 일간시험 ) 성분이온 0.1 ppm 0.25 ppm 0.5 ppm 회수율 (%) RSD(%) 회수율 (%) RSD(%) 회수율 (%) RSD(%) TCE(49) vs. safrole(162) 102.5 6.1 113.7 4.6 120.9 3.7 TCE(77) vs. safrole(162) 104.8 3.8 112.8 3.4 117.1 6.0 DCB(111) vs. safrole(162) 95.7 4.4 109.9 8.9 119.8 13.6 DCB(148) vs. safrole(162) 93.5 3.5 105.4 5.0 111.8 9.5 BzC(126) vs. safrole(162) 92.9 2.9 101.7 5.4 106.9 7.9-26 -
내부표준물질 TCE, DCB, BzC의각대표적인이온들과사프롤정량이온을비교하여본결과대체적으로양호한회수율과 RSD 결과를얻었다. 이중가장우수한결과를나타낸 BzC 126 m/z를내부표준물질로선정하고사프롤 162 m/z을정량하는것을시판화장품분석에적용하였다. 시판화장품 30종및원료로구매한 8종의제품을검정한결과시판화장품에서는사프롤이검출되지않았으나원료시료에서는넛맥분과세신분말에서사프롤이검출되었으며검출농도는각각 653.2 ppm과 80.0 ppm이었다. 일반적으로향신료로사용되는원료는 1% 이하로사용되기때문에완제품의경우 and 낮은농도로잔존하리라사료된다. B zc 그림. 시판화장품및넛맥분크로마토그램 2. DEG 분석법확립사프롤분석과동일하게 DEG 분석도 TCE, DCB, BzC를사용하여분석하고그결과를비교하여최선의내부표준물질을설정하여시판화장품분석에적용하였다. 단, DEG의경우분자량이작아여러가지이온들로정량을하였다. GC-MS 분석결과 TCE, DCB, DEG, BzC의머무름시간은각각 5.0, 6.4, 6.5, 6.6 분이었다. 설정한정량이온들은 TCE 49, 77, 113, DCB 111, 146, 148, BzC 126, 128 및 DEG 75, 76 m/z이었다. 각내부표준물질의이온들을가지고검량선을작성한결과모두상관계수 0.996 이상의우수한직선성을나타냈다. 그러나 DEG 76 m/z의경우 75 m/z에비해감도가 1/2배차이를보여회수율시험에서는제외하였다. - 27 -
B zc TC E DC B DE G 그림. DEG 및내부표준물질의크로마토그램및스펙트럼 표. 각이온별 DEG 검량선식 성분이온검량식 R 2 TCE(49) TCE(77) TCE(113) DCB(111) DCB(146) DCB(148) BzC(126) BzC(128) DEG(75) y = 0.140x 0.203 0.997 DEG(76) y = 0.073x 0.113 0.997 DEG(75) y = 0.192x 0.285 0.997 DEG(76) y = 0.100x 0.159 0.997 DEG(75) y = 0.393x 0.605 0.997 DEG(76) y = 0.204x 0.336 0.996 DEG(75) y = 0.330x 0.471 0.998 DEG(76) y = 0.172x 0.263 0.997 DEG(75) y = 0.132x - 0.186 0.998 DEG(76) y = 0.069x 0.104 0.997 DEG(75) y = 0.207x 0.295 0.998 DEG(76) y = 0.108x 0.165 0.997 DEG(75) y = 0.370x 0.446 0.999 DEG(76) y = 0.192x 0.253 0.998 DEG(75) y = 1.162x 1.354 0.999 DEG(76) y = 0.604x 0.771 0.998 크림기제를가지고 DEG 회수율시험을수행한결과, 일내시험에서회수율 95.5 ~ 103.4%, RSD 0.2 ~ 4.5% 결과를얻었다. 일간시험에서는회수율 95.3 ~ 107.67%, RSD 0.2 ~ 9.7% 를나타냈다. - 28 -
BzC TCE DCB DEG 그림. 크림기제공시험및 spike 시료크로마토그램 표. 크림에대한 DEG (75 m/z) 회수율결과 ( 일내시험 ) 성분이온 2.5 ppm 5 ppm 10 ppm 회수율 (%) RSD(%) 회수율 (%) RSD(%) 회수율 (%) RSD(%) TCE(49) vs. DEG(75) 101.7 3.7 96.4 2.1 97.4 0.2 TCE(77) vs. DEG(75) 101.9 3.3 95.5 1.7 95.3 1.2 TCE(113) vs. DEG(75) 102.9 3.1 96.2 1.3 96.3 0.6 DCB(111) vs. DEG(75) 98.5 4.5 95.6 1.9 97.5 0.3 DCB(146) vs. DEG(75) 99.4 4.4 95.8 1.7 97.0 0.2 DCB(148) vs. DEG(75) 99.1 3.4 95.9 1.8 97.2 0.2 BzC(126) vs. DEG(75) 103.3 4.5 98.2 2.0 100.7 0.9 BzC(128) vs. DEG(75) 103.4 4.5 98.4 2.0 100.3 0.8 표. 크림에대한 DEG 회수율결과 ( 일간시험 ) 성분이온 2.5 ppm 5 ppm 10 ppm 회수율 (%) RSD(%) 회수율 (%) RSD(%) 회수율 (%) RSD(%) TCE(49) vs. DEG(75) 101.7 3.7 96.4 2.1 97.4 0.2 TCE(77) vs. DEG(75) 101.9 3.3 95.5 1.7 95.3 1.2-29 -
TCE(113) vs. DEG(75) 104.9 0.6 99.6 2.9 100.1 5.7 DCB(111) vs. DEG(75) 102.7 3.4 100.7 3.4 103.3 6.2 DCB(146) vs. DEG(75) 105.4 4.1 103.1 6.7 104.8 9.7 DCB(148) vs. DEG(75) 105.5 4.6 103.1 6.4 105.0 9.3 BzC(126) vs. DEG(75) 107.6 2.8 104.6 6.1 107.2 8.3 BzC(128) vs. DEG(75) 107.6 2.0 105.0 6.1 107.2 8.3 스킨기제를가지고 DEG 회수율시험을수행한결과, 일내시험에서회수율 95.4 ~ 104.6%, RSD 0.6 ~ 2.2% 결과를얻었다. 일간시험에서는회수율 92.4 ~ 105.1%, RSD 0.3 ~ 6.4% 를나타냈다. B zc TC E DC B DE G 그림. 스킨기제공시험및 spike 시료크로마토그램 표. 스킨에대한 DEG 회수율결과 ( 일내시험 ) 성분이온 2.5 ppm 5 ppm 10 ppm 회수율 (%) RSD(%) 회수율 (%) RSD(%) 회수율 (%) RSD(%) TCE(49) vs. DEG(75) 103.4 1.8 96.5 0.7 97.9 0.9 TCE(77) vs. DEG(75) 103.4 1.8 96.3 0.3 97.3 0.9 TCE(113) vs. DEG(75) 103.7 1.7 96.4 0.6 97.3 0.6 DCB(111) vs. DEG(75) 103.9 1.4 96.3 1.8 98.3 1.0 DCB(146) vs. DEG(75) 103.8 1.1 95.4 3.1 98.6 0.9-30 -
DCB(148) vs. DEG(75) 103.8 1.2 95.9 2.0 98.2 0.7 BzC(126) vs. DEG(75) 104.5 2.2 98.8 1.8 100.1 0.8 BzC(128) vs. DEG(75) 104.6 1.7 99.6 2.8 98.5 2.0 표. 스킨에대한 DEG 회수율결과 ( 일간시험 ) 성분이온 2.5 ppm 5 ppm 10 ppm 회수율 (%) RSD(%) 회수율 (%) RSD(%) 회수율 (%) RSD(%) TCE(49) vs. DEG(75) 103.4 0.5 94.2 2.3 98.5 5.8 TCE(77) vs. DEG(75) 103.1 0.3 93.8 2.2 97.8 6.3 TCE(113) vs. DEG(75) 103.5 0.3 94.2 1.7 98.3 6.4 DCB(111) vs. DEG(75) 102.2 1.2 93.0 2.4 98.2 2.6 DCB(146) vs. DEG(75) 102.3 1.1 92.4 1.8 98.7 2.7 DCB(148) vs. DEG(75) 102.4 1.1 92.9 2.0 98.7 2.5 BzC(126) vs. DEG(75) 105.1 1.8 96.5 2.9 100.5 3.2 BzC(128) vs. DEG(75) 104.8 1.7 96.2 4.0 99.2 2.7 샴푸기제를가지고 DEG 회수율시험을수행한결과, 일내시험에서회수율 94.5 ~ 102.6%, RSD 0.0 ~ 3.9% 결과를얻었다. 일간시험에서는회수율 97.9 ~ 104.9%, RSD 0.8 ~ 6.2% 를나타냈다. BzC TCE DCB DEG 그림. 샴푸기제공시험및 spike 시료크로마토그램 - 31 -
표. 샴푸에대한 DEG 회수율결과 ( 일내시험 ) 성분이온 2.5 ppm 5 ppm 10 ppm 회수율 (%) RSD(%) 회수율 (%) RSD(%) 회수율 (%) RSD(%) TCE(49) vs. DEG(75) 101.7 3.1 96.3 2.3 97.5 0.9 TCE(77) vs. DEG(75) 100.1 2.7 95.3 0.6 94.5 0.7 TCE(113) vs. DEG(75) 100.3 3.0 96.4 0.7 96.4 1.1 DCB(111) vs. DEG(75) 100.7 2.9 98.8 1.0 99.1 0.4 DCB(146) vs. DEG(75) 100.0 2.6 97.7 0.6 97.8 0.6 DCB(148) vs. DEG(75) 100.4 2.7 98.2 0.8 98.5 0.0 BzC(126) vs. DEG(75) 101.5 3.9 99.0 0.3 99.9 1.4 BzC(128) vs. DEG(75) 102.6 2.9 99.4 0.3 99.6 1.2 표. 샴푸에대한 DEG 회수율결과 ( 일간시험 ) 성분이온 2.5 ppm 5 ppm 10 ppm 회수율 (%) RSD(%) 회수율 (%) RSD(%) 회수율 (%) RSD(%) TCE(49) vs. DEG(75) 102.5 0.8 100.2 2.2 102.3 4.0 TCE(77) vs. DEG(75) 101.7 1.4 98.3 2.7 99.8 4.9 TCE(113) vs. DEG(75) 100.9 0.7 97.9 1.3 100.0 3.0 DCB(111) vs. DEG(75) 102.0 0.8 101.6 2.3 104.4 5.3 DCB(146) vs. DEG(75) 102.3 1.7 101.7 3.2 104.1 6.2 DCB(148) vs. DEG(75) 102.2 1.3 101.4 2.8 104.3 5.9 BzC(126) vs. DEG(75) 103.6 1.6 103.7 3.8 105.8 4.8 BzC(128) vs. DEG(75) 104.4 2.4 103.9 3.7 104.9 5.8 내부표준물질 TCE, DCB, BzC의각대표적인이온들과 DEG 정량이온을비교하여본결과대체적으로우수한회수율과 RSD 결과를얻었다. 이중 BzC 126 m/z를내부표준물질로선정하고, DEG 75 m/z를정량하는것으로원료및시판화장품분석에적용하였다. 시판화장품 56종및원료로구매한 1종의제품을검정한결과, 시판화장품 2종 - 32 -
( 바디워시및아이라이너 ) 에서 DEG 가검출되었으며검출농도는각각 349.6 ppm 과 341.5 ppm 이었으나, 모든시료에서 DEG 기준인 0.1%(=1000 ppm) 이하이므로모두적 합한결과를나타냈다. 그림. 시판화장품 ( 바디워시, 아이라이너 ) 크로마토그램 3. 사프롤및 DEG 분석법의실험실간밸리데이션분석용화장품을대상으로세시험분석기관에서사프롤및 DEG 밸리데이션을수행하였다. 밸리데이션은본연구방법과동일하게진행되었고, 다만내부표준물질은 BzC 만을사용하여 GC-MS 분석하였다. 분석한결과, 세기관모두우수한직선성과회수율, 정밀성결과를나타냈다. 표. 사프롤실험실간밸리데이션결과 기관 1 기관 2 기관 3 검량선 y = 4.618x + 0.020 y = 2.582x - 0.013 R 2 1.000 1.000 회수율 (RSD) 기관 1 기관 2 기관 3 0.1ppm 106.2% (5.5%) 108.1% (2.64%) 크림 0.25ppm 114.3% (3.6%) 101.2% (4.52%) 0.5ppm 110.5% (2.7%) 103.8% (0.87%) 스킨 샴푸 0.1ppm 106.7% (1.7%) 114.7% (1.95%) 0.25ppm 104.8% (1.7%) 106.1% (1.51%) 0.5ppm 103.8% (2.1%) 101.1% (3.57%) 0.1ppm 103.1% (6.1%) 114.7% (1.95%) 0.25ppm 109.3% (3.8%) 106.1% (1.51%) 0.5ppm 116.1% (0.8%) 101.1% (3.57%) - 33 -
4. 카본블랙중 PAHs 분석총 PAHs 및내부표준물질은 HPLC-DAD-형광검출기및 GC-MS에서모두적절한분리능을보였고각기기별농도범위에서우수한직선성을보였다 ( 표 ). 그러나벤조피렌등여러 PAHs에서 HPLC-DAD-형광검출기을이용하여분석할때훨씬더우수한검출범위를나타냈다. GC-MS가정성분석에유리한면이있으나벤조피렌및디벤즈안트라센의기준허용농도가 5 ppb임을고려하면 GC-MS로분석하는것에비해 HPLC-DAD-형광검출기로분석하는것이타당하리라사료된다. [set-1] [set-2] 그림. PAHs 의 HPLC 크로마토그램 표. PAHs 의 HPLC 분석검량식및상관계수 HPLC-DA D- 형광검출기 Set-1 Set-2 PAHs 농도범위 t R 검량식 R 2 Napthalene 20-100 ppb 12.2 y = 0.055x - 0.056 0.997 1-Methylnaphthalene 0.3-5 ppm 14.1 y = 0.099x - 0.138 0.999 Acenaphthylene 50-600 ppb 14.9 y = 0.0004x -0.0032 0.998 Acenaphthene 1.25-20 ppb 15.0 y = 0.4121x + 0.090 1.000 Anthracene 2.5-40 ppb 17.7 y = 0.254x - 0.354 0.999 lndeno(1,2,3-cd)pyrene 2-200 ppb 19.3 y = 0.0023x + 0.004 1.000 Benz(a)anthracene 2.5-50 ppb 23.5 y = 0.1003x + 0.065 0.999 Benzo(k)fluoranthene 2.5-50 ppb 30.8 y = 0.186x - 0.008 0.999 Dibenzo(a,h)anthracene 0.1-4 ppb 34.0 y = 0.001x - 0.014 1.000 2-Methylnaphthalene 5-100 ppb 14.4 y = 0.099x - 0.138 0.995 Fluorene 5-60 ppb 15.3 y = 0.155x - 0.083 0.999 Phenanthrene 10-80 ppb 16.5 y = 0.0538x - 0.003 0.999 Pyrene 5-60 ppb 18.8 y = 0.0221x - 0.071 0.998 Fluoranthene 2.5-80 ppb 20.0 y = 0.0081x - 0.022 0.995-34 -
Chrysene 10-80 ppb 24.8 y = 0.0482x + 0.075 0.999 Benzo(b)fluoranthene 5-200 ppb 28.3 y = 0.0382x + 0.018 1.000 Benzo(a)pyrene 0.25-4 ppb 31.5 y = 0.059x - 0.003 0.999 Benzo(ghi)perylene 5-400 ppb 40.5 y = 0.0371x -0.046 0.998 IS(3-methylcholanthrene) 35.5 [Set-1] [Set-2] 3-Methylchloanthrene Acenaphthene - 35 -
Acenaphthylene Anthracene Benz[a]anthracene Benzo[a]pyrene Benzo[b]fluoranthene Benzo[ghi]perylene - 36 -
Benzo[k]fluoranthene Chrysene Dibenz[a,h]anthracene Fluoranthene Fluorene Indeno[1,2,3-cd]pyrene - 37 -
1-Methylnaphthalene 2-Methylnaphthalene Naphthalene Phenanthrene Pyrene 그림. PAHs 크로마토그램및 MS 스펙트럼 표. PAHs 의 GC-MS 분석검량식및상관계수 GC-MS - 38 -
Set-1 Set-2 PAHs 농도범위 t R 검량식 R 2 Napthalene 20-100 ppb 4.1 y = 0.739x - 0.205 0.996 1-Methylnaphthalene 2-20 ppm 5.0 y = 27.683x - 7.742 0.998 Acenaphthylene 50-600 ppb 5.8 y = 0.585x - 4.486 0.998 Acenaphthene 1.25-20 ppb 8.95 y = 0.011x - 0.066 0.997 Anthracene 2.5-40 ppb 12.4 y = 1.051x - 2.392 0.996 Benz(a)anthracene 2.5-50 ppb 18.1 y = 0.340x - 0.252 0.998 Benzo(k)fluoranthene 5-100 ppb 22.7 y = 0.330x - 0.386 0.998 lndeno(1,2,3-cd)pyrene 5-200 ppb 28.7 y = 0.271x - 0.672 0.999 Dibenzo(a,h)anthracene 20-100 ppb 28.9 y = 0.475x - 1.477 0.999 2-Methylnaphthalene 100-1000 ppb 4.7 y = 0.188x - 0.972 0.995 Fluorene 5-60 ppb 6.8 y = 0.306x + 0.100 0.999 Phenanthrene 10-80 ppb 8.8 y = 0.404x - 0.017 0.999 Fluoranthene 2.5-80 ppb 9.0 y = 0.605x - 1.422 0.995 Pyrene 5-60 ppb 13.2 y = 0.423x - 0.357 0.998 Chrysene 10-80 ppb 18.3 y = 0.440x - 2.047 0.999 Benzo(b)fluoranthene 10-200 ppb 22.6 y = 0.393x - 2.692 0.995 Benzo(a)pyrene 20-100 ppb 23.8 y = 0.211x + 0.418 0.997 Benzo(ghi)perylene 10-400 ppb 29.7 y = 0.310x - 2.555 0.998 IS(3-methylcholanthrene) 25.0 카본블랙은흡착력이매우우수한물질이기때문에타당한추출법을사용하여총 PAHs를추출해야한다. 본연구에서는초음파진탕기, reflux, 분액깔대기를이용한추출을시도였다. 그러나초음파진탕기 20시간추출등장시간에걸친가혹한추출방법과여러가지용매사용에도불구하고카본블랙에 spike된 PAHs 및 IS는추출되지않았다. 카본블랙을제외한공시험결과 spike된 PAHs는검출되었으며, 이러한시험결과로미루어카본블랙에흡착된 PAHs는일반적인환경에서는용출되기어려운것으로사료된다. 초음파진탕기 (20 시간 ) [AcCN] [ 톨루엔 ] [DCM-MeOH] [ 아세톤 ] reflux [DCM] [ 톨루엔 ] [ 헥산 ] - 39 -
분액깔대기 [ 카본블랙제외 ] [ 액상카본블랙 ] [ 활성탄 ] 그림. 추출법별 PAHs 크로마토그램 제4장연구개발과제의연구결과고찰및결론화장품은대부분안전한성분으로구성되어있지만간혹인체에유해한영향을미치는물질들의오용이나비의도적인혼입이발생할가능성이많다. 이러한유해물질의위협에서소비자들을보호하기위해식약청은화장품에사용할수없는원료를지정하여관리하고있다. 본연구는화장품중비의도적으로혼입될수있는사프롤과 DEG에대한분석법을마련하였다. 사프롤은화장품중주로정유성분의원료가되는창포 / 석창포, 육두구, 세신, 정향 ( 클로브 ) 추출물중에혼재되어화장품에잔류할가능성이있는물질로식약청 화장품원료지정에관한규정 ( 식약청고시제2010-99 호 ) 에서 천연에센스에자연적으로함유되어그양이최종제품에서 100ppm 을넘지않는경우는제외 로관리하고있다. 화장품중사프롤분석법을확립하기위해정량범위 0.05-0.8 ppm에서크림, 스킨, 샴푸기제를대상으로회수율을조사한결과, 크림기제에서회수율 96.7 ~ 127.8%, RSD 2.7 ~ 10.5% 결과를얻었고, 스킨기제에서회수율 97.7 ~ 122.1%, RSD 0.5 ~ 11.3% 결과를얻었으며, - 40 -
샴푸기제에서회수율 92.9 ~ 127.3%, RSD 0.8 ~ 13.6% 결과를얻었다. 확립된분석법으로유통화장품 30종을분석한결과모든제품에서사프롤은검출되지않았다. DEG는글리세린, 폴리에칠렌글리콜의유연물질로화장품에서잔류할가능성이있어식약청 화장품원료지정에관한규정 ( 식약청고시제2010-99 호 ) 에서 비의도적잔류물로서 0.1% 이하인경우는제외 로관리하고있다. 화장품중 DEG 분석법을확립하기위해정량범위 1-15 ppm에서크림, 스킨, 샴푸기제를대상으로회수율을조사한결과, 크림기제에서회수율 95.3 ~ 107.6%, RSD 2.7 ~ 10.5% 결과를얻었고, 스킨기제에서회수율 92.4 ~ 105.1%, RSD 0.3 ~ 6.4% 결과를얻었으며, 샴푸기제에서회수율 94.5 ~ 104.9%, RSD 0.0 ~ 6.2% 결과를얻었다. 확립된분석법으로 56종의유통화장품을분석한결과 2종의제품에서 DEG가검출되었으나기준인 0.1% 이하로적합하였다. 사프롤은검출되지않았다. 사프롤, DEG 분석법은우수한직선성과회수율결과를나타내유통화장품안전관리에기여하리라사료된다. 또한화장품분석의경우내부표준물질의선정에어려움을겪게되는데본연구에서는배합금지물질로지정되어있는 trichloroethanol, dichlorobenzene, benzyl chloride 를내부표준물질로선정하여사프롤및 DEG 시험에의안정성및활용가능성을조사하였다. 세물질모두 GC나 HPLC 분석에적합한안정성을보여, 향후화장품중유해물질분석에내부표준물질로충분히활용될수있으리라사료된다. 다환방향족탄화수소 (PAHs) 는유기물의불완전연소시부산물로발생하는물질로화장품성분인카본블랙에서도잔존할수있기때문에식약청에서는 카본블랙규격가이드라인 순도시험항에서 PAHs 시험을수행하도록규정하고있다. 본연구에서는 18종 PAHs에대한 GC-MS 및 HPLC-형광검출기 (anthracene 의경우 DAD 검출기사용 ) 의분석감도를비교하였고, 흡착력이강한카본블랙에서의 PAHs 추출법을수행하였다. GC-MS 및 HPLC-형광검출기의 PAHs 검출감도를비교한결과, 대체로 HPLC-형광검출기의정량범위가 GC-MS의정량범위에비해유사하거나더좋은결과를나타냈다. benzo(a)pyrene, 5 ppb 이하, dibenzo(a,h)anthracene 5 ppb 이하, 총PAHs 5 ppm 이하의기준을고려할때 HPLC-DAD-형광검출기로분석하는것이더욱유리하리라사료된다. 또한카본블랙중 PAHs 추출을여러가지가혹한방법으로수행한결과, 공시험은물론 spike한시료에서도 PAHs가검출되지않았다. 이러한결과로미루어화장품에사용된카본블랙은통상적인사용방법, 환경등에서는쉽게용출되지않으리라사료된다. 제 5 장연구개발과제의목표달성도및관련분야에의기여도 - 41 -
본연구는화장품중배합금지성분인사프롤및 DEG의분석법을확립하고, 카본블랙중 PAHs 분석법을검토하여, 부정 불량화장품색출및화장품원료의안전관리를도모하려는목적으로수행되었다. 화장품중사프롤및 DEG 검출을위해 GC-MS를이용하여신속하고신뢰성있는분석법이마련되었다. 본분석법은화장품중유해물질분석법가이드라인 ( 안 ) 으로활용되어분석법선진화에기여하리라사료된다. 또한본연구를통하여화장품중유해물질분석을위한내부표준물질 3종에대한분석특이성과안정성이확보되었고, 향후분석법에활용되리라사료된다. 카본블랙중 PAHs 분석법을수행하여검토하여타당한분석기기를제시하였고통상적인추출법으로는 PAHs가추출되지않음을확인하였 다. 이로서확립된분석법및결과는화장품품질관리는물론부정 불량화장품및 화장품원료의효과적인관리에활용될수있으므로화장품업계, 화장품검사지정기관, 관리감독기관의신속한화장품품질향상에기여할수있으리라사료된다. 그림. 화장품중유해물질분석법가이드라인 ( 안 ) - 42 -
제6장연구개발과제의연구개발결과활용계획제1절활용성과 과제명 화장품중배합금지성분분석법확립연구 과제책임자 김은정 / 화장품연구팀 / 약학 제2절활용계획가. 정책활용 기타관련정책에활용될예를구체적으로기술함 나. 언론홍보및대국민교육 언론홍보및대국민교육내용등을간략히기술함 다. 연구논문 번호논문제목저자명저널명게재연월권 ( 호 ) 페이지국내 / 국외 * SCI 여부 ** 1 2 * 국내발간학술지인경우 국내, 국외발간학술지인경우 국외 로표기 ** SCI, SCIE, 비 SCI 로구분하여표기 라. 학술발표 번호발표제목발표형태발표자학회명 국내 / 국제 마. 지식재산권 번호출원 / 등록 특허명출원 ( 등록 ) 인출원 ( 등록 ) 국 출원 ( 등록 ) 번호 ( 출원 ( 등록 ) 연월일 ) IPC 분류 - 43 -
제 7 장참고문헌 * 국문 : 저자명, 논문제목, 게재지, 년도, 권 ( 호 ), 페이지 1. 홍, 강, 김 : 식품안전관리방안연구, 식품 학회지, 2008, 9(11), 1~ 16 * 영문 : 저자명, 논문제목, 게재지, 호, 페이지 ( 년도 ) 1. Mirkin, E. V. & Mirkin, S. M. Replication fork stalling at natural impediments. M icrobiol. M ol. Biol. Rev.71, 13 35 (2007) 1. 2. FDA. Gas Chromatography - Mass Spectrometry (GC-MS) Screening Procedure for the Presence of Diethylene Glycol and Ethylene Glycol in Toothpaste. (2007). 3. Marraffa, J. M., Holland, M. G., Stork, C. M., Hoy, C. D., Hodgman, M. J., Diethylene glycol: widely used solvent presents serious poisoning potential. J. Emerg. M ed. 35, 401-406 (2008). 4. Schier, J. G., Rubin, C. S., Miller, D., Barr, D., McGeehin, M. A., Medication-associated diethylene glycol mass poisoning: a review and discussion on the origin of contamination. J. Public Health Policy. 30, 127- (2009) 5. Schep, L. J., Slaughter, R. J., Temple, W. A., Beasley, D. M., Diethylene glycol poisoning. Clin. Toxicol. (Phila) 47, 525-535 (2009) 6. Hernandez, F., Ibanez, M., Sancho, J. V. Fast determination of toxic diethylene glycol in toothpaste by ultra-performance liquid chromatography-time of flight mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 391, 1021-1027 (2008) 7. USPharmacopeia 32-NF27. (2009) 8. EuropeanPharmacopeia 6th; 6th ed. (2007) 9. Ding, J., Gu, H., Yang, S., Li, M., Li, J., Chen, H. Selective detection of diethylene glycol in toothpaste products using neutral desorption reactive extractive electrospray ionization tandem mass spectrometry. Anal. Chem. 81, p.8632-8638 (2009) 10. Gembus, V., Goulle, J. P., Lacroix, C. Determination of glycols in biological specimens by gas chromatography-mass spectrometry. J. Anal. Toxicol. 26, - 44 -
280-285 (2002) 11. Maurer, H. H., Peters, F. T., Paul, L. D., Kraemer, T. Validated gas chromatographic-mass spectrometric assay for determination of the antifreezes ethylene glycol and diethylene glycol in human plasma after microwave-assisted pivalylation. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 754, 401-409 (2001) 12. Lopez-Sanchez, M., Dominguez-Vidal, A., Ayora-Canada, M. J., Molina-Diaz, A. Assessment of dentifrice adulteration with diethylene glycol by means of ATR-FTIR spectroscopy and chemometrics. Anal. Chim. Acta. 620, 113-119 (2008) 13. Zhou, T., Zhang, H., Duan, G. Simultaneous determination of diethylene glycol and propylene glycol in pharmaceutical products by HPLC after precolumn derivatization with p-toluene sulfonyl isocyanate. J. Sep. Sci. 30, p.2620-2627 (2007) 14. Wu, J., Yuan, J., Liu, Q., Tang, F., Ding, L., Tan, J., Yao, S. New derivatizing reagent for analysis of diethylene glycol by HPLC with fluorescence detection. J. Sep. Sci. 31, 3857-3863 (2008) 제8장첨부서류본첨부서류는최종보고서서식제일뒤편에첨부함본연구개발과제의성과로기술된게재된학술지논문사본 ( 게재허가를받은경우게재증명서 ) 과지식재산권또는출원서사본을반드시첨부해야함 - 45 -
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