59 Korean J Clin Lab Sci. 2012, 44(2) : 59-65 ISSN 1738-3544 Acute Toxicity Study of Modified Je-Ho-Tang in ICR Mice In-Sun Lee 1, Jeong-Hwa Lee 2, Jae-ll Han 3, Woon-Heung Song 4 Mi-Yeon Kim 1, and Won-Kyung Jeon 1 Herbal Medicine Research Division, Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon 305-811, Korea 1, Literature & Informatics Research Division, Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon 305-811, Korea 2 Laboratory Medicine Team, ASAN Medical Center, Seoul 138-736, Korea 3 Department of Clinical Laboratory Science, Shinheung College, Uijeongbu 480-701, Korea 4 Previous studies have shown that modified Je-Ho-Tang (MJHT) has anti-platelet effects. Je-Ho-Tang (JHT), a Korean court beverage, is a traditional Korean herbal medicine that has been used for the treatment of a disease attended by great thirst, and for prevention of illness in hot summers. We made MJHT from JHT by excluding honey. The present study was performed to determine the acute oral toxicity of crude extract of MJHT in male and female ICR mice. We investigated the in vivo single dose acute toxicity of MJHT hot-water extraction. This test was orally administered once by gavage to 20 mice of each sex received doses of 0 (control group), 1250, 2500 and 5000 mg/kg body weight. Mortalities, clinical findings, autopsy findings and body weight changes were monitored daily for 14 days following the administration. We observed survival rates, general toxicities, changes of body weight, and autopsy. No significant lethality was observed after single oral administration of MJHT at the different dosages. Autopsies on the animals revealed no gross abnormalities. Therefore, the LD50 value of MJHT for ICR mice was estimated more than 5000 mg/kg by the oral route. These results suggest that no toxic dose level of MJHT in mice is considered to be more than 5000 mg/kg. Consequently, it was concluded that MJHT have no effect on acute toxicity and side effect in ICR mice. Key Words : Modified Je-Ho-Tang, Acute toxicity, LD 50 서론 제호탕 ( 醍醐逿 ) 은궁중에서더위를풀어주고갈증을멈 추게하는약으로사용되었으며, 단옷날에내의원에서만 들어올린제호탕을임금이기로소 ( 耆老所 ) 에있는신하 Corresponding Author : Won Kyung Jeon, Ph.D. Korea Institute of Oriental Medicine (KIOM), 461-24 Jeonmindong, Yusung-gu, Daejeon 305-811, South Korea Tel : +82-42-868-9505 Fax : +82-42-868-9573 E-mail : wkjeon@kiom.re.kr * 이연구는교육과학기술부지원한국한의학연구원기관고유사업 C09050 의지원을받아수행되었습니다. Received : 25 May 2012 Return for modification : 11 June 2012 Accepted : 21 June 2012 에게내려보내여름을건강하게잘보내라고하사하기도하였다. 제호탕은더위를이기고갈증을해소하며몸을보신하기위한우리나라고유의전통청량음료였다 ( 지와김, 2008). 또한, 제호탕은 동의보감 과 방약합편 등에더위를먹어생긴열을풀고번갈을멎게한다고기록되어있다. 제호탕은오매육 1근, 초과 1냥, 사인과백단향각 5돈, 꿀 5 근으로구성된처방으로서, 이들약재를곱게가루내고꿀을넣어끓이면서고르게저은것을찬물에타서마신다고기록되어있다 (Yoon 등, 2005; 황, 2002). 현재까지진행된제호탕에대한연구를살펴보면, 고문헌기록및문헌고찰에대한연구 ( 지등, 2008), 조리학적분석연구 ( 지와김, 2008), 일반영양성분연구 (Yun과 Jo, 1996; Yun과 Jo, 1996) 와효능연구등이일부이루어져있다. 제호탕과관련한효능에대한실험적연구는장내세균및면역활성에미치는연구 59
(Ji 등, 2006), 가감제호탕 ( 加減醍醐逿 ) 의전혈응집억제및혈소판부착억제작용에대한연구 (Jeon 등, 2008) 를제외하고거의보고된바없다. 본연구팀은한방처방을대상으로항혈전활성검색을하여활성후보소재를도출하고자연구를수행하던중, 제호탕과가감제호탕의항혈소판활성연구를통해가감제호탕의효능이우수하다는것을실험적으로검증한바있으나, 가감제호탕에대해실험동물을이용한독성시험에대한안전성평가는진행하지않았다. 이에본연구에서는가감제호탕의마우스에대한경구급성독성시험을우선적으로수행하였으며, 본실험결과를근거로하여반복투여독성시험을위한적절한경구투여용량단계를선택할계획이다. 한약제제라함은한약을한방원리에따라배합하여제조한의약품을의미하는데 (KFDA, 2005) 이러한한약제제는기존의 동의보감 등 11개기성한의서에수재된한약처방에대하여현재약 530여종이품목허가된상태이다 (KIOM, 2001). 여기에포함된처방은고전한의서에기록된효능및안전성에대한정보만을제공하고있어서현대과학적근거로서는한계성을가지고있다. 또한, 한방처방의효능과안전성에대한과학적기초자료부족으로환자의한약복용에대한불안이가중되고있는실정이다 (KIOM, 2009). 이와같이최근에국민들은한약제제를포함하여의약품의유효성과함께안전성에대해서도깊은관심을갖게되었으며, 유효하고안전한의약품의개발을기대하고있다 (KFDA, 1999). 따라서기존의연구에서동의보감에수록된제호탕을가감방한가감제호탕에대해항혈전효능을실험적으로검증하였기에, 본연구에서는이에대한급성독성을평가하기위해식품의약품안전청의 의약품등의독성시험기준 (KFDA, 2009) 에의하여마우스를이용한경구단회투여급성독성시험을수행함으로써가감제호탕의급성독성에관한기초자료를얻었기에보고하고자한다. 재료및방법 1. 재료 1) 실험동물및사육환경시험구역은한국한의학연구원동물실험실에서실시하였 으며, 시험동물은암수 ICR계마우스 4주령을오리엔트바이오 ( 경기도성남시중원구상대원동 143-1) 에서분양받아한국한의학연구원의실험동물윤리위원회의승인을받은후규정에따라실행하였다 ( 승인번호암컷09-054, 수컷 09-055). 시험에사용한 ICR 마우스를입수후, 외관을육안으로검사한다음 7일간의순화기간동안일반증상을관찰하여건강한암^수모두 40마리 ( 암 20, 수 20) 를선발하여체중범위에따른무작위법에의하여군분리를실시한후, 본실험을수행하였다. 순화및실험기간동안의사육환경은온도 23±3, 상대습도 50±10%, 환기횟수는시간당 12~16회, 조명은 12시간명암주기 ( 점등 7:00, 소등 19:00), 조도는 150~300 Lx로조정하여시험전기간동안일정한사육환경조건을유지하였다. 실험자는소독된기구를사용하여실험을실시하였다. 시험기간중에사용된사료는실험동물용고형사료 (PMI nutrition, USA) 를사용하였으며사료의오염물질확인은공급처에서제공한자료를근거한바시험에영향을미치는요인은발견되지않았다. 물은음수가가능한상수도수를급여하였다. 2) 시료의조제가감제호탕의한약재구성은 Table 1과같다. 한약재는 2006년백제당 ( 대전약재시장소재 ) 에서품질이우수한약재를대상으로구입하였다. 본연구원에서한약재의외부형태를비교검사한후한약재보관소에보관하였으며실험에필요할때마다정량하여사용하였다. 가감제호탕은오매 (Mume Fructus) 32 g, 초과 (Amomi Tsaoko Fructus) 2 g, 사인 (Amomi Fructus) 1 g 및백단향 (Santali Albi Lignum) 1 g으로각각정량하고, 이를믹서 (mixer) 를이용하여가루로혼합제조하였다. 상기혼합시료 36 g을증류수 360 ml Table 1. Composition of MJHT extracts Herbal medicines Weight (g) Mume Fructus 32 Amomi Tsaoko Fructus 2 Santali Albi Lignum 1 Amomi Fructus 1 Total weight 36 60 Acute toxicity study of MJHT
에넣어 70~90 에서 2시간동안가열하며환류추출한다음여과지로여과하였다. 상기여과액을 10,000 rpm에서 15 분간원심분리하여상층액을취하고, 35~40 의수용액상에서회전진공농축기를이용하여감압농축한후동결건조시켜가감제호탕동결건조물 (9.91 g, 수율 27.5%) 을제조하였다. 실험에사용하기전까지냉암소 ( 冷暗所 ) 에보관하였다. 2. 실험방법 1) 실험군설계및투여용량의설정 5주령마우스에대한가감제호탕의단회투여급성독성을평가하기위하여체중을측정하고무작위법을이용하여군분리를실시하여투여군별로암 수각 5마리씩사용하였다. 투여경로는한방임상적용경로에따라경구를선택하였으며, 투여량은투여당일의체중을기준으로하여계산하였다. 시험물질은한약추출물로단회투여에의한사망은없을것으로예측되어투여용량은최대량 5000 mg/kg을기준하여 5000, 2500, 1250, 0 mg/kg 등으로정하였다 (Table 2). 각용량군의가감제호탕은투여직전에 3차증류수로용해하여실험에사용하였다. 경구투여하기전에하룻밤절식시킨후배부피부고정법으로고정하고경구투여용금속제존데와주사관을이용하여 1회투여 / 투여당일로위내에강제경구투여하였다. 2) 임상증상및사망동물의관찰임상증상은투여당일에는가감제호탕투여직후부터 6 시간동안매시간관찰하였으며, 그후 14일동안 1일 1회 일반상태관찰법에의하여일반증상의변화, 독성증상및사망동물의유무에대해서대조군과비교관찰하였고모든경과를상세히기록하였다 (KFDA, 2009). 3) 부검실험종료후, 에테르로마취하여후대정맥을통한방혈치사시킨다음부검하여외관및내부장기 ( 심장, 신장, 폐, 간, 비장, 소장, 대장 ) 의이상유무를육안적소견으로관찰하였다. 4) 체중변화체중변동을알아보기위해시험에사용된모든동물에대하여경구투여직전과투여후 1일, 3일, 7일과부검하기직전인 14일째에체중을자동전자저울을이용하여각각측정하였다. 3. 통계처리체중에대한통계분석은 SPSS 11.0 패키지 (SPSS, USA) 를이용하였으며, 모든측정값은평균과표준편차로계산하였다. 대조군과투여군의분석수치에대한유의적검증은반복측정분산분석 (repeated measured ANOVA) 을유의성 (p<0.05) 으로검정하여유의성이인정된경우대조군과투여군간에차이가있는지조사하기위하여다중비교법인 Dunnet test를실시하였다. 분석결과에대한 p<0.05 수준에서평균치에대한유의성을분석하였다. Table 2. The groups of administration Group No. of animals (head) Dose volume (ml/kg) Dose (mg/kg) Vehicle control 10 0 T 1 10 1250 T 2 10 2500 T 3 10 5000 Acute toxicity study of MJHT 61
결과 1. 치사율및 LD 50 값가감제호탕을 1250, 2500, 5000 mg/kg 농도별로단회경구투여한후암수 ICR 마우스를 14일동안독성징후와동물의사망발현에대해관찰한결과는 Table 3과같다. 경구투여시본실험의경우가감제호탕추출물의최대량 5000 mg/kg까지투여하여도사망동물을관찰할수없어개략의반수치사용량 (LD 50 ) 을 5000 mg/kg이상으로산출하였다. 따 라서마우스에대한가감제호탕의개략의치사량은암 수모두에서 5000 mg/kg을상회하는것으로판단되었다. 2. 체중변화모든시험군에서경구투여후시간경과에따라정상적인체중증가가관찰되었는데이는체중증가억제를나타내지않는것으로보아가감제호탕은독성이없는것으로판단되었다. Table 4에서와같이암컷 ICR 마우스의대조군과시료투여군사이의유의한차이는 (p =0.940) 나타나지않았 Table 3. Mortality of male and female ICR mice treated orally with MJHT Group Days after treatment 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Final Mortality C 0/5* 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 LD 50 (mg/kg) Male Female T 1 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 T 2 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 T 3 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 C 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 T 1 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 T 2 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 T 3 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 >5,000 >5,000 * Values are expressed as number of dead animals/total animals. C: vehicle orally treated group, T 1 : 5000 mg/kg(day) of MJHT orally treated group, T 2 : 2500 mg/kg(day) of MJHT orally treated group, T 3 : 1250 mg/kg(day) of MJHT orally treated group. Table 4. Body weights in male and female ICR mice treated orally with MJHT Male Female Group Days after treatment 0 1 3 7 14 C 30.58±2.02 32.03±2.00 33.16±1.77 34.45±1.89 37.28±1.16 P -value T 1 31.02±2.01 33.17±2.68 34.34±2.93 35.09±2.94 37.36±2.10 0.034 T 2 30.16±2.21 32.56±2.18 33.36±2.52 33.60±1.95 34.86±2.66 0.683 T 3 30.64±2.27 34.09±2.74 35.10±3.02 36.85±2.52 39.74±2.35 0.578 C 24.57±1.33 27.19±2.01 27.27±1.03 27.70±1.89 28.95±2.42 T 1 24.37±1.62 26.00±1.89 27.56±1.73 28.32±2.08 30.37±1.90 0.944 T 2 23.97±1.56 26.41±1.66 27.48±1.37 27.91±1.37 29.96±2.54 1.000 T 3 24.59±1.04 26.96±1.43 26.97±1.35 28.20±1.05 30.21±2.29 0.932 Results are mean ± S.D. (n=5). Group abbreviation: C; vehicle orally treated group, T 1 ; 5000 mg/kg(day) of MJHT orally treated group, T 2 ; 2500 mg/kg(day) of MJHT orally treated group, T 3 ; 1250 mg/kg(day) of MJHT orally treated group. p values represent significant differences between the control and experimental group values, respectively (Repeated measured ANOVA, Dunnett t-test). 62 Acute toxicity study of MJHT
다. 수컷 ICR 마우스의대조군과시료투여군사이의유의한차이가 (p =0.012) 나타나사후검정을한결과가감제호탕 5000 mg/kg 투여군 (T 1 ) 만이대조군보다체중이유의하게 (p =0.034) 높아지는것으로나타났으나독성에의한체중변화는없는것으로관찰되었다. 대조군과 2500 mg/kg 투여군 (T 2 ) 및 1250 mg/kg 투여군 (T 3 ) 간의유의한차이는나타나지않았다. 또한투여용량군사이의체중변화는용량의존성을나타나지않았다. 마우스를부검하여주요장기에대한육안적소견을관찰한결과 Table 6과같다. 부검결과, 대조군과시료투여군등의모든시험군에서시험물질의투여에기인된외관상이나내부장기에어떠한육안적이상소견이나병변이발견되지않았다. 고찰 3. 임상증상시험물질가감제호탕투여한후관찰한결과 Table 5에서와같이경구투여후 14일동안암수 ICR 마우스모두본실험물질의투여에관한어떠한독성증상의이상소견이관찰되지않았다. 4. 부검소견가감제호탕경구투여후 14일째생존동물모든암수 ICR 가감제호탕은오매, 초과, 사인, 백단향등의 4종으로구성되어있으며제호탕의구성약물에서꿀을제외하고구성한처방이다 (Jeon 등, 2008). 제호탕을구성하는한약재별로동의보감에서의기록내용을살펴보면주재료로사용되는오매 ( 烏梅 ) 는매화나무의미성숙한과실을채취하여짚불연기에훈증하여건조한것으로성질이따듯하고독이없고맛이시다. 담을삭히고, 토하는것과갈증, 이질을멎게하며술독에사용될수있으며, 상한과조갈에주로쓰인다. Table 5. Clinical signs in male and female ICR mice treated orally with MJHT Variable / Group C T 1 T 2 T 3 / Dose(mg/kg) 0 1,250 2,500 5,000 / No. of animal 5 5 5 5 Male normal 5 5 5 5 Female normal 5 5 5 5 C: vehicle orally treated group, T 1 : 5000 mg/kg(day) of MJHT orally treated group, T 2 : 2500 mg/kg(day) of MJHT orally treated group, T 3 : 1250 mg/kg(day) of MJHT orally treated group. Table 6. Autopsy findings in male and female ICR mice treated orally with MJHT Variable / Group C T 1 T 2 T 3 / Dose(mg/kg) 0 1,250 2,500 5,000 / No. of animal 5 5 5 5 Male normal 5 5 5 5 Female normal 5 5 5 5 Autopsy finding at 1 day treatment of test substances. C: vehicle orally treated group, T 1 : 5000 mg/kg(day) of MJHT orally treated group, T 2 : 2500 mg/kg(day) of MJHT orally treated group, T 3 : 1250 mg/kg(day) of MJHT orally treated group. Acute toxicity study of MJHT 63
검은사마귀를없애고입이마르면서침을자주뱉는것을치료한다고기록되어져있다. 초과 ( 草果 ) 는성질이따듯하고맛은매우며독이없다. 온갖냉기에주로쓴다. 비위를따뜻하게하고구토를멎게한다. 배가불러오른것을치료하고학모를없애며숙식을없애고술독과과일의상한것을풀며, 습독에의한병을물리치고온역을풀어준다. 사인 ( 砂仁 ) 은성질이따뜻하고맛은매우며독이없다. 속을고르게하고, 기를내리며설사와이질을멎게한다. 식욕을돋게하고소화가잘되게한다. 백단향 ( 白檀香 ) 은성질이따뜻하고맛은매우며독이없다. 열로부은것을가라앉히고신기로배가아픈것을치료한다 (Yoon 등, 2005). 본연구에사용된시험물질인가감제호탕은위의구성약물을열수추출한다음농축하여동결건조의제조과정을거쳤으며냉동보관하여실험에사용하였다. 마우스는독성시험에적합한실험동물로서급성독성시험에널리사용되고있고, ICR 계통의마우스는풍부한시험기초자료가축적되어있어서시험결과의해석및평가시에활용하는데적당한것으로알려져있다. 시험물질인가감제호탕은한약처방으로 의약품등의독성시험기준 에는한계용량에대한기준이없기때문에단회경구투여에의한독성을조사하기위하여 ICR 마우스에각각고용량군, 중간용량군, 저용량군등으로시험물질의투여군을나누었으며, 대조군은 3차증류수를투여하였다 ( 고등, 2005). 본연구는가감제호탕의 ICR 마우스를이용한단회경구투여에의한독성시험의정보를얻기위하여식품의약품안전청고시제2009-116호 (2009년 8 월 24일 ) 의 의약품등의독성시험기준을근거로하여실시하였다 (KFDA, 2009). 시험물질가감제호탕에대한단회경구투여독성시험을 ICR 마우스에서경구로최고용량 5000 mg/kg까지투여한결과, 폐사및일반증상과모든생존동물에대한해부병리소견에서시험물질의투여에기인한다고사료되는변화는관찰되지않았다. 다만대조군과비교하여체중이유의하게증가하였으나독성에의한체중변화는없는것으로판단되었다. 본연구는가감제호탕에대한급성독성평가를목적으로 ICR 암 수마우스에게각각 0, 1250, 2500, 5000 mg/kg 용량으로단회경구투여한후 14일간의사망률, 일반증상, 체중변화및부검소견을관찰한결과를얻었다. 본시험결과에따르면마우스에서가감제호탕 의경구투여는모든시험군에서 LD 50 는 5000 mg/kg 이상이 었으며, 임상증상관찰시실험물질의투여에관한어떠한 독성증상의이상소견이관찰되지않았다. 또한경구투여 한마우스의체중변화는대조군과시험물질투여군간의독 성으로인한유의한차이를발견할수없었다. 모든장기에 육안적이상병변은관찰되지않아조직학적검사및간조 직세포에서의세포독성실험은수행하지않았다. 이상의모 든결과를종합하여볼때시험물질인가감제호탕은암 수 ICR 마우스에서의 LD 50 값은경구투여가 5000 mg/kg 이상인 생체내저독성의안전한물질로작용되는것으로사료된다. 따라서본연구결과를바탕으로다음실험에서는반복투여 독성시험을위한가감제호탕의고용량은 5000 mg/kg 으로 설정해야할것으로판단되다. 향후가감제호탕을실험동 물에반복투여하여중 장기간내에나타나는독성을질 적 양적으로검사하는독성평가를수행함으로써반복투여 에의한안전성기초자료를확보할계획이다. 참고문헌 1. Jeon WK, Kim YE, Park SO, Kwon DY, Ahn SW, Lee JH, et al. The modified Je-Ho-Tang, Korean hrbal medicine, inhibits whole-blood aggregation and platelet adhesion to collagen under flow. Thrombo Res.. 2008, 122:804-809. 2. Ji MS, Park MJ, Lee MY, Kim JG, Ko BS. Effect of Jehotang extract on the growth of intestinal bacteria and immunostimulation. Korean. J. Food. Sci. Technol., 2006, 38:104-108. 3. Yun SJ, Jo HJ. Studies on nutritional compositions of the Jehotang: 1. proximate Composition, free sugars, amino acids, fatty acids and mineral contents. J. Korean. Soc. Food. Sci. Nutr.. 1996, 25:649-653. 4. Yun SJ, Jo HJ. Studies on nutritional compositions of the Jehotang: 2. organic acid content and volatile aroma components. J. Korean. Soc Food. Sci. Nutr.. 1996, 25:654-658. 5. 고병섭, 박민정, 박소민, 전원경, 천진미, 정필문, 등. 가미옥천산의 ICR 마우스경구투여에의한급성독성시험연구. 동의생리병리학회지. 2005, 19:1200-1203. 6. 김형준, 윤석희, 등. 동의보감. 2005, p1147, 동의보감출판사. 7. 신현규. 표준한방처방 EBM 구축사업. 2009, p5, KIOM. 8. 의약품등의독성시험기준해설서. 1999, p1, KFDA. 9. 의약품등의독성시험기준식품의약품안전청고시 2009-116 호 2009, KFDA. 64 Acute toxicity study of MJHT
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